JPWO2012173222A1

JPWO2012173222A1 - ガリウム標識薬剤

Info

Publication number: JPWO2012173222A1
Application number: JP2013520596A
Authority: JP
Inventors: 泰荒野; 知也上原
Original assignee: Chiba University NUC
Current assignee: Chiba University NUC
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2015-02-23
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: JP5971867B2; WO2012173222A1

Abstract

標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール（ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ）と、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤；診断用または治療用の前記放射性ガリウム標識薬剤；前記放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子；前記配位子を含む薬剤とガリウム６７またはガリウム６８を含む薬剤とを、別々の包装単位として含んでなるキット；および、放射性ガリウム標識薬剤の製造方法を提供する。

Description

本発明は、標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７（ｇａｌｌｉｕｍ−６７、Ｇａ−６７）またはガリウム６８（ｇａｌｌｉｕｍ−６８、Ｇａ−６８）とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤、その製造方法、および前記放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子に関する。

放射性標識薬剤は、放射性同位元素の核種により標識された化合物を含む薬剤であり、疾患の診断や治療、例えば腫瘍の診断や治療などに広く利用されている。放射性標識薬剤を特定の組織や細胞に集積させることにより、感度の高い診断や有効な治療を行うことができ、また、正常の組織や細胞への副作用を低減することができる。例えば、腫瘍細胞が臓器や組織に転移し、散在しているような場合でも、正常の組織や細胞に影響を与えることなく、有効な診断や治療が行える。放射性標識薬剤を用いた診断や治療においては、有用な核種の選択や、該薬剤を特定の組織や細胞に集積させるための薬剤設計が行われてきた。

ガリウム（Ｇａ）は原子番号３１の元素であり、インジウムと同じ第１３族元素に属する。ガリウムの多種類の核種の中でＧａ−６７（以下、^６７Ｇａと略称することがある）とＧａ−６８（以下、^６８Ｇａと略称することがある）の二つの放射性核種が核医学診断に適した性質を有している。^６７Ｇａはサイクロトロンにより製造される半減期７８時間のγ線放出核種であり、^６７Ｇａクエン酸塩（^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ）が悪性腫瘍や炎症の診断を目的とした単一光子放射線コンピュータ断層撮影（ｓｉｎｇｌｅｐｈｏｔｏｎｅｍｉｓｓｉｏｎｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＳＰＥＣＴと略称する）用薬剤として臨床で使用されている。一方、^６８Ｇａは半減期６８分の陽電子放出核種であり、ポジトロン断層撮影（ｐｏｓｉｔｒｏｎｅｍｉｓｓｉｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下、ＰＥＴと略称する）診断に用いられる。また近年、半減期２７０日のゲルマニウム−６８（^６８Ｇｅ）との過渡平衡を利用したジェネレータシステムの開発により、サイクロトロンを設置しなくても使えるＰＥＴ核種として期待されている。

タンパク質やペプチドなどの生理活性分子は一般に、ガリウムに対する安定な結合部位を有していないことから、標的分子である生理活性分子をガリウムで標識するために、ガリウムへの配位部位と生理活性分子との結合部位とを分子内に併せ持つ二官能性キレート剤を用いた診断薬剤の開発が行われている。実際、内分泌腫瘍に発現するソマトスタチン受容体を標的としたＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ１−Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ１−Ｔｙｒ３−ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、非特許文献１および２）や乳がんのＨｅｒ２受容体を標的としたＤＯＴＡアフィボディ（ＤＯＴＡ−ａｆｆｉｂｏｄｙ、非特許文献３）などが研究されている。

しかしながら、放射性標識薬剤の製造においては、放射性ガリウムなどの金属放射性核種の濃度が極めて低いため、目的とする放射性標識薬剤を高い放射化学的収率で短時間のうちに得るために、大過剰のキレート剤、具体的には０．０１〜１ｍＭ濃度のキレート剤を用いて標識が行われている。そのため、このような放射性標識薬剤をそのまま生体に投与すると、標識されていないキレート剤が標的部位に対して放射性標識薬剤と競合し、放射性標識薬剤の集積の低下を招き、その結果、標的分子の画像化が妨げられる。このような問題に対して、比放射能の向上を目指した検討が行われているが、配位子濃度が低い場合には標識率が低下することや、二官能性キレート剤を複数個導入して標識率を向上させた場合には標的分子との結合親和性が低下することが報告されている（非特許文献４）。

一方、分子内に標的分子との結合部位（標的分子認識素子と称することがある）を２分子有する化合物（二価の化合物と称する）は結合部位を１分子有する化合物（一価の化合物と称する）に比べ標的分子への高い結合力を有することが知られており、これは多価効果として医薬品の設計に広く利用されている（非特許文献５〜７）。これらの知見から、標的分子認識素子を一つ有する一価配位子が金属原子と１：２あるいは１：３の錯体を作ることで、標的分子への標識体の集積が向上することが期待できる。

実際、本発明者らは、金属放射性核種としてテクネチウム−９９ｍ（以下、^９９ｍＴｃと略称することがある）を、そして標的分子認識素子を有する配位子としてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ結合ペニシラミン（以下、ＲＧＤ結合ペニシラミンを称することがある）を用い、^９９ｍＴｃとＲＧＤ結合ペニシラミンとで形成された錯体が標的分子への高い集積性を有し、かつ生体内で安定であることを明らかにし、該錯体の放射性標識薬剤としての有用性を示している（特許文献１および２）。

これに対し、ガリウムと配位子とで形成される１：２あるいは１：３の錯体であって生体内や過剰の配位子を除去した状態で安定に存在するものは報告されていない。生体内では、ガリウム錯体と配位子とは異なる挙動を示すことから、過剰の配位子を除去した場合における安定性が重要となる。２座配位子であるデフェリプロンはガリウムと１：３の錯体を形成するが、形成した錯体溶液から過剰の配位子を除去すると錯体が崩壊することが報告されている（非特許文献８）。

特開２００９−１３２６９１号公報。国際公開第２０１０／１２５６４７号パンフレット。

ハニン（Ｈａｎｉｎ，Ｆ．−Ｘ．）ら、「Ｔｕｍｏｒｕｐｔａｋｅｏｆ６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−Ｔｙｒ３−ｏｃｔｒｅｏｔａｔｅ：ａｎｉｍａｌＰＥＴｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｕｍｏｒｆｌｏｗａｎｄａｃｕｔｅｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＣＡ２０９４８ｒａｔｍｏｄｅｌ．」、ヌクレアーメディシンアンドバイオロジー（ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第３７巻、ｐ．１５７−１６５。カーン（Ｋｈａｎ，Ｍ．Ｕ．）ら、「ＣｌｉｎｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＧａｌｌｉｕｍ−６８ｐｏｓｉｔｒｏｎｅｍｉｓｓｉｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙｉｍａｇｉｎｇ．」、ヨーロピアンジャーナルオブサージカルオンコロジー（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｕｒｇｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ）、２００９年、第３５巻、ｐ．５６１−５６７。レン（Ｒｅｎ，Ｇ．）ら、「Ａ２−ｈｅｌｉｘｓｍａｌｌｐｒｏｔｅｉｎｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈ６８ＧａｆｏｒＰＥＴｉｍａｇｉｎｇｏｆＨＥＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」、ジャーナルオブヌクレアーメディシン（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ）、２００９年、第５０巻、ｐ．１４９２−１４９９。レンネン（Ｒｅｎｎｅｎ，Ｈ．Ｊ．Ｊ．Ｍ．）ら、「ＬａｂｅｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈＴｃ−９９ｍｖｉａｈｙｄｒａｚｉｎｏｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＨＹＮＩＣ）：Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ．」、ヌクレアーメディシンアンドバイオロジー（ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ）、２０００年、第２７巻、ｐ．５９９−６０４。マムメン（Ｍａｍｍｅｎ，Ｍ．）ら、「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｄｅｓｉｇｎａｎｄｕｓｅｏｆｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔｌｉｇａｎｄｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．」、アンゲヴァンテケミーインターナショナルエディション（ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ−ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ）、１９９８年、第３７巻、ｐ．２７５５−２７９４。ムルダー（Ｍｕｌｄｅｒ，Ａ．）ら、「Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙｉｎｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．」、オーガニックアンドバイオモレキュラーケミストリー（ＯｒｇａｎｉｃａｎｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００４年、第２巻、ｐ．３４０９−３４２４。キースリング（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．）ら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔｌｉｇａｎｄｓａｓｐｒｏｂｅｓｏｆｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．」、アンゲヴァンテケミーインターナショナルエディション（ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ−ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ）、２００６年、第４５巻、ｐ．２３４８−２３６８。モテカイティス（Ｍｏｔｅｋａｉｔｉｓ，Ｒ．Ｊ．）ら、「Ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｃｈｅｌａｔｅｓｏｆ１，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅａｎｄｒｅｌａｔｅｄｌｉｇａｎｄｓ．」、インオーガニカキミカアクタ（ＩｎｏｒｇａｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ）、１９９１年、第１８３巻、ｐ．７１−８０。

