JPWO2009104719A1 - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

本発明は、正常な透過光画像を得ることができるようにするレーザ走査顕微鏡に関する。蛍光検出ユニット２６は、レーザ光の照射により励起する試料１２からの蛍光の光量を測定し、透過光検出部２７は、レーザ光が試料１２を透過した透過光の光量を測定する。また、クレム処理部２８は、１画素対応範囲走査時間より短い下限値判定時刻における蛍光の光量が下限閾値未満である場合および１画素対応範囲走査時間中に蛍光の光量が上限閾値以上である場合の一方に該当するときにレーザ光の照射を停止させる制御を１画素対応範囲走査時間ごとに行う。また、クレム処理部２８は、下限値判定時刻での透過光の光量に基づいて、１画素対応範囲走査時間の露光がなされていたときに測定されるであろう透過光の光量を外挿し、画像取得部２９は、その外挿された光量から透過光画像を取得する。本発明は、例えば、レーザ走査顕微鏡に適用できる。

Description

本発明は、レーザ走査顕微鏡に関し、特に、正常な透過光画像を得ることができるようにしたレーザ走査顕微鏡に関する。

従来、レーザ走査顕微鏡は、生体細胞などの試料にレーザ光を照射し、そのレーザ光を走査させることで、試料の蛍光物質が励起されて試料から発せられる蛍光による蛍光画像や、試料を透過する透過光による透過光画像などを取得する。

また、特許文献１には、レーザ光による試料の損傷（退色）を抑制するために、蛍光の受光量が所定の上限の閾値以上となる場合、および、蛍光の受光量が所定の下限の閾値以下となる場合に、レーザ光の照射を停止するように制御を行うレーザ走査顕微鏡が開示されている。

特表２００７−５００８８０号公報

しかしながら、上述したような、閾値を用いてレーザ光の照射を制御するレーザ走査顕微鏡では、例えば、複数のレーザ光を試料に照射し、それぞれのレーザ光による蛍光画像を得る場合に、レーザ光の照射時間がそれぞれ異なることになる。これにより、それらのレーザ光が試料を透過した透過光の光量が照射時間によって変化してしまい、正常な透過光画像を得ることができなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、正常な透過光画像を得ることができるようにするものである。

本発明のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡において、
前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、
前記レーザ光が前記試料を透過した透過光の光量を測定する透過光測定手段と、
前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における前記蛍光の光量が下限閾値未満である場合および前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に前記蛍光の光量が上限閾値以上である場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素対応範囲走査時間ごとに行う照射制御手段と、
前記照射制御手段により、前記蛍光測定手段により測定される蛍光の光量が下限閾値未満であるか否かを判定する前記下限値判定時刻での前記透過光測定手段が測定した透過光の光量に基づいて、前記１画素対応範囲走査時間の照射がなされていたときに測定されるであろう透過光の光量を外挿する外挿手段と、
前記外挿手段により外挿された光量を画像処理し、外挿済みの透過光画像を取得する画像処理手段と
を備えることを特徴とする。

本発明のレーザ走査顕微鏡においては、レーザ光の照射により励起し、試料から発せられる蛍光の光量が測定され、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における蛍光の光量が下限閾値未満である場合および画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中における蛍光の光量が上限閾値以上である場合の少なくとも一方に該当する場合に、レーザ光の照射を停止させる制御が、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素対応範囲走査時間ごとに行われる。また、蛍光の光量が下限閾値未満であるか否かを判定する下限値判定時刻での透過光の光量に基づいて、１画素対応範囲走査時間の照射がなされていたときに測定されるであろう透過光の光量が外挿される。そして、その外挿された光量が画像処理され、外挿済みの透過光画像が取得される。

本発明のレーザ走査顕微鏡によれば、正常な透過光画像を得ることができる。

本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。 クレム処理およびクレム外挿処理について説明する図である。 透過光画像データのクレム外挿処理について説明する図である。 透過光画像データのクレム外挿処理について説明する図である。 クレム処理部２８の構成例を示すブロック図である。 クレム処理部２８の他の構成例を示すブロック図である。 クレム演算透過光画像およびクレム評価透過光画像の例を示す図である。 クレム評価透過光画像および蛍光画像を表示させる処理を説明するフローチャートである。 蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像と、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像とを示す図である。 クレム処理が施された蛍光画像とクレム処理が施されていない蛍光画像とで２分割された画像の例である。 一部でクレム処理を切り替えた画像の例である。

