KR20180118658A - 방사성 표지 약제 - Google Patents

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KR20180118658A
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야스시 아라노
도모야 우에하라
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고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠
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Abstract

신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감할 수 있는 방사성 표지 약제가 얻어지는 화합물 등에 관한 것이다. 〔1〕식(1)로 표시되는 화합물 등,〔2〕상기〔1〕에 기재된 화합물 등에, 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물 등 ,〔3〕방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물 등을 가지는 금속 착체 화합물 등,〔4〕상기〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물 등을 포함하는 방사성 표지 약제의 조제용 약제,〔5〕상기〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물 등의 방사성 표지 약제의 제조를 위한 사용,〔6〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물 등을 포함하는 방사성 표지 약제, 및〔7〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물 등을 포함하는 방사선 화상 진단약.

Description

방사성 표지 약제
본 발명은 신규 화합물, 이것을 포함하는 방사성 표지 약제, 및 상기 방사성 표지 약제의 조제용 약제 등에 관한 것이다.
방사성 표지 약제를 이용하여, 단일 광자 방사 단층 촬영(Single Photon Emission Computed Tomography, 이하 간단하게 「SPECT」라고도 말함), 양전자 방사 단층 촬영(Positron Emission Tomography, 이하 간단하게 「PET」라고도 말함) 등의 방사선 화상(畵像) 진단을 하고 있다. 이들 방사선 화상 진단에는 여러가지 방사성 핵종이 사용되지만, 그 중에서도 방사성 갈륨은 SPECT에는 갈륨-67(67Ga)이 사용되고, PET에는 갈륨-68(68Ga)을 사용할 수 있으며, 어느 장치에도 대응 가능하다. 특히, 68Ga은 게르마늄-68을 이용한 제너레이터로부터 용출할 수 있는 점으로부터, 최근 주목받고 있다. 68Ga의 반감기는 68분으로 짧기 때문에, 혈액 클리어런스가 빠른 저분자화 항체 등의 분자량이 작은 펩티드를 표지 모체로서 사용한다. 그렇지만 방사성 동위체(RI) 표지 저분자 펩티드를 생체에 투여하면, 표적 조직에 대한 특이적인 집적 외에 신장에 대한 비특이적인 집적이 관찰된다. 이 경우, 신장에 가까운 표적 조직에 대한 화상화를 곤란하게 한다. 신장에 대한 방사 활성의 집적(이하 「신장 집적」이라고도 말함)은 RI 표지 저분자 펩티드가 신장에 도입된 후, 리소좀으로 운반되어 대사된 후에 생성되는 방사성 대사물이 신장에 잔존하는 것에 기인한다.
이 문제에 대해서, 비특허문헌 1에 기재된 방사성 갈륨 표지 약제에서는 67Ga-NOTA-Bn-Met(명세서 중의 식 참조)가 신장 리소좀 분획(畵分)으로부터 소변 중으로 배설되는 것을 이용해, 방사성 갈륨 표지 항체 프래그먼트가 신장 조직에 도입된 후, 리소좀 내에서 67Ga-NOTA-Bn-Met를 유리함으로써, 종래법에 비해, 신장 집적을 유의하게 저감하고 있다.
Bioconjugate Chem., 2014, 25, 2038 - 2045.
68Ga의 반감기는 68분으로 짧은 점으로부터, 투여 후 조기에 신장에 대한 집적을 저감하는 것이 바람직하다. 상술한 방법에서는 지금까지의 표지 방법에 비해, 투여 후 1시간부터 후에 대해서 신장의 방사 활성을 유의하게 저감하고 있지만, 투여 후 1시간 이전의 투여 조기에는 저감되어 있지 않다.
그래서 본 발명은 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감할 수 있는 방사성 표지 약제가 얻어지는 화합물 등에 관한 것이다.
본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.
〔1〕하기 식(1)로 표시되는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
[화 1]
Figure pct00001
〔식 중,
A1은 아미노산 잔기이며,
m은 0~3의 정수이며,
A2는 측쇄에 아미노기 또는 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기이며,
A3은 아미노산 잔기이며,
n은 0~3의 정수이며,
R1은 A2의 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기와 결합하고, 폴리펩티드 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기를 가지는 기이며,
R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이다.
다만, R1은 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 탄소수 3~10의 복소환기를 형성하고 있어도 된다.〕
〔2〕상기〔1〕에 기재된 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염에, 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
〔3〕방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 가지는 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
〔4〕상기〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 방사성 표지 약제의 조제용 약제.
〔5〕상기〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 방사성 표지 약제의 제조를 위한 사용.
〔6〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 방사성 표지 약제.
〔7〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 방사선 화상 진단약.
〔8〕상기 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염이 방사성 표지 약제의 조제용인 상기〔1〕또는〔2〕에 기재된 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
〔9〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 방사성 표지 약제의 제조를 위한 사용.
〔10〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 방사선 화상 진단을 위한 사용.
〔11〕상기〔3〕에 기재된 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 투여하는 방사선 화상 진단 방법.
〔12〕상기〔1〕에 기재된 화합물 혹은 이의 약리학적으로 허용가능한 염, 또는 상기〔1〕에 기재된 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염에, 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염과, 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속을 포함하는 약제를 다른 포장 단위로서 포함하는 키트.
본 발명에 의하면, 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감할 수 있는 방사성 표지 약제가 얻어지는 화합물 등을 제공할 수 있다.
도 1은 방사성 금속 표지 Fab의 마우스 혈장 중 안정성의 검토의 결과를 나타낸다.
도 2는 (a) 신장 방사 활성(신장에서의 시간-방사선량 곡선) 및 (b) 방사 활성의 신장 혈액비의 경시 변화를 나타낸다.
도 3은 (a) 67Ga-NOTA-MVK-Fab, (b) 67Ga-NOTA-MI-Fab, (c) 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 투여 6시간 후까지의 소변 중 방사 활성의 SE-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 (a) 67Ga-NOTA-MVK-Fab, (b) 67Ga-NOTA-MI-Fab, (c) 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 투여 6시간 후까지의 소변 중 방사 활성의 RP-HPLC에 의한 분석, 및 (d) 67Ga-NOTA-Met 표품(標品), (e) 67Ga-NOTA-Lys 표품의 RP-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 종양 신장비를 나타낸다.
도 6은 각 67Ga 표지 Fab 용액을 SY 피하 종양 모델 마우스에 투여하고, 3시간 후의 SPECT/CT 화상이다.
도 7은 64Cu-NOTA-MVK-Fab (도면 중, 64Cu-MVK-Fab로 나타냄) 및 64Cu-NOTA-Fab(도면 중 64Cu-SCN-Fab로 나타냄)를 정상 마우스에 투여했을 때에 3시간 후의 PET 화상을 나타낸다.
［화합물 등］
＜화합물(1) 등＞
본 발명의 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염(이하, 간단하게 「화합물(1) 등」이라고도 말함)은 하기 식(1)로 표시된다.
[화 2]
Figure pct00002
〔식 중,
A1은 아미노산 잔기이며,
m은 0~3의 정수이며,
A2는 측쇄에 아미노기 또는 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기이며,
A3은 아미노산 잔기이며,
n은 0~3의 정수이며,
R1은 A2의 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기와 결합하고, 표적 분자 인식 소자 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기를 가지는 기, 또는 A2의 측쇄의 아미노기 혹은 카르복시기의 수소 원자이며,
R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이다.
다만, R1은 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 탄소수 3~10의 복소환기를 형성하고 있어도 된다.〕
본 발명에 의하면, 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감할 수 있는 방사성 표지 약제가 얻어지는 화합물을 제공할 수 있다. 이와 같이 신장 집적이 낮다는 특징을 가지는 본 발명의 방사성 표지 약제는 방사선 화상 진단에서 복부의 백그라운드가 되는 방사능이 적기 때문에, 복부의 병소 부위의 검출·진단이 용이해진다. 또한, 본 발명의 방사성 표지 약제는 표적 분자 인식 소자를 가지기 때문에, 표적 부위에 특이적으로 결합할 수 있고, 그 때문에 표적 부위에 효율적으로 집적한다. 이러한 성질 때문에, 본 발명의 방사성 표지 약제는 방사선 화상 진단의 감도, 정밀도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 효과가 얻어지는 이유는 확실하지 않지만, 이하와 같이 생각된다. 또한 이하의 설명에서는 금속으로서 67Ga를 사용한 경우를 예를 들어 설명한다.
방사성 표지 약제의 투여 후, 해당 약제가 신장 세포에 도입될 때에, 효율적으로 소변 배설성의 방사성 대사물을 유리할 수 있으면, 신장에 대한 방사 활성의 집적을 저감할 수 있다고 생각된다. 방사성 대사물로서는 하기 67Ga-NOTA-Bn-Met가 상정된다.
[화 3]
Figure pct00003
비특허문헌 1의 방법에서는 지금까지의 표지 방법에 비해, 투여 후 1시간 이후에 대해서 신장의 방사 특성을 유의하게 저감하고 있지만, 투여 조기에는 저감되어 있지 않다. 이것은 방사성 갈륨 표지 약제가 신장 세포에 도입되고, 리소좀 분획까지 운반된 후에 67Ga-NOTA-Bn-Met가 유리하는 것에 기인한다고 생각된다.
방사성 표지 약제가 신장 세포에 도입될 때에, 효율적으로 67Ga-NOTA-Bn-Met를 유리할 수 있도록, 폴리펩티드와 67Ga-NOTA-Bn-Met의 사이에 신장 쇄자연막 효소의 기질 배열을 도입함으로써, 신장 세포에 도입되기 전에 67Ga-NOTA-Bn-Met가 폴리펩티드로부터 유리되어 신장에 대한 방사성 물질의 도입을 억제해 투여 조기에 신장에 대한 집적을 저감할 수 있는 것이라고 추측된다.
특히, 아미노산 배열의 카르복실 말단을 화학 수식하지 않음으로써 신장 쇄자연막 효소에 의한 67Ga-NOTA-Bn-Met의 유리가 촉진되어 본 발명의 효과가 얻어진 것이라고 추측된다.
