JPWO2010029739A1 - 蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ポリマー層に高い含有率をもって蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】ポリマー粒子を、水を排除した非水系溶媒中で膨潤させることによってポリマー層の膨潤が促進されることに加え、ポリマー層内部への蛍光分子の移行が水分子に阻害されないため、より多くの蛍光分子がポリマー層の内部に導入される。また、非水系溶媒を蒸発除去する前に、反応系に対して水を添加するため、反応系に残存した水がポリマー粒子の乾燥を防止し、その結果、当該蛍光分子含有ポリマー粒子の高い分散性が好適に維持される。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光分子を含有するポリマー粒子に関し、より詳細には、分散性に優れ、そのポリマー層に高い含有率をもって蛍光分子を包含するポリマー粒子およびその製造方法に関する。

近年、バイオセンシング分野におけるマーカー材料として、磁性粒子の応用展開が種々検討されている。この点につき、本出願人が先に出願した特開２００６−８８１３１号公報（特許文献１）は、磁性粒子をポリマーで被膜することによって、磁性粒子の磁気応答性を維持しつつ、マーカーに要求される高い分散性を実現したポリマー磁性粒子を開示している。さらに、その発展形として、本出願人が先に出願した特開２００８−１２７４５４号公報（特許文献２）は、磁性粒子を被覆するポリマー層に蛍光分子を包含させることによって、蛍光標識としての機能と磁気応答性とを併せ持つ多機能型ポリマー磁性粒子を開示する。ここで、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子には、既存の蛍光検出器によって検出可能な蛍光輝度を実現すべく、その被覆ポリマー層により多くの蛍光分子を導入することが要求される。

特開２００６−８８１３１号公報 特開２００８−１２７４５４号公報

本発明は、上記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明は、ポリマー層に高い含有率をもって蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ポリマー粒子のポリマー層により多くの蛍光分子を含有させる方法につき鋭意検討した結果、特開２００８−１２７４５４号公報（特許文献２）に開示された被覆ポリマー層への蛍光分子の導入方法に一部改良を加えることによって、蛍光分子の含有量を大幅に増大させることに成功した。すなわち、本発明者らは、ポリマー粒子を、水を排除した非水系溶媒中で膨潤させることによって、ポリマー層の膨潤が好適に促進されることに加え、当該ポリマー層への蛍光分子の移行が水分子に阻害されないため、より多くの蛍光分子がポリマー層の内部に導入されること、さらに、非水系溶媒を蒸発除去する前に、反応系に対して水を添加することによって、非水系溶媒の蒸発除去後に反応系に残存する水がポリマー粒子の乾燥を防止することを見出し、上述した手順によって、高い含有率をもって蛍光分子を含有した蛍光分子含有ポリマー粒子が高い分散性を好適に維持した状態で得られることを発見し、本発明に至ったのである。

すなわち、本発明によれば、ポリマー磁性粒子を蛍光分子が溶解した非水系溶媒に分散させて被覆ポリマー層を膨潤し、該膨潤した被覆ポリマー層に蛍光分子を吸収させる工程と、前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー磁性粒子が分散した前記非水系溶媒に水を添加する工程と、前記非水系溶媒を蒸発除去する工程とを含む、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の製造方法が提供される。本発明においては、前記非水系溶媒を、水との親和性を有し、水よりも沸点が低く蒸気圧の高い有機溶媒とすることができる。

また、本発明によれば、被覆ポリマー層の内部に蛍光分子が導入された蛍光分子含有ポリマー磁性粒子であって、前記蛍光分子含有ポリマー磁性粒子１ｍｇあたりに少なくとも１００ｎｍｏｌの蛍光分子を含有することを特徴とする、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子が提供される。本発明においては、前記被覆ポリマー層をスチレンを含むモノマー成分からなる重合体によって形成することができる。また、本発明においては、前記蛍光分子を希土類金属キレート錯体とすることができ、前記希土類金属キレート錯体を構成する希土類金属を、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、およびジスプロシウムからなる群より選択される金属とすることができる。

