JPWO2010137404A1 - 細菌のバイオフィルムを接種した種子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、病害に対する耐性を有する種子の提供、及び病害の防除を目的として種子に微生物を接種する方法を提供することを課題とする。本発明者らは、鋭意研究の結果、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種することにより、作物の病害を防除できることを見出し、上記課題を解決した。すなわち、本発明は、バチルス属細菌のバイオフィルムを接種した種子を提供する。また、本発明はバチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法を提供する。
Description
本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のバイオフィルムを接種した種子及び、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法に関する。
植物、特に農作物の病害の防除は重要な課題である。近年、化学農薬や肥料の過度の使用により、土壌肥沃度が低下し、その一方で、農薬抵抗性の病原体の出現をもたらしているといわれ、植物の病害の防除は益々重要な課題である。植物の病害の防除の方法として、これまでに、農薬の散布、抵抗性品種の開発などがなされてきた。しかしながら、上述のような悪循環を引き起こすほか、食に対する安全、環境保護が求められる昨今、これらの方法は必ずしも望ましいものではない。
一方、微生物を土壌、種子、根部、塊茎などに導入することにより、病害を防除したり、また、作物の生長を改善したりする試みがなされている。微生物は植物栄養素、生物的賦活剤および生物的殺菌剤を分泌する場合があり、微生物が植物に接種等された際、栄養素、生物的賦活作用、生物的殺菌作用などを提供し、その結果、上記のような効果がもたらされると考えられる。微生物の導入による、植物の病害の防除、あるいは、生長の改善は、安全性、及び環境保護という観点において、望ましく、消費者のイメージもよい。また、時間、費用および手間が農薬や肥料を用いる従来の方法と比較して、低いという点においても優れている。
これまでに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種および、一部のグラム陰性菌など、根圏細菌を植物に導入することにより、その植物に誘導全身抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＩＳＲ）を誘発した例が報告されている（非特許文献１）。
一方、バチルス属細菌は、水中や土壌に普遍的に存在し、その特性がよく研究されていると共に、発酵食品や酵素の生産などに用いられており、安全性、環境への影響などが少なく、植物に導入する微生物として望ましい。バチルス属細菌は、好気性、または通性嫌気性の桿菌で通常グラム陽性を示す。環境によっては、前胞子を経て、胞子（芽胞）を形成する。バチルス属の種は高度耐性の芽胞をつくり、広域抗生物質を生成することが知られる（非特許文献２）。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の植物への導入に関してはこれまでに報告がない。
一方、微生物を土壌、種子、根部、塊茎などに導入することにより、病害を防除したり、また、作物の生長を改善したりする試みがなされている。微生物は植物栄養素、生物的賦活剤および生物的殺菌剤を分泌する場合があり、微生物が植物に接種等された際、栄養素、生物的賦活作用、生物的殺菌作用などを提供し、その結果、上記のような効果がもたらされると考えられる。微生物の導入による、植物の病害の防除、あるいは、生長の改善は、安全性、及び環境保護という観点において、望ましく、消費者のイメージもよい。また、時間、費用および手間が農薬や肥料を用いる従来の方法と比較して、低いという点においても優れている。
これまでに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種および、一部のグラム陰性菌など、根圏細菌を植物に導入することにより、その植物に誘導全身抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＩＳＲ）を誘発した例が報告されている（非特許文献１）。
一方、バチルス属細菌は、水中や土壌に普遍的に存在し、その特性がよく研究されていると共に、発酵食品や酵素の生産などに用いられており、安全性、環境への影響などが少なく、植物に導入する微生物として望ましい。バチルス属細菌は、好気性、または通性嫌気性の桿菌で通常グラム陽性を示す。環境によっては、前胞子を経て、胞子（芽胞）を形成する。バチルス属の種は高度耐性の芽胞をつくり、広域抗生物質を生成することが知られる（非特許文献２）。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の植物への導入に関してはこれまでに報告がない。
