JPWO2009060608A1

JPWO2009060608A1 - Ｓｄｆ−１を含有してなる徐放性組成物

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Publication number: JPWO2009060608A1
Application number: JP2009539954A
Authority: JP
Inventors: 田畑　泰彦; 泰彦田畑
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-11-07
Filing date: 2008-11-06
Publication date: 2011-03-17
Anticipated expiration: 2028-11-06
Also published as: EP2218459A1; WO2009060608A1; ATE543507T1; EP2218459B1; JP5248519B2; US9107953B2; ES2378918T3; EP2218459A4; US20130243824A1; US20100267612A1; US8435953B2

Abstract

本発明の課題は、ＳＤＦ−１含有徐放性組成物の提供にある。本発明は、（１）ＳＤＦ−１と、（２）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物を提供する。該組成物は、生体内にて血管前駆細胞の集積を促すケモカインであるＳＤＦ−１を持続的に放出することができるので、種々の剤形の医薬組成物として、例えば、虚血性疾患や骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤として使用可能である。

Description

本発明は、ケモカインの一種であるＳＤＦ−１を含有してなる徐放性組成物に関する。とりわけ、ＳＤＦ−１と、コハク化ゼラチンハイドロゲルまたはスルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物に関する。

ＳＤＦ−１（ストローマ細胞由来因子−１）は、４つのシステイン残基が保存されたＣＸＣケモカインファミリーに属する蛋白質であり、α、β、γ等、複数のアイソフォームの存在が確認されている。ＳＤＦ−１は、１９９３年から１９９４年にかけて、骨髄ストローマ細胞が産生する新規の分泌蛋白質として、また、Ｂリンパ球前駆細胞クローンの増殖促進機能をもつ蛋白質として発見された。その後、１９９６年には、ＳＤＦ−１が、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の宿主細胞への侵入に必要な受容体の一つを阻害する蛋白質であることが明らかにされている。

現在までに、ＳＤＦ−１の欠損マウスは、生後すぐに死亡し、骨髄系での造血や心室中隔形成、神経組織形成に異常がみられること等がわかっている。また、ＳＤＦ−１の受容体はＣＸＣＲ４であり、ケモカインの中ではじめて、ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４の一対一リガンド受容体関係を形成することが明らかとなっている。

ＳＤＦ−１が有する生理作用の一つに血管新生誘導作用がある。ＳＤＦ−１の血管新生誘導作用は、血管前駆細胞を虚血部位にリクルートする作用に基づくものであり、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）や血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等のような、それ自体血管新生作用を有する成長因子による血管新生誘導作用とはメカニズムが異なるという点で注目されている。

ＳＤＦ−１と血管新生を関連づける報告としては、これまでに、背部皮膚の挙上動物モデルにおいて、虚血部位で産生された低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）によってＳＤＦ−１産生が誘導され、これにより血管前駆細胞の虚血部位への集積が生じることが報告されている（例えば、ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）、１０（８）巻、８５８〜８６４頁（２００４年）参照）。また、ＳＤＦ−１を産生するように遺伝子改変を行った線維芽細胞を心筋梗塞部位へ移植することにより、骨髄由来の血管前駆細胞が梗塞部位に集積されること、加えて心機能の改善がみられることが報告されている（例えば、ランセット（Lancet）、３６２巻、６９７〜７０３頁（２００３年）参照）。またさらに、ＳＤＦ−１の遺伝子を下肢虚血部位へ投与することにより、血管新生が観察され、血流量も増加することが報告されている（例えば、サーキュレーション（Circulation）、１０９巻、２４５４〜２４６１頁（２００４年）参照）。

一方、血管新生作用を有する成長因子を徐放化した製剤としては、例えば、ｂＦＧＦを架橋ゼラチンゲルと組み合わせた製剤（例えば、国際公開第９４／２７６３０号パンフレット参照）や、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）をゼラチンハイドロゲルと組み合わせた製剤（例えば、国際公開第２００３／００７９８２号パンフレット参照）が知られている。

