JPWO2012002011A1 - がん患者に対する免疫療法の治療効果の予測方法、ならびに該方法に用いる遺伝子セットおよびキット - Google Patents

がん患者に対する免疫療法の治療効果の予測方法、ならびに該方法に用いる遺伝子セットおよびキット Download PDF

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Abstract

がん患者に対する免疫療法の治療効果を予測するために有用な遺伝子セットを提供する。また、遺伝子セットを構成する各遺伝子の発現量を定量することを含む、免疫療法が有効であるか否かを判定する方法を提供する。当該判定方法は、がん患者の治療方針を決定するために有用である。

Description

本発明は、がん患者に対する免疫療法の治療効果の予測方法、ならびに前記方法に用いる遺伝子セットおよびキット等に関する。
各種がんに対する免疫療法は、一部奏効する症例があるものの、すべての患者にとって最適な治療法とはなりえていない。その原因の一つとして、免疫療法が、がん細胞の増殖を抑えるために個人差の大きい免疫能を介していることが上げられる。がんの免疫療法には、現在その効果を予測する方法がなく、治療を行ってみなければ有効性を判断することができない。これまでに、乳癌患者において遺伝子発現レベルを測定し化学療法の効果を予測する方法が知られているが、この方法は遺伝子発現と他の因子とを組み合わせる複雑な系であり、また、乳癌に対する化学療法の効果のみを対象としている（特許文献１）。がんの免疫療法の治療効果や、免疫療法後の患者の予後を予測する方法はこれまで知られていない。
特表２００８−５３６０９４
本発明は、がん患者に対する免疫療法の治療効果を精度よく予測する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、長年におよぶ前立腺癌患者に対するペプチドワクチン療法で得られた結果に基づき、がん免疫療法の治療効果を予測することを試みた。まず、ペプチドワクチン療法前または後の前立腺癌患者における遺伝子発現プロファイルをＤＮＡマイクロアレイで解析した。次いで、治療後の生存日数を基準として患者を予後良好群と予後不良群に分類し、予後良好群と予後不良群を治療前の発現レベルから正確に予測できる遺伝子または遺伝子群を選別した。そして、これら遺伝子の発現レベルから、免疫療法の治療効果を予測できることを確認し、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、１つの態様において、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、
（１）免疫療法前または後のがん患者から採取された試料において、表１、表１９、表３４または表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、を含む方法を提供する。
上記がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法は、さらに、
（２）該発現レベルを用いて判別分析を行い、該患者の予後を判定する工程、
を含んでもよい。
別の態様において、本発明は、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するための、表１、表１９、表３４または表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットおよび表１、表１９、表３４または表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなるがん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのバイオマーカーを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、上記遺伝子セットの各遺伝子に対するプローブおよびプライマー、および、上記遺伝子セットの各遺伝子に対するプローブ、プライマー、および／または上記遺伝子セットの各遺伝子の発現産物を特異的に認識する抗体を含むがん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのキットを提供する。
さらにまた、別の態様において、本発明は、免疫療法が有効であると予測されるがん患者のスクリーニング方法であって、
（１）免疫療法前のがん患者から採取された試料において、表１、表１９、表３４または表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、を含む方法を提供する。
上記がん患者のスクリーニング方法は、さらに、
（２）該発現レベルを用いて判別分析を行い、該患者の予後を判定する工程、
を含んでもよい。
さらにまた、別の態様において、本発明は、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、
免疫療法前または後のがん患者から採取された血液において、IL-6蛋白質の発現レベルを測定する工程、を含む方法を提供する。血中のIL-6蛋白質量は、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのバイオマーカーともなり得る。
本発明により、がん患者の遺伝子発現プロファイルを免疫療法開始前に測定することで、その患者に対する免疫療法の治療効果を予測することが可能である。本発明は、免疫療法による効果が期待できない患者（予後不良群）の予測を可能とし、がん患者に対する治療法の選択に有用な情報を提供する。
T検定における16968遺伝子の分布。縦軸は2群間の有意水準、横軸は2群間の遺伝子の発現の比の対数を示す。n＝40（短命20名、長命20名）。 Wilcoxon検定における16968遺伝子の分布。縦軸は2群間の有意水準、横軸は2群間の遺伝子の発現の比を示す。n＝40（短命20名、長命20名）。 T検定における13遺伝子の分布。縦軸は2群間の有意水準、横軸は2群間の遺伝子の発現の比の対数を示す。n＝40（短命20名、長命20名）。 Wilcoxon検定における13遺伝子の分布。縦軸は2群間の有意水準、横軸は2群間の遺伝子の発現の比を示す。n＝40（短命20名、長命20名）。 判別に優位な遺伝子。縦軸は、判別率80%以上の遺伝子セットに用いられる頻度を示す。 ワクチン投与前（Ａ）またはワクチン投与後（Ｂ）の末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）における長命群および短命群の遺伝子発現の相違を示す。 DEFA1（Ａ）、DEFA4（Ｂ）、CEACAM8（Ｃ）およびMPO（Ｄ）について、ワクチン投与後の末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）における長命群（Long）および短命群（Short）の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した結果を示す。GAPDHを内部標準として各遺伝子の発現量を定量した。 長命群（Long）および短命群（Short）の患者血漿中におけるIL-6タンパク量の定量結果をしめす。統計学的検定は、Mann-Whitney testを用いた。
本発明は、一つの態様において、がん患者から採取された試料における１またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することを含む、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法を提供する。この予測方法は、その発現レベルにより、がん患者の免疫療法後の予後を予後良好群と予後不良群に正しく予測できる遺伝子セットを利用する。上記予測方法は、表１、表１９、表３４または表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１種類の遺伝子の発現レベルを利用してもよい。上記予測方法は、免疫療法の効果が期待できない患者、免疫療法の効果が期待できる患者あるいは免疫療法に対し治療抵抗性を示す患者を予測し、免疫療法の適用または不適用を決定する方法として利用可能である。
本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットの遺伝子の数および種類には特に制限はなく、表１に示す５４種類の遺伝子、表１９に示す１００種類の遺伝子、表３４に示す遺伝子、表３５に示す遺伝子および／またはIL-6遺伝子から任意に選択することができる。