さらに、本発明によれば、ポリマー粒子を蛍光分子が溶解した非水系溶媒に分散させてポリマー層を膨潤し、該膨潤したポリマー層に蛍光分子を吸収させる工程と、前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー粒子が分散した前記非水系溶媒に水を添加する工程と、前記非水系溶媒を蒸発除去する工程とを含む、蛍光分子含有ポリマー粒子の製造方法が提供され、ポリマー層に蛍光分子が導入された蛍光分子含有ポリマー粒子であって、前記蛍光分子含有ポリマー粒子１ｍｇあたりに少なくとも１００ｎｍｏｌの蛍光分子を含有することを特徴とする、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子が提供される。

上述したように、本発明によれば、分散性に優れ、ポリマー層に高い含有率をもって蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法が提供される。

本実施形態の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の製造工程を示したフローチャート。 実施例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示す図。 比較例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示す図。 蛍光分子を導入する前のポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示す図。 ユーロピウム単体分散液について蛍光強度を測定した結果を示す図。 蛍光ポリマー磁性粒子分散液について蛍光強度を測定した結果を示す図。 蛍光ポリマー磁性粒子分散液およびユーロピウム単体分散液のそれぞれの蛍光強度とエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)濃度の関係を示す図。 実施例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子による免疫染色を示す図。

以下、本発明を図面に示した実施の形態をもって説明するが、本発明は、図面に示した実施の形態に限定されるものではない。

本発明を、磁気応答性を備えるポリマー磁性粒子の被覆ポリマー層に対して蛍光分子を導入する実施形態を例にとって、以下説明する。図１は、本実施形態の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の製造工程を図１に示したフローチャートである。本実施形態においては、まず、工程１００において、ポリマー磁性粒子の水懸濁液を調製する。工程１００は、例えば、本出願人が先に出願した特開２００６−８８１３１号公報（特許文献１）に開示された下記の方法によって行うことができる。

まず、フェライトなどの親水性の磁性粒子に界面活性物質を吸着させて疎水化した後、この強磁性粒子にスチレンやグリシジルメタクリレートなどのラジカル付加重合可能なモノマー液と非イオン性の親水基を有する界面活性剤とを加え、さらに適量の水を添加して混合しソニケーション等を行って乳化する。このようにして調製された乳化液を６０〜８０℃に加熱したのち、親水性の開始剤を添加して乳化重合によりモノマーを重合させる。最後に、重合を終えた乳化粒子から界面活性剤を洗浄除去することにより、磁性粒子をポリマー被覆してなるポリマー磁性粒子の水懸濁液が得られる。

続く工程１０１において、工程１００で得られたポリマー磁性粒子の水懸濁液の溶媒（すなわち水）を非水系溶媒で置換した後、固相分離する。工程１０１は、例えば、以下の手順で行うことができる。まず、ポリマー磁性粒子の水懸濁液を、遠心分離機を用いて固液分離して水を除去し、残ったペレットにメタノール等のアルコールを加え、さらに固液分離するという操作を数回繰り返すことによって行うことができる。このアルコール洗浄によって、被覆ポリマー層に付着している親水性物質が除去され、被覆ポリマー層の膨潤が促進される。

続く工程１０２において、工程１０１で固液分離して得られたポリマー磁性粒子のペレットに対し、蛍光分子を非水系溶媒に溶解してなる溶液（以下、蛍光分子溶液という）を添加して振とうする。工程１０２においては、ポリマー磁性粒子の被覆ポリマー層が蛍光分子溶液の非水系溶媒によって膨潤し、この膨潤したポリマーの内部に蛍光分子が非水系溶媒とともに吸収される。

なお、本実施形態においては、被覆ポリマー層に導入する蛍光分子として、希土類金属キレート錯体を用いることができる。希土類金属キレート錯体を構成する希土類金属としては、ユーロピウムのほか、サマリウム、テルビウム、およびジスプロシウムを挙げることができる。