しかしながら、いずれの先行技術においても、ＳＤＦ−１を外来的に、かつ持続的に生体に投与した例は無く、ＳＤＦ−１がその薬理作用を効果的に発揮しうる、生体に投与可能で安全な徐放性組成物は存在しなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕
一般に、蛋白質を水溶液の状態で生体に投与すると、速やかに分解されるため、期待される生物効果は得られないものである。その問題を克服するために、近年では様々な徐放化技術が検討されており、いくつもの生理活性物質の徐放性組成物が報告されている。しかしながら、蛋白質が多様な構造を有し、多様な薬理作用を有する以上、ある蛋白質の特定の薬理作用のみを効果的に生体に与え得るように製剤設計を施すことは極めて困難なことである。ましてやＳＤＦ−１は、従前知られていた血管新生作用を有する増殖因子とは作用メカニズムの点でも異なり、また外来的かつ持続的に生体に投与された例も無いので、どのような局所濃度（あるいは血中濃度）でどれだけの期間作用させれば生体にとって望ましい薬理作用を導くことができるのか、どのような徐放化担体を用いればＳＤＦ−１を生体内で安定化できるのか、一切不明であった。

すなわち本発明の課題は、ＳＤＦ−１を含有し、局所での生理作用を誘導するために好適で、かつ生体に安全に投与することが可能な徐放性組成物を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕
本発明者は、数多くの徐放化担体を用いて鋭意検討を行った結果、コハク化ゼラチンハイドロゲルとスルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルの二種のハイドロゲルがＳＤＦ−１の徐放化において優れた効果を示し、これらのハイドロゲルそれぞれをＳＤＦ−１と組み合わせて生体内に投与した場合には、他の徐放化担体を用いた場合には観察されることのない、特段に優れた血管新生誘導効果が得られることを見出した。本発明者はこの知見をもとにさらに検討を加え、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
［１］（１）ＳＤＦ−１と、（２）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物；
［２］カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルがコハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物である前記［１］記載の徐放性組成物；
［３］コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、等電点約４．５乃至約５．０のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる前記［２］記載の徐放性組成物；
［４］コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、修飾率約１５％乃至約３０％のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる前記［２］記載の徐放性組成物；
［５］コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、平均分子量約９万乃至約１１万のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる前記［２］記載の徐放性組成物；
［６］ＳＤＦ−１が、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、またはそれらの任意の割合の混合物である前記［１］記載の徐放性組成物；
［７］注射用、経鼻投与用、経皮投与用、直腸投与用、または埋め込み投与用である前記［１］記載の徐放性組成物；
［８］埋め込み投与用である前記［７］記載の徐放性組成物；
［９］含水率が約９５％乃至約９８％である前記［８］記載の徐放性組成物；
［１０］約１週間以上にわたってＳＤＦ−１を放出する前記［８］記載の徐放性組成物；
［１１］約１ヶ月間乃至約２ヶ月間にわたってＳＤＦ−１を放出する前記［１０］記載の徐放性組成物；
［１２］注射用が、マイクロスフェア皮下注射用である前記［７］記載の徐放性組成物；
［１３］虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制用である前記［１］記載の徐放性組成物；
［１４］（１）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンの水溶液と、架橋剤の水溶液とを混合し、カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルを調製する工程；（２）工程（１）で得られた修飾ゼラチンからなるハイドロゲルを凍結乾燥する工程；および（３）工程（２）で得られた修飾ゼラチンからなるハイドロゲルの凍結乾燥体とＳＤＦ−１の水溶液とを接触させ、前記修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中にＳＤＦ−１を担持せしめる工程、を含むことを特徴とする、前記［８］記載の徐放性組成物の製造方法；
［１５］カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチン１モルに対し、約１０ミリモル乃至約５０ミリモルのＳＤＦ−１を、カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中に担持せしめる前記［１４］記載の製造方法；
［１６］前記［１］記載の徐放性組成物を含有してなる医薬；
［１７］虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤である前記［１６］記載の医薬；
［１８］前記［１６］記載の医薬の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制方法；
［１９］虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤を製造するための前記［１６］記載の医薬の使用；および、
［２０］ＳＤＦ−１の生体内での放出を徐放化させる方法であって、ＳＤＦ−１をカルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中に担持せしめる工程を有することを特徴とする方法等に関する。