好ましくは、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、表２に示す１３種類の遺伝子から選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３種類の遺伝子から構成される。遺伝子セットは、LOC653600、TNFRSF19、P4HA1、SYNE1の４種類の遺伝子を含むことが好ましい。具体的な遺伝子セットとしては、LOC653600、TNFRSF19、P4HA1およびSYNE1からなる遺伝子セット、LOC653600、TNFRSF19、G3BP2、ZNF83、C6orf222、ZBTB20、P4HA1、GP1BA、HLA-A29.1、SYNE1およびNAP1L1からなる遺伝子セット、表１０の１番目、表１１の１〜１８番目、表１２の１〜５５番目、表１３の１〜７１番目、表１４の１〜６３番目、表１５の１〜４５番目、表１６の１〜２２番目、または表１７の１〜７番目に示す遺伝子セットが挙げられる。
別の好ましい実施態様において、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、表２０に示す２９種類の遺伝子から選択される１〜２９種類、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１種類の遺伝子から構成される。具体的な遺伝子セットとしては、表２３〜３３に示す遺伝子セットが挙げられる。当業者は、実施例の記載にしたがい、１２種類以上の遺伝子を含む遺伝子セットも適宜選択することができる。
別の好ましい実施態様において、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、表３４に示す遺伝子から少なくとも１個選択される遺伝子から構成される。遺伝子セットは、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOの４種類の遺伝子を含むことが好ましい。具体的な遺伝子セットとしては、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOからなる遺伝子セット、またはDEFA1、DEAF3、DEFA4、ELA2、CSTG、CAMP、MPO、MMP9、およびCEACAM8からなる群から少なくとも１個選択される遺伝子からなる遺伝子セットが挙げられる。
別の好ましい実施態様において、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、表３５に示す遺伝子（PRKAR1A、LRRN3、PCDH17、TTN、LAIR2、RNASE3、CEACAM6、AZU1、HIST1H4C、PGLYRP1、CEACAM8、LCN2、MPO、CAMP、DEFA1、DEFA3、CTSG、DEFA4、ELA2）から少なくとも１個選択される遺伝子から構成される。遺伝子セットは、LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1の４種類の遺伝子を含むことが好ましい。具体的な遺伝子セットとしては、LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1からなる遺伝子セット、またはLRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1からなる群から少なく１個選択される遺伝子からなる遺伝子セットが挙げられる。
別の好ましい実施態様において、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、IL-6遺伝子からなる、またはIL-6遺伝子を含む。
別の好ましい実施態様において、本発明の一態様である上記予測方法に用いる遺伝子セットは、LOC653600、TNFRSF19、P4HA1、SYNE1、DEFA1、DEFA4、CEACAM8、MPO、LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1からなる群から少なくとも１個選択される遺伝子からなる遺伝子セットまたはLOC653600、TNFRSF19、P4HA1、SYNE1、DEFA1、DEFA4、CEACAM8、MPO、LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1からなる群から少なくとも１個選択される遺伝子を含む遺伝子セットが挙げられる。
本明細書において、がん患者はヒトであれば特に限定されず、例えば前立腺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌などの患者が挙げられる。前立腺癌は、進行性再燃前立腺癌であり得る。
本明細書において、免疫療法とは、がん患者における腫瘍抗原タンパク質に対する免疫応答を賦活化することによりがんを治療する方法を意味する。免疫療法としては、腫瘍抗原ペプチドを用いるペプチドワクチン療法、細胞傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞などのリンパ球を用いる養子免疫療法、腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを発現するウイルスベクターを生体に導入するＤＮＡワクチン、腫瘍抗原ペプチドを提示する樹状細胞を投与する樹状細胞ワクチンなどが挙げられる。免疫療法の好適な一例には、ペプチドワクチン療法が挙げられる。
遺伝子の発現レベルは、常套的方法により測定され得る。発現レベルの測定方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ノーザンブロット法などが挙げられる。発現レベルの測定方法の好適な一例には、ＤＮＡマイクロアレイ法が挙げられる。
ＤＮＡマイクロアレイ法では、測定対象とする遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイを使用する。使用可能なマイクロアレイの一例としては、llumina社製 HumanWG-6 v3.0 Expression BeadChipが挙げられる。あるいは、測定対象の遺伝子に対するプローブを合成し、スライドガラスなどの適当な基盤上に固定して、所望のマイクロアレイを作製してもよい。マイクロアレイの作製方法は、当業界にて周知である。マイクロアレイデータの解析も周知であり、例えば「統合ゲノミクスのためのマイクロアレイデータアナリシス」（星田有人訳 シュプリンガー・フェアラーク東京社出版）を参考に行うことができる。
遺伝子発現レベルの測定に用いるヒトである患者の試料は、限定はされないが、例えば患者から採取した末梢血を使用することができる。末梢血のうち、ミエロイド細胞(MDCs)、granulocytic MDSCs、末梢血単核球(PBMCs)、顆粒球または赤血球を、遺伝子発現レベルの測定に用いてもよい。また、患者由来の試料は、免疫療法前に採取した試料、免疫療法後に採取した試料、または免疫療法前および後に採取した試料であってもよい。免疫療法前に採取した試料を使用して、本発明の一態様である上記予測方法を実施することにより、免疫療法の効果が期待できない患者であるか、または免疫療法の効果が期待できる患者であるかを予測し、免疫療法の適用または不適用を決定してもよい。また、免疫療法後に採取した試料を使用して、本発明の一態様である上記予測方法を実施することにより、試料採取時点より後に、免疫療法の効果が期待できるか否かを予測し、更なる免疫療法の適用または不適用を決定してもよい。
ＤＮＡマイクロアレイ法による遺伝子発現レベルの測定は、例えば以下のとおりである。はじめに、患者の末梢血から全ＲＮＡを抽出し、精製する。次いで、Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit（アンビオン社製）などを使用し、ビオチン化ｃＲＮＡを合成する。このビオチン化ｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いでＣｙ３標識ストレプトアビジンと反応させる。反応後のマイクロアレイを専用のスキャナーでスキャンし、BeadStudioなどの専用ソフトウエアを用いて各スポットのＣｙ３の蛍光を数値化することで、各遺伝子の発現レベルを得ることができる。