ガリウムの放射性核種は、高度な画像診断や病態の解明などに大きく貢献すると期待されている分子イメージングに有用であるが、生体内で安定であり、かつ、標的部位に効率的に集積する放射性ガリウム標識薬剤は未だ開発されていない。

本発明は、標的部位に効率的に集積し、かつ、生体内での高い安定性を有する放射性ガリウム標識薬剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、ガリウムと２座配位子あるいは３座配位子による１：３または１：２の安定な錯体を得ることは困難であり、ガリウムとの安定な錯形成には６座の配位子が必要であると考え、ガリウムと錯形成するときは６座配位子であるが、錯形成後残存した配位子が速やかにｎ座配位子（ｎ＝１−５）に崩壊することでガリウム錯体のみが多価効果を示すという新たな薬剤設計を考案した。そして、シッフ塩基が水溶液中でアミン、アルデヒドと平衡状態にあることに注目し、配位子内にシッフ塩基が存在する場合、該シッフ塩基が、錯未形成時は加水分解を受けてアルデヒドとアミンに分解するが、ガリウムの配位により安定化されることで、標識体のみが６座となり多価効果を示すと考え（図１）、モデル配位子として配位子骨格にシッフ塩基を有するトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、以下Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと略称することがある］を用いて本薬剤設計の基礎的評価を行った。まず、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを配位子として用いてガリウムとの錯体Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌを作製した。次いで、標的分子認識素子として、悪性腫瘍などの新生血管に高密度に発現することが知られているα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する環状ペンタペプチド、シクロ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ［配列表の配列番号１、以下ｃ（ＲＧＤｆＫ）と略称することがある］をＧａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌのベンゼン環にヘキサン酸を介して結合した構造を有する錯体Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌを作製し、そのアポトランスフェリン（ａｐｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）中での安定性およびα_ｖβ_３インテグリンに対する親和性を検討した。また、担癌モデルマウスを用いてＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの標的部位への特異的な集積性をインビボで検討した。

その結果、本発明者らは、配位子骨格にシッフ塩基を有する化合物であるＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌや標的分子認識素子を有する当該化合物であるＨ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌとガリウムとの錯体がアポトランスフェリン中で安定であることを明らかにした。さらに、Ｈ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌとガリウムとの錯体が、α_ｖβ_３インテグリンに対する高い親和性を示すこと、および、担癌モデルマウスを用いた検討において、移植した腫瘍に集積して明瞭な画像を与えたが、排泄組織を除く他の組織へは集積しなかったことを明らかにした。これらの知見から、本発明者らは標的分子結合素子を有するＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと放射性ガリウムとから形成される錯体が、生体内での高い安定性を有し、かつ、標的部位に効率的に集積する放射性ガリウム標識薬剤を与え得ることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は以下に関する。
（１）標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤。
（２）標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが、配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドと結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌである前記放射性ガリウム標識薬剤。
（３）６−アミノヘキサノアートｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒド（ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫ）と、２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とをクエン酸溶液中で反応させることにより形成された錯体を含む、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤。
（４）診断用放射性標識薬剤である前記いずれかの放射性ガリウム標識薬剤。
（５）標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌからなる、標的部位への集積性が増加した放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
（６）標的分子に結合する化合物とサリチルアルデヒドとを有する化合物およびＴＡＭＥｏｌをインビトロで反応させることにより形成される化学構造を有する化合物からなる、標的部位への集積性が増加した放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
（７）標的分子に結合する化合物が、配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドである前記放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
（８）前記いずれかの放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子を含む薬剤と、ガリウム６７またはガリウム６８を含む薬剤とを、別々の包装単位として含んでなるキット。
（９）ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫと、ＴＡＭＥｏｌと、ガリウム６７またはガリウム６８とを、別々の包装単位として含んでなるキット。
（１０）標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを配位子として用い、ガリウム６７またはガリウム６８とインビトロで錯形成させることを含む放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。
（１１）標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが、配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドと結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌである前記放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。
（１２）ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫと、ＴＡＭＥｏｌと、ガリウム６７またはガリウム６８とをクエン酸溶液中で反応させることを含む、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。

本発明によれば、標的部位に効率的に集積し、かつ、生体内での高い安定性を有する放射性ガリウム標識薬剤を提供できる。具体的には、本発明により、標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤を提供できる。本発明に係る放射性ガリウム標識薬剤に含まれる錯体は、標的分子への結合部位を１箇所有する標的分子認識素子（１価の標的分子認識素子）を３個有する多価錯体であるため、従来使用されていた１価の錯体と比較して、標的部位に高い集積性を示す。

従来の放射性ガリウム標識薬剤はその製造において大過剰の配位子を使用するために、そのまま使用すると錯体を形成していない配位子が標的部位に対して放射性標識薬剤と競合し、放射性標識薬剤の標的部位への集積の低下を招き、その結果、分子イメージングにおける標的分子の画像化が妨げられていた。

本発明に係る放射性ガリウム標識薬剤は、錯体を形成していない配位子が速やかに配位座の数のより少ない配位子に崩壊し、ガリウム錯体のみが多価効果を示すために、その製造において大過剰の配位子を使用しても標的部位への集積性が高く、分子イメージング技術による診断や治療経過の観察を容易にする。