본 발명의 화합물(1) 등은 식(1)에서, A1은 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감하는 관점으로부터, 바람직하게는 지용성 아미노산 잔기이며, 보다 바람직하게는 발린, 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌의 잔기이며, 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감하는 효과를 보다 현저하게 하는 관점으로부터, 더욱 바람직하게는 발린의 잔기이다.
또한 m은 0~3의 정수이며, 바람직하게는 1이다.
A2는 아미노산 배열의 측쇄에, 폴리펩티드 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기를 도입하는 관점으로부터, 측쇄에 아미노기 또는 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 리신, 오르니틴, 아르기닌, 아스파라긴산 또는 글루타민산의 잔기이며, 보다 바람직하게는 리신, 오르니틴 또는 아르기닌의 잔기이며, 더욱 바람직하게는 리신의 잔기이다.
또한 A3으로서 다른 아미노산 잔기를 가지고 있어도 된다. A3으로서는 임의의 아미노산이 이용된다.
n은 0~3의 정수이며, 바람직하게는 0이다.
R1은 표적 분자 인식 소자 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기를 가지는 기, 또는 A2의 측쇄의 아미노기 혹은 카르복시기의 수소 원자이며, A2의 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기와 결합한다. 다만, R1은 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 탄소수 3~10의 복소환기를 형성하고 있어도 된다.
R1은 스페이서로서 기능하며, 관능기를 통해서 폴리펩티드 등의 표적 분자 인식 소자를 본 발명의 화합물에 결합할 수 있다. R1은 A2의 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기와 결합함으로써, 아미노산 배열 말단을 화학 수식하지 않고, 본 발명의 화합물과 폴리펩티드를 결합할 수 있다.
R1은 측쇄의 아미노기의 질소 원자와 결합하고 있어도 되고, 측쇄의 카르복시기와 에스테르 결합을 형성하고 있어도 된다.
R1의 표적 분자 인식 소자 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 카르복시기 또는 이의 활성 에스테르; 말레이미드기, 아크릴로일기 등의 C=C 결합을 가지는 기; 카르바모일기, 이소티오시아네이트기, 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 관능기(이하 「관능기 a」라고도 말함)를 들 수 있다. 카르복시기의 활성 에스테르로서는 클로로아세틸기, 브로모아세틸기, 요오드아세틸기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 관능기 a는 C=C 결합을 가지는 기, 카르바모일기가 바람직하다.
R1의 총 탄소수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 바람직하게는 1 이상, 보다 바람직하게는 2 이상, 더욱 바람직하게는 3 이상이며, 그리고 바람직하게는 20 이하, 보다 바람직하게는 10 이하, 더욱 바람직하게는 8 이하이다.
R1으로서는, 예를 들면 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 아실기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬카르바모일기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬티오카르바모일기를 들 수 있다.
R1이 복소환기를 형성하는 경우, 복소환기는 말레이미드기가 바람직하다.
R1이 복소환기를 형성하는 경우, 복소환기의 탄소수는 바람직하게는 3~10, 보다 바람직하게는 3~5, 더욱 바람직하게는 4 또는 5이다.
R1은 A2의 측쇄의 아미노기 혹은 카르복시기의 수소 원자이어도 된다. 즉, A2의 아미노기 혹은 카르복시기는 수식되어 있지 않아도 된다.
R1 중에서도, 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 탄소수 3~10의 복소환기가 바람직하고, 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 말레이미드기가 보다 바람직하다.
R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이다.
R2의 탄화수소기는 특별히 한정되지 않지만, 보호기로서 이용되는 탄화수소기가 바람직하고, 예를 들면 메틸기, 에틸기, t-부틸기, 벤질기 등을 들 수 있다.
이들 R2 중에서도, 수소 원자가 바람직하다.
이상의 본 발명의 화합물(1) 중에서도, 하기 식(1a)로 표시되는 화합물이 바람직하다.
[화 4]
Figure pct00004
〔식 중, R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이며, R3은 수소 원자 또는 메틸기, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 아실기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬카르바모일기, 혹은 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬티오카르바모일기이다. 다만, R4 및 R5는 인접하는 질소 원자를 포함하는 복소환을 형성하고 있어도 되고, 그 경우, 식:
[화 5]
Figure pct00005
로 표시되는 기는 식:
[화 6]
Figure pct00006
로 표시되는 기이다.〕
R4, R5는 바람직하게는 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 아실기이며, 보다 바람직하게는 카르바모일기를 가지는 총 탄소수 3~6의 아실기이다. 카르바모일기를 가지는 총 탄소수 3~6의 아실기로서는, 예를 들면 식: ―C(=O)(CH2)a(=O)NH2〔식 중, a는 1~4의 정수이다.〕로 표시되는 기를 들 수 있다.
상기 본 발명의 화합물(1)의 바람직한 구체예로서, 하기의 화합물 1-1~화합물 1-4를 들 수 있다.
[화 7]
Figure pct00007
[화 8]
Figure pct00008
[화 9]
Figure pct00009
[화 10]
Figure pct00010
본 발명의 화합물(1) 등은 상기 화합물의 약리학적으로 허용되는 염이어도 된다.
약리학적으로 허용되는 염으로서는, 예를 들면 산 부가염, 염기 부가염을 들 수 있다.
산 부가염으로서는 무기산염, 유기산염 중 어느 것이어도 된다.
무기산염으로서는, 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 요오드화수소산염, 질산염, 인산염 등을 들 수 있다.
유기산염으로서는, 예를 들면 구연산염, 옥살산염, 아세트산염, 포름산염, 프로피온산염, 벤조산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 주석산염, 메탄술폰 산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.
염기 부가염으로서는 무기 염기염, 유기 염기염 중 어느 것이어도 된다.
무기 염기염으로서는, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
유기 염기염으로서는, 예를 들면 트리에틸암모늄염, 트리에탄올암모늄염, 피리디늄염, 디이소프로필암모늄염 등을 들 수 있다.
＜화합물(2) 등＞
본 발명의 화합물(2) 등은 화합물(1), 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염에, 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염이다. 표적 분자 인식 소자는 화합물(1), 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염에, 연결기를 통해서 결합하고 있어도 되고, 직접 결합하고 있어도 된다. 연결기로서는, 2-이미노티오란으로부터 유도되는 이미노티올을 들 수 있다.
〔표적 분자 인식 소자〕
「표적 분자 인식 소자」란, 생체 내에서, 표적 분자에 결합하는 등의 표적 분자를 인식 가능한 분자, 치환기, 관능기 또는 원자단이다.
표적 분자 인식 소자로서는, 예를 들면 폴리펩티드, 그 밖에, 표적 분자에 결합하는 리간드를 들 수 있다.
폴리펩티드는 통상 표적 분자에 결합하는 폴리펩티드이며, 바람직하게는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. 특이적으로 결합한다는 것은 표적 분자에 결합하지만, 표적 분자 이외의 분자에는 결합하지 않거나, 약한 결합인 것을 말한다.
표적 분자란, 방사성 표지 약제에 의한 진단의 대상이 되는 표적 부위, 예를 들면 조직이나 세포에 존재하는 분자, 바람직하게는 특이적으로 발현하는 분자를 말한다. 「특이적으로 발현한다」란, 표적 부위에 발현하지만, 표적 부위 이외의 부위에는 발현하지 않거나, 낮은 발현인 것을 말한다.
표적 분자 인식 소자로서는, 예를 들면 염증이나 종양 세포 침윤 등에 수반하는 조직 구축에서 높은 발현이 확인되는 단백질이나 종양 세포에 특이적으로 발현하는 단백질에 결합하는 리간드, 및 항체 및 항체의 항원 결합 영역 단편 등을 들 수 있다.
항체로서는, 예를 들면 항CD25 항체, 항CD20 항체 등의 단일 클론 항체를 들 수 있다.
항체의 항원 결합 영역 단편으로서는, 예를 들면 Fab 단편(이하 간단하게 「Fab」라고도 말함), F(ab')2 단편, F(ab)2 단편, 가변 영역 단편(이하, 「Fv 단편」이라고도 말함)을 들 수 있다.
Fab 단편이란, 항체의 파파인 분해에 의해 발생하는 N말단측의 산물 및 이것과 동일한 도메인 구조를 가지는 단편을 의미한다.
F(ab')2 단편이란, 항체의 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 환원함으로써 얻어지는 단편 및 이것과 동일한 도메인 구조를 가지는 단편을 의미한다.
F(ab)2 단편이란, 2 분자의 Fab 단편이 서로 디술피드 결합으로 결합한 2량체를 의미한다.
Fv 단편이란, 항체의 단편으로서 항원과의 결합 활성을 가지는 최소의 단편을 의미한다.
항체의 항원 결합 영역 단편으로서는, 보다 구체적으로는 특정한 암세포에 특이적으로 발현하는 단백질에 대한 항체, 및 이의 Fab 단편 혹은 Fv 단편을 들 수 있다.
그 밖의 표적 분자 인식 소자로서는 암의 신생 혈관에 고발현이 확인되는 인테그린에 친화성을 가지는 환상 펜타펩티드, 예를 들면 시클로-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(이하, 「c(RGDfK)」라고도 말함)를 들 수 있다. 그 밖에, 조골성의 암(골 전이)에 많이 존재하는 히드록시아파타이트에 대한 친화성을 가지는 비스포스폰산이나 올리고 아스파라긴산, 올리고 글루타민산, 마크로파지의 표면에 존재하는 주사 인자의 수용체와 친화성이 있는 펩티드인 fMet-Leu-Phe(fMLP), 암세포에 발현이 확인되는 엽산 수용체와 결합하는 엽산과 이의 유도체 등을 들 수 있다.
또한 표적 분자 인식 소자는 이들 예시된 폴리펩티드로 한정되지 않고, 표적 분자에 결합하는 폴리펩티드이면 어느 하나를 사용할 수도 있다.
