CN103616760B

CN103616760B - 激光扫描共焦显微镜成像系统

Info

Publication number: CN103616760B
Application number: CN201310612507.8A
Authority: CN
Inventors: 黄维; 张运海; 高飞; 薛晓君
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103616760A

Abstract

本发明提供的激光扫描共焦显微镜成像系统包括数据采集单元、光源单元、扫描控制单元、上位机单元及中央控制单元，通过上位机单元采集所述荧光强度数据并根据所述荧光强度数据计算所述成像系统的扫描参数，中央控制单元根据所述上位机单元发送的所述扫描参数，生成对所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元的控制信号，实现对所述待测样品的扫描成像，从而得到信噪比满意的扫描成像图像，提高了图像成像质量。

Description

激光扫描共焦显微镜成像系统

技术领域

本发明涉及显微物镜光学检测技术领域，尤其是涉及一种激光扫描共焦显微镜成像系统。

背景技术

激光扫描共焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy，LSCM）是研究亚微米细微结构的有效技术手段，它是国内外从事生物医学和材料科学研究的科技工作者必备的大型科研仪器。在LSCM中，采用光电倍增管（PhotomultiplierTube，PMT）作为荧光探测器用来采集微弱荧光信号，具有高分辨率、高灵敏度的优点。在极弱光信号下，PMT输出信号呈现脉冲信号输出特性；在微弱光信号下，PMT输出信号呈现出脉冲信号和直流信号叠加的输出特性。

对于LSCM系统，通过X-Y扫描机构驱动扫描光斑运动并遍历样本上的成像区域，从样本返回的荧光信号通过光路后到达PMT，PMT的输出为在扫描时间内的连续模拟电压信号。由于PMT在弱光下的输出随机分布特性，如果直接对这个信号进行AD转换并由此重建图像，则一个恒定光强的样本采样也会得到一个像素点随机明暗强烈变化的图像。可以采用对PMT输出信号过采样后求平均、对像素驻留时间内PMT输出信号进行模拟积分后采样等方式提高其信噪比。

但是，在实际应用中，由于PMT采集光信号的强弱、光信号本身的信噪比存在很大的差异，对于采用对像素驻留时间内的模拟信号进行积分的方案，为满足成像质量需求，需要增强激发荧光的激光强度来提高荧光强度或者延长像素驻留时间以获得更好的信噪比。即需要对成像时间，激光强度，像素积分时间等参数进行多次调整。这个过程需要多次用较强的激光对样本进行多次遍历扫描，容易发生荧光漂白的现象，而影响最终得到图像的质量，而且整个过程需要较长的时间。

发明内容

本发明的目的是：提供一种激光扫描共焦显微镜成像系统，该激光扫描共焦显微镜成像系统能够提高成像质量。

本发明的技术方案是：一种激光扫描共焦显微镜成像系统，包括数据采集单元、光源单元、扫描控制单元、上位机单元及中央控制单元，所述数据采集单元电性连接于所述上位机单元，所述上位机单元电性连接于所述中央控制单元，所述中央控制单元与所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元均电性连接；

所述数据采集单元预扫描待测样品并获得荧光强度数据，所述上位机单元采集所述荧光强度数据并根据所述荧光强度数据计算所述成像系统的扫描参数，所述中央控制单元根据所述上位机单元发送的所述扫描参数，生成对所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元的控制信号，实现对所述待测样品的扫描成像。

下面对上述技术方案进一步解释：

所述扫描参数包括扫描速度、采样点数、像素积分时间、放电时间、激光强度及PMT增益，所述上位机单元根据所述荧光强度数据采用下述优化模型计算所述扫描参数：

maxKPI＝αSNR+βN+γL^-1θV²

所述α、β、γ、θ为各个指标的影响因子，所述KPI为优化目标，所述SNR为图像信噪比评价，所述N为扫描速度指标，所述L为激光强度指标，其中，所述扫描速度指标N与所述像素积分时间成反比，所述采样点数*（所述像素积分时间+所述放电时间）=所述扫描速度^-1，所述SNR＝I(T_int)*F，所述I(T_int)为所述像素积分时间对信号比的影响，所述F为荧光强度，所述F＝KφL(1-e^-εbc)，所述K为仪器常数，所述φ为荧光量子产率，所述ε是样品的克分子消光系数，所述b为样品池的光径长度，所述c为样品浓度，所述V为电压适配指标，所述电压适配指标V代表所述数据采集卡的电压量程与最大信号电压值的差值。