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病害に対する耐性を有する種子の提供、及び病害の防除を目的として種子に微生物を接種する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、鋭意研究の結果、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種することにより、作物の病害を防除できることを見出し、本発明を完成した。本発明は、バチルス属細菌のバイオフィルムを接種した種子を提供する。また、本発明はバチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法を提供する。
本発明者らは、鋭意研究の結果、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種することにより、作物の病害を防除できることを見出し、本発明を完成した。本発明は、バチルス属細菌のバイオフィルムを接種した種子を提供する。また、本発明はバチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法を提供する。
図１は、枯草菌ＲＢ１４のＢＦコーティング種子、液体振とう培養のコーティング種子、滅菌したＢＦに液体培養のＲＢ１４を添加したコーティングした種子を用いた、Ｒ．ソラニＫ１のプレート上での生育阻害試験結果である。
図２は、枯草菌ＲＢ１４ＢＦコーティング種子、液体振とう培養のコーティング種子、滅菌したＢＦに液体培養のＲＢ１４を添加したコーティングした種子を用いた、Ｒ．ソラニＫ１のトマト植物における生育阻害試験結果である。
図３は、ホモジナイズされたバイオフィルム中（Ａ）と液中（Ｂ）コート接種の枯草菌ＲＢ１４ＢＦの顕微鏡像。さらに両種子の拡大領域を示す（スケールバーは２００μｍ）。
図２は、枯草菌ＲＢ１４ＢＦコーティング種子、液体振とう培養のコーティング種子、滅菌したＢＦに液体培養のＲＢ１４を添加したコーティングした種子を用いた、Ｒ．ソラニＫ１のトマト植物における生育阻害試験結果である。
図３は、ホモジナイズされたバイオフィルム中（Ａ）と液中（Ｂ）コート接種の枯草菌ＲＢ１４ＢＦの顕微鏡像。さらに両種子の拡大領域を示す（スケールバーは２００μｍ）。
本発明は、バチルス属細菌のバイオフィルムを接種した種子を提供する。バチルス属細菌は、細菌そのもの、前胞子、胞子（芽胞）、いずれの形態でもよく、また、接種された際に、生存していてもよいし、生存してなくてもよい。バチルス属細菌の種類は限定されず、例として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌やセレウス菌などを挙げることができるが、本発明においては、とりわけ、枯草菌が好ましく用いられ、さらには、枯草菌の菌株の例として、枯草菌ＲＢ１４を挙げることができる。枯草菌ＲＢ１４はリポペプチド抗生物質イチュリンＡおよびサーファクチン（非特許文献３、４、５）、を生成することができる桿状グラム陽性土壌細菌として知られる。
バイオフィルムとは、微生物を静置培養することにより得られる、微生物の構造体をいう。バイオフィルムは膜状の構造体である場合が多いが、そのほかの形状をとる場合もある。枯草菌のバイオフィルムについては、様々な報告がなされている（非特許文献８，９，１０、１１）。バイオフィルムは微生物の自然の状態と考えられ、バイオフィルム中で、微生物は固体または液体表面に存在する細胞外重合物質（ＥＰＳ）内の共同体で生存すると考えられている。
接種とは、コーティングともいい、種子に接種するとは、バイオフィルムあるいはその他の状態の微生物に種子が接触し、種子に微生物が付着することを指す。バイオフィルムの接種は、種子をバイオフィルムに浸漬する、噴霧する、などして行うことができる。また、接種の際は必要に応じ、撹拌、混合などを加えてもよく、さらに、接種の過程あるいは、接種前後に、温度、圧力、湿度を変化させてもよい。
種子の種類は、植物の種子であれば、なんら限定されることはなく、例えば、トマト、稲、麦、トウモロコシ、アスパラガス、エダマメ、オクラ、カボチャ、キャベツ、キュウリ、コマツナ、ダイコン、タマネギ、ナス、ニンジン、ネギ、ハクサイ、パセリ、ピーマン、トウガラシ、ブロッコリー、ホウレンソウ、メロン、レタスの種子をあげることができる。
本発明の種子は植物の病害を防除するという特徴を有する。特にカビ性の病害を防除し、病害の例としては、門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを挙げられるが、より具体的には、枝枯病・胴枯病、斑点性の病気（ごま色斑点病、灰斑病、角斑病、褐色円星病、褐色せん孔病、褐斑病、褐紋病、黒枯病、黒星病、黒点病、黒斑病、紫斑病、実炭そ病、炭そ病、白さび病、白星病、心腐れ症（胴枯病菌）、すす斑症、そうか病、つる枯病、つる割病、葉枯病、輪斑病、輪紋病）、灰色かび病、菌核病、花腐菌核病、苗立枯病、白紋羽病、立枯病、いもち病、すそ枯病、フォモプシス腐敗病、萎黄病、果実軟腐病、芽枯病、灰色腐敗病、灰星病、株腐病、乾腐病、茎枯病、黒あざ病、黒とう病、根星斑病、枝膨病、小菌核腐敗病、半身萎ちょう病、萎ちょう病、晩腐病、腐らん病、葉かび病、葉腐病（ブラウンパッチ）、落葉病、球根腐敗病、貯蔵病害（青かび病、緑かび病、軸腐病、炭そ病、黒斑病）、芽枯症、輪紋葉枯病、黒根病、白斑病、苗立枯病、萎縮病、青枯病、うどんこ病、葉かび病、灰色かび病、根茎腐敗病、白斑葉枯病、灰星病、斑点病などを挙げることができる。