표적 분자 인식 소자는, 예를 들면 2-이미노티오란 등의 티올화 시약을 이용하여, 화합물의 관능기와 반응하는 연결기를 도입해 결합시켜도 된다. Fab 단편에 대한 해당 연결기의 도입은 상기 티올화 시약을 pH7-9의 조건에서 반응시킴으로써, Fab 단면의 아미노기에 대해서 술프히드릴기를 부가시킬 수 있다.
표적 분자 인식 소자로서는, 예를 들면 Asn-urea-Lys 부위 또는 Glu-urea-Lys 부위를 가지는 리간드를 이용해도 된다. 해당 리간드에 의하면, 전립선암에서 발현이 현저하게 상승하는 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen)의 리셉터에 선택적으로 결합한다.
Asn-urea-Lys 부위란, 식:
[화 11]
Figure pct00011
〔식 중, *는 결합 부위이다.〕로 표시되는 부위이다.
Glu-urea-Lys 부위란, 식:
[화 12]
Figure pct00012
〔식 중, *는 결합 부위이다.〕로 표시되는 부위이다.
본 발명의 화합물(2) 등을 사용하여, 해당 화합물을 포함하는 방사성 표지 약제의 조제용 약제를 제공할 수 있다.
방사성 표지 약제의 조제용 약제는 해당 화합물 외에, 수성 완충액 등의 pH 조절제, 아스코르브산, p-아미노벤조산 등의 안정화제 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 화합물(2)로서는, 예를 들면 이하의 식(2)로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화 13]
Figure pct00013
〔식 중, A1, m, A2, A3, n, R1, R2는 식(1)과 동일하고,
L1은 R1과 P1을 연결하는 연결기이며,
p는 0 또는 1이며,
P1은 표적 분자 인식 소자이다.〕
L1은 R1의 연결기와 연결 가능한 관능기에 의해 결합을 형성하고, 표적 분자 인식 소자와도 결합을 형성한다. L1은 바람직하게는, 2-이미노티오란으로부터 유도되는 이미노티올 등이다.
p는 바람직하게는 1이다.
P1은, 예를 들면 상술한 표적 분자 인식 소자이며, 바람직하게는 폴리펩티드, 또는 그 밖에, 표적 분자에 결합하는 리간드이다.
＜금속 착체 화합물(3) 등＞
본 발명의 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염(이하 「금속 착체 화합물(3) 등」이라고도 말함)은 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한 본 발명의 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 갖는다.
본 발명의 금속 착체 화합물(3) 등을 포함하는 방사성 표지 약제는 금속 착체 화합물(3) 등 외에 미반응물이나 불순물을 포함하고 있어도 되고, 제조 후에 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 법 등에 의해 정제된 금속 착체 화합물(3) 등을 포함하는 것이어도 된다.
용어 「착체」란, 금속 및 금속 유사 원소의 원자 또는 이온을 중심으로 하고, 배위자가 배위한 물질을 의미하고, 배위 화합물이라고도 한다. 배위란, 배위자가 중심의 금속과 배위 결합을 형성해 중심 금속의 주위에 배열하는 것을 말한다. 착체는 배위자와 금속의 배위 결합에 의해 형성된다. 배위자와 금속에 의한 착체의 형성을, 착형성이라고 칭한다. 배위 결합이란, 1개의 결합을 맡는 2개의 원자가 전자가, 한쪽의 원자만으로부터 제공되고 있는 결합을 말한다.
〔금속〕
금속으로서는, 예를 들면 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 18F-Al 등을 들 수 있다.
18F-Al는 18F로 표지된 Al이며, 예를 들면 [Bioconjugate Chem., 2014, 25, 2038-2045]에 기재된 방법으로, 화합물(2) 등에 도입할 수 있다.
금속은 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 18F-Al, 64Cu 및 67Cu로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 보다 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 및 18F-Al로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 더욱 바람직하게는 67Ga, 및 68Ga로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이다.
금속은 이들 구체예로 한정되지 않고, 방사성 표지 약제를 이용한 진단 등의 목적으로 적당한 방사선, 방사선량, 반감기를 가지는 한에서 모두 사용할 수 있다. 방사선 화상 진단에서 정상적인 조직이나 세포에 대한 영향을 줄인다는 관점으로부터, 단반감기 금속 방사성 동위체가 바람직하게 사용된다.
금속 착체 화합물(3) 등의 제조는 표적 분자 인식 소자와 결합시킨 상기 화합물을 배위자로서 이용하고, 금속 방사성 동위체와 인비트로에서 착형성시킴으로써 실시할 수 있다. 착형성은 종래 알려져 있는 착형성 반응을 이용하는 간편한 조작으로 실시할 수 있다.
본 발명의 금속 착체 화합물(3) 등은,
바람직하게는 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한, 식(1)로 표시되는 화합물 등에 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물을 가지는 금속 착체 화합물 등이며,
보다 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 18F-Al, 64Cu 및 67Cu로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한, 식(1)로 표시되는 화합물 등에 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물을 가지는 금속 착체 화합물 등이며,
더욱 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 18F-Al, 64Cu 및 67Cu로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한, 식(1a)로 표시되는 화합물 등에 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물을 가지는 금속 착체 화합물 등이며,
더욱 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 18F-Al, 64Cu 및 67Cu로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한, 식(1a)로 표시되는 화합물 등에 단백질 또는 그 밖에, 표적 분자에 결합하는 리간드를 결합시켜서 이루어지는 화합물을 가지는 금속 착체 화합물 등이다.
또한 상기 화합물은 금속이, 67Ga, 및 68Ga로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것이 바람직하다.
본 발명의 금속 착체 화합물(3)로서는, 예를 들면 이하의 식(3-1) 또는 식(3-2)로 표시되는 금속 착체 화합물을 들 수 있다.
[화 14]
Figure pct00014
〔식 중, A1, m, A2, A3, n, R1은 식(1)과 동일하고,
M은 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 또는 18F-Al이다.〕
[화 15]
Figure pct00015
〔식 중, A1, m, A2, A3, n, R1은 식(1)과 동일하고,
L1, p, P1은 식(2)과 동일하고,
M은 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 또는 18F-Al이다.〕
본 발명의 방사성 표지 약제는 상기 방사성 표지 폴리펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 것 외에, 필요에 따라 1 종류 또는 2 종류 이상의 의약적으로 허용되는 담체(의약용 담체)를 포함하는 의약 조성물로서 조제할 수 있다. 의약용 담체로서 수성 완충액, 산, 및 염기 등의 pH 조절제, 아스코르브산이나 p-아미노벤조산 등의 안정화제, D-만니톨 등의 부형제, 등장화제, 및 보존제 등을 예시할 수 있다. 또, 방사 화학적 순도를 개량하는데 도움이 되는 구연산, 주석산, 말론산, 글루콘산나트륨, 글루코헵톤산나트륨 등의 화합물을 첨가해도 된다. 본 발명의 방사성 표지 약제는 수용액의 형태, 동결 용액의 형태, 및 동결건조품 중 어느 것이어도 제공이 가능하다.
본 발명의 키트는 상기 화합물과, 상기 금속을 포함하는 약제를, 다른 포장 단위로서 포함한다.
본 발명의 키트는, 예를 들면 화합물(1) 등과, 표적 분자 인식 소자를 포함하는 약제와, 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속을 포함하는 약제를, 다른 포장 단위로서 포함하는 키트; 화합물(1) 등에 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물(2)과, 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속을 포함하는 약제를, 다른 포장 단위로서 포함하는 키트를 들 수 있다.
키트에 포함되는 화합물 및 약제는 모두, 필요에 따라 상기와 같은 1 종류 또는 2 종류 이상의 의약적으로 허용되는 담체(의약용 담체)를 포함할 수 있다.
［제조 방법］
본 발명의 화합물(1) 등, 및 해당 화합물(1) 등에 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물(2) 등은 공지의 방법을 이용해 합성할 수 있고, 예를 들면 본 명세서의 실시예에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 금속 착체 화합물(3) 등은 화합물(2) 등을 배위자로서 이용해 금속 방사성 동위체와 인비트로에서 착형성시킴으로써, 제조할 수 있다. 착형성은 공지된 방법을 이용해 실시할 수 있다.
［용법 용량］
본 발명의 금속 착체 화합물 등은, 예를 들면 방사선 화상 진단에 이용되는 방사성 표지 약제로서 사용된다.
방사선 화상 진단으로서는, 예를 들면 단일 광자 방사 단층 촬영(Single Photon Emission Computed Tomography, 이하 간단하게 「SPECT」라고도 말함), 양전자 방사 단층 촬영(Positron Emission Tomography, 이하 간단하게 「PET」라고도 말함) 등을 들 수 있다.
진단으로서는 특별히 한정되지 않고, 종양, 염증, 감염증, 심장 순환기 질환, 뇌·중추계 질환 등의 각종 질환 및 장기·조직의 방사선 화상 진단 등에 이용되고, 바람직하게는 암의 방사선 화상 진단에 사용된다.
진단의 대상이 되는 표적의 특성에 따라서, 표적 분자 인식 소자를 선택함으로써, 다종류 다양한 표적의 진단이나 치료가 가능하고, 본 발명의 방사성 표지 약제는 진단의 분야에서 널리 사용할 수 있다.
본 발명의 방사성 표지 약제의 투여 경로로서는, 예를 들면 정맥내 투여 혹은 동맥내 투여 등의 비경구 투여, 경구 투여를 들 수 있고, 정맥내 투여가 바람직하다.
투여 경로는 이들 경로로 한정되지 않고, 방사성 표지 약제의 투여 후에, 그 작용이 유효하게 발현할 수 있는 경로이면 모두 이용할 수 있다.
본 발명의 방사성 표지 약제의 방사 활성 강도는 본 약제를 투여함으로써 목적을 달성할 수 있는 강도이며, 또한 피험자의 방사선 피폭이 가능한 한 낮은 임상 투여량인 한에서 임의이다.
방사성 강도는 방사성 표지 약제를 사용하는 일반적인 진단 방법이나 치료 방법으로 사용되고 있는 방사 활성 강도를 참고로 해서 결정할 수 있다. 이의 투여량은 환자의 연령, 체중, 적당한 방사선 이미징 장치, 및 대상 질환의 상태 등의 여러 조건을 고려해, 이미징이 가능하다고 생각되는 방사능 및 투여량이 결정된다.