本実施形態においては、先の工程１０１において溶媒置換を行っているため、工程１０２の反応系において水が排除されている。その結果、被覆ポリマー層の膨潤が好適に促進されるとともに、被覆ポリマー層内部への蛍光分子の移行が水分子に阻害されないため、より多くの蛍光分子を被覆ポリマー層の内部に導入することが可能となる。本実施形態においては、蛍光分子溶液の溶媒、ならびに、被覆ポリマー層を膨潤するための溶媒として機能する上記非水系溶媒として、水との親和性を有し、水に比べ沸点が低く蒸気圧の高い有機溶媒を用いることが好ましい。例えば、本実施形態においては、上記非水系溶媒として、親水性基を有し、沸点が５６．５℃のアセトンを用いることができる。

工程１０２において、好ましくは、被覆ポリマー層への蛍光分子の移行が飽和状態になった後、工程１０３において、上記反応系に水を添加する。添加する水は、純水であることが好ましく、蒸留水やｍｉｌｌｉＱ水を用いることができる。また、添加する水の量は、上記反応系の非水系溶媒と等量程度とすることが好ましい。

最後に、工程１０４において、工程１０３の反応系から非水系溶媒を蒸発除去する。この非水系溶媒の蒸発除去は、水より沸点の低い非水系溶媒のみが気化する条件下で、例えば減圧処理、加熱処理、あるいは減圧しながら加熱する処理などの方法によって行うことができる。その結果、被覆ポリマー層に吸収された非水系溶媒が除去され、被覆ポリマー層内に蛍光分子のみが残留する。この際、工程１０３において添加された水が反応系に残存するため、蛍光分子が導入されたポリマー磁性粒子の乾燥が防止され、その結果、ポリマー磁性粒子の高い分散性が好適に維持される。最終的に、工程１０５において、高い含有率をもって蛍光分子を含有したポリマー磁性粒子の水懸濁液が得られる。

以上説明した手順によれば、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子１ｍｇあたり、少なくとも１００ｎｍｏｌ、好ましくは、１５０ｎｍｏｌ以上、より好ましくは、２００ｎｍｏｌ以上、望ましくは、２５０ｎｍｏｌ以上の蛍光分子を導入することができる。換言すれば、本実施形態においては、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子１個あたり、少なくとも４．０×１０^５個以上、好ましくは、６．０×１０^５個以上、より好ましくは、８．０×１０^５個以上、望ましくは、１．０×１０^６個以上の蛍光分子を導入することができるので、マーカーとしての充分な蛍光輝度が実現される。

以上説明したように、本発明の製造方法によれば、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を高い分散性を維持した状態で提供することができる。このことは、すなわち、優れた定量性を保証するものである。また、本発明の製造方法によれば、より多くの蛍光分子をポリマーの内部に完全に密封する形で導入することができるので、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子は、細胞中、生体中など、多彩な環境下において、外部環境に影響されることなく、高輝度の蛍光を安定して供給することができる。

なお、本実施形態のポリマー磁性粒子は、生理活性物質に対する結合性を改善すべく、被覆ポリマー層の表面に、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、ブチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのスペーサ分子を結合させることができるが、上述した蛍光分子の導入方法は、スペーサ分子が結合した状態のポリマー磁性粒子に対しても同様に適用することができる。

以上、本発明をフェライトなどの親水性の磁性粒子を核として形成されるポリマー磁性粒子の被覆ポリマー層に蛍光分子を導入する実施形態をもって説明してきたが、本願の技術思想は、粒子状のポリマーに蛍光分子を導入するための汎用的な方法に係るものであり、蛍光分子の導入対象をポリマー磁性粒子に限定して解釈されるべきものではないことに留意されたい。すなわち、本発明によれば、乳化重合や懸濁重合など既知の方法を経て調製される、磁性粒子を含有しない既知のポリマー粒子の水懸濁液に対して、上述した工程１０２以降の手順を加えることによって、当該ポリマー粒子の内部に、上述したのと同様の高い含有率をもって蛍光分子を包含させることができるのであり、このことは、当業者であれば容易に理解しうるところであろう。

以下、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子について、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。