符号の説明

１１ レーザ走査顕微鏡システム， １２ 試料， １３ レーザ走査顕微鏡， １４ パーソナルコンピュータ， １５ 表示装置， １６ 入力装置， １７ アプリケーションソフトウェア， ２１ レーザ光源ユニット， ２２ レーザ走査部， ２３ ダイクロイックミラー， ２４ 対物レンズ， ２５ ステージ， ２６ 蛍光検出ユニット， ２７ 透過光検出部， ２８ クレム処理部， ２９ 画像取得部，３０ ファイバー ３１ａ乃至３１ｃ レーザ光源， ３２ａ乃至３２ｃ シャッタ， ４１ ＤＭ， ４２ ＢＡフィルタ， ４３ ＰＭＴ， ５１ 入力信号処理回路， ５２ 外挿処理回路， ５３ 出力信号処理回路， ５４ 切替回路， ５５ サンプリング部， ５６ 演算部， ６１ 判定処理部， ６２₁および６２₂ サンプリング部， ６３₁および６３₂ 演算部

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。

図１において、レーザ走査顕微鏡システム１１は、試料１２に照射されるレーザ光により画像を取得するレーザ走査顕微鏡１３と、レーザ走査顕微鏡１３を制御するパーソナルコンピュータ１４とが接続されて構成される。

パーソナルコンピュータ１４には、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)などからなる表示装置１５、および、マウスやキーボードからなる入力装置１６が接続されている。パーソナルコンピュータ１４は、内蔵するCPU（Central Processing Unit）がアプリケーションソフトウェア１７を実行することで、レーザ走査顕微鏡１３により取得された画像や、レーザ走査顕微鏡１３の設定値をユーザに入力させるためのGUIなどを表示装置１５に表示させたり、ユーザが入力装置１６を操作することにより入力される設定値に基づいて、レーザ走査顕微鏡１３を制御する。

レーザ走査顕微鏡１３では、レーザ光源ユニット２１からのレーザ光が試料１２に照射され、そのレーザ光により試料１２の蛍光物質が励起されて試料から発せられる蛍光による蛍光画像、および、試料１２を透過する透過光による透過光画像が取得される。

レーザ光源ユニット２１には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発する３つのレーザ光源３１ａ乃至３１ｃ、および、レーザ光の照射をオン／オフするための３つのシャッタ３２ａ乃至３２ｃが設けられている。シャッタ３２ａ乃至３２ｃは、例えば、AOM(Acousto-Optic Modulator：音響光学素子)やAOFT（音響光学可変フィルタ）などの高速シャッタ素子であり、後述するようにクレム処理部２８の制御に従って、レーザ光源３１ａ乃至３１ｃからのレーザ光による試料１２の照射を、それぞれオン／オフする。

レーザ光源ユニット２１から発せられるレーザ光（励起光）は、出力端がファイバコネクタ（図示せず）に接続された光ファイバ（図示せず）によりダイクロイックミラー２３に導入され、反射したレーザ光はレーザ走査部２２に導入される。

レーザ走査部２２は、例えば、レーザ光を反射するミラーと、ミラーを駆動する駆動機構とを有して構成されるガルバノスキャナであり、レーザ光源ユニット２１からのレーザ光を、試料１２のＸ−Ｙ平面（試料１２に照射されるレーザ光の光軸に対し直交する平面）で走査する。レーザ走査部２２により走査されるレーザ光は、対物レンズ２４により集光されて、ステージ２５上の試料１２に照射される。

レーザ光を照射することにより励起され試料１２から発せられた蛍光は、対物レンズ２４を透過してレーザ走査部２２に入射し、デスキャンされた後ダイクロイックミラー２３に入射する。ダイクロイックミラー２３は、蛍光を透過し、その蛍光は、ファイバー３０を介して、蛍光検出ユニット２６に入射される。

蛍光検出ユニット２６において、試料１２からの蛍光は、ＤＭ（Dichroic Mirror：ダイクロイックミラー）４１ａに入射し、第１の波長領域の蛍光がＤＭ４１ａにより反射されて、ＢＡフィルタ（Barrier filter）４２ａにより、試料１２や光学系からの散乱光がフィルタリングされた後、ＰＭＴ（photo multiplier tube：光電子増倍管）４３ａに入射される。

また、ＤＭ４１ａを透過した蛍光は、ＤＭ４１ｂに入射し、第２の波長領域の蛍光がＤＭ４１ｂにより反射されて、ＢＡフィルタ４２ｂによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ４３ｂに入射される。また、ＤＭ４１ｂを透過した第３の波長領域の蛍光は、ＢＡフィルタ４２ｃによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ４３ｃに入射される。

そして、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃは、それぞれ受光した蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の電気信号をクレム処理部２８に供給する。なお、以下、適宜、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃを、それぞれ区別する必要がない場合、ＰＭＴ４３と称する。

また、試料１２に照射されたレーザ光のうち、試料１２を透過した透過光は、透過光検出部２７に入射する。透過光検出部２７は、試料１２を透過した透過光の光量に応じた電圧の電気信号をクレム処理部２８に供給する。

クレム処理部２８は、ＰＭＴ４３からの電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット２１のシャッタ３２ａ乃至３２ｃの制御を、試料１２の画像の１画素ごとに１画素に相当する所定時間（１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素対応範囲走査時間）内において行い、レーザ光の照射により試料１２が露光される露光時間を制御する処理（以下、適宜、クレム（CLEM：Controlled Light-Exposure Microscopy）処理と称する）を行う。