ＰＣＲを利用して遺伝子発現レベルを測定する場合は、例えば、試料中のmRNAからcDNAを調製し、このcDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、試料中の遺伝子発現量を定量できる。ＰＣＲによる遺伝子発現量の定量は、リアルタイムＰＣＲを利用してもよい。ＰＣＲに用いるプライマーは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができるように、当業者により適宜設定されうる。また、リアルタイムＰＣＲは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイズし、ＰＣＲ産物を定量できるように、蛍光色素を結合させたプローブを用いてもよく、当該プローブは、当業者により適宜設計され得る。SYBR（登録商標）Green等の蛍光色素を用いてリアルタイムＰＣＲをおこなってもよい。
また、遺伝子の発現レベルは、その発現産物であるタンパク質の発現レベルを測定することによっても測定することもできる。細胞膜あるいは細胞質に局在しているタンパク質は蛍光色素で標識した抗体を用い、フローサイトメトリーにより測定できる。あるいは酵素抗体法（ELISA）やウエスタンブロット法なども利用可能である。
本発明の一態様であるがん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法は、がん患者から採取された試料における１またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを測定することに加えて、さらに、測定した発現レベルを用いて判別分析を行うことを含み得る。判別分析を行った結果、免疫療法の効果の有無等の患者の予後を判定することができる。判別分析は、例えば、実施例に記載したように実施できる。具体的には、判定に用いる遺伝子を選択し、既知のデータ（学習用データ）をもとに判別関数を得る。そして、対象とする患者の遺伝子発現レベルをあてはめ、当該患者が１（長命）または０（短命）である確率を計算する。確率が５０％を超えた結果（長命（予後良好）または短命（予後不良））が、その患者の予後と判定される。長命（予後良好）の確率が５０％を超えた場合、免疫療法は当該患者に有効であると予測される。一方、短命（予後不良）の確率が５０％を超えた場合、免疫療法は当該患者に有効でないと予測される。
判別分析は、統計解析ソフトSAS（SAS Institute Japan株式会社）や統計解析ソフトJMP（SAS Institute Japan株式会社）などを用いて行うことができる。学習用データの数は特に限定されず、当業者は予測を実施可能な学習用データの数を適宜決定することができる。
また、十分な症例数（例えば、100、1000症例）の長命（予後良好）および短命（予後不良）の各個体において、判定に用いる遺伝子の標準発現レベル（長命または短命個体の発現レベルの標準値）を把握し、対象である患者の該遺伝子の発現レベルを、当該標準値と比較して、該患者の予後を判定してもよい。例えば、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPO遺伝子の発現量が長命群の標準値より高ければ、免疫療法の効果が期待できない患者であり、予後良好でないと判定される。DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPO遺伝子の各発現量の標準値は、例えば、図７のように設定できる。
なお、以下の実施例では生存日数４８０日を基準として遺伝子を選択し、生存日数４８０日を基準として判定の正誤を判断している。しかしながら、実施例の４０名の前立腺患者は生存日数９００日以上、または生存日数３００日以下の患者のみであったため、生存日数３０１〜８９９日のいずれを基準としても本発明の遺伝子セットと同じ遺伝子セットが選択されることになる。よって、長命または短命の定義の基準日は生存日数３０１〜８９９日の範囲であればいずれの日数であってもよく、４８０日に限定されない。
上記本発明の一態様である、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法は、免疫療法の効果が期待できない患者であるか、または免疫療法の効果が期待できる患者であるかを予測し、免疫療法の適用または不適用を決定する方法として利用することができる。よって、上記がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法は、免疫療法が有効であると予測されるがん患者のスクリーニング方法であり得る。
さらに、医師は、上記がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法によって得られた結果に基づき、がん患者の治療方針を決定することができる。よって、本発明は、一態様として、上記がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法を行うことを含む、がんの診断または治療方法を提供する。
本発明は、また、一態様として、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するために使用される遺伝子セットを提供する。当該遺伝子セットは、上記本発明の一態様である、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法で用いる遺伝子セットと同じであり、本発明の予測方法に用いるＤＮＡマイクロアレイ用のプローブやＰＣＲ用プライマーなどを作製するために用いることができる。
本発明は、また、一態様として、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのバイオマーカーを提供する。本明細書において、バイオマーカーは、免疫療法の効果を予測するための指標になり得るものであり、遺伝子であっても、それが発現したタンパク質であってもよい。上記本発明の一態様である、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法で用いる遺伝子セットを、バイオマーカーとして使用することができる。例えば、バイオマーカーは、表１、１９、３４または３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子、LOC653600、TNFRSF19、P4HA1およびSYNE1を含む遺伝子、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOを含む遺伝子、またはLRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1を含む遺伝子であり得る。DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOをバイオマーカーとして使用する場合、これら遺伝子発現量が長命群の標準値に比較し高いことは、免疫療法が有効でないとの予測の指標となり得る。
また、上記本発明の一態様である、がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法で用いる遺伝子セットの発現産物であるタンパク質を、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのバイオマーカーとして使用してもよい。例えば、血中のIL-6蛋白質をバイオマーカーとしてもよい。患者血中のIL-6蛋白質が長命群の標準値に比較し多い場合には、免疫療法が有効でないとの予測の指標となり得る。なお、血中のIL-6蛋白質量の標準値は、例えば、図８を参考にして、短命群：4.8pg/ml、長命群：3.3pg/mlと設定してもよい。
本発明は、また、一態様として、本発明の遺伝子セットの各遺伝子あるいは遺伝子発現産物の発現レベルを測定することができる、プローブ、プライマー、または抗体を提供する。各遺伝子に対するプローブおよびプライマーは、その遺伝子の配列情報に基づき、常套的方法により合成することができる。プローブおよびプライマーは、例えば各遺伝子の配列の一部に相補的な配列を有し、各遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、例えば、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ことである。「ストリンジェントな条件」とは、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)などに基づき当業者が適宜決定しうるものであるが、例えば0.2xSSC、0.1%SDS、65℃などが挙げられる。