また、本発明は、バチルス属細菌を静置培養してバイオフィルムを形成し、前記バイオフィルムに種子を浸漬する工程を含む、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法を提供する。
この場合も、バチルス属細菌は、細菌そのもの、前胞子、胞子（芽胞）、いずれの形態でもよく、また、接種された際に、生存していてもよいし、生存してなくてもよい。また、バチルス属細菌の種類は限定されず、例として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌やセレウス菌などを挙げることができるが、本発明においては、とりわけ、枯草菌が好ましく用いられ、さらには、枯草菌の菌株の例として、枯草菌ＲＢ１４を挙げることができる。
本発明は作物の病害からの防除を目的として行われる。特にカビ性の病害を防除を目的とすることができ、病害の例としては、門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを挙げられるが、より具体的には、枝枯病・胴枯病、斑点性の病気（ごま色斑点病、灰斑病、角斑病、褐色円星病、褐色せん孔病、褐斑病、褐紋病、黒枯病、黒星病、黒点病、黒斑病、紫斑病、実炭そ病、炭そ病、白さび病、白星病、心腐れ症（胴枯病菌）、すす斑症、そうか病、つる枯病、つる割病、葉枯病、輪斑病、輪紋病）、灰色かび病、菌核病、花腐菌核病、苗立枯病、白紋羽病、立枯病、いもち病、すそ枯病、フォモプシス腐敗病、萎黄病、果実軟腐病、芽枯病、灰色腐敗病、灰星病、株腐病、乾腐病、茎枯病、黒あざ病、黒とう病、根星斑病、枝膨病、小菌核腐敗病、半身萎ちょう病、萎ちょう病、晩腐病、腐らん病、葉かび病、葉腐病（ブラウンパッチ）、落葉病、球根腐敗病、貯蔵病害（青かび病、緑かび病、軸腐病、炭そ病、黒斑病）、芽枯症、輪紋葉枯病、黒根病、白斑病、苗立枯病、萎縮病、青枯病、うどんこ病、葉かび病、灰色かび病、根茎腐敗病、白斑葉枯病、灰星病、斑点病などを挙げることができる。
バイオフィルムとは、微生物を静置培養することにより得られる、微生物の構造体をいう。バイオフィルムは膜状の構造体である場合が多いが、そのほかの形状をとる場合もある。枯草菌のバイオフィルムについては、様々な報告がなされている（非特許文献８，９，１０、１１）。バイオフィルムは微生物の自然の状態と考えられ、バイオフィルム中で、微生物は固体または液体表面に存在する細胞外重合物質（ＥＰＳ）内の共同体で生存すると考えられている。
接種とは、コーティングともいい、種子に接種するとは、バイオフィルムあるいはその他の状態の微生物に種子が接触し、種子に微生物が付着することを指す。バイオフィルムの接種は、種子をバイオフィルムに浸漬する、噴霧する、などして行うことができる。また、接種の際は必要に応じ、撹拌、混合などを加えてもよく、さらに、接種の過程あるいは、接種前後に、温度、圧力、湿度を変化させてもよい。
種子の種類は、植物の種子であれば、なんら限定されることはなく、例えば、トマト、稲、麦、トウモロコシ、アスパラガス、エダマメ、オクラ、カボチャ、キャベツ、キュウリ、コマツナ、ダイコン、タマネギ、ナス、ニンジン、ネギ、ハクサイ、パセリ、ピーマン、トウガラシ、ブロッコリー、ホウレンソウ、メロン、レタスの種子をあげることができる。
本発明の種子は植物の病害を防除するという特徴を有する。特にカビ性の病害を防除し、病害の例としては、門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを挙げられるが、より具体的には、枝枯病・胴枯病、斑点性の病気（ごま色斑点病、灰斑病、角斑病、褐色円星病、褐色せん孔病、褐斑病、褐紋病、黒枯病、黒星病、黒点病、黒斑病、紫斑病、実炭そ病、炭そ病、白さび病、白星病、心腐れ症（胴枯病菌）、すす斑症、そうか病、つる枯病、つる割病、葉枯病、輪斑病、輪紋病）、灰色かび病、菌核病、花腐菌核病、苗立枯病、白紋羽病、立枯病、いもち病、すそ枯病、フォモプシス腐敗病、萎黄病、果実軟腐病、芽枯病、灰色腐敗病、灰星病、株腐病、乾腐病、茎枯病、黒あざ病、黒とう病、根星斑病、枝膨病、小菌核腐敗病、半身萎ちょう病、萎ちょう病、晩腐病、腐らん病、葉かび病、葉腐病（ブラウンパッチ）、落葉病、球根腐敗病、貯蔵病害（青かび病、緑かび病、軸腐病、炭そ病、黒斑病）、芽枯症、輪紋葉枯病、黒根病、白斑病、苗立枯病、萎縮病、青枯病、うどんこ病、葉かび病、灰色かび病、根茎腐敗病、白斑葉枯病、灰星病、斑点病などを挙げることができる。
また、本発明は、バチルス属細菌を静置培養してバイオフィルムを形成し、前記バイオフィルムに種子を浸漬する工程を含む、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法を提供する。
この場合も、バチルス属細菌は、細菌そのもの、前胞子、胞子（芽胞）、いずれの形態でもよく、また、接種された際に、生存していてもよいし、生存してなくてもよい。また、バチルス属細菌の種類は限定されず、例として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌やセレウス菌などを挙げることができるが、本発明においては、とりわけ、枯草菌が好ましく用いられ、さらには、枯草菌の菌株の例として、枯草菌ＲＢ１４を挙げることができる。