＜ＥＧＤＥ修飾ポリマー磁性粒子の調製＞
ＮａＯＨ水溶液（１Ｍ）にＦｅＣｌ_２水溶液を添加し、ＮａＮＯ_３により酸化処理を行った。定温保持し、平均粒径が４０ｎｍのフェライト粒子を析出させた。このフェライト粒子１５０ｍｇの懸濁液に、１０−ウンデセン酸のＮａＯＨの水溶液を添加することにより、強磁性粒子にウンデセン酸を飽和吸着させ、残った１０−ウンデセン酸のＮａＯＨの水溶液を洗浄除去することにより、疎水化強磁性粒子を得た。

この疎水化強磁性粒子に、ＰＥＯ鎖を有する非イオン性界面活性剤Ｅｍｕｌｇｅｎ １１５０Ｓ−７０（花王株式会社製）０．３ｇを溶解した水溶液を加えてソニケーションすることにより、この非イオン性界面活性剤を疎水化強磁性粒子の表面に吸着させて粒子を再親水化し水に分散させた。

次に、この再親水化フェライト粒子のコロイド溶液に、スチレン（モノマー）２．７ｇ、ＧＭＡ（グリシジルメタクリレート、モノマー）０．３ｇ、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル、開始剤）０．０２５ｇ、ＤＶＢ（ジビニルベンゼン、架橋剤）０．０８ｇ、およびジエチルエーテル２．５ｇを有するモノマーミックスを添加し、ソニケーションを行って乳化液を得た。

次に、この乳化液に対しその全量が１２５ｇになるように水を添加し、ソニケーションを行なった後、３５０ｒｐｍで攪拌を続けながら加熱し、２０〜３０分後に７０℃に達したところで水溶性開始剤Ｖ−５０（和光純薬工業（株）製）５０ｍｇを純水５ｍｌに溶かした水溶液を添加して重合反応を１２時間行ない、得られた乳化重合粒子を洗浄し、フェライト粒子がポリマーで被覆されてなるポリマー磁性粒子の水懸濁液を得た。

さらに、上述した手順で調製したポリマー磁性粒子に、スペーサとしてエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）を結合させる修飾を行った。まず、ポリマー磁性粒子にアミノ基を導入するために、ＮＨ_４ＯＨ水溶液をこの粒子のスラリーに加え、これをＨＣｌ水溶液でｐＨを調整して反応させることにより、ＧＭＡのエポキシ基を開環しアミノ基を導入した。

次に、このポリマー磁性粒子の開環したアミノ基に対し、過剰量のＥＧＤＥを仕込み、ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調整し攪拌を行なって、ポリマー被覆フェライト粒子のアミノ基とＥＧＤＥのエポキシ基とを結合させた。反応後、磁気分離操作を利用して水洗浄を行ない、ＥＧＤＥで修飾されたポリマー磁性粒子の水懸濁液を得た。

＜蛍光分子の導入＞
（蛍光分子溶液の調製）
蛍光分子として、Ｅｕ（ＴＴＡ）_３（ＴＯＰＯ）_２錯体（テノイルトリフルオロアセトンを配位したＥｕ錯体）１．１ｍｇをアセトン０．２２ｇに添加し、蛍光分子のアセトン溶液を調製した。

（アルコール洗浄）
ポリマー磁性粒子の高分子層の膨潤を促進するために、高分子層に付着している親水性物質を除くべく、ポリマー磁性粒子のアルコール洗浄を行なった。具体的は、上述した手順で調製したポリマー磁性粒子の水懸濁液１ｍｇを、遠心分離機を用いて固液分離して水を除去し、残ったペレットにメタノールを加えて分散させた後、再び同様の手順で固液分離するという操作を数回繰り返した。最後の固液分離でメタノールを除いた後に残ったペレットを使用して、下記の実施例および比較例に係る実験を行った。