사람을 대상으로 하는 경우, 각종 금속에서의 방사능량은 이하와 같다.
67Ga를 이용한 경우, 통상 SPECT에 사용되는 것이 상정되고, 그 진단 약제의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 67Ga의 방사능량으로서 1.1 MBq/kg~1.5 MBq/kg이다.
68Ga를 이용한 경우, 통상 PET에 사용되는 것이 상정되고, 진단 약제의 투여량은 68Ga의 방사능량으로서 1.5 MBq/kg~3 MBq/kg이다.
18F-Al를 이용한 경우, 통상 PET에 사용되는 것이 상정되고, 진단 약제의 투여량은 18F의 방사능량으로서 1.5 MBq~4 MBq이다.
64Cu를 이용한 경우, 통상 PET 및 방사선 치료에 사용되는 것이 상정되고, 진단 약제의 투여량은 64Cu의 방사능량으로서 1.5 MBq/kg~4 MBq/kg이며, 방사선 치료의 방사능량으로서 0.93GBq/m2~2.22GBq/m2이다.
67Cu를 이용한 경우, 통상 방사선 치료에 사용되는 것이 상정되고, 진단 약제의 투여량은 67Cu의 방사능량으로서 0.93GBq/m2~2.22GBq/m2이다.
이상, 본 발명에 의하면, 신장에 대한 집적을 투여 조기에 저감할 수 있는 방사성 표지 약제가 얻어지는 화합물을 제공할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 방사성 표지 약제는 종래에 비해, 선명한 화상을 부여하여 정밀도가 높은 방사선 화상 진단을 가능하게 한다.
실시예
이하에 설명하는 본 발명의 실시예는 예시만을 목적으로 하고, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한 이하의 실험은 치바 대학의 동물 윤리 위원회에 의해서 승인된 후에 실시되었다.
하기 실시예 및 비교예에서, 치환기, 화합물, 및 유기 용매에 대해서, 하기의 약호를 사용했다.
Fmoc: 플루오레닐메톡시카르보닐기
Boc: tert-부톡시카르보닐기
Trt(2-Cl): 2-클로로트리틸기
p-SCN-Bn-NOTA: 2-S-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7-트리아자시클로노난 1,4,7-트리아세트산
Cl-Trt(2-Cl) 레진: 2­클로로트리틸클로라이드 레진(2-Chlorotrityl chloride resin)
Fmoc-Lys(Dde)-OH: N-α-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-N-ε-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸]-L-리신
Fmoc-Lys-OH·HCl: N-α-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-L-리신 염산염
TFA: 트리플루오로아세트산
MeCN: 아세토니트릴
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: 디메틸포름아미드
DIC: N,N'-디이소프로필카르보디이미드
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
NMCM: N-메톡시카르보닐말레이미드
EDTA: 에틸렌디아민4아세트산
DPS: 2,2'-디피리딜디술피드
EtOH: 에탄올
FBS: 소 태아 혈청
D-PBS: 둘베코 인산 완충 생리 식염액
EGTA: 글리콜에테르디아민4아세트산
MGTA: DL-2-머캅토메틸-3-구아니디노에틸티오프로판산
［측정 방법, 실험 동물］
하기 실시예 및 비교예에서, 각종 물성 등의 측정 방법은 하기 방법으로 수행했다.
〔NMR(핵자기 공명)〕
1H-NMR에 의한 분석은 JEOL ECS - 400 spectrometer (일본 전자 주식회사)를 사용했다.
〔ESI-MS(일렉트로 스프레이 이온화 질량 분석)〕
ESI-MS에 의한 분석은 HPLC1200 series-6130 quadrupole LC/MS mass spectrometer (아질렌트·테크놀로지 주식회사)를 사용했다.
〔박층 크로마토그래피(TLC)〕
박층 크로마토그래피(TLC)에 의한 분석에는 실리카 플레이트 (TLC aluminium sheets Silica gel 60 RP-18F 254s, 머크 주식회사)를 사용하고, 0.1 M 아세트산 암모늄 수용액:메탄올 = 1:1의 전개 용매로 10 cm 전개한 것을 5 mm씩 절단해, 오토 웰 감마 시스템(WIZARD3, 퍼킨엘머사)에 의해 각각의 분획의 방사 활성을 측정했다.
〔셀룰로오스 아세테이트막 전기 영동(CAE)〕
셀룰로오스 아세테이트막 전기 영동(이하 「CAE」라고도 말함)에서는 영동막에 11 cm x 1 cm의 크기로 자른 셀룰로오스 아세테이트막(ADVANTEC SELECA-V, 도요로시 주식회사), 완충액에(veronal buffer, pH 8.6, I=0.06) 또는 solvent 2 (20 mM P.B.(pH 6.0))를 이용하고, 일정 전류(1 mA/cm)로 영동했다. 영동 후의 셀룰로오스 아세테이트막을 5 mm씩 절단해, 오토 웰 감마 시스템에 의해 각각의 분획의 방사 활성을 측정했다.
〔역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 분자체 고속 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)〕
(분석)
역상 고속 액체 크로마토그래피(이하 「RP-HPLC」라고도 말함)에 의한 분석은 UV 검출기로서 L-7405 (주식회사 히타치 제작소), 송액 펌프로서 L-7100(주식회사 히타치 제작소), 분석용 컬럼으로서 Cosmosil 5C18-AR-300 column (4.6 x 150 mm, 나카라이테스크 주식회사)를 사용했다.
이동상으로는 0.1% (v/v) TFA/H2O (A상)과 0.1% (v/v) TFA/MeCN (B상)을 이용하고, 0-20 분까지 A상 95% (v/v), B상 5%(v/v)로부터 A상 70%(v/v), B상 30%(v/v)까지 변화시키고, 20-40분 동안 A상 70%(v/v), B상 30%(v/v)로부터 A상 0%(v/v), B상 100%(v/v)까지 변화시킨 직선 그래디언트법에 의해 유속 1.0 mL/분으로 용출했다.
(분취)
RP-HPLC에 의한 분취에는 가이드 컬럼 Cadenza 5CD-C18 guard column (10 x 8 mm, 임택트 주식회사)를 연결한 Cadenza 5CD-C18 column (20 x 150 mm, 임택트 주식회사)를 사용했다.
이동상으로는 0.1% (v/v) TFA/H2O (A상)과 0.1% (v/v) TFA/MeCN (B상)을 이용하고, 0-30 분까지 A상 90% (v/v), B상 10%(v/v)로부터 A상 20%(v/v), B상 80%(v/v)까지 변화시키고, 30-40분 동안 A상 20%(v/v), B상 80%(v/v)로부터 A상 0%(v/v), B상 100%(v/v)까지 변화시킨 직선 그래디언트법에 의해 유속 5.0 mL/분으로 용출했다.
분자체 HPLC (이하 「SE-HPLC」라고도 말함)에 의한 분석은 Cosmosil 5 Diol-300II (7.5×600 mm, 나카라이테스크 주식회사)에 Cosmosil 5 Diol-300II 가이드 컬럼 (7.5×50mm, 나카라이테스크 주식회사)를 접속하고, 이동상으로 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.8)을 사용해 유속 1.0 mL/분으로 용출했다.
용출액은 RP-HPLC에서는 254 nm, SE-HPLC에서는 280 nm의 흡광도를 계측해, 67Ga 표지 화합물의 분석에는 γ선 검출기 Gabi star (Raytest사)를 온라인으로 접속, 혹은 용출액을 프랙션 컬렉터(Frac-920, GE 헬스케어·재팬 주식회사)에 의해 0.5분 간격으로 분취 후, 오토 웰 감마 시스템에 의해 방사 활성을 측정함으로써 분석했다.
〔실험 동물〕
동물 실험은 웅성의 ddY계 SPF 마우스 6주령 및 웅성의 BALB/c-nu/nu 마우스(일본 SLC 주식회사)를 사용했다.
［배위자의 합성］
합성예 1: 화합물 R1(NOTA-Bn-Met-OH)의 합성
p-SCN-Bn-NOTA (10 mg, 0.022 mmol)를 최종 농도가 10~100 mg/ml가 되도록 0.1 M 붕산 완충 pH 9.0에 용해하고, 0.1N NaOH 수용액으로 pH8~9로 조정 후, L-메티오닌(4.97 mg, 0.33 mmol)를 가해 실온에서 2시간 반응했다. 분취용 RP-HPLC에 의해 정제하여, 화합물 R1 2.5 mg (4.2 μmol, 수율 19%)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 R1: ESI-MS m/z [M + H]+ 600, Found 600.
실시예 1: NOTA-MVK(Mal)의 합성
NOTA-MVK(Mal)의 합성은 이하의 스킴에 의해 합성했다.
[화 16]
Figure pct00016
(합성예 2(a): 중간체1-1 (H-Lys(Dde)-Trt(2-Cl) 레진)의 합성)
Cl-Trt(2-Cl) 레진 (195 mg, 0.313 mmol, 와타나베 화학공업 주식회사), Fmoc-Lys(Dde)-OH (250 mg, 0.469 mmol) 및 DIPEA (327 μL, 1.876 mmol)를 디클로로메탄 (2 mL) 중 1.5시간 반응시켰다. 메탄올 (1 mL) 및 DIPEA (327 μL, 1.876 mmol)를 가해 반응을 정지했다. 수지를 DMF, 그 다음에 디클로로메탄으로 세정했다. 그 다음에 20%(v/v) 피페리딘/DMF (3 mL)를 가해 20분간 실온에서 교반함으로써, 중간체1-1를 제작했다.
수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트[Analytical Biochemistry, 1970, 34, 595-598]를 수행하여, Nα-Fmoc기의 탈보호를 확인했다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정하고 건조시킨 후, 피페리딘 처리시에 생성되는 N-(9-플루오레닐메틸)피페리딘의 A301에서의 흡광도를 측정함으로써 Fmoc-Lys(Dde)-OH의 수지에 대한 도입량을 정량했다(0.280 mmol, 수율 89.5%)[Journal of Organic Chemistry, 2004, 69, 4586-4594].