また、クレム処理部２８は、クレム処理を行うことにより、露光時間がレーザ光の走査速度に応じて設定される１画素分の露光時間より短い時間となったときに、ＰＭＴ４３または透過光検出部２７からの電気信号に対し、１画素分の露光時間の露光がなされていたときに得られるであろう電気信号を演算により外挿して出力する処理（以下、適宜、クレム外挿処理と称する）を行う。

レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム処理部２８がクレム処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ１４を操作することにより設定することができ、クレム処理を行うと設定されている場合、クレム処理部２８は、クレム処理を行うとともに、蛍光検出ユニット２６からの電気信号に対しクレム外挿処理を施して画像取得部２９に供給する。

また、レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム処理を行うと設定されているときに、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ１４を操作することにより設定することができる。そして、クレム処理部２８は、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うと設定されている場合、透過光検出部２７からの電気信号を外挿して画像取得部２９に供給し、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行わないと設定されている場合、透過光検出部２７からの電気信号を、そのまま画像取得部２９に供給する。

画像取得部２９は、クレム処理部２８から供給される電気信号を増幅してA/D(Analog/Digital)変換し、その電気信号から画像を組み立てる画像処理を行い、その画像処理により得られる画像データをパーソナルコンピュータ１４に供給する。

即ち、画像取得部２９は、蛍光検出ユニット２６からの電気信号より蛍光画像データを取得し、クレム処理部２８においてクレム外挿処理が施された透過光検出部２７からの電気信号よりクレム演算透過光画像データ（即ち、外挿済みの透過光）を取得し、クレム処理部２８においてクレム外挿処理が施されていない透過光検出部２７からの電気信号よりクレム評価透過光画像データ（即ち、未外挿の透過光画像）を取得する。

そして、レーザ走査顕微鏡システム１１では、蛍光画像データ、クレム評価透過光画像データ、およびクレム演算透過光画像データに基づいて、それぞれの画像を個別に表示装置１５に表示したり、ユーザにより指定された画像を重ね合わせて、または分割して表示装置１５に表示したりすることができる。

次に、図２を参照して、クレム処理およびクレム外挿処理について説明する。

図２において、横軸は時刻を表し、ある１画素の露光が開始される時刻Ｔ_startから、レーザ光の走査速度に応じて設定される１画素あたりの露光時間Ｕ（１Pixel Dwell）が経過する時刻Ｔ_endまでの時刻が示されている。また、縦軸は、ＰＭＴ４３により計測される蛍光の受光量に応じてＰＭＴ４３から出力される電気信号の電圧の積算値（即ち、蛍光光量を積算した値）が示されている。

また、図２において、V_H'は、レーザ走査顕微鏡１３において、画像を取得するために必要十分な電圧値として予めユーザにより設定されたV_thHに基づいて算出される、画素の露光時間U経過時に計測されるであろう電圧値を示している。また、Ｖ_MINは、レーザ走査顕微鏡１３において、背景（バックグラウンド）と見なせるあるいは、注目に値しないほど低い信号として設定される下限の電圧値を示している。

クレム処理部２８には、ＰＭＴ４３が試料１２からの蛍光を受光し、その受光量に応じた電圧の電気信号がＰＭＴ４３から供給され、クレム処理部２８は、時刻Ｔ_startから電圧の積算を開始し、後述する方法により時刻Ｔ_endまで積算したであろう積算値を１画素の画素値（光量）として出力する。

ここで、クレム処理部２８は、１画素の露光時間Ｕの経過時に、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達することができないと判定した場合、および、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中でV_thHに達したと判定した場合に、シャッタ３２を閉鎖して試料１２へのレーザ光の照射を停止させるように制御する。即ち、時間Ｕの経過時に、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達していなかった場合には、ＰＭＴ４３からの電気信号が取得できないような画素であり、これ以上の電気信号の取得は不要である。また、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中で、電圧Ｖ_thHを超過する場合には、ＰＭＴ４３からの電気信号は十分に取得されており、これ以上の電気信号の取得は不要である。従って、この場合には、試料１２へのレーザ光の照射を停止させることにより、試料１２の劣化（退色）を抑制する。

例えば、クレム処理部２８は、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達するか否かを判定する時刻である下限値判定時刻Ｔ_thLにおける電圧値Ｖ_nが、下限閾値Ｖ_thL（Ｖ_thL＝Ｖ_MIN×Ｔ_thL／Ｕ）未満であるか否かを判定し、下限値判定時刻Ｔ_thLにおける電圧値Ｖ_nが、下限閾値Ｖ_thL未満であると判定した場合、シャッタ３２を閉鎖する。また、例えば、クレム処理部２８は、電圧が、所定の上限閾値Ｖ_thHを超えたときには、電圧が上限閾値Ｖ_thHを超えた時刻Ｔ_nを記憶し、シャッタ３２を閉鎖する。

