JPWO2010119698A1 - 頭頸部腫瘍増殖抑制剤 - Google Patents

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Abstract

本発明の目的は、新たな頭頸部腫瘍増殖抑制剤、頭頸部腫瘍転移抑制剤、及び、頭頸部治療用医薬組成物を提供することにある。本発明は、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を利用することを特徴とする。頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡとしては、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31を好適に例示することができ、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡとして、miR-133b、miR-145、miR-375を好適に例示することができる。

Description

本発明は、概して、細胞生物学及び分子生物学の分野に関する。より詳細には、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡ（microＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）の阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍増殖抑制剤、頭頸部腫瘍転移抑制剤、並びに、頭頸部腫瘍治療用医薬組成物に関する。
頭頸部腫瘍は、耳、鼻、咽頭、喉頭、頸部あるいは口腔等にできる腫瘍であるが、特に悪性腫瘍は５０歳以上の男性に多く、全悪性腫瘍の６％を占める。罹患率は年齢と共に高率となり、全世界では６５万人以上が罹患し、そのうち３５万人が原病死している。中でも喉頭がんは、頭頸部の悪性腫瘍においては最も多い疾患であり、年間死亡数の将来予測では、死亡者数が増加することが予測される（非特許文献１参照）。
頭頸部腫瘍の診断は内視鏡検査及び各種画像検査（ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ等）を用いた病期診断と生検による組織診断によってなされ、これらをもとに良性腫瘍では根治可能な一期的摘出術が行われる一方、悪性腫瘍に対しては手術・放射線治療・化学療法が行われ、進行がんの場合はそれらを組み合わせて行うことが必要とされている。しかし、頭頸部腫瘍に対する手術は頭頸部、顔面を整容的に著しく損なう上、発声・嚥下等の身体的機能にも高度の影響を及ぼし、身体的・心理的に侵襲が大きく、それ故、患者のＱＯＬ (Quality of Life)の大幅な低下を来す。そしてこれらの治療を組み合わせたとしても、治療効果は決して高いとは言えず、進行がんでは５年生存率はわずか３０％程度に留まっている（非特許文献２参照）。
マイクロＲＮＡは細胞内に存在し、タンパクへの翻訳がなされない、長さ２２塩基程度の１本鎖ＲＮＡである（非特許文献３参照）。１９９３年に線虫において、２００１年には脊椎動物でも発見され、種を越えて保存されている。現在、ヒトゲノム上には１０００近くのマイクロＲＮＡの存在が予測され、これまでに８００以上のヒトマイクロＲＮＡがクローニングされている。また、マイクロＲＮＡは、ゲノム上のタンパク翻訳領域の３０％に対し、ｍＲＮＡに結合することで遺伝子制御を行っていると推測されており（非特許文献４参照）、それ故、マイクロＲＮＡの機能破綻が各種の疾患を引き起こす可能性がある。以上の事実から、最近マイクロＲＮＡを用いた遺伝子診断法、疾患の病型判定、予後予測あるいは医薬品開発が期待され、欧米では、マイクロＲＮＡの機能解析と医療への応用が試みられている。また、がん・悪性腫瘍に関しても、その発症・進展に関しては、これまでがん遺伝子、がん抑制遺伝子の関与が知られているが、マイクロＲＮＡによっても制御されることが明らかとなっており、腫瘍の発現、進行、転移のいずれの制御にも関わっているとされている。これらを用いたマイクロＲＮＡ医薬の開発はいくつかなされているものの（例えば、miR-34を利用した大腸がん細胞増殖抑制剤；特許文献１参照）、非常に立ち後れているという現状がある。
特開２００８−２３９５９６号公報
「がん・統計白書」、大島明ら、２００４年６月発行、篠原出版新社 Marur S, ForastiereAA. Head and neck cancer: changing epidemiology, diagnosis, and treatment. Mayo Clin Proc. 2008; 83(4): 489-501. Barbarotto E, Schmittgen TD, CalinGA. microRNAs and cancer:profile, profile, profile. Int J Cancer. 2008; 122(5):969-977. Zeng Y, Yi R, Cullen BR. miRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc Nat Acad Sci2003; 100: 9779-9784.