所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的激光强度并根据所述激光强度控制所述光源单元发射相应的激光强度。

所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的扫描速度并根据所述扫描速度控制所述扫描控制单元驱动扫描振镜的运动。

所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的采样点数、像素积分时间及放电时间并根据所述采样点数、像素积分时间及放电时间控制所述数据采集单元生成相应的采样点数、像素积分时间及放电时间。

所述光源单元包括激光器组和声光可调谐滤光器，所述中央控制单元控制所述激光器组对光源光强进行调整及控制所述声光可调谐滤光器对激光进行选通和强度调制。

所述数据采集单元包括数据采集卡、PMT和信号调理电路，所述数据采集卡采集所述荧光强度数据，所述PMT采集荧光信号，所述信号调理电路包括信号放大模块和像素时间积分模块，所述中央控制单元控制所述数据采集卡生成采样点数，所述中央控制单元控制所述PMT的增益，所述中央控制单元控制所述信号放大模块的放电时间，所述中央控制单元控制所述像素时间积分模块的像素积分时间。

所述扫描振镜为X-Y扫描振镜。

本发明的优点是：

1.本发明提供的激光扫描共焦显微镜成像系统通过上位机单元采集所述荧光强度数据并根据所述荧光强度数据计算所述成像系统的扫描参数，中央控制单元根据所述上位机单元发送的所述扫描参数，生成对所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元的控制信号，实现对所述待测样品的扫描成像，从而得到信噪比满意的扫描成像图像，提高了图像成像质量。

2.另外，本发明提供的激光扫描共焦显微镜成像系统通过上位机单元采集所述荧光强度数据并根据所述荧光强度数据计算所述成像系统的扫描参数，再根据所述扫描参数对成像进行控制，可以在获得满意信噪比图像的前提下，尽量避免激光强度过大对样本荧光物质的影响。有利于对样本同一区域进行多次扫描和获得更快的扫描速度。

附图说明

图1为本发明实施例提供的激光扫描共焦显微镜成像系统结构示意图；

图2为本发明实施例提供的激光强度指标F与荧光强度数据的曲线图；

图3为本发明实施例提供的像素积分时间与信噪比评价SNR的曲线图。

其中：数据采集单元110、光源单元120、扫描控制单元130、上位机单元140、中央控制单元150、激光器组121、声光可调谐滤光器122、数据采集卡111、PMT112、信号调理电路113、X-Y扫描振镜131。

具体实施方式

请参考图1，图1为本发明实施例提供的激光扫描共焦显微镜成像系统结构示意图100。

激光扫描共焦显微镜成像系统100包括数据采集单元110、光源单元120、扫描控制单元130、上位机单元140及中央控制单元150。

其中，数据采集单元110电性连接于上位机单元140，上位机单元140电性连接于中央控制单元150，中央控制单元150与数据采集单元110、光源单元120及扫描控制单元130均电性连接。

数据采集单元110预扫描待测样品并获得荧光强度数据，上位机单元140采集荧光强度数据并根据荧光强度数据计算成像系统的扫描参数，中央控制单元150根据上位机单元140发送的扫描参数，生成对数据采集单元110、光源单元120及扫描控制单元130的控制信号，实现对待测样品的扫描成像。