(합성예 2(b): 중간체1-2 (H-Val-Lys(Dde)-Trt(2-Cl) 레진)의 합성)
중간체1-1 (0.280 mmol)에, Fmoc 고상 합성법에 의해 2.5 등량의 Fmoc-Val-OH (237 mg, 0.783 mmol), DIC (108 μL, 0.783 mmol), HOBt (107 mg, 0.783 mmol)를 DMF (3 mL) 중, 실온에서 2시간 교반했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행함으로써, 축합 반응의 종료를 확인한 후, DMF로 수지를 세정했다. 그 다음에, 20%(v/v) 피페리딘/DMF (3mL)를 가해 20분간 실온에서 교반하여, 중간체1-2를 제작했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행하여, Nα-Fmoc기의 탈보호를 확인했다.
(합성예 2(c): 중간체1-3 (Boc-Met-Val-Lys(Dde)-Trt(2-Cl) 레진)의 합성)
중간체1-2 (0.280 mmol)에, Fmoc 고상 합성법에 의해 2.5 등량의 Boc-Met-OH (249 mg, 0.783 mmol), DIC (108 μL, 0.783 mmol), HOBt (107 mg, 0.783 mmol)를 DMF (3 mL) 중, 실온에서 2시간 교반하여, 중간체1-3를 제작했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행함으로써, 축합 반응의 종료를 확인한 후, DMF 및 디클로로메탄으로 수지를 세정했다.
(합성예 2(d): 중간체1-4 (Boc-Met-Val-Lys(H)-Trt(2-Cl) 레진)의 합성)
중간체1-3 (0.280 mmol)를 2%(v/v) 히드라진 /DMF (3 mL) 중 실온에서 1시간 교반한 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정한 후, 감압 건조함으로써, 중간체1-4를 제작했다.
(합성예 2(e): 중간체1-5 (Boc-Met-Val-Lys(H)-OH)의 합성)
중간체1-4 (0.280 mmol)를 아세트산:2,2,2-트리플루오로에탄올:디클로로메탄= 3:1:6 (2 mL, 용량비)의 혼액 중 실온에서 2시간 교반했다. 수지를 여과하여 제거한 후, 여과액을 감압 유거하여 얻어진 잔사에 디에틸에테르(3 mL)를 가함으로써 결정화시켰다. 결정을 여과하여 취하고, 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 건조함으로써 중간체1-5 84 mg (0.177 mmol, 수율 63%)를 백색 고체로서 얻었다.
중간체1-5 : 1H-NMR (CD3OD): δ 0.97 - 0.99 [6H, m, CH 3 ] 1.44 [9H, s, OtBu]1.65 - 2.11[12H, m, CH 2 , CH, SCH3] 2.48 - 2.56 [2H, m, CH 2 NH2] 2.88 - 2.93 [2H, t, SCH 2 ] 4.15 - 4.87[3H, m, CHCO]; ESI-MS m/z [M + H]+ 477, Found 477.
(합성예 2(f): 중간체1-6 (Boc-Met-Val-Lys(Mal)-OH)의 합성)
중간체1-5 (6.60 mg, 13.9 μmol)를 빙냉 하에서 sat. NaHCO3 aq. (100 μL)에 용해하고, NMCM (3.22 mg, 20.8 μmol)를 가했다. 빙냉 하 2시간 교반한 후, 5%(wt/wt) 구연산 용액을 가해 중화했다. 클로로포름 (5 mL x 3)으로 추출해, 황산 나트륨으로 건조 후, 여과액을 감압 증류함으로써, 중간체1-6 7.26 mg(13.1 μmol, 수율 94.1%)를 백색 고체로서 얻었다.
중간체1-6: 1H-NMR (CDCl3): δ 0.90 - 0.95 [6H, m, CH 3 ] 1.32 - 1.44 [2H, m, CH 2 ] 1.44 [9H, s, Boc] 1.48 - 1.70 [2H, m, CH 2 CH2-maleimide] 1.70 - 1.92 [1H, m, CH] 1.92 - 2.10 [2H, m, CH 2 CHCO] 2.10 - 2.28 [5H, m, CH 2 CH2SCH3, SCH 3 ] 2.54 [2H, t, SCH 2 ] 3.48 - 3.53 [2H, m, CH 2 -maleimide] 4.05 - 4.44 [3H, m, CHCO] 6.72 [2H, s, maleimide]; ESI-MS m/z [M + H]+ 557, Found 557
(합성예 2(g): 중간체1-7 (H-Met-Val-Lys(Mal)-OH)의 합성)
중간체1-6 (7.26 mg, 13.1 μmol)를 4 N HCl/아세트산에틸에 용해하고, 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 유거해, 헥산으로 공비함으로써, 중간체1-7의 염산염 5.92 mg (12.1 μmol, 수율 92.4%)를 백색 고체로서 얻었다.
중간체1-7: ESI-MS m/z [M + H]+ 457, Found 457.
(합성예 2(h): 화합물1-1 (NOTA-Met-Val-Lys(Mal)-OH)의 합성)
중간체1-7의 염산염 (5 mg, 10.2 μmol)를 건조 DMF(100 μL)에 용해하고, 트리에틸아민(6 μL)을 가했다. p-SCN-Bn-NOTA (7.4 mg, 16.4 μmol)를 가해 실온에서 2시간 교반한 후, H2O로 10배로 희석하고, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제하여, 화합물1-1(이하, 「NOTA-MVK(mal)」라고도 말함) 2.8 mg (3.1 μmol, 수율 28.2%)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물1-1: 1H-NMR (D2O): 0.90 - 0.95 [6H, m, CH 3 ] 1.28 - 1.30 [2H, m, CH 2 ] 1.52 - 1.56 [2H, m, CH 2 CH2-maleimide] 1.75 - 1.86 [2H, m, CH 2 CHCO], 2.04 - 2.10 [6H, m, CH, CH 2 CH2SCH3, SCH3] 2.50 - 2.57 [2H, m, SCH 2 ] 2.57 - 3.88 [21H, m, CH 2 -maleimide, CH 2 , CH, CH 2 COOH] 4.13 - 4.25 [3H, m, CHCO] 6.78 [2H, s, maleimide] 7.26 - 7.34 [4H, m, phenyl]; ESI-MS m/z [M + H]+ 907, Found 907; HRMS m/z [M + H]+ calculated for C40H59N8O12S2 907.36938, observed 907.36338.
참고예 1: NOTA-MVK(Bzo)의 합성
NOTA-MVK(Bzo)의 합성은 이하의 스킴에 의해 합성했다.
[화 17]
Figure pct00017
(합성예 3(a): N-(벤조일옥시)숙신이미드의 합성)
벤조산 (1 g, 8.20 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (1.04 g, 9.02 mmol)를 30 ml의 건조 DMF에 용해하고, 아르곤 분위기 하 0℃에서 10 mL의 건조 DMF에 용해한 디시클로헥실카르보디이미드 (1.86 g, 9.02 mmol)를 적하했다. 실온으로 되돌리고, 12시간 교반 후, 침전을 여과하여 제거하고, 용매를 감압 유거함으로써 N-(벤조일옥시)숙신이미드의 조정제물 2.06 g를 백색 고체로서 얻었다. 이 화합물은 소량의 우레아를 포함하지만, 그대로 다음의 반응에 이용했다. 1H-NMR (CDCl3): δ 2.91 (4H, t, CH 2 ), 8.00-8.24 (5H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 220, Found 220.
(합성예 3(b): 중간체2-1 Fmoc-Lys(Bzo)-OH의 합성)
N-(벤조일옥시)숙신이미드 (27 mg, 0.12 mmol)를 디클로로메탄(1 mL)에 용해하고, milliQ (1 mL)에 용해한 Fmoc-Lys-OH·HCl (50 mg, 0.12 mmol) 및 탄산수소나트륨(20 mg, 0.12 mmol)에 적하 후, 실온에서 격렬하게 교반했다. 24시간 교반 후, 1 N 염산으로 산성으로 한 후, 디클로로메탄 (5 ml x 3)으로 추출하고, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조했다. 용매를 감압 유거한 후, 헥산:에틸아세테이트:아세트산 = 1:2:0.1을 용출 용매로 하는 오픈 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 중간체2-1(Fmoc-Lys(Bzo)-OH) 57 mg (0.12 mmol, 49%)를 얻었다. 1H-NMR (CDCl3): δ 1.48-1.94 (6H, m, CH 2 ), 3.46 (2H, t, CH 2 ), 3.73-4.40 (4H, m, CH, CH 2 ), 7.23-8.06 (13H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 473, Found 473.
(합성예 3(c): 중간체2-2 H-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진의 합성)
Cl-Trt(2-Cl) 레진 (32 mg, 0.052 mmol, 와타나베 화학공업 주식회사), Fmoc-Lys(Bzo)-OH (37 mg, 0.078 mmol) 및 DIPEA (36 μL, 0.209 mmol)를 디클로로메탄 (0.5 mL) 중 1.5시간 반응시켰다. 메탄올 (0.2 mL) 및 DIPEA (36 μL, 0.209 mmol)를 가해 반응을 정지했다. 수지를 DMF 그 다음에 디클로로메탄으로 세정했다. 그 다음에 20% 피페리딘/DMF (3mL)를 가해, 20분간 실온에서 교반함으로써, 중간체2-2 (H-Lys-Trt(2-Cl) 레진)를 제작했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행하여, Nα-Fmoc기의 탈보호를 확인했다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정하고 건조시킨 후, 피페리딘 처리시에 생성되는 N-(9-플루오레닐메틸)피페리딘의 A301에서의 흡광도를 측정함으로써 Fmoc-Lys(Bzo)-OH의 수지에 대한 도입량을 정량했다(0.040 mmol, 76%).