（実施例１）
上述した手順で得られたポリマー磁性粒子のペレットに対して、１．０８
μｍｏｌの蛍光分子を含むアセトン溶液を添加して、ポリマー磁性粒子をアセトン溶液に分散させた。このアセトン溶液を室温で１時間振とう後、このアセトン溶液に対し、ｍｉｌｌｉＱ水を添加した。なお、ｍｉｌｌｉＱ水は、アセトン溶液と等量を添加した。その後、６０℃で真空加熱を行ってアセトンを蒸発除去し、ポリマー磁性粒子の水懸濁液を得た。

（比較例１）
上述した手順で得られたポリマー磁性粒子のペレットに対して、ｍｉｌｌｉＱ水を添加してポリマー磁性粒子を水に分散させた。次に、この水懸濁液に対し、１．０８μｍｏｌの蛍光分子を含むアセトン溶液を添加して混合した。なお、蛍光分子のアセトン溶液は、上記ｍｉｌｌｉＱ水と等量を加えた。最後に、この混合溶液を室温で１時間振とう後、６０℃で真空加熱を行ってアセトンを蒸発除去し、ポリマー磁性粒子の水懸濁液を得た。

（比較例２）
上述した手順で得られたポリマー磁性粒子のペレットに対して、１．０８
μｍｏｌの蛍光分子を含むアセトン溶液を添加して、ポリマー磁性粒子を分散させた。このアセトン溶液を室温で１時間振とう後、６０℃で真空加熱を行い、アセトンを蒸発除去し、ポリマー磁性粒子の粉末を得た。

＜分散性の検証＞
上記実施例１ならびに比較例１で得られたポリマー磁性粒子の水懸濁液のそれぞれについて、遠心分離機を用いて固液分離し、得られたペレットを０．１％ＮＰ４０ (界面活性剤ノニデットＰ-４０、販売元ナカライテスク)の溶液に分散させて洗浄した後に、再度、水に懸濁して分散性の評価を行った。また、比較例２で得られたポリマー磁性粒子の粉末についても同様に、０．１％ＮＰ４０ の溶液を添加し、水への分散を試みた。なお、分散性の評価は、動的光散乱法を用いた粒径の重量換算分布の測定結果に基づいて行った。粒径の重量換算分布の測定にはＦＰＡＲ−１０００(大塚電子株式会社)を使用した。

図２は、実施例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示し、図３は、比較例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示す。また、図４は、蛍光分子を導入する前のポリマー磁性粒子の粒径の重量換算分布の測定結果を示す。蛍光分子を導入する前のポリマー磁性粒子は、図４に示されるような単峰性の分布を示していたが、実施例１および比較例１についても、図２および図３に示されるように、図４と同様の単峰性の分布を示す結果となり、平均粒径がいずれも２２０ｎｍ前後であったことから、蛍光分子導入後に単粒子分散を保っていることが分かった。なお、比較例２についても測定を試みたが、サンプルのポリマー磁性粒子が著しく凝集してしまったため、水に分散させることができず、測定そのものが不可能であった。上述した実施例の結果から、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子が、好適な分散性を備えることが示された。このことは、センシングマーカーの用途における優れた定量性を保証するものである。

＜蛍光分子の導入量の検証＞
次に、実施例１および比較例１のそれぞれについて、Ｅｕ（ＴＴＡ）_３（ＴＯＰＯ）_２錯体の導入量を測定した。具体的には、蛍光分子が導入されたポリマー磁性粒子から、アセトンを用いてユーロピウム錯体を溶出させ、この溶出されたユーロピウムを原子発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ, Ｌｅｅｍａｎ Ｌａｂｓ, ＩＮＣ Ｕ．Ｓ．Ａ． 装置名：Ｐｒｏｄｉｇｙ ＩＣＰ）で定量した。下記表１は、その定量結果を示す。