配位子がガリウムと錯形成することによりシッフ塩基が安定化し、配位子の分解が防止されることを説明する図である。シッフ塩基を有するモデル配位子であるトリサリチルアルジミノメチルエタノール［Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］は、ガリウムと錯形成しないときはＴＡＭＥｏｌとサリチルアルデヒド（Ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ、ｓａｌ）に分解するが、ガリウムと錯形成したＧａ−Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌは分解しない。 ^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと非放射性ガリウム標識（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌのそれぞれの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）保持時間が一致したことを示す図である。パネル（Ａ）は、^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌのＲＰ−ＨＰＬＣ分析における放射活性（Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。パネル（Ｂ）は対照である非放射性ガリウム標識（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌのＲＰ−ＨＰＬＣにおけるガリウムイオン強度（^６９Ｇａｉｏｎｃｏｕｎｔ）を誘導結合プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ−ＭＳ）により分析した結果を示す。横軸は保持時間（分）［ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）］を示す。（実施例４） ^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌと非放射性ガリウム標識（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのそれぞれのＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間が一致したことを示す図である。パネル（Ａ）は、対照である非放射性ガリウム標識（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌをＲＰ−ＨＰＬＣで分析し紫外吸収（ＵＶ吸収）を測定したところ、保持時間２８．５分にＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌ、２６分にｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫが観察されたことを示す。パネル（Ｂ）は、^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのＲＰ−ＨＰＬＣ分析において、その放射活性（Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）が２８．５分に観察されたことを示す。パネル（Ｃ）は、^６７Ｇａ標識後にＲＰ−ＨＰＬＣで分析しＵＶ吸収を測定したところ、主に、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫが２６分に、^６７Ｇａ−クエン酸ガリウム（^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ）に含まれるベンジルアルコールが１５分に観察されたことを示す。横軸は保持時間（分）［ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）］を示す。（実施例４）Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌはエタノール溶液中では安定であるが、リン酸緩衝液中で速やかにサリチルアルデヒドとＴＡＭＥｏｌに崩壊することを示す図である。パネル（Ａ）は、エタノール中でＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを１時間インキュベーション後にＲＰ−ＨＰＬＣにより分析しＵＶ吸収を測定した結果を示す。パネル（Ｂ）は、リン酸緩衝液中でＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを１時間インキュベーション後にＲＰ−ＨＰＬＣにより分析しＵＶ吸収を測定した結果を示す。保持時間１３．５分はＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ、保持時間５分はサリチルアルデヒドのピークである。横軸は保持時間（分）［ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）］を示す。（実施例５）アポトランスフェリン溶液中において^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが安定に存在することを示す図である。横軸は期間（時間）［Ｔｉｍｅ（ｈ）］を、縦軸は完全なものの割合（％ｏｆｉｎｔａｃｔ）を示す。（実施例５）アポトランスフェリン溶液中において^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌが安定に存在することを示す図である。横軸は期間（時間）［Ｔｉｍｅ（ｈ）］を、縦軸は完全なものの割合（％ｏｆｉｎｔａｃｔ）を示す。（実施例５） ^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３−ＴＡＭＥｏｌの標的部位への集積性と、副作用である他組織へのその集積の程度を、担癌モデルマウスを用いてインビボで検討した結果を示す図である。^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３−ＴＡＭＥｏｌは、左足に移植した腫瘍（Ｔｕｍｏｒ）を明瞭に画像化したが、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）および膀胱（Ｂｌａｄｄｅｒ）の排泄組織を除く他の組織への集積は観察されなかった。（実施例７）

本発明は、標的分子認識素子と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤、その製造方法、および前記放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子に関する。

用語「放射性ガリウム標識薬剤」は、放射性標識薬剤の１種であり、ガリウムの放射性核種により標識された化合物を含み、標的部位、例えば特定の組織や細胞の標識化に使用される薬剤を意味する。かかる薬剤は、疾患の診断や治療効果の経過観察など、例えばＳＰＥＣＴやＰＥＴなどを用いた分子イメージング技術による診断や治療効果の経過観察に使用される。ガリウムの放射性核種として、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａを好ましく例示できる。

用語「錯体」とは、金属および金属類似元素の原子またはイオンを中心にして、配位子が配位した物質を意味し、配位化合物ともいう。配位とは、配位子が中心の金属と配位結合を形成して中心金属の周囲に配列することをいう。錯体は、配位子と金属との配位結合により形成される。配位子と金属による錯体の形成を、錯形成と称することがある。配位結合とは、１本の結合にあずかる２個の原子価電子が、一方の原子のみから提供されている結合をいう。多配位とは、複数の配位子が中心の金属と配位結合を形成して中心金属の周囲に配列することをいう。ｎ配位とは、ｎ分子の配位子が中心の金属と配位結合を形成して中心金属の周囲に配列することをいう。金属が遷移金属である場合、ｎは一般的に２から９である。錯体において、中心金属の周囲に集まって配位結合をつくる配位子の数を配位数という。

用語「配位子」とは、錯体中で中心金属に配位結合している他の原子（配位原子）を含む化合物を意味する。配位子には多数の種類があり、２つ以上の可能な配位原子を含む化合物を多座配位子、１つである場合を単座配位子、２つである場合を２座配位子、３つである場合を３座配位子のように称する。

用語「標的分子認識素子」とは、標的分子に結合する化合物、好ましくは特異的に結合する化合物を意味する。標的分子に特異的に結合するとは、標的分子には結合するが、標的分子以外の分子には結合しないか、弱く結合することをいう。標的分子認識素子として、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、および抗体断片などを挙げることができる。標的分子認識素子と結合させた配位子と金属とで錯体を形成させることにより、該錯体を標的分子、すなわち標的部位に結合させることができる。したがって、標的分子認識素子を選択して用いることにより、所望の標的部位に錯体を集積させることができる。

本発明において、錯体を形成する金属は、配位子と２配位以上の配位結合を形成する金属、例えばガリウムが使用される。金属として、好ましくは金属放射性核種が使用される。金属放射性核種として具体的には、^６７Ｇａおよび^６８Ｇａを好ましく例示できる。金属放射性核種はこれら具体例に限定されず、放射標識薬剤を用いた診断や、がん疾患などの内部放射線治療などの目的に適当な放射線、放射線量、半減期を有する限りにおいていずれも使用することができる。診断および治療において正常の組織や細胞への影響を少なくするという観点から、短半減期金属放射性核種が好ましく使用される。

本発明において、錯体を形成する配位子は、金属と配位結合により多配位の錯体を形成し得る化合物であって、錯体を形成しない場合は速やかに崩壊する化合物が使用される。具体的には、配位子骨格内にシッフ塩基を有する化合物が好ましく例示できる。シッフ塩基は水溶液中でアミン、アルデヒドと平衡状態にあるため、シッフ塩基を有する配位子が錯体を形成していない時には分解されるが、錯形成することにより安定化し、錯形成した標識体のみが多価効果を示すと考えることができる（図１）。したがって、本発明に係る錯体は、その製造において大過剰の配位子を使用しても、錯体を形成していない配位子が速やかに配位座の数のより少ない配位子に崩壊し、錯体のみが多価効果を示すために、標的部位への集積性が従来製造されていた錯体と比較して高い。

配位子骨格にシッフ塩基を有する化合物として、トリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］を好ましく例示できる。配位子は特に限定されず、金属と多配位の錯体を形成する化合物である限りにおいていずれも使用することができる。

本発明において、標的分子認識素子として、タンパク質、ペプチド、抗体、および抗体断片を例示できる。具体的には、炎症や腫瘍細胞浸潤などに伴う組織構築において高い発現が認められるタンパク質や腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質に結合するリガンド、抗体および抗体のＦａｂ断片などを例示できる。より具体的には、がんの新生血管に高発現が認められるインテグリンに親和性を有する環状ペンタペプチド、例えばシクロ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ［配列表の配列番号１、ｃ（ＲＧＤｆＫ）と略称する］を挙げることができる。そのほか、造骨性のがん（骨転移）に多く存在するヒドロキシアパタイトへの親和性を有するビスフォスフォン酸やオリゴアスパラギン酸、オリゴグルタミン酸、マクロファージの表面に存在する走査因子の受容体と親和性があるペプチドであるｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、がん細胞に発現が認められる葉酸受容体と結合する葉酸とその誘導体などを例示できる。標的分子認識素子は、例示された化合物に限定されず、標的分子に結合する化合物であればいずれを使用することもできる。

標的分子認識素子と配位子とを結合させるとき、それらの間にスペーサーを介在させることができる。配位子が複数の標的分子認識素子を有する場合、該配位子と金属とで形成される錯体が多価効果を有効に示すためには、標的分子認識素子同士の間の距離が重要となる。標的分子認識素子同士の間の距離は、該標的分子認識素子の大きさにより異なる。例えば、α_ｖβ_３インテグリンを標的としたＲＧＤ結合薬剤の多価効果についての検討で、ＲＧＤペプチド間に２５〜３０ｂｏｎｄの距離が必要とされている。標的分子認識素子同士の間の距離は例示した距離に限定されず、使用する標的分子認識素子により適当な距離を選択する。このような距離を保つためにスペーサーの利用が有効である。スペーサーとして好ましく使用できる化合物として、ヘキサン酸などの直鎖飽和カルボン酸、アミノ酸数個からなるペプチド、複数のエチレングリコールからなるエチレングリコール鎖などを例示できる。より好ましくはヘキサン酸を例示できる。標的分子認識素子と配位子を結合させる方法は特に限定されないが、例えば、カルボン酸とアミノ基によるアミド結合や、ハロゲン化アルキルによるＮ−アルキル化により結合させることができる。

