JPWO2011115106A1 - 擬似運動療法のための医薬 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明により、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を有効成分として含み、運動を負荷することなく筋肉の生理状態を運動後の生理状態に変化させるための医薬が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、糖尿病の予防及び/又は治療における運動療法の代替薬物療法のために用いる上記の医薬が提供される。
さらに、上記の医薬の製造のためのアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物の使用が提供される。
(a)被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程;及び
(b)上記工程(a)で選抜されたアゴニスト候補化合物をAdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせるアゴニスト候補化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物として選抜する工程
を含む方法により、効率的かつ精度よくアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物をスクリーニングすることができる。
A.方法
マウスとしては実験時に8-10週齢のものを用いた。muscle-R1KOマウスの運動能力の測定については、トレッドミル運動負荷試験のレジメを20分間及び15 m/分とし、運動耐容能は20分をマウスが電気刺激を回避することができなかった回数で割ることにより評価した。C2C12細胞による筋原性分化の誘導は文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288−1295 (2002))により行った。5日目までに細胞は多核収縮筋細胞に分化していた。C2C12筋細胞はすべての実験において筋原性分化の後に使用した。
以下、方法の詳細について説明する。
第三のloxPサイトがAdipor1遺伝子のイントロン2に導入され、floxed(loxPが導入された)ネオマイシン耐性遺伝子(neoR)がAdipor1遺伝子のイントロン5へ導入されたAdipor1のための標的ベクターを構築した(図20a)。培養、J1胚性幹(ES)細胞(129/Sv)のエレクトロポレーション及び相同組換クローン用スクリーニングの方法は、J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002)に記載の方法に若干の変更を加えた。雄のキメラマウスをC57Bl/6雌マウスと掛け合せてヘテロ(Adipor1lox/+)マウスを作成し、別個に作成した2匹の雄のキメラマウスからのF1子孫をC57Bl/6雌マウスと掛け合せて、F2マウスを得た。両方のマウス系とも本研究で行った全実験を通じて同一の表現型を示した。その後、本発明者らはAdipor1lox/+マウス (C57Bl/6及び129/svバックグラウンド)とC57Bl/6マウスの5回を超える回数の戻し交配を行った。
floxed AdipoR1対立遺伝子を有する動物と、形質転換により筋肉クレアチンキナーゼプロモーター(MCK-Cre)の調節下でcreレコンビナーゼを発現するマウス(Mol. Cell, 2, 559-569 (1998)とを交配させることによってmuscle-R1KOマウスを作成した(図26a,b)。ノーザンブロッティング(図26c)及びリアルタイムPCR(データ非表示)から、muscle-R1KOマウスの腓腹筋及びヒラメ筋ではAdipoR1 mRNA発現が対照マウスで見られたそれの約5%にまで劇的に縮小されていることが明らかになった(図26c)。肝臓や脂肪組織のようなAdipoR1を発現することが知られている他の組織も検査したが、AdipoR1転写レベルの著しい変化はいずれにも見られなかった(図26c)。AdipoR1発現は心臓では約70%に減少したが、非筋肉組織では変化せず、このことはAdipoR1の筋肉特異的なノックアウトが筋肉において成功しており、また特異的であることを示していた。重要なことに、これらの組織のいずれもAdipoR2レベルの代償性のいかなる増加調節も示さず、また血漿アディポネクチンレベルの有意な変化はなかった。