本発明の課題は、新たな頭頸部腫瘍増殖抑制剤、頭頸部腫瘍転移抑制剤、及び、頭頸部治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、これまでに、頭頸部腫瘍の１種である喉頭がんの組織に特異的に発現しているマイクロＲＮＡを明らかにすべく、喉頭組織におけるマイクロＲＮＡの発現プロファイルの構築を既に行っている（特願２００８−２４３３０６号参照）。その結果、喉頭の非がん部である正常組織あるいは炎症組織と比較して、喉頭がん組織に特徴的な発現傾向を示すマイクロＲＮＡを見出した。その中でも、miR-196aは非がん部と比較して特に顕著な発現の増加を認め、miR-133b及びmiR-375は、非がん部と比較して特に顕著な発現の低下を認めた。そこで、これらのマイクロＲＮＡを、喉頭がんを含めた頭頸部腫瘍に対する新しい治療分子標的と考え、株化した頭頸部がん細胞として、喉頭がん細胞であるＪＨＵ０１１に加え、同じく頭頸部の重層扁平上皮がん細胞である２種類のがん細胞株（Ｃａ９−２２：口腔がん、ＳＡＳ：舌がん）を用いて、前述のマイクロＲＮＡの生物学的意義の解析を試みることとした。
この解析の前提として、まず、Ｃａ９−２２ならびにＳＡＳにおける上記３種類のマイクロＲＮＡの発現量を、喉頭の非がん組織をコントロールとして比較検討した（後述の参考例１参照）。その結果、Ｃａ９−２２では、miR-196aがコントロールと比較して約６５倍に発現が増加しており、miR-133bはコントロールと比較して約６４分の１に発現が低下していた。また、miR-375においては、発現が認められなかった。同様に、ＳＡＳにおいても、miR-196aがコントロールと比較して、約８８倍に発現が増加しており、miR-133b及びmiR-375はコントロールと比較して、各々約１９分の１及び約１４８分の１に発現が低下していた。すなわち、miR-196aは、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡであり、miR-133b及びmiR-375は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡであることが確認された。
次いで、本発明者らは、前述の３種類の頭頸部がん細胞株及びＦａＤｕ細胞（下咽頭がん細胞株）の合計４種類の頭頸部がん細胞株に対して、miR-196a（頭頸部腫瘍において発現が増加マイクロＲＮＡ）の阻害物質や、miR-133bやmiR-375（頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ）の模倣物質を導入したところ、前述の４種類の頭頸部がん細胞の増殖が抑制されること、及び、miR-196aの阻害物質を、頭頸部腫瘍モデルマウスに投与したところ腫瘍の増殖や転移が抑制されること等を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍治療用医薬組成物や、（２）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍増殖抑制剤や、（３）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質が、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡのアンチセンス核酸であることを特徴とする上記（２）に記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や、（４）頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質が、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの模倣物質であることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や、（５）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡが、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであり、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡが、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤に関する。
また、本発明は、（６）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍転移抑制剤や、（７）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質が、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡのアンチセンス核酸であることを特徴とする上記（６）に記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤や、（８）頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質が、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの模倣物質であることを特徴とする上記（６）又は（７）に記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤や、（９）頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡが、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであり、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡが、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（６）〜（８）のいずれかに記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤に関する。
本発明によれば、頭頸部腫瘍に対して増殖抑制効果を示す、頭頸部腫瘍増殖抑制剤、頭頸部腫瘍に対して転移抑制効果を示す、頭頸部腫瘍転移抑制剤、及び、頭頸部腫瘍治療用医薬組成物等を提供することができる。
図１Ａ：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＩＮＨ ＮＣ（ネガティブコントロール）又はＩＮＨ １９６ａ（miR-196aのアンチセンス配列からなるＲＮＡ）をトランスフェクションした後、培養し、培養３日目と５日目に細胞数を測定した結果を示す。なお、白丸でドットしたグラフはＩＮＨ ＮＣの結果を示し、黒丸でドットしたグラフはＩＮＨ １９６ａの結果を示す。図１Ｂの左パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＩＮＨ ＮＣ又はＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした後、３日培養した細胞の生細胞由来プロテアーゼの相対活性を示す図である。なお、パネル中の左の棒グラフはＩＮＨ ＮＣ群の結果を示し、右の棒グラフはＩＮＨ １９６ａ群の結果を示す。図１Ｂの右パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＩＮＨ ＮＣ又はＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした後、３日培養した細胞の死細胞由来プロテアーゼの相対活性を示す図である。