本発明は作物の病害からの防除を目的として行われる。特にカビ性の病害を防除を目的とすることができ、病害の例としては、門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを挙げられるが、より具体的には、枝枯病・胴枯病、斑点性の病気（ごま色斑点病、灰斑病、角斑病、褐色円星病、褐色せん孔病、褐斑病、褐紋病、黒枯病、黒星病、黒点病、黒斑病、紫斑病、実炭そ病、炭そ病、白さび病、白星病、心腐れ症（胴枯病菌）、すす斑症、そうか病、つる枯病、つる割病、葉枯病、輪斑病、輪紋病）、灰色かび病、菌核病、花腐菌核病、苗立枯病、白紋羽病、立枯病、いもち病、すそ枯病、フォモプシス腐敗病、萎黄病、果実軟腐病、芽枯病、灰色腐敗病、灰星病、株腐病、乾腐病、茎枯病、黒あざ病、黒とう病、根星斑病、枝膨病、小菌核腐敗病、半身萎ちょう病、萎ちょう病、晩腐病、腐らん病、葉かび病、葉腐病（ブラウンパッチ）、落葉病、球根腐敗病、貯蔵病害（青かび病、緑かび病、軸腐病、炭そ病、黒斑病）、芽枯症、輪紋葉枯病、黒根病、白斑病、苗立枯病、萎縮病、青枯病、うどんこ病、葉かび病、灰色かび病、根茎腐敗病、白斑葉枯病、灰星病、斑点病などを挙げることができる。
以下に本発明の実施例を示す。ただし、本発明は実施例に制限されるものではない。
本実施例では、バチルス属細菌として、枯草菌を用い、これを静置培養してバイオフィルムを形成し、あるいはバイオフィルムの対照として、液体振とう培養液とし、これらをトマト種子に接種し、病原体感染に対する防除効果を観察した。
病原体としては、神奈川県園芸試験場から分離されたリゾクトニア・ソラニＫ−１（非特許文献６）を用いた。リゾクトニア・ソラニは植物の病原微生物として知られるカビの一種で、特に多種の植物に門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを引き起こすことが知られる。特にトマトの苗立枯病の特性は、詳細に報告されている（非特許文献７）。
培地組成
枯草菌ＲＢ１４は、前培養として、改変ＬＢ培地（ポリペプトン（Ｎｉｈｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（Ｏｒｉｅｎｔａｌ社、Ｔｏｋｙｏ）５ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．０に調節）を用い液、体振とう培養を行った。
また、改変ＬＢ培地の１．５％寒天（清水食品株式会社）を加えたＬ寒天プレートを、コロニー形成単位（ｃｆｕ）計数のために用いた。
枯草菌ＲＢ１４の本培養には、魚肉タンパク質（Ｋａｍａｂｏｋｏ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｄａｗａｒａ、Ｊａｐａｎによって提供された）５０ｇ／Ｌ、グルコース６７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２ｍｇ／ＬおよびＣａＣｌ２ １８４ｍｇ／Ｌを含む培地を用いた。
リゾクトニア・ソラニＫ１は、ジャガイモ浸出液２００ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌおよびポリペプトン１０ｇ／Ｌを含み、ｐＨ５．６に調節したジャガイモデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地で培養した。
枯草菌ＲＢ１４の培養
枯草菌株ＲＢ１４（非特許文献４）の凍結ストック溶液（１０％グリセロール溶液に−８０℃で保存）５ｍｌを改変ＬＢ培地に加え、前培養のために１分間に１２０ストローク（ｓｐｍ）の振盪を加えながら、３７℃で１６時間インキュベートした。一晩培養した枯草菌ＲＢ１４の４００μｌを、２００ｍｌ三角フラスコ内の４０ｍｌの魚肉タンパク質培地に接種した。次に、フラスコを、静的条件下で２５℃で３日間した。バイオフィルムは培養液表面に膜として形成された。同様に、１２０ｓｐｍの下の３０℃で３日間振とう培養し、液体振とう培養液を得た。これはバイオフィルムの対照として以後の実験に用いられた。
Ｒ．ソラニＫ１の培養
Ｒ．ソラニＫ１は、ＰＤＡ寒天培地上で培養した後、２００ｍｌフラスコ内の４０ミリリットルのＰＤＢに一部を接種し、２８℃の暗所で７日間インキュベートした。
種子に付着したＲＢ１４の計測
バイオフィルムあるいは液体振とう培養液を接種した種子に付着しているＲＢ１４の細菌数を計測するために、１０個の接種済み種子を滅菌ポリプロピレン試験管にとり、１分間撹拌した後に、試験管を０．８５％ＮａＣｌで連続希釈してＬ寒天プレート上に広げた。プレートを３７℃で１６時間インキュベートし、コロニー数を数えた。
土壌中のＲＢ１４の計測
土壌中の生存するＲＢ１４の計測のためには、ＲＢ１４を含有する３ｇの土壌を、５０ｍｌ三角フラスコ内の８ｍｌの０．８５％ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）に懸濁して、１５０ｓｐｍで１５分間振とうし、先に述べたＬ寒天プレートを用いて生存するＲＢ１４を計測した。
土壌の調製
土壌として１０．５％全炭素および０．６％全窒素を含有する、ｐＨ４．２の市販の黒色土壌（Ｎｉｔｔａｉ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。土壌は４：１（ｗ／ｗ）の比でバーミキュライトと混合し、調製土壌をポリプロピレンの袋に入れて、１２時間間隔で３回、１２１℃で２０分間加圧滅菌した。その後、土壌を肥料で改良し：Ｎ−０．０４％、Ｐ−０．０９％、Ｋ−０．０６％、Ｃａ−０．０６％、Ｍｇ−０．０６％、Ｆｅ−０．００１％、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を加えて最大容水量の約６０％にした。