錯体の製造は、標的分子認識素子と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを配位子として用い、金属とインビトロで錯形成させることにより実施できる。

錯体の製造は、あるいは、標的分子認識素子と、配位子と、金属とを混合して標的分子認識素子と配位子とを結合させると同時に錯体を形成させることができる。例えば、６−アミノヘキサノアートｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒド（ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫ）と、２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］と、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａとをクエン酸溶液中で反応させることにより、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａの錯体を形成させることができる。錯形成反応は、放射性ガリウムとして^６７ＧａＣｌ_３を使用して酢酸緩衝液中あるいはクエン酸溶液中で実施することもできる。好ましい反応条件は、^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅを使用する場合、配位子濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭ程度、クエン酸濃度が１〜１０ｍＭ程度、ｐＨ４〜６、温度が８０〜１００℃、反応時間が１５〜６０分間である。放射性ガリウムとして^６７ＧａＣｌ_３を使用する場合、好ましい反応条件は、配位子濃度が０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ程度の０．１Ｍ酢酸緩衝液あるいは０．１ｍＭ〜１０ｍＭクエン酸溶液、ｐＨ３〜６、温度が室温から１００℃、反応時間が５〜３０分間である。

本発明に係る放射性標識薬剤として、ｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと^６７Ｇａまたは^６８Ｇａとから形成される錯体構造を有する錯体を含む放射性標識薬剤を例示できる。

本発明に係る放射性標識薬剤として、好ましくは、ｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）をヘキサン酸を介して結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと^６７Ｇａまたは^６８Ｇａとから形成される錯体構造［下式（Ｉ）］を有する錯体を含む放射性標識薬剤を好ましく例示できる。

上記式（Ｉ）で表される錯体において、Ｇａは^６７Ｇａまたは^６８Ｇａであり得る。

本発明に係る放射性標識薬剤として、より好ましくは、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫと、ＴＡＭＥｏｌと、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａとをクエン酸溶液中で反応させることにより形成された錯体を含む、放射性ガリウム標識薬剤を例示できる。

本発明に係る放射性標識薬剤は、標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と多配位の錯体を形成する配位子と該金属の放射性核種とから形成される錯体を有効成分とするものである。このような錯体は、標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と多配位の錯体を形成する配位子を含むため、配位子と同数の標的分子認識素子を有する。すなわち、このような錯体は複数の標的分子結合部位を有する。このように、標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と多配位の錯体を形成する配位子含み、その結果錯体中に配位子と同数の標的分子認識素子を有する錯体を多価錯体と称し、そして多価の錯体を有効成分として含む放射性標識薬剤を多価放射性標識薬剤と称する。例えば、標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と３配位の錯体を形成する配位子を含む錯体は、錯体中に３箇所の標的分子結合部位を有し、３価錯体と称する。また、標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と２配位の錯体を形成する配位子を含む錯体は、錯体中に２箇所の標的分子結合部位を有し、２価錯体と称する。標的分子認識素子と結合させた配位子であって金属と１配位の錯体を形成する配位子を含む錯体は、錯体中に１箇所の標的分子結合部位を有し、１価錯体と称する。

標的分子への結合部位を２箇所有する化合物（２価の化合物）は標的分子への結合部位を１箇所有する化合物（１価の化合物）に比べて標的分子との高い親和性や集積を示すことが知られている（非特許文献３）。標的分子へ結合する化合物として抗体を例にとると、２価のＩｇＧ抗体は、１価のＦａｂ断片よりも少なくとも５０〜１００倍、多価抗体のＩｇＭはＩｇＧの１０^４倍の抗原との結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）を有する。

このことから、多価錯体は１価錯体と比較して、標的分子との高い親和性や集積を示す。したがって、多価錯体を含む放射性標識薬剤は、標的部位に高い集積性を示す。

本発明に係る放射性標識薬剤は、放射性標識薬剤を用いた画像診断や、内部放射線治療に使用することができる。本発明に係る放射性標識薬剤は、がん疾患の診断や治療に好ましく使用されるが、適用疾患は特に限定されず、画像診断や内部放射線治療が適用される疾患であればいずれの疾患にも使用できる。診断や治療の対象となる標的の特性にしたがって、放射性標識薬剤の有効成分である錯体に結合させる標的分子認識素子を選択することにより、該標的の診断や治療が可能であり、本放射性標識薬剤は診断および治療の分野で広く使用できる。

本発明に係る放射性標識薬剤の投与経路として、静脈内投与あるいは動脈内投与を好ましく挙げることができる。投与経路はこれら経路に限定されず、本放射性標識薬剤の投与後、その作用が有効に発現し得る経路であればいずれも利用できる。

本発明に係る放射性標識薬剤の放射活性強度は、本標識薬剤を投与したことにより目的を達成し得る強度であり、かつ、被験者の放射線被爆が可能な限り低い臨床投与量である限りにおいて任意である。放射性強度は、放射性標識薬剤を使用する一般的な診断方法や治療方法で使用されている放射活性強度を参考にして決定できる。

本発明に係る放射性標識薬剤は、上記錯体を有効成分として含むほか、必要に応じて、１種類または２種類以上の医薬的に許容される担体（医薬用担体）を含むことができる。医薬用担体として、ｐＨを調整するための酸、塩基、緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤を例示できる。

本発明において、標的分子認識素子と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを含む薬剤と、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａを含む薬剤とを、別々の包装単位として含んでなるキットを提供できる。本発明に係るキットとして、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫを含む薬剤と、ＴＡＭＥｏｌを含む薬剤と、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａを含む薬剤とを、別々の包装単位として含んでなるキットを好ましく例示できる。^６７Ｇａまたは^６８Ｇａを含む薬剤は、好ましくは^６７Ｇａ溶液または^６８Ｇａ溶液であり、より好ましくはクエン酸^６７Ｇａや^６７ＧａＣｌ_３を、さらに好ましくはクエン酸^６７Ｇａを例示できる。キットに含まれる薬剤は、必要に応じて、上記のような１種類または２種類以上の医薬的に許容される担体（医薬用担体）を含むことができる。

本発明に係る放射性標識薬剤の有効成分である錯体は多価錯体であり、１価錯体と比較して、標的分子との高い親和性や集積を示す。したがって、本発明に係る多価錯体を含む放射性標識薬剤は、従来使用されていた１価錯体を含む放射性標識薬剤と比較して、標的部位に高い集積性を示し、そのため放射性標識薬剤を用いた画像診断において高い感度を提供できる。また、本発明に係る多価錯体を含む放射性標識薬剤は、生体内において十分な安定性を示す。

このように、本発明に係る多価錯体を含む放射性標識薬剤の使用により、標的部位への放射性錯体の集積を増加させることができ、その結果、放射性標識薬剤を用いた画像診断において高い感度を提供できる。例えば、本発明に係る放射性標識薬剤の有効成分である錯体は、がんの新生血管に高発現が認められるインテグリンに親和性を有する環状ペンタペプチドであるｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）を標的分子認識素子として複数有するため、１価錯体と比較して、標的部位であるがん新生血管への集積が増加する。また、この錯体は生体内において十分な安定性を示した。したがって、このような錯体を含む放射性標識薬剤は、がんの診断において高い感度を提供できる。