なお、パネル中の左の棒グラフはＩＮＨ ＮＣ群の結果を示し、右の棒グラフはＩＮＨ １９６ａ群の結果を示す。図１Ｃの左パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした後、３日培養した細胞をHoechst染色し、それを蛍光顕微鏡で観察した様子を示す図である。図１Ｃの右パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした後、３日培養した細胞をHoechst染色し、それを蛍光顕微鏡で観察した様子を示す図である。 図２の左パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＭＩＭ ＮＣ（ネガティブコントロール）をトランスフェクションした後、５日培養した細胞をHoechst染色し、それを蛍光顕微鏡で観察した様子を示す図である。図２の右パネル：ＪＨＵ−０１１細胞に、ＭＩＭ ３７５（miR-375の模倣遺伝子）をトランスフェクションした後、５日培養した細胞をHoechst染色し、それを蛍光顕微鏡で観察した様子を示す図である。 図３Ａの左パネル：がん細胞の移植から９週間後におけるＩＮＨ ＮＣ投与群のマウスの腫瘍の外観を示す図である。この図では、中心に壊死を伴う腫瘍の増大が認められた。図３Ａの右パネル：がん細胞の移植から９週間後におけるＩＮＨ １９６ａ投与群のマウスの腫瘍の外観を示す図である。図３Ｂ：頭頸部腫瘍モデルマウスに、ＩＮＨ １９６ａを投与した群、又は、ＩＮＨ ＮＣを投与した群における、相対腫瘍体積（％）の推移を示す図である。なお、ここでいう相対腫瘍体積（％）とは、マウスへのがん細胞の移植から１週間後における各群の腫瘍体積の平均値を１００％としたときの、各群の相対腫瘍体積（％）の平均値をいう。また、白丸でドットしたグラフはＩＮＨ ＮＣ群の結果を示し、黒丸でドットしたグラフはＩＮＨ １９６ａの結果を示す。 図３の実験における両群の頭頸部腫瘍モデルマウス（移植から３ヶ月後）の腫瘍組織から作製した組織切片について、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った結果を示す図である。図４Ａ及びＢは、ＩＮＨ １９６ａ投与群の結果を示し、図４Ｃ及びＤは、ＩＮＨ ＮＣ投与群の結果を示す。 図５Ａ〜Ｄ：図３の実験における両群の頭頸部腫瘍モデルマウス（移植から３ヶ月後）の頸部リンパ節組織から作製した組織切片について、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った結果を示す図である。図５Ａ及びＢは、ＩＮＨ １９６ａ投与群の結果を示し、図５Ｃ及びＤは、ＩＮＨ ＮＣ投与群の結果を示す。図５Ｅ：図３の実験における両群の頭頸部腫瘍モデルマウス（移植から３ヶ月後）から摘出した頸部リンパ節における転移の有無の割合を示す。なお、左の棒グラフはＩＮＨ ＮＣ投与群の結果を示し、右の棒グラフはＩＮＨ １９６ａ投与群の結果を示す。
本発明の頭頸部腫瘍治療用医薬組成物や、頭頸部腫瘍増殖抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤としては、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質（以下、「本発明における阻害物質」ともいう）、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質（以下、「本発明における促進物質」ともいう）を含有している限り特に制限されず、上記の「頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡ」としては、miR-455-3p（マイクロＲＮＡ-455-3p）（配列番号１）、miR-455-5p（マイクロＲＮＡ-455-5p）（配列番号２）、miR-130b（マイクロＲＮＡ-130b）（配列番号３）、miR-130b*（マイクロＲＮＡ-130b*）（配列番号４）、miR-801（マイクロＲＮＡ-801）（配列番号５）、miR-196a（マイクロＲＮＡ-196a）（配列番号６）、miR-21（マイクロＲＮＡ-21）（配列番号７）及びmiR-31（マイクロＲＮＡ-31）（配列番号８）を好適に例示することができ、中でも、miR-196aをより好適に例示することができ、上記の「頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ」としては、miR-133b（マイクロＲＮＡ-133b）（配列番号９）、miR-145（マイクロＲＮＡ-145）（配列番号１０）及びmiR-375（マイクロＲＮＡ-375）（配列番号１１）を好適に例示することができ、中でもmiR-133b及びmiR-375をより好適に例示することができる。後述の実施例の結果から明らかなように、本発明における阻害物質や促進物質は、頭頸部腫瘍の増殖抑制効果や転移抑制効果を有しているため、頭頸部腫瘍治療用医薬組成物や頭頸部腫瘍増殖抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤として使用することができる。なおmiR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31の発現が頭頸部腫瘍において増加していること、並びに、miR-133b、miR-145及びmiR-375の発現が頭頸部腫瘍において低下していることは、前述の特願２００８−２４３３０６号にも開示されている。
上記の「頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡ」とは、頭頸部の正常組織等の非がん組織における発現と比較して、頭頸部腫瘍において発現が増加しているマイクロＲＮＡを意味し、上記の「頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ」とは、頭頸部の正常組織等の非がん組織における発現と比較して、頭頸部において発現が低下しているマイクロＲＮＡを意味する。なお、ある特定のマイクロＲＮＡが、頭頸部の正常組織等の非がん組織における発現と比較して、頭頸部腫瘍において発現が増加するか又は低下するかは、後述の参考例１や、前述の特願２００８−２４３３０６号の出願明細書に開示された方法（マイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法）により確認することができる。また、本明細書における「頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡ」としては、「頭頸部腫瘍において特異的に発現が増加するマイクロＲＮＡ」であることが好ましく、本明細書における「頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ」としては、「頭頸部腫瘍において特異的に発現が低下するマイクロＲＮＡ」であることが好ましい。