液体振とう培養液の接種
上記培養での通り培養された液体振とう培養液３０ｍｌを、４℃で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、培養液中の細菌細胞の密度を、約１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した。それに滅菌トマト種子を１５分間に浸し、種子を３０℃の暗所で３日間、２％寒天プレート上で発芽させた。
バイオフィルムの接種
上記の通り培養されたバイオフィルムを含む魚肉タンパク質培地から界面のバイオフィルムを収集した。２ｇ湿重量の新しいバイオフィルムを８ｍｌ滅菌水と混合し、Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎホモジナイザ（ＮＳ−３１０Ｅ、ＮＩＴＩ−ＯＮ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて１５秒間ホモジナイズし、このホモジナイズした試料を用いて種子にコーティングした。ホモジナイズしたバイオフィルム中の細菌細胞の密度は、１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。トマト種子を接種材料中に１５分間浸し、上記と同様に種子を発芽させた。なお、加圧滅菌したバイオフィルムはＸＸＸＸのように調製された。
対照（コントロール）となる種子の調製
トマト種子は７０％エタノールで、次に０．５％次亜塩素酸ナトリウムで消毒した。滅菌水で数回すすいだ。上記と同様に発芽させた。
植物栽培試験
滅菌土壌（１５０ｇ）を、直径約９０ｍｍ、高さ８０ｍｍのプラスチックポットに入れた。各ポットに９個の発芽種子を播種して、１６時間の光（約６，０００ルクス）条件下の、９０％相対湿度を有する３０℃の生育箱の中に置いた。
感染土壌を用いた実験では、病原真菌Ｒ．ソラニ株Ｋ１で感染した土壌を用いた。すなわち、ＰＤＢの表面に形成したＲ．ソラニの菌糸体マットを、滅菌水中でホモジナイザ（ＡＣＥホモジナイザ、Ｎｉｈｏｎｓｅｉｋｉ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって４，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズし、発芽トマト種子を播種する６日前に土壌に接種した。接種材料は、土壌１００ｇにつき菌糸体１ｇの投与量で土壌に導入した。
統計分析
各植物試験は４回繰り返し、各データ平均をフィッシャーの分散分析によって分析した。
土壌中のイチュリンＡの測定
各ポットからの土壌（３ｇ）を、５０ｍｌ三角フラスコ内の２１ｍｌの溶媒［アセトニトリルおよび３．８ｍｍトリフルオロ酢酸（４：１ ｖ／ｖ）］に懸濁し、室温で１時間振盪機（１４０ｓｐｍ）内に保った。土壌懸濁液をワットマンｎｏ．２ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でろ過し、ろ液を蒸発乾固させた。沈殿物を２ｍｌのメタノールに溶解し、１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に分配した。溶液を、１５，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を、０．２μｍポアサイズのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）によってろ過した。ろ過した溶液を、ＯＤＳカラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ−１８ｅ １００−４．６、Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ社、Ｄａｒｍｓｔａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量化した。イチュリンＡの測定のために、システム（ＬＣ−８００システム、ＪＡＳＣＯ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を２．０ｍｌ／分の流速で作動させ、アセトニトリル：１０ｍｍ酢酸アンモニウム（３５：６５ｖ／ｖ）の溶離液により、２０５ｎｍでモニタリングした。
プレート上での真菌抑制評価
試験はジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレートの上で実施し、真菌病原体の小さなマットを中央に置き、次にバイオフィルムあるいは液体振とう培養液を接種した種子を側に植え、プレートを、２８℃の静的条件で５日間インキュベートした。真菌の増殖の阻害は、後に阻止円のサイズ（ｍｍ）を測定することによって評価した。また、殺菌した種子を、対照として植えた。供試真菌の増殖は、式：（ａ１−ａ２／ａ１）×１００を用いて百分率（％）で計算し、式中、ａ１は抗菌なしの場合の真菌の増殖（直径測定値から面積として計算される）（陰性対照）を表し、ａ２は、ＲＢ１４の投与下の真菌の増殖である。測定値を１００から引いて、増殖阻害率を求めた。
結果
プレート上での阻害活性
バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子のプレート上での阻害活性の比較を、図１に示す。バイオフィルムを接種した種子は、最も高い阻害率（３４％）を示した。液体振とう培養を接種した種子は、２８％の病原体阻害を可能にした。そして加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子は、約３０％の阻害率を示した。対照種子は、阻害活性を示さなかった。
植物実験
図２は、バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子をＲ．ソラニ感染土壌に使用したときの、植物試験におけるトマト苗の真菌増殖阻害を示す。対照とした種子をＲ．ソラニ感染土壌に播種した場合は、植物の７７％が苗立枯病を起こした。液体振とう培養を接種した種子は、苗立枯病は３０％であり、バイオフィルムを接種した種子では、苗立枯病は６％と、顕著に減少していた。
顕微鏡解析
図３は、バイオフィルムおよび液体振とう培養を接種した種子表面の顕微鏡画像を示す。図３Ａはバイオフィルムを接種した種子、頭３Ｂは液体振とう培養を接種した種子である。バイオフィルムを接種した種子は細胞の凝集塊を含んでいるが、液体振とう培養を接種した種子は主に分散細胞を含むことが観察された。バイオフィルムは多量の多糖類を含んでいるため、種子表面への細胞の付着がより強固であるためこのような結果が得られたと推測される。
枯草菌数及びイチュリンＡ濃度
バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子の枯草菌数およびイチュリンＡ濃度を測定した結果を表１に示す。
各種子は接種後１〜２×１０８個程度の枯草菌を有していた。これらを播種した後、土壌中の枯草菌は１〜２×１０７ｃｆｕ／ｇとなった。バイオフィルムを接種した種子では液体振とう培養でコーティングした種子よりも２倍多くの細胞を有しており、播種後の土壌中でも２倍程度の菌数が観察された。枯草菌は、リポペプチド抗生物質のイチュリンＡを生成することが知られている。土壌中のイチュリンＡを測定したところ、種子播種の前には土壌中にイチュリンＡは存在していなかったが、最終的な刈り取り時までにはかなりの量のイチュリンＡがトマト植物の根部から測定された（表１）。
以上の結果より、枯草菌ＲＢ１４のバイオフィルムを接種した種子が、Ｒ．ソラニＫ１の増殖および生長に対する直接阻害効果を有し、それによってトマト植物の苗立枯病を抑制したことが示された。この活性は、リポペプチド抗生物質、特にイチュリンＡの生成とバイオフィルムに存在するＥＰＳに起因したものと推測される。また、本実施例は、枯草菌のバイオフィルムを接種した種子が、病害の防除に効果があることを示すものであり、特にカビ性の病害であれば、Ｒ．ソラニＫ１に対するのと同様の効果があるものと示唆される。
この出願は２００９年５月２８日に出願された日本国特許出願番号２００９−１２８８１６からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。
本実施例では、バチルス属細菌として、枯草菌を用い、これを静置培養してバイオフィルムを形成し、あるいはバイオフィルムの対照として、液体振とう培養液とし、これらをトマト種子に接種し、病原体感染に対する防除効果を観察した。
病原体としては、神奈川県園芸試験場から分離されたリゾクトニア・ソラニＫ−１（非特許文献６）を用いた。リゾクトニア・ソラニは植物の病原微生物として知られるカビの一種で、特に多種の植物に門枯れ、株枯れ、立枯れ、根腐れなどを引き起こすことが知られる。特にトマトの苗立枯病の特性は、詳細に報告されている（非特許文献７）。
培地組成
枯草菌ＲＢ１４は、前培養として、改変ＬＢ培地（ポリペプトン（Ｎｉｈｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（Ｏｒｉｅｎｔａｌ社、Ｔｏｋｙｏ）５ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．０に調節）を用い液、体振とう培養を行った。
また、改変ＬＢ培地の１．５％寒天（清水食品株式会社）を加えたＬ寒天プレートを、コロニー形成単位（ｃｆｕ）計数のために用いた。
枯草菌ＲＢ１４の本培養には、魚肉タンパク質（Ｋａｍａｂｏｋｏ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｄａｗａｒａ、Ｊａｐａｎによって提供された）５０ｇ／Ｌ、グルコース６７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２ｍｇ／ＬおよびＣａＣｌ２ １８４ｍｇ／Ｌを含む培地を用いた。
リゾクトニア・ソラニＫ１は、ジャガイモ浸出液２００ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌおよびポリペプトン１０ｇ／Ｌを含み、ｐＨ５．６に調節したジャガイモデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地で培養した。
枯草菌ＲＢ１４の培養