このように、クレム処理部２８が、１画素ごとに、ＰＭＴ４３の受光量に応じた電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット２１のシャッタ３２の開閉を制御する処理がクレム処理である。

そして、クレム処理部２８は、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないと判定し、シャッタ３２を閉鎖した場合に、シャッタ３２を閉鎖せずに時刻Ｔ_endまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないときに外挿された電圧Ｖ_L’は、Ｖ_L’＝Ｖ_n×（Ｕ／Ｔ_thL）で求められる。

また、クレム処理部２８は、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中で上限閾値V_thHに達したと判定し、シャッタ３２を閉鎖した場合に、シャッタ３２を閉鎖せずに時刻Ｔ_endまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、上限閾値Ｖ_thHでの時刻Ｔ_nの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が上限閾値V_thHを越えたときに外挿された電圧Ｖ_H'は、Ｖ_H'＝Ｖ_thH×（Ｕ／Ｔ_n）で求められる。

このように、クレム処理部２８が、クレム処理によりシャッタ３２ａ乃至３２ｃが閉鎖されたときに、測定された電圧を外挿する処理がクレム外挿処理である。

ここで、レーザ光源ユニット２１には、３つのレーザ光源３１ａ乃至３１ｃが設けられており、レーザ光源３１ａ乃至３１ｃのレーザ光により試料１２の蛍光物質が励起されて発生する蛍光が、試料１２からそれぞれ発せられ、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃにより受光される。従って、試料１２に含まれる蛍光物質に応じて、それらの蛍光の光量はそれぞれ異なっており、クレム処理部２８では、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃからの電気信号ごとに、クレム処理を行う。

このようにクレム処理が行われることにより、シャッタ３２ａ乃至３２ｃが閉鎖される時刻は、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃからの電気信号それぞれによって異なるものとなる。これにより、あるレーザ光により試料１２の蛍光物質が励起されて発生する蛍光の光量が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないほど少ない場合には、そのレーザ光の照射は、下限値判定時刻Ｔ_thLで停止される。一方、他のレーザ光により試料１２の蛍光物質が励起されて発生する蛍光の光量が多い場合には、そのレーザ光の照射は、電圧が上限閾値Ｖ_thHを超える時刻Ｔ_nまで、或いは、１画素の露光時間Ｕが経過する時刻Ｔ_endまで行われる。

また、レーザ走査顕微鏡１３では、試料１２を透過する透過光を受光する透過光検出部２７からの電気信号により透過画像を取得するが、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃの受光量に応じて、レーザ光源３１ａ乃至３１ｃからのレーザ光の照射が停止する時刻が異なる場合には、レーザ光の照射時間（露光時間）に応じて透過光光量が異なり、これにより、正常な透過画像を得ることができない。

ところで、蛍光の光量が少ない場合であっても、下限値判定時刻Ｔ_thLまでは必ずレーザの照射が行われる。このことより、クレム処理部２８は、透過光画像データに対してクレム外挿処理を施す場合には、クレム処理が行われるときに、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて透過光検出部２７から出力される電気信号に対して処理を施す。

即ち、図３および図４を参照して、透過光画像データのクレム外挿処理について説明する。

図３および図４においては、横軸は図２と同様に、時刻を表している。また、縦軸は、透過光検出部２７により計測される透過光の受光量に応じて出力される電気信号の電圧の積算値（即ち、透過光光量を積算した値）が示されている。

図３には、例えば、２つのレーザ光が試料１２に照射されているときに、両方のレーザ光が下限値判定時刻Ｔ_thLで両方とも停止した場合に測定される電圧値Ｖ₁と、それらのいずれか一方のレーザ光が下限値判定時刻Ｔ_thLで停止した場合に測定される電圧値Ｖ₂とが示されている。

図４には、例えば、２つのレーザ光が試料１２に照射されているときに、両方のレーザ光が時刻Ｔ_n（上限閾値Ｖ_thHを超過した時刻）で両方とも停止した場合に測定される電圧値Ｖ₁と、それらのいずれか一方のレーザ光が時刻Ｔ_nで停止した場合に測定される電圧値Ｖ₂とが示されている。なお、電圧が上限閾値Ｖ_thHを超過する時刻Ｔ_nは、下限値判定時刻Ｔ_thLから時刻Ｔ_endまでの上限値検出範囲Ｐで検出される。

図３および図４に示すように、２つのレーザ光の両方が停止する場合と、一方が停止する場合とで、測定される電圧値（即ち、外挿が行われない電圧値）が異なるとともに、レーザ光が停止する時刻によっても、測定される電圧値が異なる。

そこで、クレム処理部２８は、上述したようにレーザ光の照射が必ず行われている下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nに基づいて直線外挿を行い、１画素分の露光時間の露光がなされていたときに得られるであろう電圧値として、外挿電圧値Ｖ’（Ｖ’＝Ｖ_n×Ｕ／Ｔ_thL）を算出する。