上記表１に示されるように、比較例１においては、ポリマー磁性粒子１ｍｇあたり５５．１ ｎｍｏｌのユーロピウムが導入されていることが分かった。これは、ポリマー磁性粒子の１粒子の重さを６．０７×１０^−１５ｇとして換算すると、ポリマー磁性粒子１個にユーロピウム錯体が２．０１×１０^５個が導入されたことを意味する。なお、本実施例のポリマー磁性粒子の１粒子あたりの重さは、以下の手順で導出した。本実施例のポリマー磁性粒子におけるポリマー層の体積比は、熱分析の結果から約６２％であることがわかった。マグネタイトの比重（５．３ｇ／ｃｍ^３）およびポリマーの比重（１．０ｇ／ｃｍ^３）から、本実施例のポリマー磁性粒子の比重を1．４５ｇ／ｃｍ^３とした。一方、ＴＥＭ像より本実施例のポリマー磁性粒子の粒径が約２００ｎｍであったことから、本実施例のポリマー磁性粒子１個あたりの重さを６．０７×１０^−１５ｇと推定した。

一方、実施例１においては、ポリマー磁性粒子１ｍｇあたり３８６
ｎｍｏｌのユーロピウムが導入されていることが分かった。これは、ポリマー磁性粒子１個にユーロピウム錯体が１．４１×１０^６個が導入されたことを意味し、比較例１に比べて蛍光分子の導入量が７倍近く増大したことが分かった。

＜蛍光分子の導入形態の検証＞
さらに、実施例１で作製した蛍光ポリマー磁性粒子について、蛍光分子（Ｅｕ（ＴＴＡ）_３（ＴＯＰＯ）_２錯体）が、ポリマーの表面に単に付着しているのではなく、その内部に密封される形で導入されていることを以下の手順で検証した。

（蛍光強度のｐＨ依存性）
実施例１で作製した蛍光ポリマー磁性粒子を、４種類のバッファー（酢酸バッファー、ホウ酸＋塩化カリウム-水酸化ナトリウムバッファー、リン酸バッファー、Hepes-NaOHバッファー）の各ｐＨ溶液中に分散させたもの（以下、蛍光ポリマー磁性粒子分散液として参照する）を用意した。なお、各蛍光ポリマー磁性粒子分散液は、粒子濃度が20μg/mlとなるように調製した。

一方、比較例として、上述したのと同じ４種類のバッファーの各ｐＨ溶液中にＥｕ（ＴＴＡ）_３（ＴＯＰＯ）_２錯体をミセル化して分散させたもの（以下、ユーロピウム単体分散液として参照する）を用意した。なお、各ユーロピウム単体分散液は、1 nmol/mlになるように調整した。

上述した手順で調製した蛍光ポリマー磁性粒子分散液およびユーロピウム単体分散液のそれぞれについて、蛍光分光光度計LS-55(PerkinElmer)を用いて蛍光強度を測定した。なお、測定においては、Excitationを340 nmとし、Emissionを550-700 nmで計測し、618 nmの値を蛍光強度とした。スリットはExcitation、Emissionとも10.0 nmとした。

図５は、ユーロピウム単体分散液について蛍光強度を測定した結果を示す。図５に示されるように、ユーロピウム単体分散液については、全てのバッファーにおいて中性付近で強い蛍光強度が測定されたものの、その他のｐＨ領域においては蛍光強度が急落しており、Ｅｕ（ＴＴＡ）_３（ＴＯＰＯ）_２錯体の蛍光強度は、外部環境のｐＨの影響を大きく受けることが示された。

一方、図６は、蛍光ポリマー磁性粒子分散液について蛍光強度を測定した結果を示す。図６に示されるように、蛍光ポリマー磁性粒子分散液については、全てのｐＨ領域において強い蛍光強度が維持しており、その蛍光強度が外部環境のｐＨの影響を受けないことがわかった。

（蛍光強度の消光剤濃度依存性）
上述した手順で調製した蛍光ポリマー磁性粒子分散液（ｐＨ 7.95)およびユーロピウム単体分散液（ｐＨ 7.95）に対して、ユーロピウム錯体の消光剤として知られるEDTAを添加した後、上述したのと同様の条件で蛍光強度を測定した。なお、EDTA濃度については、５条件（0 mM、0.1 mM、0.3 mM、1 mM、3 mM）を設定した。