本発明に係る放射性標識薬剤はまた、従来の放射性ガリウム標識薬剤と比較して有用性が高い。従来の放射性ガリウム標識薬剤はその製造において大過剰の配位子を使用するために、そのまま使用すると錯体を形成していない配位子が標的部位に対して放射性標識薬剤と競合し、放射性標識薬剤の集積の低下を招き、その結果、分子イメージングにおける標的分子の画像化が妨げられていた。一方、本発明に係る放射性標識薬剤は、錯体を形成していない配位子が速やかに配位座の数のより少ない配位子に崩壊し、錯体のみが多価効果を示すために、その製造において大過剰の配位子を使用しても標的部位への集積性が高く、分子イメージング技術による診断や治療経過の観察を容易にする。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

標的部位に効率的に集積し、かつ、生体内での高い安定性を有する放射性ガリウム標識薬剤の製造を目的とし、Ｇａと錯形成するときは６座配位子であるが、錯形成後残存した配位子が速やかにｎ座配位子（ｎ＝１−５）に崩壊するという薬剤設計考案した。そして、シッフ塩基が水溶液中でアミン、アルデヒドと平衡状態にあることに注目し、シッフ塩基を有する配位子が錯体を形成していない時には分解されるが、錯形成することにより安定化すると考え（図１）、モデル配位子として配位子骨格にシッフ塩基を有するＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを用い、Ｇａとの錯体Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを製造し、本薬剤設計の基礎評価を行った。次いで、標的分子認識素子として、悪性腫瘍などの新生血管に高密度に発現することが知られているα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する環状ペンタペプチドであるｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）を、Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌのベンゼン環にヘキサン酸を介して結合したＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌを作製し、そのアポトランスフェリン中での安定性およびα_ｖβ_３インテグリンに対する親和性を検討した。さらに、担癌モデルマウスを用いてＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの標的部位への特異的な集積性をインビボで検討した。

（機器と試薬）
ガリウム−６７（^６７Ｇａ）は［^６７Ｇａ］Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ（富士フイルムＲＩファーマ株式会社、トウキョウ、ニッポン）を用いた。ＨＰＬＣによる分析は、ＵＶ検出器Ｌ−７４０５、ポンプＬ−７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ製）を使用して行った。ＲＴ−ＨＰＬＣカラムは５Ｃ_１８−ＡＲ−３００カラム（４．６×１５０ｍｍ、ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ製、キョウト、ニッポン）を用い、流速１ｍＬ／分でミリＱ水（ｍｉｌｌｉＱ水、Ａ相）とメタノール（Ｂ相）を５０：５０から０：１００まで１５分で変化させる直線グラジエント法（システム１）、あるいはＡ相：Ｂ相を９０：１０から４０：６０まで３０分で変化させる直線グラジエント法（システム２）、さらに、ＴＳＫｇｅｌＴＭＳ２５０（４．６×７５ｍｍＴＯＳＯＨ、トウキョウ、ニッポン）を用いて、流速０．８ｍＬ／分で０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＮＯ_３−バッファーｐＨ７．０（Ｃ相）とアセトニトリル（Ｄ相）を９５：５で溶出した（システム３）。溶出液はフラクションコレクター（ＲｅｄｉＦｒａｃ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、トウキョウ）を用いて３０秒毎に分取した。放射活性はオートウェルガンマカウンター（ＡＲＣ−３８０Ｍ、アロカ、トウキョウ）を用いて計測した。また、ＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳによる分析は、ＨＰＬＣ溶出液をＩＣＰ−ＭＳＨＰ４５００（アジレント、トウキョウ）にオンラインで接続し分析した。順相薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）には、シリカゲルプレート（メルクシリカゲル６０Ｆ_２５４、日本メルク、トウキョウ）を、逆相薄層クロマトグラフィー（ＲＰ−ＴＬＣ）には逆相シリカゲルプレート（メルクシリカゲル６０−ＲＰ−１８Ｆ_２５４Ｓ、日本メルク、トウキョウ）を用い、展開溶媒としてメタノール（システム４）あるいは０．１Ｍ酢酸アンモニウム：メタノール＝１：１を用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳおよびＦＡＢ−ＭＳによる分析はそれぞれＪＥＯＬＪＮＭ−ＡＬＰＨＡ４００スペクトロメータ（ＪＥＯＬ社、トウキョウ）およびアジレント６１００ＡＪＥＯＬＪＭＳ−ＡＸ５０５マススペクトロメータ（ＪＥＯＬ社、トウキョウ）を使用して行った。^１２５Ｉ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（^１２５Ｉ−ＲＧＤｙＶ）および^{１８５／１８７}Ｒｅ−ＴＭＥＣ−［Ｎ−ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）］_２は以前に報告した方法（特許文献１）に従って合成した。その他の試薬は特級試薬を購入し、そのまま使用した。

（配位子の合成）
Ｇａと錯形成するときは６座配位子であるが、錯形成後残存した配位子が速やかにｎ座配位子（ｎ＝１−５）に崩壊するという薬剤設計を基に、配位子の骨格内にシッフ塩基を有するＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを合成した。

１．トリサリチルアルジミノメチルエタノール［Ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］の合成

Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの合成法を化学反応式１に示す。

（化学反応式１）

１−１．ペンタエリトリトールトリアジド（Ｐｅｎｔａ−ｅｒｉｔｈｏｒｉｔｏｌ−ｔｒｉ−ａｚｉｄｅ）の合成
ペンタエリトリトールトリブロミン（Ｐｅｎｔａ−ｅｒｉｔｈｏｒｉｔｏｌ−ｔｒｉ−ｂｒｏｍｉｎ）２ｇ（６．１７ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム４．７ｇ（７２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）３５ｍＬに溶解し、窒素雰囲気下８０℃で２４時間攪拌した。溶媒を減圧除去した後、残渣をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）３０ｍＬに溶解し、ミリＱ水（ｍｉｌｌｉＱ水）２０ｍＬで２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残渣をヘキサン：酢酸エチル（３：１）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、ペンタエリトリトールトリアジドを無色透明油状物として得た（収量１．１０ｇ；収率８４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：^ＴＭ３．３４（ｓ，６Ｈ，ＣＨ_２）、３．４９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）、ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１２［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：２１２．

１−２．２，２’，’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］の合成
ペンタエリトリトールトリアジド１．１０ｇ（５．２ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）１．００ｇにメタノール１０ｍＬを加え、水素雰囲気下４時間攪拌した。セライトろ過した後、溶液を減圧除去し、ＴＡＭＥｏｌを無色透明オイルとして得た。この化合物は精製をすることなく次の反応に用いた（収量１７７ｍｇ；収率２５．６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ２．６１（ｓ，６Ｈ，ＣＨ_２）、３．４６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：１３４．

１−３．トリサリチルアルジミノメチルエタノール［Ｈ _３（ｓａｌ） _３ＴＡＭＥｏｌ］の合成
ＴＡＭＥｏｌ１７０ｍｇ（１．２７ｍｍｏｌ）とサリチルアルデヒド（ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ）４８９ｍｇ（４ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解した。一晩室温で静置し、溶媒を減圧濃縮し黄色結晶を得た。結晶を最少量のメタノールに溶解し、再結晶することでＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを黄色結晶として得た（収量８３ｍｇ；収率１４．６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ３．７２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ_２），３．７５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），６．８９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ），６．９７（ｄ，３Ｈ，ＣＨ），７．２５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ），７．３４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ），８．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ＝Ｎ），ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４６［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：４４６．