このように、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nに基づいて直線外挿を行うことで、安定した外挿電圧値を得ることができ、正常な透過画像を得ることができる。即ち、一定の露光時間Ｕで照射が行われたときの透過画像を正常な画像としたときに、上述したように、複数のレーザ光の照射時間がそれぞれ異なる場合には、それぞれの画素の照射時間に応じた透過画像になり、正常な画像を得ることができなかった。これに対し、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nに基づいて直線外挿を行うことで、上限値検出範囲Ｐでレーザ光の照射が停止しても、一定の露光時間Ｕで露光がなされていたときに得られるであろう電圧値が外挿電圧値Ｖ’として算出されるので、正常な画像を得ることができる。また、クレム処理部２８では、１画素ごとにクレム外挿処理を行うため、下限値判定時刻Ｔ_thLで直線外挿の演算を開始することで、露光時間Ｕで確実に外挿電圧値を算出することができる。

また、このようにして下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nに基づいてクレム外挿処理を行うか否かは、ユーザが、パーソナルコンピュータ１４を操作することにより設定することができ、クレム処理部２８は、その設定に従って処理を行う。

次に、図５は、クレム処理部２８の構成例を示すブロック図である。

クレム処理部２８には、図１の透過光検出部２７が受光した透過光の光量に応じた電気信号が入力信号として供給され、透過光検出部２７からの入力信号は、まず、クレム処理部２８中の入力信号処理回路５１および切替回路５４に供給される。

また、入力信号処理回路５１には、図示しないクロック回路から露光時間Ｕに同期したピクセルクロック信号（入力制御信号）が供給される。入力信号処理回路５１は、積算回路およびA/D(Analog/Digital)変換回路を備えており、ピクセルクロック信号に従って、透過光検出部２７からの入力信号を積算し、その電気信号をA/D変換して外挿処理回路５２に供給する。

外挿処理回路５２は、サンプリング部５５および演算部５６を備えている。サンプリング部５５は、入力信号処理回路５１から供給される電気信号を、下限値判定時刻Ｔ_thLでサンプリングして、その電気信号を演算部５６に供給する。

演算部５６は、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値に基づいて、図３および図４を参照して説明したように外挿電圧値Ｖ’（Ｖ’＝Ｖ_n×Ｕ／Ｔ_thL）を算出し、外挿電圧値Ｖ’を出力信号処理回路５３に供給する。

なお、演算部５６では、入力信号処理回路５１、外挿処理回路５２、および出力信号処理回路５３のそれぞれの回路での処理の速度を考慮した回路定数ｋを用いて、外挿電圧値Ｖ’を算出する際に、Ｖ’＝Ｖ_n×Ｕ／Ｔ_thL×ｋを演算する。また、例えば、処理速度と外挿精度とのバランスを考慮して、Ｕ／Ｔ_thL×ｋを定数ａとしてあらかじめ算出しておき、外挿電圧値Ｖ’をＶ_n×ａの演算、即ち、乗算だけで求めることができる。これにより、処理に時間がかかる除算が不要となり、処理速度を向上させることができる。

出力信号処理回路５３は、D/A(Digital/Analog)変換回路を備えており、演算部５６からの外挿電圧値Ｖ’をD/A変換して、図示しないクロック回路から供給される露光時間Ｕに同期したピクセルクロック信号（出力制御信号）に従って、出力信号処理回路５３は、そのピクセルクロック信号に従って、D/A変換した外挿電圧値Ｖ’の電気信号を切替回路５４に供給する。

切替回路５４には、画像取得部２９を介して、パーソナルコンピュータ１４から、ユーザの設定に従った切替信号が供給され、切替回路５４は、その切替信号に従って、出力信号処理回路５３から供給される外挿電圧値Ｖ’の電気信号、および、透過光検出部２７から直接供給される入力信号のうちの、いずれか一方を出力信号として画像取得部２９に供給する。即ち、クレム外挿処理を行うと設定されている場合、切替回路５４は、出力信号処理回路５３から供給される外挿電圧値Ｖ’の電気信号を出力し、一方、クレム外挿処理を行わないと設定されている場合、切替回路５４は、透過光検出部２７から直接供給される入力信号（即ち、透過光量に応じた電圧の電気信号）を出力する。

また、画像取得部２９は、例えば、積算回路およびサンプリング部を備えているとともに、パーソナルコンピュータ１４からの切替信号に従って、それらの回路を切り替えることができる。即ち、画像取得部２９は、クレム外挿処理を行うと設定されている場合、演算部５６において演算が施された外挿電圧値Ｖ’の電気信号からクレム演算透過光画像を取得する。一方、画像取得部２９は、クレム外挿処理を行わないと設定されている場合、透過光検出部２７から切替回路５４を介して供給される透過光の光量に応じた電気信号を積算し、時刻Ｔ_endでサンプリングした電気信号（例えば、図３の電圧値Ｖ₁またはＶ₂）からクレム評価透過光画像を取得する。