また、上記の「頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質」とは、かかるマイクロＲＮＡに直接的若しくは間接的に結合するか、又は、かかるマイクロＲＮＡを直接的又は間接的に分解することによって、かかるマイクロＲＮＡの作用を阻害する物質を意味する。かかる本発明における阻害物質の好ましい例としては、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡに直接的に結合することによって、かかるマイクロＲＮＡの作用を阻害する物質を挙げることができ、中でも、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡに直接的に結合することによって、かかるマイクロＲＮＡの作用を阻害する核酸を好適に挙げることができ、中でも、かかるマイクロＲＮＡに対するアンチセンス核酸をより好適に挙げることができ、中でも、かかるマイクロＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡやＲＮＡをさらに好適に挙げることができ、中でも、配列番号１に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-455-3pのアンチセンスＲＮＡ）、配列番号２に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-455-5pのアンチセンスＲＮＡ）、配列番号３に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-130bのアンチセンスＲＮＡ）、配列番号４に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-130b*のアンチセンスＲＮＡ）、配列番号５に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-801のアンチセンスＲＮＡ）、配列番号６に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-196aのアンチセンスＲＮＡ）、配列番号７に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-21のアンチセンスＲＮＡ）、配列番号８に示される配列のアンチセンス配列からなるＲＮＡ（miR-31のアンチセンスＲＮＡ）をさらにより好適に挙げることができ、中でも、miR-196aのアンチセンスＲＮＡを特に好適に挙げることができる。なお、上記の本発明における阻害物質としては、頭頸部腫瘍において発現が増加する１種のマイクロＲＮＡの阻害物質を用いてもよいが、頭頸部腫瘍増殖抑制効果や頭頸部腫瘍転移抑制効果をより確実に得たり、より多く得る観点から、頭頸部腫瘍において発現が増加する２種以上のマイクロＲＮＡの阻害物質を併用することが好ましい。また、頭頸部腫瘍増殖抑制効果に着目した頭頸部腫瘍増殖抑制剤と、頭頸部腫瘍転移抑制効果に着目した頭頸部腫瘍転移抑制剤とで、用いるマイクロＲＮＡの阻害物質は異なっていてもよい。
上記の「かかるマイクロＲＮＡの作用を阻害する物質」であるかどうかは、例えば、後述の実施例１における頭頸部扁平上皮がん細胞株の増殖アッセイにおいて、その物質をいずれかの頭頸部扁平上皮がん細胞株にトランスフェクション等により導入した場合に、細胞増殖抑制効果が認められるかどうかや、後述の実施例２における頭頸部腫瘍モデルマウスを用いたin vivo増殖アッセイにおいて、その物質を頭頸部腫瘍モデルマウスの腫瘍形成部に接種した場合に、腫瘍増殖抑制効果が認められるかどうかを調べることによって判別することができる。
上記の「頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質」とは、かかるマイクロＲＮＡに直接的若しくは間接的に結合することによって、かかるマイクロＲＮＡの作用を上昇させる物質か、又は、かかるマイクロＲＮＡの模倣物質を意味する。かかるマイクロＲＮＡの模倣物質とは、マイクロＲＮＡのヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡを含み、かつ、頭頸部腫瘍増殖抑制効果や頭頸部腫瘍転移抑制効果を有する物質を意味し、便宜上、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ自身も含む趣旨である。かかる本発明における促進物質の好ましい例としては、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの模倣物質を挙げることができ、中でも、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡを模倣した核酸を好適に挙げることができ、中でも、かかるＲＮＡ自身を含む物質をより好適に挙げることができ、中でも、かかるＲＮＡとそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡをさらに好適に挙げることができ、中でも、miR-133bのＲＮＡ配列（配列番号９）とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡ、miR-145のＲＮＡ配列（配列番号１０）とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡ、miR-375のＲＮＡ配列（配列番号１１）とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡをさらにより好適に挙げることができ、中でも、miR-375のＲＮＡ配列とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡを特に好適に挙げることができる。なお、上記の本発明における促進物質としては、頭頸部腫瘍において発現が低下する１種のマイクロＲＮＡの促進物質を用いてもよいが、頭頸部腫瘍増殖抑制効果や頭頸部腫瘍転移抑制効果をより確実に得たり、より多く得る観点から、頭頸部腫瘍において発現が低下する２種以上のマイクロＲＮＡの阻害物質を併用することが好ましい。また、頭頸部腫瘍増殖抑制効果に着目した頭頸部腫瘍増殖抑制剤と、頭頸部腫瘍転移抑制効果に着目した頭頸部腫瘍転移抑制剤とで、用いるマイクロＲＮＡの促進物質は異なっていてもよい。
本発明における阻害物質や促進物質の頭頸部腫瘍増殖抑制効果の程度としては、特に制限されないが、後述の実施例１における頭頸部扁平上皮がん細胞株の増殖アッセイにおいて、いずれかの頭頸部扁平上皮がん細胞株において、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上の細胞増殖抑制効果を好適に例示することができ、また、後述の実施例２における頭頸部腫瘍モデルマウスを用いたin vivo増殖アッセイにおいて、がん細胞の移植から１２週間後における相対腫瘍体積（％）が、ネガティブコントロール投与群の相対腫瘍体積（％）に対して割合として５０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは２５％以下、さらに好ましくは２０％以下の頭頸部腫瘍増殖抑制効果を好適に例示することができる。また、本発明における阻害物質や促進物質の頭頸部腫瘍転移抑制効果の程度としては、特に制限されないが、後述の実施例４のリンパ節組織の病理学的観察において、頸部リンパ節への転移が生じない程度の頭頸部腫瘍転移抑制効果を好適に例示することができる。
本明細書中のマイクロＲＮＡの由来となる生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。なお、前述の配列番号１〜１１の配列は全てヒト由来のマイクロＲＮＡである。また、マイクロＲＮＡの配列は特に哺乳動物間では保存性が高く、上記のマイクロＲＮＡはヒト以外の哺乳動物においてもヒトと同様の発現プロファイルを示すと考えられる。また、ヒト以外の上記の各生物からのマイクロＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている情報に基づいて確認又は特定することができる。