(합성예 3(d): 중간체2-3 H-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진의 합성)
H-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진 (0.026 mmol)에, Fmoc 고상 합성법에 의해 2.5 등량의 Fmoc-Val-OH (22 mg, 0.065 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC, 10 μL, 0.065 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt, 10 mg, 0.065 mmol)를 DMF (3 mL) 중, 실온에서 2시간 교반했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행함으로써, 축합 반응의 종료를 확인한 후, DMF로 수지를 세정했다. 그 다음에, 20% 피페리딘/DMF (3mL)를 가해, 20분간 실온에서 교반하여, 중간체2-3 (H-Val-Lys-Trt(2-Cl) 레진)를 제작했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행하여, Nα-Fmoc기의 탈보호를 확인했다.
(합성예 3(e): 중간체2-4 H-Met-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진의 합성)
H-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진 (0.026 mmol)을 출발 물질로 하여, Fmoc 고상 합성법에 의해 2.5 등량의 Fmoc-Met-OH (24 mg, 0.065 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (10 μL, 0.065 mmol), HOBt (9.9 mg, 0.065 mmol)를 DMF (1 mL) 중, 실온에서 2시간 교반했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행함으로써, 축합 반응의 종료를 확인한 후, 20% 피페리딘/DMF (3mL)를 가해, 20분간 실온에서 교반하여, 중간체2-4 (H-Met-Val-Lys-Trt(2-Cl) 레진)를 제작했다. 수지의 일부를 채취하여 카이저 테스트를 수행하여, Nα-Fmoc기의 탈보호를 확인했다.
(합성예 3(f): 중간체2-5 H-Met-Val-Lys(Bzo)-OH의 합성)
H-Met-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl) 레진을 아세트산:2,2,2-트리플루오로에탄올:디클로로메탄 = 3:1:6 (2 mL)의 혼액 중 실온에서 2시간 교반했다. 수지를 여과하여 제거한 후, 여과액을 감압 유거하여 얻어진 잔사에 디에틸에테르 (3 mL)를 가함으로써 결정화시켰다. 결정을 여과하여 취하고, 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 건조함으로써 중간체2-4 (H-MetValLys(Bzo)-OH)의 아세트산염(9.7mg, 69.0%)를 백색 결정으로서 얻었다. 1H-NMR (D2O): δ 0.90-0.92 (6H, m, CH 3 ), 1.37-1.88 (6H, m, CH 2 ), 1.97-2.06 (6H, m, SCH 3 , COCHCH, SCH2CH 2 ), 2.44-2.49 (2H, m, SCH 2 ), 3.30-3.38 (2H, m, NHCH 2 ), 4.04-4.17 (3H, m, COCH), 7.48-7.73 (5H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 481, Found 481; m.p.: 179-180 ℃.
(합성예 3(g): NOTA-MVK(Bzo)의 합성)
p-SCN-Bn-NOTA (5.6 mg, 12.5 μmol)를 최종 농도가 10~100 mg/ml가 되도록 0.1 M 붕산 완충 pH 9.0에 용해하고, 0.1 N 수산화나트륨 수용액으로 pH 8~9로 조정 후, H-MetValLys(Bzo)-OH (4.0 mg, 8.3 μmol)를 가해 실온에서 2시간 반응했다. 분취용 RP-HPLC에 의해 정제하여, 하기 식으로 나타내는 NOTA-MVK(Bzo) 2.5 mg (2.69 μmol, 32.4%)를 백색 고체로서 얻었다. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 0.85-0.90 (6H, m, CH 3 ), 1.23-1.68 (6H, m, CH 2 ), 1.98-2.10 (6H, m SCH 3 , COCHCH, SCH2CH 2 ), 2.41-4.28 (26H, m, CH 2 , CH, SCH 2 , COCH), 7.43-8.16 (9H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 931, Found 931; HRMS m/z [M + H]+ calculated for C43H63N8O11S2 931.40577, observed 931.41015; m.p.: 146-148 ℃.
[화 18]
Figure pct00018
참고예 2: NOTA-MIK(Bzo)의 합성
합성예 2(b)의 Fmoc-Val-OH를 Fmoc-Ile-OH로 대신한 것 이외에는 참고예 1과 동일하게 하여, 하기에 나타내는 NOTA-MIK(Bzo)를 합성했다.
[화 19]
Figure pct00019
[2관능성 킬레이트 시약 결합 Fab의 제작]
(합성예4-1: Fab의 제작)
C-kit (9 mg, 12A8, 면역 생물 연구소)를 10 mM Na2EDTA 및 20 mM 시스테인을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0, 1.5 mL)에 용해하고, 고정화(Immobilized) 파파인 50% 슬러리 (더모·피셔·사이언티픽사) 500 μL를 가해 37℃에서 42 시간 인큐베이트했다. 반응 종료 후, 10 mM 트리스 염산 버퍼(Tris-HCl)(pH 7.5)를 2 mL 가해 0.45 μm의 필터로 여과하여, 여과액을 회수했다. 여과액을 10 kDa의 한외 여과막을 이용해 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 치환하여, 1 mL로 농축했다. 그 후, Protein A 컬럼을 이용하여 정제를 실시하여, Fab를 얻었다. 얻어진 Fab는 0.1 M 인산 완충액(pH 6.8)을 용출 용매로 한 유속 1.0 mL/분으로 용출하는 SE-HPLC에 의해 생성을 확인해, A280를 측정함으로써 농도를 산출했다.
(합성예4-2: IT-Fab의 제작)
충분히 탈기한 2 mM EDTA 함유 0.16 M 붕산 완충액 (pH 8.0)을 이용해 Fab 용액(200 μL, 2.0 mg/mL)를 조제하고, 동일한 완충액에 용해한 2-이미노티오란(2-IT)(7.5 μL, 2.0 mg/mL)를 가해 37℃에서 30분간 반응했다. 반응 후, 충분히 탈기한 2 mM EDTA 함유 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0)으로 평형화한 Sephadex G-50 Fine을 이용하는 스핀 컬럼법[Analytical Biochemistry, 1984, 142, 68-78]에 의해 반응 용액 중의 과잉의 2-IT를 제거했다. Fab 1분자당 도입된 티올기의 수는 2,2'-디피리딜디술피드 (DPS)를 이용해 측정했다[Archives of Biochemistry and Biophysics, 1967, 119, 41-49].
[Fab 결합을 한 배위자의 제작]
실시예 2: NOTA-MVK-Fab의 제작
2-IT에 의해 티올화한 Fab 용액(100 μL)에 DMF에 용해한 NOTA-MVK(mal) (50 mg/mL)를 1.25 μL 가해 37℃에서 1시간 반응했다. 그 다음에 0.1 M 인산 완충액(pH 6.0)을 이용해 요오드아세트아미드 용액(10 mg/mL)을 조제하고, 이것을 12.5 μL 가한 후, 37℃에서 1시간 반응을 실시하여, 미반응의 티올기를 알킬화했다. 그 후, 0.25 M 아세트산 완충액(pH 5.5)로 평형화한 Sephadex G-50 Fine을 이용하는 스핀 컬럼법으로 정제하여, 하기 화합물2-1(이하, 「NOTA-MVK-Fab」라고도 말함)을 얻었다. Fab 1분자당 도입된 NOTA-MVK(mal) 유래의 단위수는 요오드아세트아미드를 가하기 전에 DPS를 이용해 측정한[Archives of Biochemistry and Biophysics, 1967, 119, 41-49]티올수를 먼저 구한 티올수를 차감함으로써 구했다.
[화 20]
Figure pct00020
비교예 1: NOTA-MI-Fab의 제작
NOTA-MVK(mal)를 하기 NOTA-MI(mal) ([Bioconjugate Chem. 2014, 25, 2038-2045]에 기재된 방법에 따라 합성한 것)로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로, NOTA-MI-Fab를 작성했다.
[화 21]
Figure pct00021
비교예 2: NOTA-SCN-Fab의 제작
0.1 M 붕산 완충액(pH 9.0)을 이용해 Fab 용액(100 μL, 5.0 mg/mL)을 조제하고, 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0)에 용해한 p-SCN-Bn-NOTA (5.0 mg/mL)를 2.25 μL 가해 실온에서 12시간 교반했다. 반응 후, 충분히 탈기한 0.25 M 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 평형화한 Sephadex G-50 Fine을 이용하는 스핀 컬럼법으로 정제하여, NOTA-SCN-Fab를 얻었다.
[방사성 금속 표지 Fab의 작성]
실시예 3: 67Ga-NOTA-MVK-Fab의 제작
67GaCl3(5 μL, 후지 필름 RI 파마 주식회사)을 0.25 M 아세트산 완충액(pH 5.5, 5 μL)에 혼화하여, 실온에서 5분간 정치했다. NOTA-MVK-Fab 용액(10 μL)을 혼합한 후, 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 20 mM EDTA 용액(20 μL)을 가한 후, 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 Sephadex G-50 Fine을 이용하는 스핀 컬럼법으로 정제함으로써, 하기 금속 착체 화합물3-1(이하, 「67Ga-NOTA-MVK-Fab」라고도 말함)을 제작했다. TLC, CAE, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
[화 22]
Figure pct00022
비교예 3: 67Ga-NOTA-MI-Fab의 제작
NOTA-MVK-Fab 용액을 NOTA-MI-Fab 용액으로 변경한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로, 67Ga-NOTA-MI-Fab를 제작했다. TLC, CAE, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
비교예 4: 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 제작
NOTA-MVK-Fab 용액을 NOTA-SCN-Fab 용액으로 변경한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로, 67Ga-NOTA-SCN-Fab를 제작했다. TLC, CAE, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
참고예 3: 비방사성 Ga-NOTA-Bn-Met의 합성
GaCl3(1.2 mg, 6.77 μmol)을 0.25 M 아세트산 나트륨 완충액 (50 μL)에 용해하고 화합물 R1 (3.0 mg, 4.51 μmol)을 가했다. 실온에서 1시간 반응 후, 분석용 RP-HPLC에 의해 정제하여, 비방사성 Ga-NOTA-Bn-Met 0.5 mg (0.83 μmol, 수율 18.5%)를 백색 고체로서 얻었다.
비방사성 Ga-NOTA-Bn-Met:ESI-MS m/z [M + H]+ 600, Found 600.