（配位子の合成）
Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを基本骨格とし、かつ、標的分子認識素子としてｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）を有する配位子Ｈ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの合成を試みた。Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの各サリチルアルデヒドに標的分子認識素子を結合することで、３価の標識体が得られる。標的分子への結合部位を複数有する多価薬剤の親和性には、それぞれの結合部位同士の距離が重要となる。実際、α_ｖβ_３インテグリンを標的としたＲＧＤ結合薬剤の多価効果についての検討で、ＲＧＤペプチド間に２５〜３０ｂｏｎｄの距離が必要とされている。そこでＲＧＤと配位子のスペーサーとしてヘキサン酸を選択して、Ｈ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの合成を試みた。

まず、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫの合成を行った。アルデヒド基の保護基として当初アセタールを試みたが、導入時の酸触媒により、カルボン酸とのエステルの生成が確認され、精製が困難であった。そこで、アミンとアルデヒドとの縮合によりシッフ塩基をつくり、これを保護基として用いた。スペーサーを結合させたｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）との縮合後、ペプチドの脱保護およびシッフ塩基の加水分解を同時に行い、ＲＴ−ＨＰＬＣにより精製することでｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫを７工程で合成した。

２．ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒド（ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫ）の合成

ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫの合成は、具体的には、パラヒドロキシ安息香酸（ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）を出発物質として用いて、ダフ反応（Ｄｕｆｆｒｅａｃｔｉｏｎ）によりアルデヒド基を導入し、次いでアミンとの縮合によりシッフ塩基（ｓｈｉｆｆｂａｓｅ）を作りアルデヒドを保護することにより行った（化学反応式２）。

（化学反応式２）

２−１．３−ホルミル−４−ヒドロキシ安息香酸（３−Ｆｏｒｍｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）の合成
パラヒドロキシ安息香酸５．０ｇ（３６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、ＴＦＡ）１３ｍＬに懸濁させ、ＴＦＡ１５ｍＬに溶解したヘキサメチレンテトラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｔｅｔｒａｍｉｎｅ）５．１ｇ（３６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下室温で滴下した。原料が消失するまで７０℃で還流した後、室温下４ＮＨＣｌ１００ｍＬを加えた。３時間攪拌後、黄色の析出物をろ取し、３００ｍＬのミリＱ水で洗浄することにより目的物を得た（収量２．１ｇ；収率３５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）７．０１（ｄ，１Ｈ，Ａｒｉｌ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ａｒｉｌ），８．３８（ｓ，１Ｈ，Ａｒｉｌ），１０．１１（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ）．

２−２．４−ヒドロキシ−３−［（２−ヒドロキシフェニルイミノ）メスチル］安息香酸｛４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｎｏ）−ｍｅｔｈｔｙｌ］−ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ｝の合成
３−ホルミル−４−ヒドロキシ安息香酸５００ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）とオルトアミノフェノール（ｏ−ａｍｉｎｏ−ｐｈｅｎｏｌ）３２８ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）に溶解した。７０℃で５分間還流後室温まで冷却し、析出した赤褐色結晶をろ取することで目的物を得た（収量２４０ｍｇ；収率３１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））６．９０（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），６．９６（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ），７．１２（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），７．４３（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），７．９１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）８．２４（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）９．１０（ｓ，１Ｈ，ＣＨ＝Ｎ）．ＥＳＩ−Ｍ（ｍ／ｚ）：２５６［（Ｍ−Ｈ）⁻］；Ｆｏｕｎｄ：２５６．

２−３．Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸（Ｆｍｏｃ−６−Ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄ）の合成
６−アミノヘキサン酸（６−Ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄ）２．５ｇ（１９ｍｍｏｌ）を水３８ｍＬに溶解させ、１０％ＮａＨＣＯ_３溶液３８ｍＬを加え攪拌した。その後、ジオキサン３８ｍＬに溶解したＦｍｏｃ−Ｃｌ３．１ｇ（２１ｍｍｏｌ）を先の溶液に０℃でゆっくりと滴下した。室温で４８時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、２ＮＨＣｌ３０ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルム−メタノール（４０：１）を溶出溶媒とするシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的化合物を白色結晶として得た（収量１．６１ｇ；収率２４％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：３５４．

２−４．Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサノアート−ｃ［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ］の合成
Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸３２４ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、ｃｙｃｌｏ［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ］８３８ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、（ＨＯＢｔ）１５６ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ４３．７ｍＬに溶解した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｏｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＷＳＣＩ］１９４ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（３２．８ｍＬ）溶液を氷冷攪拌下ゆっくりと滴下し、室温で二晩攪拌した。溶媒を減圧留去後、残渣をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、５％クエン酸（３０ｍＬ）、ブリン（３０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）、ブリン（３０ｍＬ）、そして５％クエン酸（３０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣に少量のジエチルエーテル（Ｅｔ_２Ｏ）を加え、析出した薄黄色の結晶を粗生成物として得た。クロロホルム−メタノール（１０：１）を溶出溶媒とするシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的化合物を灰白色の結晶として得た（収量７０５．４ｍｇ；収率６１．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１２４７［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：１２４７．

２−５．６−アミノヘキサノアート−ｃ［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ］［ｈｘ−ｃ（Ｒ（Ｐｂｆ）ＧＤ（ＯｔＢｕ）ｆＫ］の合成
Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサノアート−ｃ［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ］６９７．５ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を５％ピペリジン／ＤＭＦ溶液４６．５ｍＬに溶解し、室温で１０分間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をノルマルヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）（１００ｍＬ）およびＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄することにより目的とする灰白色結晶を得た（収量５７８．２ｍｇ；収率１００％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０２５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：１０２５．

２−６．ｈｘ−ｃ［Ｒ（Ｐｂｆ）ＧＤ（ＯｔＢｕ）ｆＫ］結合サリチルアルデヒド｛ｓａｌ−ｈｘ−ｃ［Ｒ（Ｐｂｆ）ＧＤ（ＯｔＢｕ）ｆＫ］｝の合成
４−ヒドロキシ−３−［（２−ヒドロキシフェニルイミノ）メスチル］安息香酸３１ｍｇ（１４６．４μｍｏｌ）、ｈｘ−ｃ［Ｒ（Ｐｂｆ）ＧＤ（ＯｔＢｕ）ｆＫ］１００ｍｇ（９７．６μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１５ｍｇ（１０．７μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ４４ｍＬに溶解した。乾燥ＤＭＦ４．４ｍＬに溶解したＷＳＣＩ／ＨＣｌ１９ｍｇ（１０．７μｍｏｌ）を氷冷攪拌下ゆっくり滴下した。室温で２日攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル５ｍＬおよび５％クエン酸５ｍＬで洗浄後、橙黄色の結晶を粗成生物として得た。これ以上の精製を行わず、次の反応に用いた（粗収量：９６．５ｍｇ；粗収率：７７％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１２６５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：１２６５．

２−７．ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒド（ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫ）の合成
Ｓａｌ−ｈｘ−ｃ［Ｒ（Ｐｂｆ）ＧＤ（ＯｔＢｕ）ｆＫ］７０ｍｇ（５５．４μｍｏｌ）をＴＦＡ：水＝９：１の溶液３０ｍＬに溶解し、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、残渣を水とアセトニトリル９：１溶液に溶解し、ＨＰＬＣ（システム１）で分取した（収量：１３．４８ｍｇ；収率：２８．９％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：８６５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：８６５．

ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫを用いて、ＴＡＭＥｏｌとの縮合を行い、Ｈ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの合成を試みたが目的物の合成は困難であった。これはペプチドが有機溶媒に難溶性であり、水溶液中で結合反応を行っているため、形成された配位子が安定に存在できないためと考えられた。そこで配位子Ｈ_３（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌを作製せず、ｃ（ＲＧＤｆＫ）（配列表の配列番号１）を標的分子認識素子として有する配位子とガリウムとの錯体の作製は、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫと、ＴＡＭＥｏｌと、ガリウムとを同時に混合して、配位子骨格の形成とガリウムとの錯形成を同時に行わせることにより実施した（後述３−２．および４−２．）。