PCRを用いてマウスの遺伝子型決定を行った。AdipoR1遺伝子型決定に2つのプライマーを使用した:フォワードプライマーとして5'-ACA GGC ACA TAA CAT CTA AGG CA -3'及びリバースプライマーとして5'-AGC ATG ATA CTG AGT TGG CCA CA-3'を用いた。floxed AdipoR1遺伝子の検出における2個のプライマーとしては、5'-CGG TGT TGA CGA GGC GTC CGA AG -3'及び5'-GGT CTT CGG GAT GTT CTT CCT G -3'を用いた。Creの検出に用いたプライマーは、5'-CGC CGC ATA ACC AGT GAA AC -3'、5'-ATG TCC AAT TTA CTG ACC G-3'、5'-ACA GCG TGA ATT TTG GAG TCA GAA-3'及び5'-GCT TTG CTC AGC CTC GCT AT -3'とした。
in vivoでのAMPKリン酸化を研究するために、下大静脈カテーテルによりマウスに体重10gあたり30μgの組み換えネズミ・アディポネクチンを静脈内注射した(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002))。それにより血漿アディポネクチンレベルがおよそ30μg/mlに増加した;このことは、本研究で使用したアディポネクチン用量が内因性のアディポネクチンレベルに匹敵したことを示している。マウスの全長アディポネクチンは以下の文献記載の方法により作成した(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003))。
ノーザンブロットは文献記載の方法に従って行った(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); Nature 423, 762-769 (2003))。全RNAはメーカーの説明書に従ってTrizol (Invitrogen)を用いて細胞又は組織から調製した。AdipoR1のcDNAプローブテンプレートは特異的プライマーを用いるRT-PCRよって調製した。フォワードプライマーとしては5'-GCTGAGGAAGATCAAGCATGCCCGGTG -3'、リバースプライマーとしては5'-TTGGAAAAAGTCCGAGAGACCTTCTCTG -3'を用いた。
AMPKα、PGC-1α、トロポニンI、IRS-1、Akt、S6K1、JNK、CaMKI、MEF2、MCAD、SOD2、カタラーゼ、Glut4、HDAC5及びFOXO1のリン酸化及び/又はタンパク質レベルは文献記載の方法により測定した(EMBO J. 19, 989-996 (2000); Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006); Nature 458, 1056-1060 (2009); Cell Metab. 4, 75-87 (2006); Nature 444, 860-867 (2006); Steroids 72, 422-428 (2007))。3-5-非依存性実験の1つからの代表的なデータを示す。
マウスC2C12筋原細胞を10%(v/v)ウシ胎児血清を含む90%ダルベッコ改良・高グルコース・イーグル培地中で培養した。細胞が80%コンフルエントに達した時点で、培地を低血清分化誘導用培地(98%ダルベッコ改良・高グルコース・イーグル培地、2.5%(v/v)のウマ血清)に置き換えることにより、筋原細胞を筋細胞に分化するように誘導した。培地は毎日交換した。C2C12細胞は、ポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用し、メーカーの説明書に従ってトランスフェクトした。
ミトコンドリア含有量の分析は文献記載の方法(Cell Metab. 4, 75-87 (2006))に若干の変更を加えて行った。ミトコンドリア含有量の定量は、文献記載の方法(Obes. Res. 13, 574-581 (2005))により mtDNA及びMitoTrackerグリーンプローブ(Molecular Probes)を用いて行った。MitoTrackerグリーンプローブは、ミトコンドリアの膜電位にかかわらずミトコンドリア内に優先的に蓄積し、ミトコンドリア質量の正確な評価を行うことができる。細胞をPBSで洗浄し、100nM MitoTrackerグリーンFM(Molecular Probes)を加えて37℃で30分間培養した。トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、PBSに再懸濁した。蛍光強度を490及び516nmの励起波長及び発光波長をそれぞれ用いて検出し、測定値は全タンパク質(mg/ml)に対応するように補正した。
光学顕微鏡及び組織化学的分析法を用いて、muscle-R1KOマウスの骨格筋(ヒラメ筋)におけるI型繊維遺伝子発現の変化と実際の筋繊維形態の間の関係を調べた。I型及びII型繊維の間の識別は種々のpH値でのミオシンATPase染色によって行うことができる。特に、pH 4.3ではI型繊維はよく染まるが、II型繊維は染まらない(Physiol. Rev. 80, 1215−1265 (2000))。筋肉サンプルは液体窒素で冷却したイソペンタン中に冷凍し、横方向の連続切片を改良Gomori トリクロームで染色した(J. Neurol. Sci. 26, 479-488 (1975))。シトクロムcオキシダーゼ(COX)( J. Cell Biol. 38, 1-14 (1968))及びコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)活性(A Modern Approach,Muscle Biopsy. (Saunders, London, 1973))を酵素組織化学的に分析して評価した。