プライマーは、各遺伝子またはその一部を増幅するためのＰＣＲに用いることができるように設計され得る。各遺伝子の配列情報は、本明細書中の表に記載するGenBank Accession番号にしたがい得ることができる。また、抗体の作製方法も当業界にて周知である（“Antibodies: A Laboratory Manual”, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）。
例えば、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOのそれぞれのプローブおよびプライマーは、実施例で記載した配列番号１〜８のオリゴヌクレオチドであり得る。
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、またFab、F(ab')2、およびFvのような抗体断片であってもよい。
本発明は、また、一態様として、上記プローブ、プライマー、および／または抗体を含む、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのキットを提供する。
キットは、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ノーザンブロット法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法などに用いられるキットである。ＤＮＡマイクロアレイ法用のキットとしては、前記プローブが適当な基盤上に固定されたマイクロアレイを含むものが挙げられる。
また、キットは、例えば、血中のIL-6蛋白質量を定量するために、抗IL-6ポリクローナル抗体または抗IL-6モノクローナル抗体を含んでもよい。
キットは、測定方法に応じて、その他必要な試薬を含んでいてもよい。
本発明は、また、一態様として、がん患者に対する免疫療法の効果を予測するための遺伝子セットの選択方法を提供する。当該遺伝子セットの選択方法は、例えば、工程１：免疫療法の効果があった群（長命群）と免疫療法の効果がなかった群（短命群）のそれぞれのがん患者由来の試料において発現している遺伝子の発現量を定量する工程；
工程２：免疫療法の効果があった群（長命群）と免疫療法の効果がなかった群（短命群）の間での遺伝子発現量の差異と、その統計学的有意差に基づき、免疫療法の効果を予測するマーカーとなり得る遺伝子を選択する工程；および
工程３：選択した遺伝子の中で、免疫療法の効果を予測するために最も良い組み合わせを変数選択により決定する工程を含む。
遺伝子発現量の差異は、例えば、短命群での発現量／長命群での発現量を求め、log2「短命群での発現量／長命群での発現量」の値に基づき評価してもよい。
統計学的有意差は、ｔ検定および／またはWilcoxon検定を用いてもよく、Limmaの方法（Smyth. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical applications in genetics and molecular biology (2004) vol.3 pp. Article 参照）を用いてもよい。
例えば、上記工程２において、log2「短命群での発現量／長命群での発現量」<-1.0または>1.0かつＰ値（limma）<0.01の条件を満たす遺伝子を選択してもよい。
変数選択は当業者により適宜実施されることができる。例えば、Sungwoo Kwon et al：DNA Microarray Data Analysis for Cancer Classification Based on Stepwise Discriminant Analysis and Bayesian Decision Theory. Genome Informatics 12: 252-254 (2001)に記載されているStepwise Discriminant Analysis (SDA)を実施してもよい。SDAの実施例としては、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）１個の遺伝子を遺伝子セットに加えることによりWilksのラムダ（Wilk's lambda）が明らかに減少する場合、その遺伝子を遺伝子セットに加える；
（ｉｉ）そして、１個の遺伝子を遺伝子セットから除くことによりWilksのラムダ（Wilk's lambda）の増加が僅かな場合、その遺伝子を遺伝子セットから除く；
（ｉｉｉ）上記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を、統計学的観点から、Wilksのラムダ（Wilk's lambda）が変化しなくなるまで繰り返す、
を実施することが挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
１：ＤＮＡマイクロアレイによるペプチドワクチン療法前の遺伝子発現プロファイルの検討
患者試料として、久留米大学倫理委員会により承認されたプロトコールに即してインフォームドコンセントを得た前立腺癌患者から過去の臨床試験において再燃前立腺癌と診断された時点に収集した末梢血を使用した。４０名の前立腺癌患者において、ＤＮＡマイクロアレイ（llumina社製 HumanWG-6 v3.0 Expression BeadChip）を用いて、ペプチドワクチン療法前の遺伝子発現プロファイルを調べた。前立腺癌患者は、予後良好群（ペプチドワクチン療法後の生存日数９００日以上）２０名、予後不良群（ペプチドワクチン療法後の生存日数３００日以下）２０名であった。
（Ｉ）患者末梢血からのＲＮＡ抽出・精製
１．患者末梢血サンプルにTRIzol LS（インビトロジェン社製）を１：３の比率になるように添加し、混濁した。
２．TRIzol LS溶液７５０μＬに対し、２００μＬのクロロホルムを加え、混濁後、遠心分離した。
３．上清を新しいチューブに移し、上清の０．５５倍量のエタノールを添加した。
４．SV Total RNA Isolation System（プロメガ社製）のカラムに上記３．の検体をのせ、フィルターを通した。
５．フィルターを５００μＬのWash Bufferで洗浄した。
６．全ＲＮＡを８０μＬのNuclease Free Waterで溶出した。
７．分光光度計を用いて、ＲＮＡの濃度を測定し、Experionシステム（バイオラッド社製）を用いて電気泳動によりＲＮＡのクオリティをチェックした。
（ＩＩ）Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit（アンビオン社製）を用いたマイクロアレイ用ｃＲＮＡの合成
（１）逆転写による一本鎖ｃＤＮＡの合成
１．各５００μｇの全ＲＮＡにNuclease Free Waterを加え、１１μＬに調整した。
２．上記１．の溶液に９μＬのReverse Transcription Master Mixを加え、４２°Ｃで２時間インキュベートした。
（２）二本鎖ｃＤＮＡ合成
１．８０μＬの Second Strand Master Mixを、上記（１）２．の各々のチューブに添加した。
２．各チューブを１６°Ｃで２時間インキュベートした。
（３）ｃＤＮＡ精製
１．２５０μＬのcDNA Binding Bufferを各々のチューブに添加した。
２．上記１．の溶液を、cDNA Filter Cartridgeにのせ、遠心によりフィルターを通した。
３．フィルターを５００μＬのWash Bufferで洗浄した。
４．ｃＤＮＡを１９μＬの５０〜５５°Ｃに予熱しておいたNuclease Free Waterで溶出した。
（４）インビトロ転写反応によるｃＲＮＡ合成
１．７．５μＬのIVT Master Mixを、上記（３）４．で得られたｃＤＮＡサンプルに添加した。
２．上記１．のチューブを３７℃で１４時間インキュベートした。
３．上記２．のチューブに７５μＬのNuclease Free Waterを添加した。
（５）ｃＲＮＡ精製
１．３５０μＬのcRNA Binding Bufferを各チューブに添加した。
２．２５０μＬの１００％エタノールを各チューブに加え、混濁した。
３．上記２．のサンプルをcRNA Filter Cartridgeにのせ、遠心によりフィルターを通した。
４．６５０μＬのWash Bufferでフィルターを洗浄した。
５．ｃＲＮＡを１００μＬの５０〜５５°Ｃに予熱しておいたNuclease Free Waterで溶出した。
６．ｃＲＮＡ濃度をＯＤで測定後、ハイブリダイゼーションサンプルとした。
（ＩＩＩ）マイクロアレイハイブリダイゼーション
（１）ハイブリダイゼーション用ｃＲＮＡの調製
１．各５００μｇの全ＲＮＡにNuclease Free Waterを加え、１０μＬに調整した。
２．上記１．の溶液に２０μＬのGEX-HYBを加え、６５℃で５分インキュベートした。
（２）ハイブリダイゼーション