なお、クレム処理部２８は、クレム外挿処理を行わないときに、透過光検出部２７からの電気信号を直接出力する他、その電気信号を積算し、サンプリングして出力してもよい。

即ち、図６は、クレム処理部２８の他の構成例を示すブロック図である。

図６のクレム処理部２８は、図５のクレム処理部２８と同様に、入力信号処理回路５１および出力信号処理回路５３を備えており、外挿処理回路５２’の構成が、図５の外挿処理回路５２と異なる。

外挿処理回路５２’は、判定処理部６１、サンプリング部６２₁および６２₂、並びに演算部６３₁および６３₂を備えており、判定処理部６１に供給される切替信号に従って処理の切り替えを行う。

即ち、判定処理部６１は、ユーザの設定に従って、クレム外挿処理を行うことを設定する切替信号がパーソナルコンピュータ１４から供給されると、入力信号処理回路５１から供給される電気信号をサンプリング部６２₁に供給する。一方、判定処理部６１は、クレム外挿処理を行わないことを設定する切替信号がパーソナルコンピュータ１４から供給されると、入力信号処理回路５１から供給される電気信号をサンプリング部６２₂に供給する。

サンプリング部６２₁は、入力信号処理回路５１からの電気信号を、下限値判定時刻Ｔ_thLでサンプリングして、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_nを演算部６３₁に供給し、演算部６３₁は、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値Ｖ_n、露光時間Ｕ、および回路定数ｋに基づいて、外挿電圧値Ｖ’を算出し、外挿電圧値Ｖ’を出力信号処理回路５３に供給する。

一方、サンプリング部６２₂は、入力信号処理回路５１から供給される電気信号を、時刻Ｔ_endでサンプリングし、時刻Ｔ_endでの電圧値（例えば、図３の電圧値Ｖ₁またはＶ₂）を演算部６３₂に供給し、演算部６３₂は、その電圧値を、回路定数ｋを用いて補正して出力信号処理回路５３に供給する。

出力信号処理回路５３には、クレム外挿処理を行うことが設定されている場合、演算部６３₁から外挿電圧値Ｖ’が供給され、出力信号処理回路５３は、外挿電圧値Ｖ’をD/A変換して画像取得部２９に出力する。これにより、画像取得部２９は、クレム演算透過光画像データを取得する。

また、出力信号処理回路５３には、クレム外挿処理を行うことが設定されていない場合、演算部６３₂から時刻Ｔ_endでの電圧値が供給され、出力信号処理回路５３は、時刻Ｔ_endでの電圧値をD/A変換して画像取得部２９に出力する。これにより、画像取得部２９は、クレム評価透過光画像データを取得する。

このように、クレム処理部２８において処理を切り替えることにより、レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム演算透過光画像およびクレム評価透過光画像のどちらも取得することができる。

例えば、図７のAには、クレム演算透過光画像が示されている。クレム演算透過光画像では、クレム外挿処理により画像全体が、クレム処理が施されなかった場合（即ち、シャッタ３２を閉鎖せずに時刻Ｔ_endまで露光を行った場合）と同等の光量の画像が表示される。また、クレム演算透過光画像では、試料１２により光量が減少した部分が、その他の部分より暗く表示されている。

また、図７のBには、クレム評価透過光画像が示されている。クレム評価透過光画像では、レーザ光が下限値判定時刻Ｔ_thLで停止した箇所が暗く表示され、レーザ光が時刻Ｔ_nで停止した箇所が明るく表示されている。このように、クレム処理においてレーザ光が停止した箇所、即ち、露光時間が短かった箇所を画素ごとに把握することができる。

このように、レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム評価透過光画像により、各画素におけるレーザ光（励起光）の照射時間を確認することができる。

なお、本実施形態では、試料１２にレーザ光を照射する前に、ユーザがパーソナルコンピュータ１４を操作することによりクレム外挿処理を行うか否かを予め設定して、クレム演算透過光画像およびクレム評価透過光画像のいずれか一方を取得することを開示しているが、これに限らない。

図６に示すクレム処理部２８の入力信号処理回路５１と外挿処理回路５２’との間に記憶部を設ける構成にしてもよい。

その場合、記憶部には下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値と、時刻Ｔ_endでの電圧値とが１画素分ごとにA/D変換後のデジタル信号データとして保存される。クレム演算透過光画像および／またはクレム評価透過光画像の作成は、試料１２にレーザ光を照射した後に、ユーザがパーソナルコンピュータ１４を操作することによりクレム外挿処理を行うか否か設定して、記憶部に保存されたデジタル信号データを呼び出し、外挿処理回路５２’および出力信号処理回路５３を経た結果、出力されるA/D変換後のアナログ信号を用いて、画像取得部２９にて行う。