具体地，扫描参数包括扫描速度、采样点数、像素积分时间、放电时间、激光强度及PMT增益，上位机单元140根据荧光强度数据采用下述优化模型计算所述扫描参数：

maxKPI=αSNR+βN+γL^-1+θV²

其中，α、β、γ、θ为各个指标的影响因子，KPI为优化目标，SNR为图像信噪比评价，N为扫描速度指标，L为激光强度指标，其中，扫描速度指标N与像素积分时间成反比，采样点数*（像素积分时间+放电时间）=扫描速度^-1，SNR＝I(T_int)*F，I(T_int)为像素积分时间对信噪比的影响，F为荧光强度，F＝KφL(1-e^-εbc)，K为仪器常数，φ为荧光量子产率，ε是样品的克分子消光系数，b为样品池的光径长度，c为样品浓度，所述V为电压适配指标，所述电压适配指标V代表所述数据采集卡的电压量程与最大信号电压值的差值。

具体地，α、β、γ、θ代表各个指标的影响因子，即在优化问题求解中，更看重哪个因素。比如，当β、γ不变的情况下，增大α的值，则优化问题的结果会使得采样的SNR提高，而更少的考量成像速度和激光强度对荧光物质的损伤，优选地，α、β为正值。γL^-1表征激光对荧光物质的损伤的惩罚项，故γ应为负值，因为激光越强，能激发的荧光也越强，但是强激光容易使荧光物质失去再次被激发的特性，所以，激光强度应在一个合理的范围。此分量的目的就在于此，此处L^-1可以选择更合理的激光对荧光物质伤害的表征函数。

可以理解，通过电压适配指标V可以让积分后的信号电压范围落在数据采集单元110的最佳量程范围内。

请参阅图2，图2为激光强度指标L与荧光强度数据的曲线图，可以理解，在荧光强度数据已知的情况下，通过两者之间的曲线关系可以得到激光强度指标L；即在激光较弱阶段，荧光强度与激光强度呈线性关系，但随着激光强度增大，有的荧光物质失去被激发的能力，即公式中的c降低，使得激光强度的继续提升不能得到更高的荧光强度。可以理解，激光强度指标L与荧光强度数据相关，越强的激光能激发出更强的荧光，但是激光强度达到一定程度后，荧光强度受样本本身荧光物质的约束，荧光光强不能继续增强；且强激光容易使荧光物质发生漂白作用，不利于多次成像

可控积分器呈现出与积分时间相关的低通滤波器的特性。而PMT的输出信号中脉冲式的噪声频谱可以近似为单位冲击函数的频谱，而可控积分器的低通特性可以有效的滤除噪声的高频分量。近似的，如果增加一倍T_int，则探测信号中的噪声分量将减半。请参阅图3，图3为像素积分时间与信噪比的关系图，其中，曲线1表示的光强>曲线2表示的光强>曲线3表示的光强。

可以理解，通过上述优化模型可以得到最优的KPI，而最优的KPI对应于上述一套扫描参数，中央控制单元150根据扫描参数，生成对数据采集单元110、光源单元120及扫描控制单元130的控制信号，实现对所述待测样品的扫描成像，从而得到信噪比满意的扫描成像图像，提高了图像成像质量。

具体地，中央控制单元150接收上位机单元140发送的激光强度并根据激光强度控制光源单元120发射相应的激光强度。

具体地，中央控制单元150接收上位机单元140发送的扫描速度并根据扫描速度控制扫描控制单元130驱动扫描振镜的运动。

具体地，中央控制单元150接收上位机单元140发送的采样点数、像素积分时间及放电时间并根据采样点数、像素积分时间及放电时间控制数据采集单元110生成相应的采样点数、像素积分时间及放电时间。

进一步地，光源单元120包括激光器组121和声光可调谐滤光器122，中央控制单元150控制激光器组121对光源光强进行调整及控制声光可调谐滤光器122对激光进行选通和强度调制。可以理解，中央控制单元150接收上位机单元140发送的激光强度控制激光器组121及声光可调谐滤光器122对激光进行相应的调整。

进一步地，数据采集单元110包括数据采集卡111、PMT112和信号调理电路113，数据采集卡111采集荧光强度数据，PMT112采集荧光信号，信号调理电路113包括信号放大模块（图未示）和像素时间积分模块（图未示），中央控制单元150控制数据采集卡111生成采样点数，控制PMT112的增益，控制信号放大模块的放电时间和控制像素时间积分模块的像素积分时间。可以理解，中央控制单元150接收上位机单元140发送的采样点数、PMT增益、像素积分时间及放电时间并根据采样点数、PMT增益、像素积分时间及放电时间控制数据采集卡111生成相应的采样点数、控制PMT112的增益、控制像素时间积分模块的像素积分时间及信号放大模块的放电时间。