１．専用チャンバーにセットしたHumanWG-6 v3.0 Expression BeadChipに、調製済みのｃＲＮＡサンプルをアプライした。
２．専用チャンバーのふたを閉め、５５℃で１８時間インキュベートした。
（ＩＶ）マイクロアレイ洗浄・染色
（１）アレイの洗浄
１．Wash E1BC溶液中で、マイクロアレイのカバーを外した。
２．アレイを速やかにスライドラックにセットし、５５℃に予熱しておいた1×High-Temp Wash buffer内で１０分間洗浄した。
３．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄した。
４．アレイをエタノール中で５分間洗浄した。
５．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄した。
６．染色専用トレイに４ｍｌのブロックE1バッファーを準備し、アレイを一枚ずつセットし、室温で１０分間ブロッキングを行った。
７．染色専用トレイに２ｍｌのブロックE1バッファーに対して２μＬのストレプトアビジン−Ｃｙ３を加え、アレイを一枚ずつセットし、室温で１０分間染色を行った。
８．アレイをWash E1BC溶液中で５分間洗浄後、遠心により乾燥した。
（Ｖ）スキャニング、数値化
１．Illumina社専用スキャナーにアレイをセットし、標準モードでスキャンを行った。
２．スキャン終了後、専用ソフトウエアBeadStudioを用いて、マイクロアレイ上の各スポットの数値化を行った。
得られたマイクロアレイデータは、VST（Variance Stabilizing Transformation）、及びRSN（robust spline normalization）を用いて正規化を行なった。陰性対照（マイクロアレイ上に存在しない遺伝子に対するプローブにより測定される遺伝子発現量）に対するPresence Probability <0.05の遺伝子発現量を有意と判断した。４０名中、７０％以上の患者でPresence Probability <0.05の遺伝子を以下の実験に使用した。
２：予測に用いる遺伝子の選択
実施例１の前立腺癌患者を、ペプチドワクチン療法後の生存日数を基準として、生存日数４８０日以上を予後良好群（長命群）、生存日数４８０日未満を予後不良群（短命群）と分類し、2群間を有意に区別できる遺伝子を選択した。解析には、t検定とWilcoxon（ウイルコクソン）検定を用いて行った。
具体的には、16968遺伝子について、短命群 (S)と長命群 (L) で、t検定およびWilcoxon検定を行った（図１、２）。その結果、t検定とWilcoxon検定で、有意水準「p <= 0.001」または「変動量 (Fold Change) が2倍以上」となる54遺伝子を抽出した(表１)。54遺伝子の発現レベル（蛍光リーダー測定値）は、表１の「短命群の平均（Ｓ）」、「長命群の平均（Ｌ）」のカラムに示す。

Figure 2012002011
さらに、選択された54遺伝子からt検定とWilcoxon検定における変数選択を行い（図３、４）、13遺伝子を選択した（表２）。
Figure 2012002011
３．選択された遺伝子の判別率
３−１．判別率の計算
選択された遺伝子による短命群・長命群の判別率を計算した。具体的には、データセットから学習用のデータとテスト用のデータに分けてモデルの構築・テストを行うために、交差確認 (cross-validation) を行った。交差確認法には、データセットから1つの個体を除いて学習を行い、学習データに用いていない1つの個体で判別モデルの評価を行う作業をすべての個体に対して繰り返して行う leave-one-out cross-validation を使用した。
例として、表３に示すプローブID 770400、3130370、4220731、5550711 の4種類の遺伝子を用いた解析結果を示す。解析には、統計解析ソフトSAS（SAS Institute Japan株式会社）および統計解析ソフトJMP（SAS Institute Japan株式会社）を使用した。
Figure 2012002011
表４は、40人の学習用データに対して、leave-one-out cross validation を行った結果を示すものである。つまり、表３の判別関数を用いて、症例がどの群に属するかを予測した表である。表中、(実群)は実際に属している群、(予測)は判別関数を用いて予測された群を表す。表から、S2_pre は 0 (短命群)→ 0 (短命群) へ正しく予測され、S10_pre は 0 (短命群)→ 1 (長命群) へ誤って予測されていることが分かる。表の＊は実際に属している群とは異なる群へ予測された症例を示すものであり、全部で4人存在した。
Figure 2012002011
表５は、表４の結果を 2×2 のクロス表にまとめたものである。
0 → 0 と正しく判別できている症例は 17人 (17/20 = 0.85: 85%)、
1 → 1 と正しく判別できている症例は 19人 (19/20 = 0.95: 95%)
であることが分かる。これが判別率である。
Figure 2012002011
表６は、11人のテスト用データに対して、表３の判別関数を用いて判別分析を行った結果である。表６は、表４と同様症例がどの群に属するかを予測した結果を示す。＊のついた1名の症例（4818441059_E）のみ、1 (長命群) → 0 (短命群) へ誤って判別された。
Figure 2012002011
表７は、表６の結果を 2×2 のクロス表にまとめたものである。
0 (短命群) → 0 (短命群) と正しく判別できている症例は 6人 (6/6 = 1.00: 100%)、
1 (長命群) → 1 (長命群) と正しく判別できている症例は 4人 (4/5 = 0.80: 80%)
であることが分かる。
Figure 2012002011
以上から、プローブID 770400、3130370、4220731、5550711の4種類の遺伝子を用いて判別分析を行うと、学習用データとテスト用データのいずれにおいても、症例の属する群を 80%以上で正しく判別 (予測) できることが分かる。
３−２．選択された遺伝子による判別率
次いで、上記２で選択された13遺伝子の組み合わせについて判別率を計算した。
（１）1遺伝子による判別率
学習用データ (40人) およびテスト用データ (11人) を使用し、13遺伝子のうち1遺伝子により長命または短命の判別が可能か否か（判別率が80%以上となるか）を検討した。
表８に示すように、長命の判別に関して学習用データ (40人) およびテスト用データ (11人) で80%以上の判別率で予測できる遺伝子は、13遺伝子のうち5960072（BY797688）の1種類であった。この遺伝子により予測すると、学習用データ (40人) を使った短命の判別率（ccvP0）は85%、テスト用データ (11人) を使った短命の判別率（ctcP0）は67%となった。一方、学習用データを使った長命の判別率（ccvP1）は85%、テスト用データを使った長命の判別率（ctcP1）は80%となった。
Figure 2012002011
 Pbnum: プローブ（遺伝子）の数
Pb1: プローブID
ccvP0: 学習用データ (40人) を使った 0 (短命)→0 (短命) の判別率
ctcP0: テスト用データ (11人) を使った 0 (短命)→0 (短命) の判別率
ccvP1: 学習用データを使った 0 (長命)→0 (長命) の判別率
ctcP1: テスト用データを使った 0 (長命)→0 (長命) の判別率
flg0： 短命の判別率が、学習用データとテスト用データでともに 80%以上となったもの
flg1: 長命の判別率が、学習用データとテスト用データでともに 80%以上となったもの
（２）2遺伝子による判別率