図７は、蛍光ポリマー磁性粒子分散液およびユーロピウム単体分散液のそれぞれの蛍光強度とEDTA濃度の関係を示す。図７に示されるように、ユーロピウム単体分散液においては、EDTA濃度が1 mMになったあたりから蛍光強度が減少しはじめ、EDTA濃度が3 mMになると蛍光強度は50%にまで減少した。一方、図７に示されるように、蛍光ポリマー磁性粒子分散液においては、EDTA濃度の上昇に伴う蛍光強度の低下は観察されなかった。

上述した２つの測定結果は、実施例１で作製した蛍光ポリマー磁性粒子に導入されたユーロピウム錯体が外的環境の影響を受けていないことを示している。このことは、実施例１で作製した蛍光ポリマー磁性粒子においては、ユーロピウム錯体がポリマーの表面に単に付着しているのではなく、ポリマーの内部に密封される形で導入されていることを推察させるものである。

上述した実施例の結果から、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子においては、より多くの蛍光分子がポリマーの内部に完全に密封されていることが示された。このことは、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子が、外部環境に影響されることなく、高輝度の蛍光を安定して供給することを保証するものである。

次に、実施例１で作製した蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を使用して、乳腺ＣＮＢ検体の蛍光抗体法による免疫染色（蛍光免疫染色法）を以下の手順で実施した。

（蛍光分子含有ポリマー磁性粒子に対する抗EGFR抗体の固定化）
実施例１において調製したＥＧＤＥ修飾ポリマー磁性粒子に対して、3.0M NH4OHで24時間70℃で反応を行うことによりＥＧＤＥ末端のエポキシ基にアミノ基を導入した後、0.5M無水コハク酸ＤＭＦ溶液中で12時間（室温）反応させることによって、ポリマー磁性粒子の表面にカルボキシル基を導入した。このポリマー磁性粒子に対して、実施例1と同様の方法でユーロピウム錯体を導入し、カルボキシル化蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を作製した。

上述した手順で作製したカルボキシル化蛍光分子含有ポリマー磁性粒子1 mgに対し、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）のmilliQ溶液（20 mg/ml）を200 μl添加した後、4℃で30分間浸とうを行い、カルボキシル基の活性化を行った。その後、500 μlの氷上で冷やしたmilliQ及び粒子上抗体固定化バッファーを1回ずつ使用して、遠心分離を用いて素早く洗浄した。次に50 μg分の抗EGFR抗体を粒子上抗体固定化バッファー50 μlに溶解した溶液を添加し、4℃で2時間振とうした後、1 Mのエタノールアミン溶液を5 μl添加して、4℃で一昼夜浸とうした。最後に、1 mlの抗体固定化後洗浄バッファーで5回洗浄した後、作製された抗EGFR抗体固定化蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を4℃で遮光保存した。

（抗EGFR抗体固定化蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を用いた免疫染色）
乳腺ＣＮＢ検体のパラフィン切片をスライドグラスに貼付した後、キシレンによる脱パラフィン処理、メタノールによる親水処理、流水水洗（15min）を行なった。さらにこれについて、DAKO Proteinase K(0.4mg/ml/0.05M TBS pH7.5〜7.7)を使用して抗原賦活化処理（室温30min）を行なったのち、さらに、流水水洗（15min）を経て、5%BSAによるブロッキング処理（20min）を実施した。

上記サンプルに対し、上述した手順で作製した抗EGFR抗体固定化蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の分散液（分散溶媒：10mM Hepes-NaOH (pH7.9), 50mM KCl, 1mM EDTA, 0.1%(w/v) Tween 20）を滴下した後、スライドグラスの裏側にネオジム磁石を10min配置した。その後、サンプルをTBSで洗浄し、親水性封入材によって封入した。