また、本明細書における「頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡ」には、かかるマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列において、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部の正常組織等の非がん組織と比較して、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡが便宜上含まれる。また、本明細書における「頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡ」には、かかるマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列において、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、頭頸部の正常組織等の非がん組織と比較して、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡが便宜上含まれる。上記の「１若しくは２個以上」としては、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましく、１〜２個が特に好ましく、１個がさらに好ましい。なお、上記の欠失等されたヌクレオチド配列からなるＲＮＡが、頭頸部の正常組織等の非がん組織と比較して、頭頸部腫瘍組織において発現が増加するか又は低下するかは、例えば後述のマイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法により容易に確認することができる。
本発明の頭頸部腫瘍増殖抑制剤は、所望の頭頸部腫瘍増殖抑制効果を有している限り、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の他に、他の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や抗がん剤等の任意成分を含んでいてもよい。また、頭頸部腫瘍転移抑制剤は、所望の頭頸部腫瘍転移抑制効果を有している限り、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の他に、他の頭頸部腫瘍転移抑制剤等の任意成分を含んでいてもよい。さらに、頭頸部腫瘍治療用医薬組成物は、所望の頭頸部腫瘍増殖抑制効果及び／又は頭頸部腫瘍転移抑制効果を有している限り、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の他に、他の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や抗がん剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤等の任意成分を含んでいてもよい。なお、本発明の頭頸部腫瘍抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤や頭頸部腫瘍治療用医薬組成物には、本発明における阻害物質と本発明における促進物質を両方含んでいてもよい。また、頭頸部腫瘍治療用医薬組成物には、頭頸部腫瘍増殖抑制効果に優れた本発明における阻害物質及び／又は本発明における促進物質と、頭頸部腫瘍転移抑制効果に優れた本発明における阻害物質及び／又は本発明における促進物質とを併せて含有することが、より優れた頭頸部腫瘍治療効果を得る観点から好ましい。
本発明の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤や頭頸部腫瘍治療用医薬組成物に含有される本発明における阻害物質や促進物質は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れた頭頸部腫瘍増殖抑制効果や頭頸部腫瘍転移抑制効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えば本発明における阻害物質や促進物質を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明における阻害物質や促進物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
また、本発明における阻害物質や促進物質が核酸、特にアンチセンスＲＮＡや二重鎖ＲＮＡである場合は、ＲＮＡ等の核酸用のキャリアーを用いることが好ましく、かかるキャリアーとしては、アテロコラーゲン（前述の特許文献１参照）や、コレステロール分子（NATURE, Vol 438, 1 December 2005, p685-689； NATURE, Vol 452, 17, April 2008, p896-900参照）を好適に例示することができる。これらのキャリアーを用いて、本発明における阻害物質や促進物質を静脈内注射するなどすれば、本発明における阻害物質や促進物質を頭頸部腫瘍組織の細胞内にまで輸送することができる。
本発明の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤や頭頸部腫瘍治療用医薬組成物の投与方法としては、所望の頭頸部腫瘍増殖抑制効果や所望の頭頸部腫瘍転移抑制効果が得られる限り特に制限されず、静脈内注射による投与や、頭頸部腫瘍部分又はその周辺部分への注射による投与等を例示することができる。また、本発明の頭頸部腫瘍増殖抑制剤や頭頸部腫瘍転移抑制剤や頭頸部腫瘍治療用医薬組成物の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の頭頸部腫瘍の状態や投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。
本明細書中の「頭頸部腫瘍」の種類としては、頭頸部がん（初発又は再発）、頭頸部異形成、頭頸部ポリープを例示することができ、頭頸部がん（初発又は再発）、頭頸部異形成を好適に例示することができ、頭頸部がん（初発又は再発）をより好適に例示することができ、初発の頭頸部がんをさらに好適に例示することができる。また、本明細書中の頭頸部腫瘍における頭頸部としては、口唇・口腔、鼻・副鼻腔、唾液腺、耳・側頭骨、頭蓋底等の頭部や、咽頭、喉頭、食道、甲状腺等の頸部を挙げることができるが、頸部を好適に例示することができ、中でも喉頭をより好適に例示することができる。頭頸部の腫瘍は、多くの場合、喉頭がん同様その組織型が扁平上皮細胞由来と考えられるため、本発明における阻害物質や促進物質は、喉頭がんや口腔がん以外の頭頸部腫瘍に対しても、増殖抑制剤や転移抑制剤や治療用医薬組成物として使用することができる。なお、本発明における特定の阻害物質や特定の促進物質は、すべての頭頸部腫瘍に対して増殖抑制効果や転移抑制効果を示すとは限らないが、多くの頭頸部腫瘍に対して増殖抑制効果や転移抑制効果を示す。したがって、本発明における阻害物質や促進物質の中から、増殖抑制のターゲットである頭頸部腫瘍に対して増殖抑制効果や転移抑制効果を示すものを適宜選択することにより、その頭頸部腫瘍に対する増殖抑制剤や転移抑制剤や治療用医薬組成物を容易に作製することができる。