참고예 4: 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)의 제작
NOTA-MVK-Fab 용액을 NOTA-MVK(Bzo) 용액으로 변경한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로, 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)를 제작했다. TLC, CAE, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
참고예 5: 67Ga-NOTA-MIK(Bzo)의 제작
NOTA-MVK-Fab 용액을 NOTA-MIK(Bzo) 용액으로 변경한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로, 67Ga-NOTA-MIK(Bzo)를 제작했다. TLC, CAE, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
실시예 4: 64Cu-NOTA-MVK-Fab의 제작
64CuCl2(5 μL)를 0.1M 구연산 암모늄 완충액(pH 5.5, 5 μL)에 혼화하여, 실온에서 5분간 정치했다. NOTA-MVK-Fab 용액(10 μL)을 혼합한 후, 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 20 mM EDTA 용액(20 μL)을 가한 후, 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 Sephadex G-50 Fine을 이용하는 스핀 컬럼법으로 정제함으로써, 하기 금속 착체 화합물3-2(이하, 「64Cu-NOTA-MVK-Fab」라고도 말함)을 제작했다. TLC, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
[화 23]
Figure pct00023
비교예 5: 64Cu-NOTA-SCN-Fab의 제작
NOTA-MVK-Fab 용액을 NOTA-SCN-Fab 용액으로 변경한 것 이외에는 실시예 4와 동일한 방법으로, 67Ga-NOTA-SCN-Fab를 제작했다. TLC, SE-HPLC에서 방사 화학적 수율 95% 이상을 확인했다.
[특성의 검토]
〔BBMVs와의 인큐베이트 시험〕
(신장 쇄자연막 소포)
신장 쇄자연막 소포 (BBMVs)는 Wistar계 웅성 랫(200-250 g)의 신장으로부터 제작했다. 모든 조작은 빙상에서 수행했다. 피질에 중량으로 2~3배의 300 mM 만니톨, 및 5 mM EGTA를 포함하는 12 mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.1)을 가하고, 폴리트론 호모게나이저(PT-3100 Kinematica GmgH Littau, Switzerland)로 2분간 호모게나이즈하여, 동일한 완충액으로 희석함으로써 10% 호모게네이트했다. 그 다음에, 증류수로 2배로 희석한 후, 최종 농도가 10 mM가 되도록 1.0 M MgCl2 수용액을 가해 15분간 방치했다. 그 후, 호모게네이트를 1,900 g로 원심하여, 상청(上淸)을 추가로 30분간 24,000 g로 원심했다. 침전을 피질 중량의 20배에 상당하는 150 mM 만니톨 및 2.5 mM EGTA를 포함하는 6 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.1)에 재현탁하여, 테플론(등록 상표) 호모게나이저(1,000 rpm, 10 strokes)에 의해 호모게나이즈했다. 그 다음에, 최종 농도가 10 mM가 되도록 1.0 M MgCl2 수용액을 가하여 현탁액을 15분간 방치하고, 그 후 호모게네이트를 1,900 g로 원심하여, 상청을 추가로 30분간 24,000 g로 원심했다. 얻어진 침전을 피질 중량의 10배에 상당하는 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)에 현탁하여, 재차 테플론 호모게나이저(1,000 rpm, 10 strokes)에 의해 동질화했다. 그 다음에, 호모게네이트를 30분간 24,000 g로 원심하여, BBMVs를 침전으로서 얻었다. BBMVs의 침전을 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.0)에 재현탁하여, 0.4 × 19 mm의 바늘에 10회 통과시킴으로써 소포의 크기를 일정하게 했다. 인큐베이트 실험에는 단백질 농도가 10 mg/mL가 되도록 희석해 이용했다. 조제한 BBMVs에 대해서, 리소좀 마커 효소인 β-갈락토시다제 활성을 p-니트로페닐-β-D-갈락토-피라노시드를 이용해 측정함으로써, 리소좀 분획의 혼입을 평가했다. 또, γ-글루타밀 트랜스퍼라제, 아미노펩티다제의 활성을, L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드, L-류신-p-니트로아닐리드를 이용해 측정했다.
(인큐베이트 시험)
BBMVs와 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)의 인큐베이트 실험은 이하의 방법으로 수행했다. 단백질 농도를 10 mg/mL가 되도록 조제한 BBMVs (10 μL)를, 37℃에서 10분간 프리인큐베이트했다. 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)는 RP-HPLC에 의해 과잉의 배위자를 제거한 후, D-PBS (-)에 재용해했다. 67Ga-NOTA-MVK(Bzo) 용액(10 μL)을 BBMVs 용액에 가해 37℃에서 2시간 인큐베이트 후에 용액의 일부를 채취하여, RP-TLC로 분석했다. 또, EtOH를 40 μL 가해 1분간 15,000 g로 원심함으로써 단백질을 침전시킨 후, 회수한 상청을 D-PBS (-)로 희석해 RP-HPLC에 의해 분석했다.
효소 저해제 공존 하에서의 BBMVs에 의한 대사의 평가는 동일하게 프리인큐베이트한 BBMVs (10 μL)에 각 효소 저해제(5 μL)를 최종 농도가 1 mM가 되도록 가해 10분간, 37℃에서 인큐베이트한 후, 67Ga-NOTA-MVK(Bzo) 용액(5 μL)을 가함으로써 수행했다. 저해제에는 카르복시펩티다제 M의 저해제인 MGTA, 레날 디펩티다제의 저해제 cilastatin, 안지오텐신-전환 효소의 저해제 captpril, 중성 엔도펩티다제의 특이적 저해제인 phosphoramidon을 이용했다. 또, 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)와 67Ga-NOTA-MIK(Bzo)의 비교는 상기와 동일한 방법에 의해 실시하여, RP-HPLC 및 TLC에 의해 분석했다.
결과, 67Ga-NOTA-MVK(Bzo)에서는 67Ga-NOTA-Met를 80.6% 유리한 것에 대해서, 67Ga-NOTA-MIK(Bzo)에서는 67Ga-NOTA-Met를 94.8% 유리했다. 이들 결과로부터, 67Ga-NOTA-MVK의 배열 구조 또는 67Ga-NOTA-MIK의 배열 구조를 가지는 경우, 신장에 대한 집적이 낮게 억제된다고 생각된다.
〔방사성 금속 표지 Fab의 마우스 혈장 중 안정성의 검토〕
실시예 및 비교예에서 제조한 방사성 금속 표지 Fab의 용액(30 μL)을, 각각 마우스 혈장(270 μL)에 가해 37℃에서 인큐베이트했다. 1, 3, 6, 24시간 후에 각 군 3개의 용액을 TLC 및 CAE에 의해 분석함으로써, 미변화체의 방사 활성의 비율을 산출했다. 도 1은 방사성 금속 표지 Fab의 마우스 혈장 중 안정성의 검토의 결과를 나타낸다. 또한 도면 중, 67Ga-NOTA-MVK-Fab의 결과는 「MVK」, 67Ga-NOTA-MI-Fab의 결과는 「MI」, 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 결과는 「SCN」로서 나타낸다(이하 동일). 결과, 24시간 후에서도 95% 이상의 방사 활성이 Fab 분획에 존재했다.
〔방사성 금속 표지 Fab의 마우스 체내 동태의 검토〕
실시예 및 비교예에서 제조한 방사성 금속 표지 Fab를 인산 완충 생리 식염수(1 mM, pH 7.4)로 희석했다. 마우스 꼬리 정맥으로, Fab 농도를 5 μg/100 μL로 조정한 각 방사성 금속 표지 Fab 용액(0.3 μCi/100 μL/마리)을 투여했다. 투여 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간 후에 각 군 5 마리의 마우스를 도살하고, 혈액 및 관심 장기를 채취하여, 중량을 측정 후, 오토 웰 감마 시스템에 의해 방사 활성을 측정했다. 또, 투여 6시간, 24 시간 후까지의 분뇨를 채취하여, 분뇨 중에 포함되는 방사 활성을 오토 웰 감마 시스템에 의해 측정했다.
67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab를 정상 마우스에 투여 후의, 체내 방사 활성 분포의 경시 변화를 표 1에 나타낸다. 도 2는 (a) 신장 방사 활성(신장에서의 시간-방사선량 곡선) 및 (b) 방사 활성의 신장 혈액비의 경시 변화를 나타낸다.
Figure pct00024
67Ga-NOTA-SCN-Fab는 투여 조기에 신장에 높은 방사 활성이 관찰되고, 투여 6시간 후에서도, 63 %ID/g와 높은 방사 활성이 확인되었다. 또, 67Ga-NOTA-MI-Fab는 투여 1시간에 최대값 44 %ID/g를 나타냈지만, 그 후 경시적으로 감소해, 6시간 후에서는 신장에 23 %ID/g의 방사 활성이 관찰되었다. 한편으로, 67Ga-NOTA-MVK-Fab는 투여 조기에 신장에 대한 집적은 낮은 값을 나타내고, 30 분 후에서 최대값 20 %ID/g를 나타냈지만, 그 후 경시적으로 감소해, 6시간 후에서는 8 %ID/g와 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab와 비교해 현저하게 낮은 값을 나타냈다. 또, 신장 혈액비에서도, 67Ga-NOTA-MVK-Fab는 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab와 비교해, 현저하게 낮은 값을 나타낸다.
〔소변 중 방사 활성의 분석〕
마우스꼬리 정맥으로 실시예 및 비교예에서 제조한 방사성 금속 표지 Fab (20 μCi, 100 μL)를 투여하고, 6시간 후까지에 집적한 소변을 0.45 μm의 필터로 여과한 후, SE-HPLC에서 화학형을 분석했다. 또, 회수한 소변에 2 배량의 EtOH를 가함으로써 단백을 침전시켜, 15,000 g로 5분간 원심한 후에 상청을 회수했다. 상청을 회수한 후에 66 질량% EtOH 용액 300 μL (D-PBS (-) 100 μL + EtOH 200 μL)를 이용해 펠렛을 세정하고, 재차 원심하여 상청을 회수하는 작업을 2회 실시하여, 「(상청의 활성)/[(상청의 활성)＋(펠렛에 남은 활성)]×100」의 계산식으로, 상청으로의 회수율(상청으로 회수한 방사 활성의 비율)을 산출했다. 그 후, EtOH 농도가 15 질량% 이하가 되도록 상청을 D-PBS (-)로 희석해, RP-HPLC에 의한 분석을 실시했다.