枯草菌株ＲＢ１４（非特許文献４）の凍結ストック溶液（１０％グリセロール溶液に−８０℃で保存）５ｍｌを改変ＬＢ培地に加え、前培養のために１分間に１２０ストローク（ｓｐｍ）の振盪を加えながら、３７℃で１６時間インキュベートした。一晩培養した枯草菌ＲＢ１４の４００μｌを、２００ｍｌ三角フラスコ内の４０ｍｌの魚肉タンパク質培地に接種した。次に、フラスコを、静的条件下で２５℃で３日間した。バイオフィルムは培養液表面に膜として形成された。同様に、１２０ｓｐｍの下の３０℃で３日間振とう培養し、液体振とう培養液を得た。これはバイオフィルムの対照として以後の実験に用いられた。
Ｒ．ソラニＫ１の培養
Ｒ．ソラニＫ１は、ＰＤＡ寒天培地上で培養した後、２００ｍｌフラスコ内の４０ミリリットルのＰＤＢに一部を接種し、２８℃の暗所で７日間インキュベートした。
種子に付着したＲＢ１４の計測
バイオフィルムあるいは液体振とう培養液を接種した種子に付着しているＲＢ１４の細菌数を計測するために、１０個の接種済み種子を滅菌ポリプロピレン試験管にとり、１分間撹拌した後に、試験管を０．８５％ＮａＣｌで連続希釈してＬ寒天プレート上に広げた。プレートを３７℃で１６時間インキュベートし、コロニー数を数えた。
土壌中のＲＢ１４の計測
土壌中の生存するＲＢ１４の計測のためには、ＲＢ１４を含有する３ｇの土壌を、５０ｍｌ三角フラスコ内の８ｍｌの０．８５％ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）に懸濁して、１５０ｓｐｍで１５分間振とうし、先に述べたＬ寒天プレートを用いて生存するＲＢ１４を計測した。
土壌の調製
土壌として１０．５％全炭素および０．６％全窒素を含有する、ｐＨ４．２の市販の黒色土壌（Ｎｉｔｔａｉ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。土壌は４：１（ｗ／ｗ）の比でバーミキュライトと混合し、調製土壌をポリプロピレンの袋に入れて、１２時間間隔で３回、１２１℃で２０分間加圧滅菌した。その後、土壌を肥料で改良し：Ｎ−０．０４％、Ｐ−０．０９％、Ｋ−０．０６％、Ｃａ−０．０６％、Ｍｇ−０．０６％、Ｆｅ−０．００１％、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を加えて最大容水量の約６０％にした。
液体振とう培養液の接種
上記培養での通り培養された液体振とう培養液３０ｍｌを、４℃で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、培養液中の細菌細胞の密度を、約１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した。それに滅菌トマト種子を１５分間に浸し、種子を３０℃の暗所で３日間、２％寒天プレート上で発芽させた。
バイオフィルムの接種
上記の通り培養されたバイオフィルムを含む魚肉タンパク質培地から界面のバイオフィルムを収集した。２ｇ湿重量の新しいバイオフィルムを８ｍｌ滅菌水と混合し、Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎホモジナイザ（ＮＳ−３１０Ｅ、ＮＩＴＩ−ＯＮ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて１５秒間ホモジナイズし、このホモジナイズした試料を用いて種子にコーティングした。ホモジナイズしたバイオフィルム中の細菌細胞の密度は、１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。トマト種子を接種材料中に１５分間浸し、上記と同様に種子を発芽させた。なお、加圧滅菌したバイオフィルムはＸＸＸＸのように調製された。
対照（コントロール）となる種子の調製
トマト種子は７０％エタノールで、次に０．５％次亜塩素酸ナトリウムで消毒した。滅菌水で数回すすいだ。上記と同様に発芽させた。
植物栽培試験
滅菌土壌（１５０ｇ）を、直径約９０ｍｍ、高さ８０ｍｍのプラスチックポットに入れた。各ポットに９個の発芽種子を播種して、１６時間の光（約６，０００ルクス）条件下の、９０％相対湿度を有する３０℃の生育箱の中に置いた。
感染土壌を用いた実験では、病原真菌Ｒ．ソラニ株Ｋ１で感染した土壌を用いた。すなわち、ＰＤＢの表面に形成したＲ．ソラニの菌糸体マットを、滅菌水中でホモジナイザ（ＡＣＥホモジナイザ、Ｎｉｈｏｎｓｅｉｋｉ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって４，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズし、発芽トマト種子を播種する６日前に土壌に接種した。接種材料は、土壌１００ｇにつき菌糸体１ｇの投与量で土壌に導入した。
統計分析
各植物試験は４回繰り返し、各データ平均をフィッシャーの分散分析によって分析した。
土壌中のイチュリンＡの測定