13遺伝子から任意の2遺伝子を選ぶ組み合わせは78種類あり、表９にその一部を示す。例えば、長命の判別に関して学習データ (40人) およびテストデータ (11人) で80%以上の判別率で予測できる2種類の遺伝子プローブセットは、次の6セット（表９：1〜6）（プローブ１/プローブ2［学習用データ (40人) を使った短命の判別率（ccvP0）は85%/テスト用データ (11人) を使った短命の判別率（ctcP0）; 学習用データを使った長命の判別率（ccvP1）/テスト用データを使った長命の判別率（ctcP1）］：2360672/3130370 (85/66.67;85/80), 770400/2360672(70/33.33;80/80), 770400/5960072 (90/66.67; 80/80), 2360672/5080692 (65/50; 80/80), 2360672/5960072 (95/66.67; 80/80), 2360672/6590484 (75/33.33; 80/80)であった。一方、短命の判別に関して80%以上の判別率で予測できる2種類の遺伝子プローブセットは、次の15セット（表９：7〜21）（プローブ１/プローブ2［学習用データ (40人) を使った短命の判別率（ccvP0）/テスト用データ (11人) を使った短命の判別率（ctcP0）; 学習用データを使った長命の判別率（ccvP1）/テスト用データを使った長命の判別率（ctcP1）］：2370754 /5960072 (80/83.33; 95/40), 3440189/5550711 (85/83.33.; 90/60), 3420136/5960072 (90/83.33; 90/40),： 2370754/4260767 (80/100; 90/0), 2030332/5550711 (90/83.33.; 85/60), 3420136/3440189 (85/83.33; 85/60),： 2370754/3130370 (80/83.33; 85/40), 2360672/4220731 (80/83.33.; 80/60), 3440189/4220731 (8583.33/;80/60), 4220731/4260767 (85/100.; 80/20), 4220731/5550711 (85/83.33; 75/60), 3420136/4220731 (95/83.33.; 75/40), 2370754/4220731 (95/83.33; 75/20),2370754/5550711 (85/83.33.; 7520/),4260767/6590484 (80/100; 75/20)であった。
Figure 2012002011
（３）3遺伝子による判別率
13遺伝子の中から3種類の遺伝子を選択する組み合わせは286種類であり、表１０にその一部を示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ (40人) およびテストデータ (11人) で80%以上の判別率で予測できる3種類の遺伝子プローブセットは2360672/3440189/4220731（表１０：1）のみであり、学習用データ (40人) を使った短命の判別率（ccvP0）は90%、テスト用データ (11人) を使った短命の判別率（ctcP0）は83.33%となった。一方、学習用データを使った長命の判別率（ccvP1）は90%、テスト用データを使った長命の判別率（ctcP1）は80%であった。同様に、80%以上の判別率で長命を予測できるプローブセットは16種類（表１０：2〜17）が挙げられる。また、90%以上の判別率で短命を予測できるプローブセットは、以下の遺伝子プローブセット：2030332/2370754/4260767、2030332/2370754/3440189、3440189/5080692/5550711、2360672/4220731/5550711、3440189/4220731/5550711、2370754/3440189/5550711、2370754/3440189/4220731、2370754/4220731/4260767、3420136/4220731/5550711、3420136/4220731/4260767、3130370/3420136/4220731が挙げられる。
Figure 2012002011
（４）4遺伝子による判別率
13遺伝子の中から4種類の遺伝子を選択する組み合わせは715種類あり、表１１にその一部を示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる4種類の遺伝子プローブセットは18種類［表１１：1〜18］が挙げられる。
Figure 2012002011
（５）5遺伝子による判別率
13遺伝子の中から5種類の遺伝子を選択する組み合わせは1287種類あり、その一部を表１２に示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる5種類の遺伝子プローブセットは55種類（表１２：1〜55）が挙げられる。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
（６）6遺伝子による判別率
13遺伝子の中から6種類の遺伝子を選択する組み合わせは1716種類あり、その一部を表１３に示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる6種類の遺伝子プローブセットは71種類（表１３：1〜71）が挙げられる。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
（７）7遺伝子による判別率
13遺伝子の中から7種類の遺伝子を選択する組み合わせは1715種類あり、その一部を表１３に示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる7種類の遺伝子プローブセットは63種類［表１４：1〜63］である。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
Figure 2012002011
（８）8遺伝子による判別率
13遺伝子の中から8種類の遺伝子を選択する組み合わせは1287種類あり、表１５にその一部を示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる8種類の遺伝子プローブセットは45種類（表１５：1〜45）が挙げられる。
Figure 2012002011

Figure 2012002011
（９）9遺伝子による判別率
13遺伝子の中から9種類の遺伝子を選択する組み合わせは715種類あり、その一部を表１６に示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる9種類の遺伝子プローブセットは22種類（表１６：1〜22）が挙げられる。
Figure 2012002011
（１０）10遺伝子による判別率
13遺伝子の中から10種類の遺伝子を選択する組み合わせは286種類あり、その一部を表１７に示す。例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる10種類の遺伝子プローブセットは7種類（表１７：1〜7）が挙げられる。
Figure 2012002011
（１１）11遺伝子による判別率
13遺伝子の中から11種類の遺伝子を選択する組み合わせは78種類あり、例えば、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる11種類の遺伝子プローブセットは1種類［770400/2360672/2370754/3130370/3420136/3440189/4220731/4260767/5080692/5550711/6590484が挙げられる。
上記と同様にして、13遺伝子の中から12または13種類の遺伝子を選択する組み合わせを検討した。長命・短命の判別に関して学習データ （40人） およびテストデータ （11人） で80%以上の判別率で予測できる遺伝子プローブセットは見いだされなかった。
（１４）判別に優位な遺伝子の選択
上記のように13遺伝子の中から1種類、2種類・・・、13種類を用いた場合に判別率が良い遺伝子（判別率80%以上となった遺伝子セットに用いられる頻度が高い遺伝子）が4種類選択された（プローブID：770400, 2360672, 4220731, 5550711）。表１８および図５は、flg0 と flg1 がともに 1 (学習用データとテスト用データで判別率が 80%以上) となるプローブの組み合わせから得られるプローブの出現頻度を示す。これら4種類の遺伝子が入った組み合わせでは、予後予測可能率が高かった。
Figure 2012002011
実施例２
１：免疫関連遺伝子の選択
16968遺伝子の中から免疫関連遺伝子748遺伝子に焦点を当て、実施例１と同様に短命群と長命群においてt検定を行った。その結果、p値が小さい（有意差が大きい）ものから上位100番目までを候補遺伝子とした(表１９)。前記100遺伝子の発現レベル（蛍光リーダー測定値）は、表１９の「0」（短命群）および「1」（長命群）のカラムに示す。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
Figure 2012002011