また、図６に示すクレム処理部２８の外挿処理回路５２’と出力信号処理回路５３とをクレム処理部２８に配置する代わりに画像取得部２９に配置し、記憶部をクレム処理部２８の入力信号処理回路５１の後側、または、画像取得部２９の外挿処理回路５２’の前側に設けてもよい。

その場合、記憶部には下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧値と、時刻Ｔ_endでの電圧値とが１画素分ごとにA/D変換後のデジタル信号データとして保存される。クレム演算透過光画像またはクレム評価透過光画像の作成は、試料１２にレーザ光を照射した後に、ユーザがパーソナルコンピュータ１４を操作することによりクレム外挿処理を行うか否か設定して、クレム処理部２８または画像取得部２９の記憶部に保存されたデジタル信号データを呼び出し、画像取得部２９の外挿処理回路５２’および出力信号処理回路５３を経て、デジタル信号から画像生成して、それをパーソナルコンピュータ１４に送り画像表示してもよいし、そのデジタル信号データをデジタル信号の状態でパーソナルコンピュータ１４に送り、パーソナルコンピュータ１４で画像を生成して表示してもよい。

次に、図８は、ユーザがパーソナルコンピュータ１４を操作して、クレム処理部２８に対する設定を行い、クレム評価透過光画像および蛍光画像を表示させる処理を説明するフローチャートである。

例えば、ユーザが、ステージ２５に試料１２をセットし、レーザ走査顕微鏡システム１１を起動させると処理が開始され、パーソナルコンピュータ１４が実行するアプリケーションソフトウェア１７は、表示装置１５にGUIを表示し、ステップＳ１１において、ユーザが入力装置１６を操作して、レーザ光源ユニット２１のレーザ光源３１ａ乃至３１ｃのうちの、クレム処理の対象となるレーザ光源を選択すると、ユーザにより選択されたレーザ光源をクレム処理部２８に設定する。

ステップＳ１１の処理後、ステップＳ１２に進み、ユーザが入力装置１６を操作して、下限値判定時刻Ｔ_thL、下限閾値Ｖ_thL、および上限閾値Ｖ_thHを入力すると、アプリケーションソフトウェア１７は、それらの設定値をクレム処理部２８に設定し、処理はステップＳ１３に進む。

ステップＳ１３において、ユーザは、クレム評価透過光画像を確認することによるクレム処理におけるレーザ光の照射時間のコントロール結果を確認するために、入力装置１６を操作して、透過光画像のクレム外挿処理を行わない指示を入力すると、アプリケーションソフトウェア１７は、その入力に応じて、図５を参照して説明した切換信号を、クレム処理部２８の切替回路５４に供給する。これにより、クレム処理部２８では、透過光画像のクレム外挿処理が無効となるように設定され、切替回路５４は、透過光検出部２７から直接供給される電気信号を出力するように設定される。

ステップＳ１３の処理後、処理はステップＳ１４に進み、アプリケーションソフトウェア１７は、ユーザの操作に応じて、クレム処理を行うとともに、ＰＭＴ４３からの電気信号に対しクレム外挿処理を施すようにクレム処理部２８を設定する。これにより、クレム処理部２８によりクレム外挿処理が施されたＰＭＴ４３からの電気信号に基づいて、画像取得部２９が蛍光画像データを取得し、表示装置１５に蛍光画像が表示されるようになる。

ステップＳ１４の処理後、処理はステップＳ１５に進み、アプリケーションソフトウェア１７は、ユーザの操作に応じて、クレム処理部２８から出力されるクレム評価透過光画像データを画像化し、疑似カラー表示によりクレム評価透過光画像を表示装置１５に表示するように画像取得部２９を設定し、処理はステップＳ１６に進む。

ステップＳ１６において、ユーザが入力装置１６を操作して、蛍光画像データおよびクレム評価透過光画像データの取得の開始を指示すると、アプリケーションソフトウェア１７は、その指示に従って、レーザ走査顕微鏡１３の各部を制御し、それらのデータの取得を開始させる。これにより、クレム処理部２８は、蛍光画像データおよびクレム評価透過光画像データの取得を開始する。

ステップＳ１６の処理後、処理はステップＳ１７に進み、アプリケーションソフトウェア１７は、クレム処理部２８から画像取得部２９に供給されるクレム評価透過光画像データに基づいて、表示装置１５にクレム評価透過光画像を表示するように制御を行う。これにより、表示装置１５にクレム評価透過光画像が表示され、ユーザは、クレム評価透過光画像、即ち、クレム処理部２８によりクレム処理が施されることによる各画素におけるレーザ光の照射時間のコントロール結果を確認することができる。

ステップＳ１７の処理後、処理はステップＳ１８に進み、アプリケーションソフトウェア１７は、ユーザの操作に従って、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像を表示するか否かを判定する。ステップＳ１８において、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像を表示すると判定された場合、処理はステップＳ１９に進む。