（非放射性ガリウム錯体の合成）
Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌおよびＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの合成法を化学反応式３に示す。Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌはクエン酸ガリウム（Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ）との配位子交換反応により合成した。

（化学反応式３）

３−１．Ｇａ−（ｓａｌ） _３ＴＡＭＥｏｌの合成
Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ１２．８ｍｇ（２８．９μｍｏｌ）とガリウム−アセチルアセトナート（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）１０．５ｍｇ（２８．６μｍｏｌ）をエタノール８．５ｍＬに溶解し、８０℃で１２時間還流した。析出した淡黄色結晶を濾取し、目的とするガリウム錯体を得た（収量８ｍｇ；収率５４％）。ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；Ｆｏｕｎｄ：５１０．

３−２．Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ） _３ＴＡＭＥｏｌの合成
ＴＡＭＥｏｌ０．０３３ｍｇ（２５０ｎｍｏｌ）、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫ０．８６ｍｇ（１μｍｏｌ）をミリＱ水１２０μＬに溶解した。ＧａＣｌ_３３４ｍｇ（１９６μｍｏｌ）を０．１Ｎクエン酸三ナトリウム溶液４ｍＬに溶解し、０．２ＮＮａＯＨ溶液でｐＨ６〜６．５に調整した溶液５μＬを先の溶液に加え、８０℃で１時間加熱した。室温まで冷却した後、ＲＴ−ＨＰＬＣ（システム３）により精製し、目的とする錯体を得た（収量０．１ｍｇ；収率１４．４％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３７０［（Ｍ＋２Ｈ）^２＋］，９１４［（Ｍ＋３Ｈ）^３＋］；Ｆｏｕｎｄ：１３７０（ｍ／２ｚ），９１４（ｍ／３ｚ）．

Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌはクロロホルムや酢酸エチルをはじめとするほとんどの有機溶媒に難溶性で、加熱したＤＭＳＯにのみ多少溶解した。

［放射性ガリウム（^６７Ｇａ）標識］
４−１． ^６７Ｇａ−（ｓａｌ） _３ＴＡＭＥｏｌの作製
Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ０．５ｍｇを１．１２ｍＬのエタノールに溶解した。本溶液２０μＬに^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ溶液を２０μＬ加え、８０℃で１５分間加熱した。放射化学的収率はＴＬＣ（システム４）により求めた。

４−２． ^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ） _３ＴＡＭＥｏｌの作製
２ｍＭｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫと０．５７ｍＭＴＡＭＥｏｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液２０μＬに^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅ溶液４０μＬを加え、８０℃で１時間加熱した。放射化学的純度はＴＬＣ（システム５）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（システム３）により求めた。

［^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの形成の確認］
^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌは、上記のように^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅとＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌとの配位子交換反応により、最終濃度５×１０^−４Ｍにおいて放射化学的収率９５％以上で得られた。

^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの形成の確認を、ＲＴ−ＨＰＬＣにおける^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間をＧａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間と比較することにより行った。Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの非放射性ガリウム錯体は難溶性であり、ＲＴ−ＨＰＬＣ装置に付随したＵＶ検出装置で検出できる量の溶解度を有していなかったため、非放射性ガリウム錯体の保持時間はＩＣＰ−ＭＳにより求めた。ＴＳＫｇｅｌＴＭＳ２５０カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ分析において、非放射性Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間と^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ錯体の保持時間（５．５分）が一致した（図２）。また、ＴＬＣ（システム４）を用いた分析においても同様のＲｆ値（順相：０．５５、逆相：０．７９）に放射活性とＵＶ吸収を観察した。このように、^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間がＧａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間と類似したことから、^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの形成を確認した。

［^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの形成の確認］
^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌは、上記のようにｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫとＴＡＭＥｏｌを混合した溶液に^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅを加えて加熱することにより合成した。本合成方法では、ガリウムの配位した錯体は三価錯体として安定に存在するが，ガリウムが配位しないものは一価配位子のまま存在すると考えられる。そこで、ＲＴ−ＨＰＬＣでの分析および質量分析により構造を確認した非放射性ガリウム錯体Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのＲＴ−ＨＰＬＣにおける保持時間と放射性ガリウム錯体の保持時間とを比較することにより、^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの形成の確認を行った。

ＲＰ−ＨＰＬＣ（システム２）分析において、^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの保持時間はＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのものと一致した（２８．５分）（図３のパネルＡおよびＢ）。ＵＶによる分析では、主なＵＶ吸収はｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫおよび^６７Ｇａ−ｃｉｔｒａｔｅに含まれるベンジルアルコールであり（それぞれ２６分および１５分）、Ｈ_３−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌやＨ_２−（ＲＧＤ−ｈｘ）_２ＴＡＭＥｏｌなどのガリウムを含まない多価配位子のＵＶ吸収は観察されなかった（図３のパネルＣ）。このことから、本合成方法の産物には^６７Ｇａ錯体のみが三価体として存在していると考えることができる。

^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌは、最終濃度６．６７×１０^−４Ｍにおいて放射化学的収率９５％以上で得られた。

Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ、^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ、および^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの安定性の評価を行った。

［Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの水溶液中での安定性の評価］
配位子であるＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの安定性の評価を行った。Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを１ｍＭ／エタノール溶液として３７℃で１時間インキュベーションした。また、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの１ｍＭ／エタノール溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３倍に希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。両溶液をＲＰ−ＨＰＣＬ（システム３）により分析し、分解で生じるサリチルアルデヒドの量を比較した。

Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌは、エタノール溶液中では安定であったが、リン酸緩衝液中では保持時間５分のサリチルアルデヒドのピークが主に観察された（図４）。このことから、リン酸緩衝液で希釈することによりＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌは、速やかにサリチルアルデヒドとＴＡＭＥｏｌに崩壊することが明らかになった。

また、^６７Ｇａ標識した後のＲＴ−ＨＰＬＣ分析においても、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの残存量は僅かであった。

これらの結果は、錯形成後残存した配位子が速やかに２座配位子に分解することを示す。

（ガリウム錯体のアポトランスフェリン中での安定性の評価）
^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの安定性を評価するために、アポトランスフェリンに対する安定性を評価した。Ｇａは鉄イオンと似た性質をもち、炭酸イオン存在下では血漿タンパク質であるトランスフェリンと結合する。そのため、不安定なＧａ錯体は血漿中で分解し、トランスフェリンと結合後、肝臓などへ運ばれる。ＲＴ−ＨＰＬＣで精製した^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌの炭酸イオン存在下におけるアポトランスフェリンに対する安定性を検討した。

具体的には、次のように評価を実施した。まず、ＲＰ−ＨＰＬＣ（システム２）により過剰のｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫを除去し、精製した^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌを０．１Ｍ炭酸バッファー（ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４）に溶解した。本溶液１００μＬにアポトランスフェリン１．０４ｍｇを１５０μＬの０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ７．４）に溶解した溶液を加え、３７℃で１、３、６時間インキュベーションし、ＴＬＣ（システム４、５）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（システム３）で未反応の割合を求めた。

^６７Ｇａ−（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌはアポトランスフェリン溶液中において６時間後まで安定に存在した（図５）。

これらの結果は、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが、Ｇａと錯形成した場合は安定であり、錯形成後残存した場合は速やかに２座配位子に崩壊するという所期の目的を満たした配位子であることを示す。

本配位子の各サリチルアルデヒドに標的分子認識素子ｃ（ＲＧＤｆＫ）を有し、Ｇａと錯形成した錯体、^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌを作製し、同様に安定性の検討を行った。

^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌも６時間後まで安定に存在した（図６）。従って、パラ位に標的分子認識素子の導入を行っても錯体の安定性に影響はないと考えられた。

以上の結果より、ＴＡＭＥｏｌは標的分子認識素子としてペプチドを導入しても高い安定性を有し、錯形成により生じたＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのみが三価として安定に存在し、錯形成を行わなかったものは、加水分解により、一価体となるという所期の目的に適した化合物であると考えられる。