血漿H2O2レベルはAmplex Red過酸化水素アッセイキット(Invitrogen)( J. Clin. Invest. 118, 789-800 (2008))を用いて測定した。ミトコンドリアのH2O2レベルはAmplex redホースラディッシュペルオキシダーゼ法(Molecular Probes)( Anal. Biochem. 253, 162-168 (1997))により測定した。
骨格筋ホモジネートを抽出し、組織トリグリセリド含有量を文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))に若干の変更を加えて測定した。酸化ストレスが増加したかどうかを調べるために、文献記載の方法に従って血漿チオバルビツル酸反応性物質(TBARS)に代表されるような酸化的損傷のマーカーによって脂質過酸化反応を測定した(J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))。組織サンプルを50mM Tris-HCl(pH 7.4)及び1.15%KClを含む緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離にかけた。上清をアッセイに使用した。組織ホモジネート及び血漿中の脂質過酸化反応のレベルをLPOテスト(和光純薬工業)を使用してTBARSの量で測定した。化学物質を含む他の全ての材料は参考文献(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006); J. Biol. Chem. 279, 30817-30822 (2004))中に記載される供給元から入手した。
血漿ブドウ糖レベルはグルコースBテスト(和光純薬工業)を使用して測定した。血漿インスリンはインスリンイムノアッセイ(Shibayagi)により測定した。
クランプ実験は文献記載の方法(J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))に若干の変更を加えて行った。実験の2-3日前にペントバルビタールナトリウムによる全身麻酔下で右頚静脈中に注入カテーテルを挿入した。実験は6時間の絶食の後、覚醒してストレスの無い条件下のマウスで行った。インスリンのprimed continuous infusion法(Humulin R, Lilly)を行い(3.0 ミリユニット/kg/min)、ブドウ糖投与( [6,6-2H2]ブドウ糖で20%に濃縮した10mlあたり5gのブドウ糖(シグマ))により血中ブドウ糖濃度を5分毎にモニターして120分間120mg/dlに維持した。血液は尾部先端から90、105及び120分後にサンプリングしてブドウ糖消失率(Rd)を測定した。Rdは非定常状態方程式によって計算し、内因性ブドウ糖生産(EGP)をRdと外因性ブドウ糖注入率との間の差として求めた(J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))。
使用したトレッドミル運動試験のレジメは2週間、1日当たり30分間、15m//分とした。
2対のsiRNAsを、リポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen)を使用して、化学的に合成しアニリーングしてC2C12筋細胞中にトランスフェクトした(J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))。センスsiRNAsの配列は以下のとおりである、
マウスAdipoR1:GAGACUGGCAACAUCUGGACATT;
マウスAdipoR2:GCUUAGAGACACCUGUUUGUUTT。
AMPKα1、AMPKα2、CaMKKβ、PGC-1α、SIRT1及びLKB1 siRNAは、アプライド・バイオシステムズから購入した。非機能性jumbled siRNA(関連性なし)(アプライド・バイオシステムズ)でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。トランスフェクションの48時間後に、細胞を溶解した。