また、本発明には、「本発明における阻害物質及び／又は促進物質を哺乳動物に投与する工程を含む頭頸部腫瘍増殖抑制方法」や、「本発明における阻害物質及び／又は促進物質を哺乳動物に投与する工程を含む頭頸部腫瘍転移抑制方法」や、「本発明における阻害物質及び／又は促進物質を哺乳動物に投与する工程を含む頭頸部腫瘍の予防・治療方法」や、「頭頸部腫瘍増殖抑制剤、頭頸部腫瘍転移抑制剤又は頭頸部腫瘍治療用医薬組成物の製造における、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の使用」や、「頭頸部腫瘍増殖抑制又は頭頸部腫瘍転移抑制における、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の使用」や、「頭頸部腫瘍の治療における、本発明における阻害物質及び／又は促進物質の使用」も含まれる。
［参考例１］
［頭頸部扁平上皮がん細胞株におけるマイクロＲＮＡの発現解析］
後述の実施例１記載の増殖アッセイの前提として、その増殖アッセイに用いる頭頸部扁平上皮がん細胞株につき、miR-196a、miR-133b、miR-375の３種類のマイクロＲＮＡに関する発現解析を行なった。具体的には、以下のような方法で行なった。
まず、頭頸部腫瘍の１種である頭頸部扁平上皮がん細胞株として、Ｃａ９−２２（口腔がん細胞株）、ＳＡＳ（舌がん細胞株）、ＪＨＵ−０１１（喉頭がん細胞株）の３種類を用意した。次いで、mirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各細胞から、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。抽出した各トータルＲＮＡ及びTaqMan（登録商標）MicroRNA Assays（Applied Biosystems社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。定量の方法は、添付のプロトコールに記載の方法にしたがった。リアルタイムＰＣＲに用いたTaqMan probeとしては、miR-196a、miR-133b、miR-375につき、それぞれPart Number 4373104、4373172、4373027のプローブ（Applied Biosystems社製）を用いた。コントロールとして、喉頭の非がん組織由来のトータルＲＮＡについても、同様の方法により、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。その結果、Ｃａ９−２２では、miR-196aがコントロールと比較して約６５倍に発現が増加しており、miR-133bはコントロールと比較して約６４分の１に発現が低下していた。また、miR-375においては、発現が認められなかった。同様に、ＳＡＳにおいても、miR-196aがコントロールと比較して、約８８倍に発現が増加しており、miR-133b及びmiR-375はコントロールと比較して、各々約１９分の１及び約１４８分の１に発現が低下していた。すなわち、miR-196aは、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡであり、miR-133b及びmiR-375は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡであることが確認された。この結果は、特願２００８−２４３３０６号で確認された結果と同様であった。
［頭頸部扁平上皮がん細胞株の増殖アッセイ］
頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質や、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質について、頭頸部腫瘍の増殖抑制効果を調べるために、頭頸部扁平上皮がん細胞株の増殖アッセイを行なった。具体的には以下のような方法を用いた。
まず、頭頸部扁平上皮がん細胞株で発現が増加傾向を示したmiR-196aに対しては、かかるマイクロＲＮＡの阻害物質として、miR-196aのＲＮＡ配列（配列番号６）に相補的な配列（miR-196aのアンチセンス配列）からなるＲＮＡ（ＩＮＨ １９６ａ、dharmacon社製）を用いた。また、頭頸部扁平上皮がん細胞株で発現が減少傾向を示したmiR-133bやmiR-375に対しては、かかるマイクロＲＮＡの促進物質として、それぞれのマイクロＲＮＡの模倣核酸、すなわち、miR-133b については、miR-133bのＲＮＡ配列（配列番号９）とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡ（ＭＩＭ １３３ｂ、dharmacon社製）を、miR-375については、miR-375のＲＮＡ配列（配列番号１１）とそれに相補的なＲＮＡ配列とからなる二重鎖ＲＮＡ（ＭＩＭ ３７５、dharmacon社製）を用いた。また、ネガティブコントロールとしては、ヒト、マウス、ラットの既知のマイクロＲＮＡと相同でないC. elegans由来の配列を用い、阻害物質のネガティブコントロール（ＩＮＨ ＮＣ、dharmacon社製）、ならびに模倣物質のネガティブコントロール（ＭＩＭ ＮＣ、dharmacon社製）を用意した。
ＪＨＵ−０１１細胞に対して、２４wellプレートに１ウェルあたり２０，０００個の細胞をまき、その翌日、ＩＮＨ １９６ａあるいはＩＨＮ ＮＣをトランスフェクションした。その後、５日間の培養において、３日目と５日目に０．４％トライパンブルー染色し、細胞数をCountess（登録商標、Invitrogen社製）にて測定した。結果、培養５日目の時点で、ＩＮＨ １９６ａ群では細胞数２２．６７±３．０６×１０４個／ｍｌであったのに対し、ＩＮＨ ＮＣ群では細胞数４４．３３±６．６６×１０４個／ｍｌであり、ＩＮＨ １９６ａ群では、ＩＮＨ ＮＣ群と比較して、細胞数の増殖が有意に抑制されていた（ｔ検定にて、ｐ＜０．０１）（図１Ａ）。
次に、これらに関しては、生細胞数と死細胞数を同時に評価するために、MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay（Promega社製）を用いて各々の相対的細胞数を評価した。このアッセイは、異なる２つのプロテアーゼである、生細胞由来プロテアーゼならびに死細胞由来プロテアーゼの活性を測定することで、各々生細胞数と死細胞数を同一ウェル内で測定する手法である。生細胞由来プロテアーゼはインタクトな生細胞内に限定されるため、このアッセイにおける細胞透過性のペプチド基質ＧＦ−ＡＦＣが生存細胞を透過し切断される際、生細胞数に比例した蛍光シグナルを生じることを利用して検出できる。また、死細胞由来プロテアーゼは、細胞膜に損傷を受けた細胞から漏出され、培地中でも活性を有するため、細胞非透過性蛍光ペプチドＡＡＦ−Ｒ１１０を基質に用いることで、蛍光法により死細胞数に比例したシグナルとして検出できる。具体的には、ＪＨＵ−０１１細胞に対して、９６wellプレートに１ウェルあたり５，０００個の細胞をまき、その翌日、ＩＮＨ １９６ａあるいはＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした。３日後、上記生細胞由来プロテアーゼと死細胞由来プロテアーゼの各々の活性を測定し、ＩＨＮ ＮＣをトランスフェクションした細胞由来の蛍光度の平均値を１として、生細胞および死細胞数の蛍光シグナルの相対値を算出した。結果、ＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、ＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした場合において、生細胞数の抑制（ＩＨＮ ＮＣ群：１±０．０１９、ＩＮＨ １９６ａ群：０．５８４±０．０２９、ｔ検定でｐ＜０．０１）と、死細胞数の促進（ＩＨＮ ＮＣ群：１±０．０２５、ＩＮＨ １９６ａ群：１．６９２±０．０５９、ｔ検定でｐ＜０．０１）を認めた（図１Ｂ）。