各ポットからの土壌（３ｇ）を、５０ｍｌ三角フラスコ内の２１ｍｌの溶媒［アセトニトリルおよび３．８ｍｍトリフルオロ酢酸（４：１ ｖ／ｖ）］に懸濁し、室温で１時間振盪機（１４０ｓｐｍ）内に保った。土壌懸濁液をワットマンｎｏ．２ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でろ過し、ろ液を蒸発乾固させた。沈殿物を２ｍｌのメタノールに溶解し、１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に分配した。溶液を、１５，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を、０．２μｍポアサイズのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）によってろ過した。ろ過した溶液を、ＯＤＳカラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ−１８ｅ １００−４．６、Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ社、Ｄａｒｍｓｔａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量化した。イチュリンＡの測定のために、システム（ＬＣ−８００システム、ＪＡＳＣＯ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を２．０ｍｌ／分の流速で作動させ、アセトニトリル：１０ｍｍ酢酸アンモニウム（３５：６５ｖ／ｖ）の溶離液により、２０５ｎｍでモニタリングした。
プレート上での真菌抑制評価
試験はジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレートの上で実施し、真菌病原体の小さなマットを中央に置き、次にバイオフィルムあるいは液体振とう培養液を接種した種子を側に植え、プレートを、２８℃の静的条件で５日間インキュベートした。真菌の増殖の阻害は、後に阻止円のサイズ（ｍｍ）を測定することによって評価した。また、殺菌した種子を、対照として植えた。供試真菌の増殖は、式：（ａ１−ａ２／ａ１）×１００を用いて百分率（％）で計算し、式中、ａ１は抗菌なしの場合の真菌の増殖（直径測定値から面積として計算される）（陰性対照）を表し、ａ２は、ＲＢ１４の投与下の真菌の増殖である。測定値を１００から引いて、増殖阻害率を求めた。
結果
プレート上での阻害活性
バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子のプレート上での阻害活性の比較を、図１に示す。バイオフィルムを接種した種子は、最も高い阻害率（３４％）を示した。液体振とう培養を接種した種子は、２８％の病原体阻害を可能にした。そして加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子は、約３０％の阻害率を示した。対照種子は、阻害活性を示さなかった。
植物実験
図２は、バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子をＲ．ソラニ感染土壌に使用したときの、植物試験におけるトマト苗の真菌増殖阻害を示す。対照とした種子をＲ．ソラニ感染土壌に播種した場合は、植物の７７％が苗立枯病を起こした。液体振とう培養を接種した種子は、苗立枯病は３０％であり、バイオフィルムを接種した種子では、苗立枯病は６％と、顕著に減少していた。
顕微鏡解析
図３は、バイオフィルムおよび液体振とう培養を接種した種子表面の顕微鏡画像を示す。図３Ａはバイオフィルムを接種した種子、頭３Ｂは液体振とう培養を接種した種子である。バイオフィルムを接種した種子は細胞の凝集塊を含んでいるが、液体振とう培養を接種した種子は主に分散細胞を含むことが観察された。バイオフィルムは多量の多糖類を含んでいるため、種子表面への細胞の付着がより強固であるためこのような結果が得られたと推測される。
枯草菌数及びイチュリンＡ濃度
バイオフィルム、液体振とう培養液、あるいは加圧滅菌したバイオフィルムを接種した種子の枯草菌数およびイチュリンＡ濃度を測定した結果を表１に示す。
各種子は接種後１〜２×１０８個程度の枯草菌を有していた。これらを播種した後、土壌中の枯草菌は１〜２×１０７ｃｆｕ／ｇとなった。バイオフィルムを接種した種子では液体振とう培養でコーティングした種子よりも２倍多くの細胞を有しており、播種後の土壌中でも２倍程度の菌数が観察された。枯草菌は、リポペプチド抗生物質のイチュリンＡを生成することが知られている。土壌中のイチュリンＡを測定したところ、種子播種の前には土壌中にイチュリンＡは存在していなかったが、最終的な刈り取り時までにはかなりの量のイチュリンＡがトマト植物の根部から測定された（表１）。
この出願は２００９年５月２８日に出願された日本国特許出願番号２００９−１２８８１６からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。
Claims (5)
- バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のバイオフィルムを接種した種子。
- バチルス属細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項１の種子。
- バチルス属細菌を静置培養してバイオフィルムを形成し、前記バイオフィルムに種子を浸漬する工程を含む、バチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法。
- バチルス属細菌が枯草菌である請求項３に記載のバチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法。
- 作物の病害からの防除を目的として行う請求項３または４のいずれかに記載のバチルス属細菌のバイオフィルムを種子に接種する方法。
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