NAD+及びNADHヌクレオチドは文献記載の方法(Nature 458, 1056-1060 (2009))により直接測定した。全体骨格筋又は2枚の10cmデッシュのC2C12筋細胞を200μlの酸抽出バッファー中でホモジナイズしてNAD+濃度を測定するか、あるいは200μl のアルカリ抽出によりNADH濃度を測定した。次に、ホモジネートを中和し、サンプル5μlを使用して酵素による循環反応を行った後に蛍光法でヌクレオチド濃度を測定した。両方のヌクレオチドに対する値は線形範囲内に検知された。各動物又は各実験中の平行細胞デッシュから得られた比率の比較により、NAD+/NADH比を計算した。
ガラスベースデッシュ(IWAKI)上で培養されたC2C12筋細胞を2.5μM fura-2/AMで30分間処理した。Aquacosmosカルシウム画像システム(浜松フォトニクス)で蛍光を測定した。リガンドは、灌流リンゲル溶液(140 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5mM HEPES, 2.0 mMピルビン酸ナトリウム塩, 1.25 mM KH2PO4, 2.0 mM CaCl2, 2.0 mM MgCl2, 9.4 mM D-グルコース(pH 7.4))によって供給した。カルシウムキレート化実験については、EGTA溶液(140 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5 mM HEPES, 2.0 mMピルビン酸ナトリウム塩, 1.25 mM KH2PO4, 2.0 mM MgCl2, 5.0 mM EGTA-2Na, 9.4 mM D-グルコース (pH 7.4))を槽溶液として用いた。fura-2蛍光比をカルシウムイオン信号に換算した。
V期ないしVII期の卵母細胞を、室温で1ないし2時間、カルシウムイオンフリーの食塩水(82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2及び5 mM HEPES, pH 7.5)中で2 mg/mlコラゲナーゼS-1(新田ゼラチン)で処理した。次いで、mAdipoR1用の50 ngのcRNAを卵母細胞に微量注入した。cRNAは線形修飾pSPUTKから合成した。注入処理した卵母細胞を10μg/mlのペニシリン及びストレプトマイシンを添加した浴槽溶液(88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.3 mM Ca(NO3)2, 0.4 mM CaCl2, 0.8 mM MgSO4, 2.4 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, pH 7.6)中、18℃で3日間培養した。
マウスのヒラメ筋の切片を8-10週齢マウスから切り出した。標本を0.1%のクレモフォア EL(Sigma)の存在下で5μM fura-2/AMで15分間処理した。蛍光画像は、冷却電荷結合素子(CCD)カメラ(iXon、アンドール)及び乾燥対物レンズ(10x、NA=0.3、オリンパス)を装備した倒立蛍光顕微鏡(IX71、オリンパス)を使用して、327-353 nm及び369-391nmの励起フィルタ、409nmのダイクロイックミラー及び515-560nmの蛍光フィルタから成るフィルターセットにより得た。リガンドは、灌流リンゲル溶液(150のmM NaCl, 4 mM KCl, 2.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 30 mM D-グルコース, 5 mM HEPES (pH 7.4))によって供給した。
(19)インスリン抵抗性指数
経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)及びインスリン耐性試験(ITT)は文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001))に若干の変更を加えて行った。ブドウ糖とインスリン曲線の面積は、それぞれブドウ糖値(1 mg/ml=1cm)及びインスリン値(1 ng/ml=1cm)の累積平均高に時間(60min=1cm)を掛けることにより計算した(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); Nature Med. 7, 941-946 (2001))。インスリン抵抗性指数は、ブドウ糖負荷試験でのブドウ糖とインスリンの面積の積×10-2から計算した。結果は対照同腹子の値に対するパーセンテージで表わした。
クエン酸シンターゼ活性は、文献記載の方法(Cell Metab. 4, 75-87 (2006); Eur. J. Biochem. 10, 198-206 (1969); Obes Res 13, 574-581 (2005))を使用してホモジネートから分光光度計で測定した。クエン酸シンターゼ活性は0.12 mM 5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)及び0.6 mMオキサロ酢酸塩を含む0.1M Tris-HCl(pH 8.3)アッセイバッファー中で37℃で測定した。最初の2分間に412 nmでの吸光度を記録した後、3 mMアセチル-CoAを加えて反応を開始し、吸光度の変化を7分間、10秒毎に測定した。