Ｃａ９−２２細胞に対して、９６wellプレートに５，０００個の細胞をまき、その翌日、ＩＮＨ １９６ａ、ＭＩＭ １３３ｂ、ＭＩＭ ３７５、ＩＮＨ ＮＣ、ＭＩＭ ＮＣを常法にしたがって、それぞれ５ｐｍｏｌをトランスフェクションした。その後、それらの各細胞を５日間培養し、それらの各細胞数を計測した。培養後の細胞数の測定は、ＷＳＴアッセイを利用し、細胞内酵素（ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ）の酵素活性を指標として間接的に評価することにより行なった。Ｃａ９−２２細胞における増殖アッセイの結果、ＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした場合については、ＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数はほとんど変わらなかったものの、ＭＩＭ １３３ｂやＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合については、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数は減少傾向にあり、特にＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合は、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数が４２．１％（ｔ検定にて、ｐ＜０．０１）も減少していた。
また、ＳＡＳ細胞に対しても同様の増殖アッセイを行なった結果、ＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした場合については、ＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数はほとんど変わらず、また、ＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合については、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数はほとんど変わらなかったものの、ＭＩＭ １３３ｂをトランスフェクションした場合については、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数が３５．１％（ｔ検定にて、ｐ＜０．０１）も減少していた。
さらに、ＪＨＵ−０１１細胞に対しても同様の増殖アッセイを行なった結果、ＩＮＨ １９６ａをトランスフェクションした場合については、ＩＮＨ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数が２０．０％も減少していた。また、ＭＩＭ １３３ｂやＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合については、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数は減少傾向にあり、特にＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合は、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、培養後の細胞数が２９．２％も減少していた。
なお、ＪＨＵ−０１１細胞に関しては、細胞の増殖抑制効果を別の手法でも確認するために、ＩＮＨ １９６ａ、ＭＩＭ ３７５、ＩＮＨ ＮＣ、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした後、Hoechst染色し、それらを蛍光顕微鏡で観察した。Hoechst染色は蛍光色素であるHoechstが核の二重鎖ＤＮＡに結合し、紫外線波長で励起されることにより青色の蛍光を発することを利用した染色法であり、これにより細胞数を直接視認することができる点で、細胞数を間接的に評価するＷＳＴアッセイよりも精度は高い。このHoechst染色によると、ＩＮＨ １９６ａあるいはＭＩＭ ３７５をトランスフェクションした場合の、各々３日後（図１Ｃ）、５日後（図２）の細胞増殖抑制効果は、ＷＳＴアッセイの結果から算出した細胞増殖抑制効果に一致した結果となっていた。
そこで、この手法を利用して、細胞増殖抑制効果の定量化を以下のように行なった。まず、Ｃａ９−２２細胞、ＳＡＳ細胞、ＪＨＵ−０１１細胞に加え、扁平上皮がん細胞株であるＦａＤｕ細胞（下咽頭がん細胞株）をスライドガラス（BD BioCoat（登録商標）、BD Falcon社製）上で培養し、２４時間後、Lipofectamine（登録商標）2000（Invitrogen社製）を用いて、 ＩＮＨ １９６ａ、ＭＩＭ １３３ｂ、ＭＩＭ ３７５、コントロールとしてＩＮＨ ＮＣ、ＭＩＭ ＮＣをそれぞれトランスフェクションした。その後、３日間培養し、核染色をHoechst33258にて行い、鏡検像の細胞染色領域を、画像解析ソフト（Image-Pro Plus（登録商標））を用いて計測した。結果、Ｃａ９−２２細胞において、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、ＭＩＭ ３７５をトランスフェクションすることで４０．３％の細胞数減少をみた。また、ＳＡＳ細胞においては、ＭＩＭ ＮＣをトランスフェクションした場合と比較して、ＭＩＭ １３３ｂをトランスフェクションすることで２３．１％の細胞数減少をみた。さらに、ＪＨＵ−０１１細胞ならびにＦａＤｕ細胞においては、コントロールをトランスフェクションした場合と比較して、ＩＮＨ １９６ａ（ＪＨＵ−０１１細胞：３８．５％の細胞数減少、ＦａＤｕ細胞：５３．６％の細胞数減少）、ＭＩＭ １３３ｂ（ＪＨＵ−０１１細胞：３８．８％の細胞数減少、ＦａＤｕ細胞：２７．３％の細胞数減少）、ＭＩＭ ３７５（ＪＨＵ−０１１細胞：４９．９％の細胞数減少、ＦａＤｕ細胞：５７．９％の細胞数減少）をトランスフェクションしたいずれの場合においても細胞数の減少を認めた。
以上の一連の結果から、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質や、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質は、頭頸部腫瘍の増殖抑制効果を有していることが示された。
［頭頸部腫瘍モデルマウスを用いたin vivo増殖アッセイ］
頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質が、in vivoにおいても頭頸部腫瘍の増殖抑制効果を有しているかを調べるために、in vivo増殖アッセイを行った。具体的には以下のような方法を用いた。