67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab, 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 투여 6시간 후까지에 소변 중에 배설된 방사 활성의 분석 결과를(도 3 및 도 4)에 나타낸다.
도 3은 (a) 67Ga-NOTA-MVK-Fab, (b) 67Ga-NOTA-MI-Fab, (c) 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 투여 6시간 후까지의 소변 중 방사 활성의 SE-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다. SE-HPLC 분석에서는 모두 70~80%ID/g의 방사 활성이 보유 시간 24~25 분의 저분자 분획에 존재했다.
도 4는 (a) 67Ga-NOTA-MVK-Fab, (b) 67Ga-NOTA-MI-Fab, (c) 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 투여 6시간 후까지의 소변 중 방사 활성의 RP-HPLC에 의한 분석, 및 (d) 67Ga-NOTA-Bn-Met 표품(상술한 비방사성 Ga-NOTA-Bn-Met), (e) 67Ga-NOTA-Bn-Lys 표품의 RP-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다. 에탄올 침전법에 의해 단백질을 제거한 후, RP-HPLC에 의한 분석을 수행한 결과, 67Ga-NOTA-SCN-Fab에서는 주로 67Ga-NOTA-Bn-Lys와 동일한 보유 시간 8 분의 분획에 방사 활성이 용출된 것에 대해, 67Ga-NOTA-MVK-Fab 및 67Ga-NOTA-MI-Fab의 주된 방사 활성은 67Ga-NOTA-Bn-Met와 동일한 보유 시간 15.5 분의 분획에 용출되었다. 67Ga-NOTA-Bn-Lys 표품은 「Bioconjugate Chem., 1997, 8, 365-369」에 기재된 방법에 따라서 합성했다.
이상, 소변 중의 방사 활성의 분석에 의해 도 3에 나타내는 SE-HPLC에 의한 분석으로, 대부분의 방사 활성이 저분자 분획으로 배설되어 도 4에 나타내는 RP-HPLC의 결과로부터, 67Ga-NOTA-MVK-Fab에서는 저분자 분획에서의 주된 방사 활성은 67Ga-NOTA-Bn-Met인 것을 알 수 있다.
〔SY 피하 종양 모델 마우스 체내 분포 시험〕
(세포 배양)
SY cells의 배양은 150 mm Cell Culture Dish-Treated (트루라인사)를 이용해서 수행했다. 10% (v/v) FBS (주식회사 일본 생물 재료 센터) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(5000 unit-5000 μg/ml, Invitrogen, 라이프·테크놀로지스·재팬사)가 되도록 FBS 및 페니실린/스트레프트마이신을 첨가한 RDMI-1640 with L-글루타민산 및 페놀 레드(와코준야쿠 공업 주식회사)를 사용해, 37℃, 5%(v/v) CO2, 포화 수증기압 하에서 인큐베이트했다.
(동물 실험 모델)
피하 종양 모델 마우스를 이용한 체내 동태 실험에는 왼발 대퇴부에 3×106개의 SY cells를 이식해, 4~5주간 후에 종양 사이즈가 0.4 g~1.0 g으로 성장한 BALB/c-nu/nu 마우스(웅성, 8~10주령)를 사용했다.
(체내 분포 시험)
상술한 방법에 의해 조제한 실시예 및 비교예에서 제조한 방사성 금속 표지 Fab를 인산 완충 생리 식염수(1 mM, pH 7.4)로 희석했다. 상기 피하 종양 모델 마우스의 꼬리 정맥으로, Fab 농도를 5 μg/100 μL로 조제한 각 방사성 금속 표지 Fab 용액(0.3 μCi/100 μL/마리)을 투여했다. 투여 3시간, 6시간 후(6시간 후는 67Ga-NOTA-MVK-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab만)에 각 군 5마리의 마우스를 도살해, 혈액 및 관심 장기를 채취, 중량을 측정 후, 오토 웰 감마 시스템에 의해 방사 활성을 측정했다.
Figure pct00025
67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab를 SY 피하 종양 모델 마우스에 투여 후의, 체내 방사 활성 분포를 표 2에 나타낸다. 도 5는 67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab의 종양 신장비를 나타낸다. 투여 3시간 후에서, 67Ga-NOTA-MVK-Fab는 0.63으로 높은 종양 신장비를 나타냈다. 한편으로, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab는 투여 3시간 후에서 신장에 각각 64%ID/g, 97%ID/g으로 높은 방사 활성이 관찰되었기 때문에, 종양 신장비는 각각 0.16, 0.09로 낮은 값을 나타냈다.
(SPECT 촬상)
상술한 방법에 의해 조제한 실시예 및 비교예에서 제조한 방사성 금속 표지 Fab를 인산 완충 생리 식염수(1 mM, pH 7.4)로 희석했다. 상기 SY 피하 종양 모델 마우스의 꼬리 정맥으로, Fab 농도를 5 μg/100 μL로 조제한 각 방사성 금속 표지 Fab 용액(100 μCi/100 μL/마리)을 투여했다. 각 군 2마리의 마우스를 SPECT/CT 장치(SPECT4CT, Trifoil Imaging, CA)를 이용하고, 개구 지름 1 mm, 5 핀홀 콜리메이터를 360도 수집, 64 프로젝션, 1 분/프로젝션의 조건에서, 투여 후 2.5시간으로부터 촬상했다.
67Ga-NOTA-MVK-Fab, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab를 SY 피하 종양 모델 마우스에 투여 후의 SPECT/CT 화상을 도 6에 나타낸다. 도 6은 각 67Ga 표지 Fab 용액을 SY 피하 종양 모델 마우스에 투여하고, 3시간 후의 SPECT/CT 화상이다. 종양(T), 신장(K), 방광(B)을 나타낸다. 투여 3시간 후에서, 67Ga-NOTA-MVK-Fab는 신장에 대한 집적이 낮고, 종양을 명료하게 화상화했다. 한편으로, 67Ga-NOTA-MI-Fab 및 67Ga-NOTA-SCN-Fab에서는 종양을 화상화했지만, 신장에도 높은 방사 활성이 관찰되었다.
이상, 방사성 표지 약제는 신장에 대한 집적이 낮고, 방사선 화상 진단의 감도, 정밀도를 향상시킬 수 있다.
(PET 촬상)
64Cu-NOTA-MVK-Fab 및 64Cu-NOTA-Fab를 정상 마우스에 투여하고(0.09-0.14 mCi), 3시간 후에 30분에 걸쳐 PET(Inveon, Siemens Medical Solutions, USA) 촬상했다.
도 7은 64Cu-NOTA-MVK-Fab (도면 중, 64Cu-MVK-Fab로 나타냄) 및 64Cu-NOTA-Fab(도면 중 64Cu-SCN-Fab로 나타냄)를 정상 마우스에 투여했을 때에 3시간 후의 PET 화상을 나타낸다. 64Cu-NOTA-MVK-Fab는 신장에 대한 집적이 낮다. 한편으로, 64Ga-NOTA-SCN-Fab에서는 신장에 높은 방사 활성이 관찰되었다.
이상, 64Cu-NOTA-MVK-Fab에 관한 방사성 표지 약제는 신장에 대한 집적이 낮은 것을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 하기 식(1)로 표시되는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
    [화 1]
    Figure pct00026

    〔식 중,
    A1은 아미노산 잔기이며,
    m은 0~3의 정수이며,
    A2는 측쇄에 아미노기 또는 카르복시기를 가지는 아미노산 잔기이며,
    A3은 아미노산 잔기이며,
    n은 0~3의 정수이며,
    R1은 A2의 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기와 결합하고, 표적 분자 인식 소자 또는 이의 연결기와 결합가능한 관능기를 가지는 기, 또는 A2의 측쇄의 아미노기 혹은 카르복시기의 수소 원자이며,
    R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이다.
    다만, R1은 환 구성 원자의 하나로서 A2의 측쇄의 아미노기의 질소 원자를 포함하는 탄소수 3~10의 복소환기를 형성하고 있어도 된다.〕
  2. 청구항 1에 있어서,
    A1이 발린, 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌의 잔기인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    A2가 리신, 오르니틴 또는 아르기닌의 잔기인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    m이 1인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    n이 0인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 하기 식(1a)로 표시되는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
    [화 2]
    Figure pct00027

    〔식 중, R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1~8의 탄화수소기이며, R3은 수소 원자 또는 메틸기, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 아실기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬기, 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬카르바모일기, 혹은 관능기 a를 가지는 총 탄소수 2~20의 알킬티오카르바모일기이다. 다만, R4 및 R5는 인접하는 질소 원자를 포함하는 복소환을 형성하고 있어도 되고, 그 경우, 식:
    [화 3]
    Figure pct00028

    로 표시되는 기는 식:
    [화 4]
    Figure pct00029

    로 표시되는 기이다.〕
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염에, 표적 분자 인식 소자를 결합시켜서 이루어지는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 표적 분자 인식 소자가, 표적 분자에 결합하는 폴리펩티드인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 항체의 Fab 단편인 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  10. 방사성 금속 및 방사성 원자 표지 금속으로부터 선택되는 1종의 금속과, 상기 금속에 배위한 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 가지는 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 금속이 67Ga, 68Ga, 18F-Al, 64Cu 또는 67Cu인 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염.
  12. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 방사성 표지 약제의 조제용 약제.
  13. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 방사성 표지 약제의 제조를 위한 사용.
  14. 청구항 10 또는 청구항 11의 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 방사성 표지 약제.
  15. 청구항 10 또는 청구항 11의 금속 착체 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 방사선 화상(畵像) 진단약.
KR1020187025332A 2016-03-01 2017-02-28 방사성 표지 약제 KR20180118658A (ko)

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