酸素消費量は、絶食条件下の動物でO2/CO2代謝測定システムを用いて24時間、3分毎に測定した(モデルMK-5000; 室町機械、東京、日本)。マウスをそれぞれ室温で0.5 l/minの気流が供給されている密閉チャンバー(560 ml容積)中に入れた。酸素消費量はそれに流量を掛けることによりミリリットル/分に換算した。
文献記載の方法(J. Control Release 64, 133-142 (2000))によってゼラチン水溶液をグルタルアルデヒドで架橋することによりヒドロゲルを調製した。ゼラチンヒドロゲル中にBay-K 8644を取り込むために、20μlのBay-K 8644 (0.25μM)を20 mgの凍結乾燥ヒドロゲル上に滴下し、4℃で一晩放置した。麻酔下で、Bay-K 8644を取り込んだゼラチンヒドロゲルを皮下に移植した。その後、皮膚を4-0ナイロンモノフィラメントで注意深く縫合した。
全細胞電流はパッチクランプ増幅器(CEZ-2400;日本光電工業)で増幅し、PowerLabディジタイザ(AD Instruments)でデジタル化した。細胞外溶液にはリンゲル液を使用した。電極溶液は140 mM KCl, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA-2K及び10 mM D-グルコースを含んだ(pH 7.4)。データは2 kHzのローパスフィルタにかけ、20 kHzでサンプリングした。リンゲル液に溶かしたリガンドを、自作の加圧放出システムで、2連ガラスキャピラリーを通じて少なくとも2回供給した。
(1)muscle-R1KOマウスにおけるPGC-1αとミトコンドリアの減少
muscle-R1KOマウスはAMPKリン酸化の低下を示した(図1a)。さらに、アディポネクチンの投与により、対照である同腹子の筋肉中のAMPKリン酸化は増加したが、muscle-R1KOマウスでは増加しなかった(図7a)。一方、アディポネクチンは両方の遺伝子型において肝臓中のAMPKのリン酸化を増加させた(図7b)。muscle-R1KOマウスではさらにPGC1-αのようなミトコンドリア生合成に関与する分子(Cell 98, 115−124 (1999))も、メッセンジャーRNA(Ppargc1a)(図1b)及びタンパク質レベル(図1c)の両方で減少していた。アディポネクチンは、対照である同腹子の筋肉中のPpargc1aの発現レベルを増加させたが、muscle-R1KOマウスでは増加させなかった(図7c)。
muscle-R1KOマウスではI型繊維(Physiol. Rev. 80, 1215−1265 (2000)) 分化筋細胞エンハンサー因子2C(Mef2c) (EMBO J. 19, 1963−1973 (2000)) (図1b)に関与する分子も減少しており、I型繊維マーカー・トロポニンI (slow)も減少していた(図1e)。対照的に、muscle-R1KOマウスでMHCIIa、MHCIIx及びMHCIIbの発現レベルは対照マウスに見られたものとほぼ同レベルであり(図8c-e)、このことはmuscle-R1KOマウスにおける酸化的高耐久性繊維が減少していることを示してる。これらの知見は、組織学的分析(図1f,g)と一致した。muscle-R1KOマウスのヒラメ筋では、I型繊維は20%減少していた(図1g)。
ブドウ糖投与の後のブドウ糖及びインスリンの血漿レベルは、対照マウスよりもmuscle-R1KOマウスにおいて著しく高かった(図2a,b)。対照マウスと比較してmuscle-R1KOマウスがインスリン摂取後に血漿ブドウ糖レベルを調整する能力は著しく低下していた(図2c)。高インスリン−正常血糖クランプ実験を行なったところ、筋肉中のAdipor1を破壊しても内因性のブドウ糖生産が有意に変化することはなかったが、ブドウ糖消失率とブドウ糖注入率は著しく低下した。このことは筋肉中のインスリン感受性の低下を示している(図2d-f)。
次に、muscle-R1KOマウスが先に述べたこれらの表現型を示す分子メカニズムを調べた。C2C12筋細胞に30μg/mlアディポネクチンを加えてインキュベートしたところミトコンドリアDNA含有量が増加した(図3a)。AMPK活性は、AMPKキナーゼ(AMPKK) (Cell Metab. 1, 15−25 (2005); J. Biol. Chem. 271, 27879−27887 (1996))による活性化ループ中においてAMPKα(Thr 172)のリン酸化に依存している。LKB1とCaMKKβは様々な組織及び細胞中に存在する2つの主要なAMPKKであることが知られている(Cell Metab. 1, 15−25 (2005); Cell Metab. 2, 9−19 (2005); Cell Metab. 2, 21−33 (2005))。AdipoR1又はCaMKKβを抑制すると、あるいはAMPKα1、及びAMPKα2又はPGC-1αの両方の発現をそれぞれに特異的な短分子干渉RNA(siRNA)により抑制すると(図9a-e)、アディポネクチンにより誘導されるミトコンドリアDNA含有量の増加が顕著に縮小した(図3a)。対照的に、特異的なsiRNAによりAdipoR2発現を抑制(図9f)しても、アディポネクチンにより誘導されるミトコンドリア生合成が有意に減少することはなかった(図3a)。