^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのα_ｖβ_３インテグリンに対する親和性を検討した。

［固相α_ｖβ_３結合アッセイ（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ α_ｖβ_３ｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ）］
標的分子認識素子を３個有する３価の放射性ガリウム錯体^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌの標的分子α_ｖβ_３インテグリンへの結合親和性を、^１２５Ｉ−ＲＧＤｙＶとの競合的結合アッセイにより検討した。対照化合物として、環状ペンタペプチドであり１価化合物であるｃ（ＲＧＤｙＶ）（配列番号２）および２価化合物である^{１８５／１８７}Ｒｅ−ＴＭＥＣ−［Ｎ−ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）］_２（特許文献２）を使用した。

具体的には、次のように評価を実施した。イムノロックウェルモジュール（マキシソープ、Ｎａｌｇｅ−ＮｕｎｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＫ．Ｋ．、トウキョウ）プレートに、ヒト精製α_ｖβ_３インテグリン（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のコーティングバッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ_２、０．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＭｎＣｌ_２）溶液（６００ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、４℃で一晩コーティングした。ウエルをバインディングバッファー（０．１％ＢＳＡ／コーティングバッファー）２００μＬで２回洗浄した。各ウエルを２時間ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ／コーティングバッファー）２００μＬでブロッキングした後、各ウエルをバインディングバッファー２００μＬで２回洗浄した。バインディングバッファーに溶解した^１２５Ｉ−ＲＧＤｙＶ溶液（９５μＬ、０．３μＣｉ）および各濃度（２ｎＭ、２０ｎＭ、０．２μＭ、２μＭ、２０μＭ、２００μＭ、２０００μＭ）の非放射性リガンドＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌ、^{１８５／１８７}Ｒｅ−ＴＭＥＣ−［Ｎ−ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）］_２およびｃ（ＲＧＤｙＶ）溶液５μＬを加えて最終濃度を１０^−１０、１０^−９、１０^−８、１０^−７、１０^−６、１０^−５、１０^−４Ｍとし、３７℃で１時間振とうした。ウエルをバインディングバッファー２００μＬで３回洗浄し、各ウエルの放射活性を測定した。

^１２５Ｉ−ＲＧＤｙＶとの競合的結合アッセイにおいてα_ｖβ_３インテグリンへの結合性を評価したところ、ｃ（ＲＧＤｙＶ）、^{１８５／１８７}Ｒｅ−ＴＭＥＣ−［Ｎ−ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）］_２、およびＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌのＩＣ_５０値はそれぞれ１１４±１３ｎＭ、４４．７±１３ｎＭ、および５．２６±０．３５ｎＭであった。Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌが最も低いＩＣ_５０値を示した。

このように、３価化合物であるＧａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３ＴＡＭＥｏｌは、α_ｖβ_３インテグリンへの結合能が、１価の化合物であるｃ（ＲＧＤｙＶ）（配列番号２）や２価化合物である^{１８５／１８７}Ｒｅ−ＴＭＥＣ−［Ｎ−ｈｘ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）］_２（特許文献２）よりも高いことが判明した。

これらの結果は、ｓａｌ−ｈｘ−ＲＧＤｆＫとＴＡＭＥｏｌとからなる配位子は、Ｇａと錯形成することで、親和性の高い３価の錯体となる一方、未反応の配位子は親和性の低い一価のままであることを示す。

ｃ（ＲＧＤｆＫ）を標的分子認識素子として用いた以上の検討から、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌはガリウムと錯形成を行ったもののみが三価体として安定に存在し、錯形成を行わなかったものは加水分解により一価となり、多価効果により親和性に差が生じることが明らかになった。このように、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ、および標的分子認識素子を有するＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌは、標的部位への集積を向上する新たな放射性ガリウムの標識薬剤の設計に有用である。

腫瘍の画像診断における^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３−ＴＡＭＥｏｌの効果と、副作用である他組織への集積の程度を、担癌モデルマウスを用いて検討した。

具体的には、ヒトグリオーマ細胞、Ｕ８７ＭＧを移植した担癌マウスに^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３−ＴＡＭＥｏｌ（６．４ＭＢｑ、０．４ｍＭ、１００μＬ）を投与し、投与１時間後に小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置にて撮像した。撮像は、５穴マルチピンホールコリメータを装着したＦＸ−３２００小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置（ＧａｍｍａＭｅｄｉｃａ社製）を用い、６０ｓ／ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ、ＲＯＲ４５ｍｍの条件により撮像した。撮像中、マウスは１．３％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）により麻酔を行った。

図７に示すように、^６７Ｇａ−（ＲＧＤ−ｈｘ）_３−ＴＡＭＥｏｌは、左足に移植した腫瘍を明瞭に画像化した。一方、他の組織へのその集積は、腎臓および膀胱の排泄組織以外では観察されなかった。

本結果から、標的分子認識素子を有するＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと放射性ガリウムとから形成される錯体構造を有する錯体は、標的部位に特異的に集積し、画像診断で標的部位を明瞭に画像化できること、および排泄組織以外の他の組織に集積するという副作用を示さないことが、インビボにおいて明らかになった。

以上説明したとおり、本発明は、標的分子認識素子と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌと、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤を提供できる。

本発明に係る放射性ガリウム標識薬剤は、錯体を形成していない配位子が速やかに配位座の数のより少ない配位子に崩壊し、ガリウム錯体のみが多価効果を示すために、標的部位への集積性が高く、また、安定性も高いため、疾患の診断や治療効果の経過観察など、例えばＳＰＥＣＴやＰＥＴなどを用いた分子イメージング技術による診断や治療効果の経過観察などに有用である。

配列番号１：第１０フィブロネクチンタイプＩＩＩ反復領域に由来する環状ペプチド。
配列番号２：環状ペプチド。

Claims

標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とから形成される錯体構造を有する錯体を含み、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤。
標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが、配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドと結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌである請求項１に記載の放射性ガリウム標識薬剤。
６−アミノヘキサノアートｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒドと、２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とをクエン酸溶液中で反応させることにより形成された錯体を含む、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤。
診断用放射性標識薬剤である請求項１から３のいずれか１項に記載の放射性ガリウム標識薬剤。
標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］からなる、標的部位への集積性が増加した診断用放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
標的分子に結合する化合物とサリチルアルデヒドとを有する化合物および２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］をインビトロで反応させることにより形成される化学構造を有する化合物からなる、標的部位への集積性が増加した放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
標的分子に結合する化合物が配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドである請求項５または６に記載の放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子。
請求項５から７のいずれか１項に記載の放射性ガリウム標識薬剤の調製用配位子を含む薬剤と、ガリウム６７またはガリウム６８を含む薬剤とを、別々の包装単位として含んでなるキット。
６−アミノヘキサノアートｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒドと、２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とを、別々の包装単位として含んでなるキット。
標的分子に結合する化合物と結合させたトリサリチルアルジミノメチルエタノール［ｔｒｉ−ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌ、Ｈ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌ］を配位子として用い、ガリウム６７またはガリウム６８とインビトロで錯形成させることを含む放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。
標的分子に結合する化合物と結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌが、配列表の配列番号１に示す環状ペンタペプチドと結合させたＨ_３（ｓａｌ）_３ＴＡＭＥｏｌである請求項１０に記載の放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。
６−アミノヘキサノアート−ｃ（ＲＧＤｆＫ）結合サリチルアルデヒドと、２，２’，２’’−トリ（アミノメチル）エタノール［２，２’，２’’−ｔｒｉ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｅｔｈａｎｏｌ、ＴＡＭＥｏｌ］と、ガリウム６７またはガリウム６８とをクエン酸溶液中で反応させることを含む、標的部位への集積性および安定性が増加した放射性ガリウム標識薬剤の製造方法。