１０匹の６週齢ヌードマウスの頸部に、喉頭がん由来のヒト扁平上皮がん細胞ＪＨＵ−０１１をそれぞれ５×１０６個異種移植し、頭頸部腫瘍モデルマウスを作製した。移植から７日目（Ｄ７）に、頭頸部腫瘍モデルマウスの頸部に腫瘍が形成されたことを確認した後、これらの頭頸部腫瘍モデルマウスを２群に分けて、片方の１群を前述のＩＮＨ １９６ａ投与群（miR-196a inhibitor）（ｎ＝５）とし、もう片方の群を前述のネガティブコントロール投与群（inhibitor negative control）（ｎ＝５）とした。ＪＨＵ−０１１の移植から７日目（Ｄ７）、１３日目（Ｄ１３）、１９日目（Ｄ１９）に、ＩＮＨ １９６ａ投与群には、１ｎｍolのＩＮＨ １９６ａ（１０μＭのDharmacon micro RNAを０．１ｍｌ）と０．１ｍｌのAtelocollagen（AteloGene（登録商標）株式会社高研社製）との混合物を、ネガティブコントロール投与群には、１ｎｍolのinhibitor negative control（１０μＭのDharmacon micro RNAを０．１ｍｌ）と０．１ｍｌのAtelocollagen（AteloGene（登録商標）、株式会社高研社製）との混合物を、腫瘍周囲に局所投与した。すべての頭頸部腫瘍モデルマウスの腫瘍径（縦・横・高さ）を、移植から１週間後（１Ｗ）、３週間後（３Ｗ）、６週間後（６Ｗ）、９週間後（９Ｗ）、１２週間後（１２Ｗ）に計測し、縦・横・高さの積を体積比として両群で比較した。９週間後（９Ｗ）の腫瘍を観察した結果を図３Ａ（左：ネガティブコントロール投与群、右：ＩＮＨ １９６ａ投与群）に示す。また、１週間後（１Ｗ）における各群の腫瘍体積の平均値を１００％としたときの、各群の相対腫瘍体積（％）の平均値の推移を図３Ｂに示す。以上、miR-196aの阻害物質の投与によって、頭頸部腫瘍モデルマウスにおける腫瘍の増大が顕著に（図３Ａ）、かつ有意に（* ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）抑制されることが明らかとなり、in vivoにおいても、頭頸部腫瘍の増殖抑制効果が得られることが示された。
［頭頸部腫瘍モデルマウスにおける腫瘍組織の病理学的観察］
実施例２のin vivo増殖アッセイにおいて、移植から３ヶ月後における両群の頭頸部腫瘍モデルマウスの腫瘍組織から腫瘍を摘出し、１０％ホルマリン固定、パラフィン包埋し、組織標本を作製した。この組織標本について、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行い、組織形態を観察した。その結果を図４Ａ〜Ｄに示す。図４Ａは、ＩＮＨ １９６ａ投与群の腫瘍組織の組織標本の観察結果を示し、図４Ｂは、その一部（図４Ａ中の四角で囲われた部分）の拡大図を示す。また、図４Ｃは、ネガティブコントロール投与群の腫瘍組織の組織標本の観察結果を示し、図４Ｄは、その一部（図４Ｃ中の四角で囲われた部分）の拡大図を示す。ネガティブコントロール投与群では、一部壊死を伴うがん細胞（燕麦型の細胞）の増殖が認められたのに対し（図４Ｃ及びＤ）、ＩＮＨ １９６ａ投与群では、腫瘍内部に組織球の増生が認められるものの、がん細胞の存在は確認されなかった（図４Ａ及びＢ）。この結果から、miR-196aの阻害物質の投与による頭頸部腫瘍の増殖抑制効果は、病理学的にも裏付けられた。
［頭頸部腫瘍モデルマウスにおけるリンパ節組織の病理学的観察］
実施例２のin vivo増殖アッセイにおいて、移植から３ヶ月後における両群の頭頸部腫瘍モデルマウスの頸部リンパ節を摘出し、１０％ホルマリン固定、パラフィン包埋し、組織標本を作製した。この組織標本について、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行い、組織形態を観察した。その結果を図５Ａ〜Ｄに示す。図５Ａは、ＩＮＨ １９６ａ投与群の頸部リンパ節の組織標本の結果を示し、図５Ｂは、その一部（図５Ａ中の四角で囲われた部分）の拡大図を示す。また、図５Ｃは、ネガティブコントロール投与群の頸部リンパ節の組織標本の結果を示し、図５Ｄはその一部（図５Ｃ中の四角で囲われた部分）の拡大図を示す。ネガティブコントロール投与群では、がん細胞（燕麦型の細胞）が増殖し、がんの転移が認められたのに対し（図５Ｃ及びＤ）、ＩＮＨ １９６ａ投与群では、がん細胞の存在は確認されず、がんの転移は認められなかった（図５Ａ及びＢ）。また、上記両群の腫瘍モデルマウス各々２匹から頸部リンパ節を複数摘出し、組織学的にがんの転移の有無を検討したところ、ネガティブコントロール投与群では８３％の頸部領域リンパ節（locoregional lymph node）に転移が認められたのに対し、ＩＮＨ １９６ａ投与群では、５０％のリンパ節に認める程度であった（図５Ｅ）。以上の結果から、miR-196aの阻害物質の投与により、頭頸部腫瘍の増殖だけでなく、リンパ節転移も抑制し得ることが病理学的に示された。
本発明は、腫瘍の増殖抑制や腫瘍の転移抑制による頭頸部腫瘍治療の分野に特に有用である。

Claims (9)

  1. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍治療用医薬組成物。
  2. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍増殖抑制剤。
  3. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質が、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡのアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項２に記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤。
  4. 頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質が、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの模倣物質であることを特徴とする請求項２又は３に記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤。
  5. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡが、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであり、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡが、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の頭頸部腫瘍増殖抑制剤。
  6. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質、及び／又は、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質を含有する頭頸部腫瘍転移抑制剤。
  7. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡの阻害物質が、頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡのアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項６に記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤。
  8. 頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの促進物質が、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡの模倣物質であることを特徴とする請求項６又は７に記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤。
  9. 頭頸部腫瘍において発現が増加するマイクロＲＮＡが、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであり、頭頸部腫瘍において発現が低下するマイクロＲＮＡが、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の頭頸部腫瘍転移抑制剤。
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