进一步地，扫描振镜为X-Y扫描振镜131。可以理解，中央控制单元150接收上位机单元140发送的扫描速度并根据扫描速度控制扫描控制单元130驱动X-Y扫描振镜131的运动。

本发明提供的激光扫描共焦显微镜成像系统100通过上位机单元140采集荧光强度数据并根据荧光强度数据计算成像系统的扫描参数，中央控制单元150根据上位机单元140发送的扫描参数，生成对数据采集单元110、光源单元120及扫描控制单元130的控制信号，实现对待测样品的扫描成像，从而得到信噪比满意的扫描成像图像，提高了图像成像质量。

另外，本发明提供的激光扫描共焦显微镜成像系统100可以在获得满意信噪比图像的前提下，尽量避免激光强度过大对样本荧光物质的影响，有利于对样本同一区域进行多次扫描和获得更快的扫描速度。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，包括数据采集单元、光源单元、扫描控制单元、上位机单元及中央控制单元，所述数据采集单元电性连接于所述上位机单元，所述上位机单元电性连接于所述中央控制单元，所述中央控制单元与所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元均电性连接；

所述数据采集单元预扫描待测样品并获得荧光强度数据，所述上位机单元采集所述荧光强度数据并根据所述荧光强度数据计算所述成像系统的扫描参数，所述中央控制单元根据所述上位机单元发送的所述扫描参数，生成对所述数据采集单元、光源单元及扫描控制单元的控制信号，实现对所述待测样品的扫描成像；

maxKPI＝αSNR+βN+γL^-1+θV²

所述α、β、γ、θ为各个指标的影响因子，所述KPI为优化目标，所述SNR为图像信噪比评价，所述N为扫描速度指标，所述L为激光强度指标，其中，所述扫描速度指标N与所述像素积分时间成反比，所述采样点数*(所述像素积分时间+所述放电时间)＝所述扫描速度^-1，所述SNR＝I(T_int)*F，所述I(T_int)为所述像素积分时间对信号比的影响，所述F为荧光强度，所述F＝KφL(1-e^-εbc)，所述K为仪器常数，所述φ为荧光量子产率，所述ε是样品的克分子消光系数，所述b为样品池的光径长度，所述c为样品浓度，所述V为电压适配指标，所述电压适配指标V代表所述数据采集卡的电压量程与最大信号电压值的差值。

2.根据权利要求1所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的激光强度并根据所述激光强度控制所述光源单元发射相应的激光强度。

3.根据权利要求1所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的扫描速度并根据所述扫描速度控制所述扫描控制单元驱动扫描振镜的运动。

4.根据权利要求1所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述中央控制单元接收所述上位机单元发送的采样点数、像素积分时间及放电时间并根据所述采样点数、像素积分时间及放电时间控制所述数据采集单元生成相应的采样点数、像素积分时间及放电时间。

5.根据权利要求1所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述光源单元包括激光器组和声光可调谐滤光器，所述中央控制单元控制所述激光器组对光源光强进行调整及控制所述声光可调谐滤光器对激光进行选通和强度调制。

6.根据权利要求1所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述数据采集单元包括数据采集卡、PMT和信号调理电路，所述数据采集卡采集所述荧光强度数据，所述PMT采集荧光信号，所述信号调理电路包括信号放大模块和像素时间积分模块，所述中央控制单元控制所述数据采集卡生成采样点数，所述中央控制单元控制所述PMT的增益，所述中央控制单元控制所述信号放大模块的放电时间，所述中央控制单元控制所述像素时间积分模块的像素积分时间。

7.根据权利要求3所述的激光扫描共焦显微镜成像系统，其特征在于，所述扫描振镜为X-Y扫描振镜。