興味深いことに、C2C12筋細胞をアディポネクチンで処理すると、fura-2-ベースの蛍光イメージングで測定した細胞内カルシウムイオン濃度が増加した(図4a)。C2C12筋細胞はアディポネクチンに対して用量依存的な応答を示した。EGTAにより細胞外の遊離カルシウムイオンを除去すると、アディポネクチン誘導性のカルシウムイオン応答はほとんど完全に消失したが(図4a)、EGTAはATP誘導性の細胞内カルシウムイオン放出に効果を示さなかった。特異的なsiRNAを用いてAdipoR1発現を抑制すると(図4b)、C2C12筋細胞のアディポネクチンに対するカルシウム応答は大幅に縮小した(図4c,d)。これらの結果は、C2C12筋細胞のアディポネクチン処理後の細胞外カルシウムイオンの流入にAdipoR1が介在することを示している。
C2C12筋細胞にアディポネクチンを加えてインキュベートするとThr 172におけるAMPKα-のサブユニットのリン酸化が増加し、EGTAはアディポネクチン誘導によるAMPKリン酸化の増加を部分的に抑制した(図5a)。EGTAはAMPKのイオノマイシン依存性リン酸化をほとんど完全に消失させたが、EGTAはC2C12筋細胞におけるAMPKの5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-D-リボシド(AICAR)誘導によるリン酸化に影響を及ぼさなかった(図5a)。
さらに、運動によるカルシウムイオン信号伝達経路及びAMPK/SIRT1経路の同時活性化がAdipoR1とは無関係にmuscle-R1KOマウスにおける表現型を回復させるかどうか調べたところ、2週間の運動によりmuscle-R1KOマウス(図6a-d)の筋肉においてインスリン抵抗性が著しく改善し、ミトコンドリアの含有量及びクエン酸シンターゼ活性のような機能が増加していた。
(7)muscle-R1KOは骨格筋におけるアディポネクチン作用を低下させる
muscle-R1KOはAMPK (図1a)とその細胞内基質であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)(図14a)のリン酸化の減少を示した。muscle-R1KOミトコンドリア特異的ゴモリ染色の減少を示した(図15a)。
muscle-R1KOはI型繊維分化筋細胞エンハンサー因子2C(Mef2c) (EMBO J. 19, 1963-1973 (2000)) (図1b及び図16a)と共にI型繊維マーカー・ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームI(図15b)、トロポニンI(slow) (Tnni1) (図1e及び図15c)及びミオグロビン(Mb) (Physiol. Rev. 80, 1215−1265 (2000)) (図15d)に関与する分子の減少を示した。これらの結果は、組織学的分析と一致した(図1f,g及び図15e)。muscle-R1KOマウスのヒラメ筋では、I型繊維は20%減少していた(図1g及び図15e)。
muscle-R1KOマウスの筋肉中のMEF2、MCAD、SOD2、カタラーゼ及びGlut4のタンパク質発現レベルは対照マウスで見られるものと比較して著しく減少していた(図16)。これらの結果は、muscle-R1KOマウスが筋肉中においてI型繊維の減少、組織トリグリセリド含有量の増加、及び酸化ストレスの増加を示したという結果に合致していた。
30μg/mlアディポネクチンを加えてC2C12筋細胞をインキュベートすると、MitoTrackerグリーンを用いての評価ではミトコンドリアDNA含有量及びミトコンドリア量が増加した(図17a-c)。AMPK阻害剤であるAraAは単独で、ミトコンドリア生合成の増加に対するアディポネクチンの効果をほとんど完全に消失させた(図17a,c)。CaMKK阻害剤であるSTO-609 (J. Biol. Chem. 277, 15813-15818 (2002))は単独で、ミトコンドリア生合成の増加に対するアディポネクチンの効果をほとんど完全に消失させた(図17a,c)。
アディポネクチンはC2C12筋細胞中のNAD+/NADH比、NAD+及びNADHの含有量を増加させた(図3g及び図18a,b)。muscle-R1KOもin vivoでNAD+/NADH比、NAD+及びNADH含有量の減少を示した(図3i及び図18c,d)。これらの結果は、PGC-1αの発現と脱アセチルを掛け合わせて評価される総活性がmuscle-R1KOマウスでは顕著に縮小されていることを示唆している(図10)。