ステップＳ１９において、アプリケーションソフトウェア１７は、画像取得部２９を制御して、蛍光画像データとクレム評価透過光画像データとに基づいて、それぞれの画像を重ね合わせた画像を生成させ、表示装置１５に、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像（後述の図９のA）を表示させる。

ステップＳ１９の処理後、または、ステップＳ１８で蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像を表示を表示しないと判定された場合、処理はステップＳ２０に進む。ステップＳ２０において、アプリケーションソフトウェア１７は、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像を表示するか否かを判定する。そして、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像を表示すると判定された場合、処理はステップＳ２１に進む。

ステップＳ２１において、アプリケーションソフトウェア１７は、画像取得部２９を制御して、蛍光画像データとクレム評価透過光画像データとに基づいて、それぞれの画像を２分割表示させた画像を生成させ、表示装置１５に、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像（後述の図９のB）を表示させる。

ステップＳ２１の処理後、または、ステップＳ２０で蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像を表示しないと判定された場合、処理は終了する。

以上のように、レーザ走査顕微鏡システム１１では、ユーザの設定に従って、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像や、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像を表示することができる。

このように、評価透過光画像を疑似カラー表示させることにより、ユーザは、クレム処理において露光時間が制御された箇所を画素ごとに確認（把握）することができる。また、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを比較することで、ユーザは、クレム処理において露光時間が制御された箇所を空間的に把握することができる。

例えば、図９のAは、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを重ね合わせた画像であり、この画像では、試料１２である細胞の輪郭付近などが明るくなる画像が表示されている。また、図９のBは、蛍光画像とクレム評価透過光画像とを２分割表示させた画像である。

なお、例えば、レーザ走査顕微鏡システム１１では、１枚の蛍光画像を得る途中で、クレム処理のオン／オフを切り替えることができ、クレム処理が施された蛍光画像とクレム処理が施されていない蛍光画像とで２分割された画像を得ることができる。

図１０は、クレム処理が施された蛍光画像とクレム処理が施されていない蛍光画像とで２分割された画像の例である。

図１０に示されている画像は、上側がクレム処理が施された蛍光画像で、下側がクレム処理が施されていない蛍光画像である。このように、クレム処理が施された蛍光画像とクレム処理が施されていない蛍光画像とで２分割された画像により、クレム処理が蛍光画像に適切に施されているか否かを確認することができる。例えば、画像の上側と下側とが、ほぼ同様の蛍光画像であれば、クレム処理が蛍光画像に適切に施されている、即ち、図２の電圧Ｖ_H’および電圧Ｖ_L’が適切に求められていることが分かる。

また、クレム処理が施された蛍光画像とクレム処理が施されていない蛍光画像とは、２分割で表示する他、例えば、クレム処理が施された蛍光画像の一部に、クレム処理が施されていない蛍光画像を表示させたり、クレム処理が施されていない蛍光画像の一部に、クレム処理が施された蛍光画像を表示させたりすることができる。

例えば、図１１のAは、クレム処理が施された蛍光画像の一部に、クレム処理が施されていない蛍光画像を表示させた画像の例であり、図１１のBは、クレム処理が施されていない蛍光画像の一部に、クレム処理が施された蛍光画像を表示させた画像の例である。

このように、試料１２の細胞ごとに、クレム処理のオン／オフを切り替えることにより、クレム処理が蛍光画像に適切に施されているか否かを確認することができるとともに、例えば、特定の細胞の劣化だけを抑制することができる。

なお、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。

また、本明細書において、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

Claims (3)

1. レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡において、
   前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、
   前記レーザ光が前記試料を透過した透過光の光量を測定する透過光測定手段と、
   前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における前記蛍光の光量が下限閾値未満である場合および前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に前記蛍光の光量が上限閾値以上である場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素対応範囲走査時間ごとに行う照射制御手段と、
   前記照射制御手段により、前記蛍光測定手段により測定される蛍光の光量が下限閾値未満であるか否かを判定する前記下限値判定時刻での前記透過光測定手段が測定した透過光の光量に基づいて、前記１画素対応範囲走査時間の照射がなされていたときに測定されるであろう透過光の光量を外挿する外挿手段と、
   前記外挿手段により外挿された光量を画像処理し、外挿済みの透過光画像を取得する画像処理手段と
   を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 前記画像処理手段は、さらに前記１画素対応範囲走査時間経過時に前記透過光測定手段が測定した透過光の光量に基づいて、前記外挿手段による外挿処理を行わない未外挿の透過光画像を取得する機能を有する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
3. 前記画像処理手段により取得される前記外挿済みの透過光画像または前記未外挿の透過光画像と、前記蛍光測定手段により測定された蛍光の光量に基づく蛍光画像とを、ユーザの指定に従って、重ね合わせて、または、１つの画面に分割して表示させる表示制御手段を
   さらに備えることを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。

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