上記の100種類の免疫関連遺伝子を用いて変数選択を行った結果、29遺伝子が選択された(表２０)。この29遺伝子の遺伝子セットは、長命・短命の判別に関して学習データ （40人） で100%の判別率で予測可能であった。この遺伝子セットでテスト用データ (11人) を判別したところ、短命の判別率（ctcP0）は83.33%、長命の判別率（ctcP1）は80%であった（表２１）。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
上記29種類の免疫関連遺伝子から、特に関連があると考えられ、かつ生存期間と遺伝子発現の相関が高い上位11遺伝子にTNF関連遺伝子(2360672)を追加した、12遺伝子を選択した（表２２）。
Figure 2012002011
２：選択された遺伝子の判別率
（１）1〜12遺伝子の組合せによる判別率
上記12遺伝子のうち、1種類で高率(ccvP0＋ccvP1＋ctcP0＋ctcP1＞290)に予測可能な遺伝子プローブは１種類:4830255（表２３）であり、短命の判別に関して学習データ （40人） で90％、テストデータ （11人） で50％、長命の判別に関して学習データで70％、テストデータで80％の確率で予測可能であった。
Figure 2012002011
 また、上記12遺伝子のうち、2〜11種類で高率(ccvP0＋ccvP1＋ctcP0＋ctcP1＞290)に予測可能な遺伝子プローブの例を、以下の表に示す。
Figure 2012002011
Figure 2012002011
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上記表において、pb1〜11、ccvP0、ccvP1、ctcP0、ctcP1、sumP、flg_ccv、flg_ctc等は、以下を意味する：
pb1：プローブ1
pb2：プローブ2
pb3：プローブ3
pb4：プローブ4
pb5：プローブ5
pb6：プローブ6
pb7：プローブ7
pb8：プローブ8
pb9：プローブ9
pb10：プローブ10
pb11：プローブ11
pb12：プローブ12
ccvP0：学習用データで、「短命→短命」 と正しく判定できた割合
ccvP1：学習用データで、「長命→長命」 と正しく判定できた割合
ctcP0：テスト用データで、「短命→短命」 と正しく判定できた割合
ctcP1：テスト用データで、「長命→長命」 と正しく判定できた割合
sumP：ccvP0 + ccvP1 + ctcP0 + ctcP1
flg_ccv：ccvP0 と ccvP1 がともに 80%以上のもの
flg_ctc：ctvP0 と ctvP1 がともに 80%以上のもの。
実施例３
進行性再燃前立腺癌患者における個別化ペプチドワクチン投与後900日以上生存した群を長命群（16症例）と、ワクチン投与後300日以内に死亡した群を短命群（14症例）とした。なお、ペプチドワクチンは、ワクチン接種前に存在する宿主免疫を考慮して医師により適宜選択された。最大４ペプチド（3mg/各ペプチド）をフロイント不完全アジュバントと共に、１回／週、６週間皮下投与した。ワクチン投与前およびワクチン投与後で血液を採取し、末梢血単核球(PBMCs)を、Ficoll-Paque （GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden）を用いた密度勾配遠心により調製した。患者の末梢血単核球（顆粒球、リンパ球等を含む）における長命群と短命群の２群間で発現の差が見られる遺伝子を、ＤＮＡマイクロアレイ（Ilumina社製 Human WG-6 v3.0 Expression BeadChip）を用いて、実施例１と同様にして解析した。なお、マイクロアレイのデータは、BeadStudio v3.0 software（Illumina）を用いて抽出した。長命群と短命群の遺伝子発現の差を評価するために、fold-change (FC) rankingおよびLinear Models for Microarray Data (LIMMA) Bioconductor packageを用いたP-valueを採用した。FCは、log2FC=log2(SS/SL)（ここで、SLは長命群由来のサンプルにおける標的遺伝子のアッセイレンジ（assay range）を、SSは短命群由来のサンプルにおける標的遺伝子のアッセイレンジ（assay range）を表す）で計算された。
発現量の違い（log2FC）を横軸に、統計学的有意性（negative log P-value）を縦軸にしたvolcano plotを作成した（図６）。図６中、例えば、円内の領域は、ワクチン投与後において、長命群と短命群の間で発現の差が大きかった遺伝子を示す。
fold-change ranking (log2FC < -1.0 or > 1.0)かつP-value (P <0.01)の条件を満たす遺伝子が36遺伝子に相当する42プローブが同定された。そのうち1遺伝子（LTB）は短命群で減少したが残り35遺伝子はすべて発現が増加した（表３４）。
Figure 2012002011
注目に値するのは35の短命群で増加した遺伝子のうち20種類は顆粒球およびそれらの機能に関連して発現することで知られた遺伝子であった。例えば、ディフェンシン（DEFA1, DEFA3, DEFA4)、ELA2, CTSG, CAMP, あるいは MPOなどが、顆粒球細胞中の顆粒内に局在することが知られている。さらにMMP9やアルギナーゼのように腫瘍増殖や免疫抑制に重要な役割を演じる分子などが認められた。
短命群の方が長命群よりも発現が増加した遺伝子の中で、DEFA1, DEFA4, CEACAM8, および MPOの4種類につき、 異なる遺伝子発現をリアルタイムPCRで確認した（図７）。リアルタイムPCRは、Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio)を使用し、a SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara Bio)を用いて行った。defensin alpha, myeloperoxidase (MPO)、carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8(CEACAM8)、GAPDHについて使用したプライマーの配列は、以下(a)〜(d)のとおりである。
（a）DEFA1
PCRプライマー１：5’-CGGACATCCCAGAAGTGGTTG-3’（配列番号１）
PCRプライマー２：5’-CCCTGGTAGATGCAGGTTCCATA-3’（配列番号２）

（b）DEFA4
PCRプライマー１：5’-CACTCCAGGCAAGAGGTGATGA-3’,（配列番号３）
PCRプライマー２：5’-GAGGCAGTTCCCAACACGAAGT-3’;（配列番号４）

（c）CEACAM8
PCRプライマー１：5’-TGGCACATTCCAGCAATACACA-3’,（配列番号５）
PCRプライマー２：5’-ATCATGATGCTGACAGTGGCTCTA-3’;（配列番号６）

（d）MPO
PCRプライマー１：5’-CTGCATCATCGGTACCCAGTTC-3’（配列番号７）
PCRプライマー２：5’-GATGCCTGTGTTGTCGCAGA-3’;（配列番号８）

(e) GAPDH
PCRプライマー１：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’, （配列番号９）
PCRプライマー２：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’. （配列番号１０）
実施例４
ワクチン投与前の患者末梢単核球で長命群（20症例）と短命群（20症例）で発現の異なる遺伝子を検索した。遺伝子の発現量（FC）およびlimma P-valueともにワクチン投与後の場合（実施例３参照）よりも減少した。事実、ワクチン投与後と同じ基準値(log2FC < -1.0 or > 1.0 and P <0.01)で遺伝子を選択した場合、5遺伝子由来の5プローブのみが異なる発現遺伝子として同定された。同じ基準値と比べてより厳しくない基準値（log2FC < -0.6 or > 0.6 and P <0.05）を用いた場合は19遺伝子由来の23プローブが選択された。それらの遺伝子のうち、4遺伝子（PRKAR1A, LRRN3, PCDH17, TTN）が短命群で減少し、15遺伝子（LAIR2、RNASE3、CEACAM6、AZU1、HIST1H4C、PGLYRP1、CEACAM8、LCN2、MPO、CAMP、DEFA1、DEFA3、CTSG、DEFA4、ELA2）が増加した（表３５）。
Figure 2012002011