AdipoR1を筋特異的に破壊してもPPARα(Ppara)レベルに有意な効果はなかったが (図19a)、その結果として、筋肉中のACO(Acox1)のようなPPARα標的遺伝子の発現レベルは著しく低下した(図19b)。この結果はPGC-1α活性の低下を示唆している。また、これらの結果は、muscle-R1KOマウスが筋肉中にPPAR補活性化因子としてのPGC-1α活性の低下を示すという結果と一致していた。
AdipoR1を筋特異的に破壊するとO2消費が著しく減少したが(図19c)、RQには有意な効果はなかった(図19d)。これらの結果は、AdipoR1の筋特異的な破壊が結果としてブドウ糖と脂肪酸の酸化を両方とも減少させることを示唆している。
Glut4(Slc2a4)の発現レベルは、ヒラメ筋のようなI型繊維が豊富な筋肉やmuscle-R1KOの腓腹筋のようなタイプIIに富んだ筋肉においても、対照マウスのそれと比較して著しく減少していた(図19e,f)。これらの結果はmuscle-R1KOマウスの筋肉中に観察されたGlut4の低下が単に繊維状組成物の変質による二次的なものではないという考えと一致している。
カルシウムイオン-チャネルオープナー(Nature 303, 535-537 (1983); Am. J. Physiol. 258, R462-468 (1990))であるBay-K 8644 を0.25μM加えたことによるCaMKKβ活性の増加(図20a)は、muscle-R1KOマウスの筋肉においてAktのインスリン刺激によるリン酸化を著しく増強し(図20b)、ミトコンドリアの含有量(図20c)やクエン酸シンターゼ活性のような機能(図20d)を増大させた。これらの結果は、AdipoR1によるアディポネクチン誘導性の細胞外カルシウムイオンの流入が筋肉中のミトコンドリア生合成のアディポネクチン誘導性の増加にとって重要であるという結論と一致している。
AICAR(Am. J. Physiol. 273, E1107-1112 (1997))の投与は、muscle-R1KOマウスの筋肉におけるAMPKのリン酸化を著しく増加させた(図20e)。AICARによるAMPKの活性化(Diabetologia 45, 56-65 (2002); Cell 134, 405-415 (2008))及びレスベラトロールによるSIRT1活性化(Cell 127, 1109-1122 (2006))はmuscle-R1KOマウスの筋肉中でインスリン抵抗性を著しく改善し、ミトコンドリア含有量及びクエン酸シンターゼ活性のような機能を増大させた(図20f-i及び図21a-d)。これらの結果は、AdipoR1による、アディポネクチンに刺激されたAMPK及びSIRT1の活性化が筋肉中のインスリン感受性及びミトコンドリア生合成のアディポネクチン誘導性の増加にとって重要であるという結論と一致している。
特異的siRNAによるAdipor1の抑制(図9a)はアディポネクチンによるミトコンドリア含有量の増加を顕著に縮小し(図3a)、同時にAkt中のSer 473のインスリン刺激性のリン酸化の増加を顕著に縮小した(図22a)。これらのデータは、特にアディポネクチンによるミトコンドリア能力の活性化が筋細胞中のインスリン信号伝達の増加に関係しているという考えと一致している。
Foxo中のThr 24及びSer 253のインスリン刺激性のリン酸化(EMBO J. 19, 989-996 (2000))は、muscle-R1KOマウスの骨格筋中では対照マウスにおけるそれと比較して著しく減少していた(図22b)。これらの結果は、1型 筋繊維の減少、不十分な血糖調節及び身体的な運動能力の低さのような筋肉におけるAdipoR1ノックアウトの影響の多くが、Foxo 活性化の影響(J. Biol. Chem. 279, 41114-41123 (2004))に類似しているという考えと一致している。
デアセチラーゼSIRT1ノックダウン処理を行ったC2C12筋細胞にアディポネクチン刺激を行った際のPGC-1αアセチル化の量は、アディポネクチン刺激を行っていないC2C12筋細胞におけるものとほとんど同じであった。これらの結果は、6時間の絶食のような本発明者らの条件下ではアディポネクチン刺激が無いとC2C12筋細胞中でデアセチラーゼSIRT1は十分に活性化されないという可能性を示している(図22c)。
アディポネクチンに対する内向き電流反応を、-60mVの保持電位でC2C12筋細胞の全細胞パッチクランプ記録によって観察した(図23a)。また、特異的siRNAによりAdipoR1発現を抑制すると(図4b)、C2C12筋細胞のアディポネクチンに対する全細胞の電流反応は著しく縮小した(図23a,b)。これらの結果は、C2C12筋細胞のアディポネクチン処理における電流発生にはAdipoR1が介在することを示唆している。