なお、対照サンプルとして、免疫ペルオキシダーゼ法（染色液：マイヤーヘマトキシリン）によって免疫染色を行なった同じ乳腺ＣＮＢ検体の組織切片を用意した。

図８（ａ）は、実施例１の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を使用して免疫染色を行なったサンプルの蛍光顕微鏡写真を示し、図８（ｂ）は、免疫ペルオキシダーゼ法によって免疫染色を行なった対照サンプルの顕微鏡写真を示す。図８に示されるように、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を使用した免疫染色によれば、対照サンプルと同等のコントラストをもって、がん化している部分を蛍光染色できることが確認された。

上述した実施例の結果から、本発明の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子をアフィニティ反応の利用したバイオセンシングにおける蛍光マーカに適用した場合、必要十分な輝度の蛍光を供給できることが示された。

以上、説明したように、本発明によれば、ポリマー層の内部により多くの蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法が提供される。本発明の蛍光分子含有ポリマー粒子は、高輝度の蛍光標識として安定して機能することができ、バイオセンシング分野における有用なマーカー材料として更なる応用展開が期待される。

Claims (11)

1. ポリマー磁性粒子を蛍光分子が溶解した非水系溶媒に分散させて被覆ポリマー層を膨潤し、該膨潤した被覆ポリマー層に蛍光分子を吸収させる工程と、
   前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー磁性粒子が分散した前記非水系溶媒に水を添加する工程と、
   前記非水系溶媒を蒸発除去する工程とを含む、
   蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の製造方法。
2. 前記非水系溶媒が、水との親和性を有し、水よりも沸点が低く蒸気圧の高い有機溶媒である、請求項１に記載の製造方法。
3. 被覆ポリマー層の内部に蛍光分子が導入された蛍光分子含有ポリマー磁性粒子であって、
   前記蛍光分子含有ポリマー磁性粒子１ｍｇあたりに少なくとも１００ｎｍｏｌの蛍光分子を含有することを特徴とする、蛍光分子含有ポリマー磁性粒子。
4. 前記被覆ポリマー層がスチレンを含むモノマー成分からなる重合体によって形成される、請求項３に記載の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子。
5. 前記蛍光分子が希土類金属キレート錯体である、請求項３または４に記載の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子。
6. 前記希土類金属キレート錯体を構成する希土類金属が、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、およびジスプロシウムからなる群より選択される、請求項５に記載の蛍光分子含有ポリマー磁性粒子。
7. ポリマー磁性粒子の水懸濁液を非水系溶媒で溶媒置換することによって水を除去した後、該ポリマー磁性粒子を蛍光分子が溶解した非水系溶媒に分散させて被覆ポリマー層を膨潤し、該膨潤した被覆ポリマー層の内部に蛍光分子を吸収させる工程と、
   前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー磁性粒子が分散した前記非水系溶媒に水を添加する工程と、
   前記非水系溶媒を蒸発除去して、前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー磁性粒子の水懸濁液を得る工程とを含む、
   蛍光分子含有ポリマー磁性粒子の製造方法。
8. ポリマー粒子を蛍光分子が溶解した非水系溶媒に分散させてポリマー層を膨潤し、該膨潤したポリマー層に蛍光分子を吸収させる工程と、
   前記蛍光分子を吸収した前記ポリマー粒子が分散した前記非水系溶媒に水を添加する工程と、
   前記非水系溶媒を蒸発除去する工程とを含む、
   蛍光分子含有ポリマー粒子の製造方法。
9. ポリマー層に蛍光分子が導入された蛍光分子含有ポリマー粒子であって、
   前記蛍光分子含有ポリマー粒子１ｍｇあたりに少なくとも１００ｎｍｏｌの蛍光分子を含有することを特徴とする、蛍光分子含有ポリマー粒子。
10. 蛍光抗体法によって免疫染色する方法であって、
    基板に貼付した組織切片に対して、抗体を固定化した請求項３〜６のいずれか１項に記載の前記蛍光分子含有ポリマー磁性粒子を付与し、該蛍光分子含有ポリマー磁性微粒子を前記組織切片に向けて強制的に磁気誘導することを特徴とする、蛍光免疫染色方法。
11. 前記磁気誘導は、前記基板の裏側に磁石を配置することによって行なう、請求項１０に記載の蛍光免疫染色方法。

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