 注目すべき点としては、これらの短命群で増加した15種類の遺伝子のうち13種類は顆粒球特異的でワクチン投与前後で一般的に同定される遺伝子であった。
マイクロアレーによる遺伝子発現情報のもっとも重要な応用の一つが、治療効果の予測である。そこで、ワクチン投与前の患者末梢単核球でのcDNAマイクロアレーで検索した遺伝子発現プロファイルがペプチドワクチン投与後における予後予測に有用であるかどうかを検討した。上記４０症例（長命群（20症例）と短命群（20症例））について、ワクチン投与前の末梢単核球で発現の異なった23プローブ（表３５）から変数選択(The stepwise discriminant analysis method)でLRRN3, PCDH17, HIST1H4C, および PGLYRP1の4つの遺伝子セット選び、予後予測を検討した。その結果、４０人中３２人(80%)で、ワクチン投与後の予後（長命または短命か）を予測することができた。Sensitivity (%)、Specificity(%)、positive predictive value、negative predictive value、Accuracy(%)は、それぞれ、85%(17/20); 75%(15/20); 77%(17/22); 83%(15/18); 80%(32/40)であった。（表３６の上（Training））。確認として、新規independent patients（13人）を対象に４つの遺伝子を用いて判定を行った。その結果、13人中12人(93%)で、ワクチン投与後の予後（長命または短命か）を予測することができた（表３６の下（Test））。Sensitivity (%)、Specificity(%)、positive predictive value、negative predictive value、Accuracy(%)は、それぞれ、100%(7/7); 83%(5/6); 88%(7/8); 100%(5/5); 92%(12/13)であった。なお、表３６中、○で囲んだ数字は、予測で短命群に入り、実際にも短命だった患者数、つまり、 ワクチン投与前の予後不良判定当たり数を示し、□で囲んだ数字は、予測で長命群に入り、実際にも短命だった患者数、つまり、ワクチン投与前の予後良好判定当たり数を示す。
Figure 2012002011
また、ワクチン投与前の患者の血漿中のサイトカイン、ケモカインおよび成長因子のレベルの検出を、bead-based multiplex assay (xMAP; Luminex Corporation, Austin, TX）を用いて行った。IL-1Rα, IL-1β, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IP-10, RANTES, Eotaxin, MIP-1α, MIP-1β MCP-1, MIG, VEGF, EGF, HGF, および FGF basicを含むサイトカイン、ケモカインおよび成長因子のレベルの測定は、キット（Invitrogen Corporation: Human 30-Plex)を用いて行った。
その結果、長命群に比較し、短命群では血漿にIL-6が高含量存在した（図８）。
本発明は、免疫療法による効果が期待できない患者（予後不良群）の予測を可能とし、がん患者に対する治療法の選択に有用な情報を提供する。
本出願の優先権主張の基礎となる出願は日本国特許出願：特願２０１０−１４７７９７であり、引用によりその全内容が本出願に含まれる。

Claims (21)

  1. がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、免疫療法前のがん患者から採取された試料において、表１または表１９に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、を含む方法。
  2. 遺伝子セットが、LOC653600、TNFRSF19、P4HA1およびSYNE1を含む、請求項１に記載の方法。
  3. がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、免疫療法後のがん患者から採取された試料において、表３４に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、を含む方法。
  4. 遺伝子セットが、DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOを含む、請求項３に記載の方法。
  5. がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、免疫療法前のがん患者から採取された試料において、表３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セットの各遺伝子の発現レベルを測定する工程、を含む方法。
  6. 遺伝子セットが、LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1を含む、請求項５に記載の方法。
  7. さらに、該発現レベルを用いて判別分析を行い、該患者の予後を判定する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 予後不良群を予測するための、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 免疫療法がペプチドワクチン療法である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. がんが前立腺癌である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. がん患者から採取された試料が、血液である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. がん患者に対する免疫療法の効果を予測するための、表１、１９、３４、または３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる遺伝子セット。
  13. 遺伝子セットが、表２または２２に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子からなる、請求項１２に記載の遺伝子セット。
  14. LOC653600、TNFRSF19、P4HA1およびSYNE1を含む、請求項１２または１３に記載の遺伝子セット。
  15. DEFA1、DEFA4、CEACAM8およびMPOを含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の遺伝子セット。
  16. LRRN3、PCDH17、HIST1H4CおよびPGLYRP1を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の遺伝子セット。
  17. 請求項１２〜１６のいずれかに記載の遺伝子セットからなるがん患者に対する免疫療法の効果を予測するためのバイオマーカー。
  18. 表１、１９、３４、または３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計されたプローブ。
  19. 請求項１８に記載のプローブおよび／または表１、１９、３４、または３５に示す遺伝子の群から選択される少なくとも１の遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーを含むキット。
  20. プローブおよびプラーマーが以下（１）〜（４）：
    （１）配列番号１の配列からなるプライマー、配列番号２の配列からなるプライマーおよび配列番号３の配列からなるプローブ；
    （２）配列番号４の配列からなるプライマー、配列番号５の配列からなるプライマーおよび配列番号６の配列からなるプローブ；
    （３）配列番号７の配列からなるプライマー、配列番号８の配列からなるプライマーおよび配列番号９の配列からなるプローブ；および、
    （４）配列番号１０の配列からなるプライマー、配列番号１１の配列からなるプライマーおよび配列番号１２の配列からなるプローブ；
    のいずれかの組み合わせである、請求項１９に記載のキット。
  21. がん患者に対する免疫療法の効果を予測する方法であって、免疫療法前のがん患者から採取された血液において、IL-6タンパク質の発現量を測定する工程、を含む方法。
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