ビス-(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N9,N9-テトラ-酢酸テトラアセトキシメチルエステル(BAPTA-AM)(細胞内カルシウムキレート剤)はアディポネクチン誘導性のAMPKのリン酸化の増加をEGTAとほぼ同程度に部分的に抑制したが(図24a)、U73122(PLC阻害剤)はC2C12筋細胞におけるAMPKのアディポネクチン誘導性のリン酸化にほとんど効果を示さなかった(図24b)。
C2C12筋細胞のアディポネクチン処理により、CaMKI リン酸化(J. Biol. Chem. 273, 31880-31889 (1998); Trends Biochem. Sci. 24, 232-236 (1999))に短時間のうちに、一時的な強い増加が生じた(図25a、図25bの上パネル、図25c)。EGTAで細胞外カルシウムイオンを除去するとアディポネクチン刺激によるCaMKIリン酸化の増加はほとんど完全に消失した (図25a、図25bの上パネル、図25c)。これらのデータは、おそらくCaMKKβ活性化によるアディポネクチン誘導性のCaMKIリン酸化はほぼ完全にカルシウムイオンの進入に依存することを示している。CaMKIのリン酸化に続いて、アディポネクチンは連続的であって、かつ部分的な細胞外カルシウムイオンの流入に依存した様式でAMPKリン酸化をさらに増加させた(図25a、図25bの中央パネル、図25c)。
昆虫の嗅覚受容体もGPCRとの相同性を欠き、アミノ末端が細胞内に位置する反対型7回膜貫通型のトポロジーを有し、細胞外のカルシウムイオンの流入を誘導することが報告されている(Nature 452, 1002-1006 (2008))。従って、AdipoR1による信号伝達は昆虫嗅覚受容体の信号伝達と共通する可能性がある。さらに上記に示した結果から、AdipoR1を分子ターゲットとする新しい抗糖尿病薬及び抗アテローム形成薬を開発できるものと考えられる。
PGC-1αは骨格筋における酸化的代謝の重要な調節因子である。PGC-1αと OXPHOSレベルの低下は、ヒト(Nature Genet. 34, 267-273 (2003))及びマウスにおいてインスリン抵抗性と2型糖尿病に関係している(図14a-c)。しかしながら、筋肉特異的なPGC-1α-ノックアウトマウスはインスリン抵抗性(J. Clin. Invest. 117, 3463-3474 (2007))を示さなかった。したがって、AMPKによるS6K1の阻害のようなPGC-1α-非依存性の経路も筋肉中のアディポネクチン/AdipoR1のインスリン感受性増加作用に寄与しているものと考えられる。
以上のように、muscle-R1KOマウスがミトコンドリア含有量及び酵素の減少を示すことが示された。PGC-1αはミトコンドリアの含有量及び機能の重要な調節因子である。PGC-1αの発現がいくつかの生理的な状況において調整されていることが報告されており、例えば骨格筋では運動に部分的に反応してCaMKやCREBのような分子によるカルシウムイオン信号伝達が増加することにより調整されている(Nature 454, 463−469 (2008))。PGC-1α活性は、例えばAMPKによるリン酸化(Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017−12022 (2007))、及びAMPKとSIRT1による脱アセチル化(Nature 434, 113−118 (2005))のようないくつかの種類のPGC-1α修飾によって調整されることも報告されている。AMPKとSIRT1は運動によっても活性化することができた。muscle-R1KOマウスがPGC-1αの脱アセチルの減少と同様にPGC-1α発現の減少も示すことも証明された。これと一致して、アディポネクチンがAdipoR1によるカルシウムイオン流入を誘導し、それによりCaMKKβを活性化し、それがPGC-1α発現の増加を導くこと、並びにアディポネクチン/AdipoR1がAMPKとSIRT1を活性化し、それがPGC-1αの脱アセチル化を誘導することも証明された。これらのデータは、アディポネクチンとAdipoR1が運動と同様の様式で、PGC-1αの発現及び活性化の両方の増加を促すことを示している(図6e)。
Claims (4)
- アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を有効成分として含む擬似運動療法のための医薬。
- アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を有効成分として含み、運動を負荷することなく筋肉の生理状態を運動後の生理状態に変化させるための医薬。
- 糖尿病の予防及び/又は治療における運動療法の代替薬物療法のために用いる請求項1又は2に記載の医薬。
- アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を有効成分として含むI型筋繊維の増幅剤。
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