〔発明の効果〕
本発明によって、ケモカインであるＳＤＦ−１を生体内で徐放化させることが可能となるので、例えば、該組成物を注射し、経鼻投与し、経皮投与し、直腸投与し、あるいは埋め込み投与することで、血管新生を誘導したり、あるいは軟骨、筋肉、皮膚真皮組織等の種々の組織の再生を誘導することが可能となる。また、例えば、虚血性疾患や骨疾患等を治療および／または症状進展抑制することが可能となる。また本発明の組成物に用いるカルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルは、ＳＤＦ−１の生体内での安定性を向上するものであるので、ＳＤＦ−１の生体内安定化剤としても利用可能である。

図１は、各種ゼラチンハイドロゲルからのＳＤＦ−１の徐放を示す。図２は、コハク化ゼラチンハイドロゲルからのＳＤＦ−１の徐放を示す。図３は、ＳＤＦ−１含有コハク化ゼラチンハイドロゲルの投与による血管新生誘導効果を示す。

本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2007-289598号（2007年11月7日出願）の明細書に記載された内容を包含する。

本発明において、ＳＤＦ−１は、ＳＤＦ−１αまたはその成熟型だけでなく、ＳＤＦ−１β、ＳＤＦ−１γ、ＳＤＦ−１δ、ＳＤＦ−１εもしくはＳＤＦ−１φ等のアイソフォームまたはそれらの成熟型であってもよく、またこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。本発明における好ましいＳＤＦ−１としては、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、またはそれらの任意の割合の混合物等が挙げられる。また、ＳＤＦ−１は、ＣＸＣＬ−１２、あるいはＰＢＳＦと称される場合もある。

本発明において、ＳＤＦ−１は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。また、ＳＤＦ−１は、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や、塩基（例えば、アルカリ金属塩）等と塩（好ましくは酸付加塩）を形成していてもよい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩が挙げられる。

本発明において、ＳＤＦ−１は、その種を問わない。本発明で使用するＳＤＦ−１は、哺乳動物、例えば、ヒトや、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の非ヒト動物のものであってもよい。通常、本発明で開示する「（１）ＳＤＦ−１と、（２）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物」（以下、本発明の組成物と略記する場合がある）を適用する対象の種を選択すればよい。例えば、本発明の組成物をヒトに適用しようとする場合、ヒトのＳＤＦ−１（例えば、ＳＤＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿９５４６３７）、ＳＤＦ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０００６００））を用いて本発明の組成物を製造すればよい。

本発明において、ＳＤＦ−１は、それ以外の夾雑物によってＳＤＦ−１の作用が阻害されない程度に精製されたものであればよい。好ましくは、医薬として使用できる程度に精製されたものであればよい。

本発明において、ＳＤＦ−１は、天然から、あるいは遺伝子工学的手法によって製造することができる。天然から得る場合には、哺乳動物、例えば、ヒトや非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等）の、例えば、脾臓等、既にＳＤＦ−１の存在が明らかにされている各種臓器から抽出することができる。ＳＤＦ−１の存在が明らかにされている臓器の具体的な一例を挙げれば、例えば、ＳＤＦ−１のレセプターであるＣＸＣＲ４を発現した腫瘍細胞が、高頻度で転移する臓器にＳＤＦ−１が多く存在することが明らかとなっている。一方、遺伝子工学的手法により製造する場合には、哺乳動物、例えば、ヒトや非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等）の、ＳＤＦ−１をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＳＤＦ−１を得ることができる。ここで、前記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、カイコ等の各種昆虫、または各種動物細胞等を用いることができる。

本発明において、「カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲル」（以下、単に「本発明で用いるハイドロゲル」と略記する場合がある）とは、「カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチン」を用いて製造されたハイドロゲルを意味する。ここで、「カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチン」（以下、単に「本発明で用いる修飾ゼラチン」と略記する場合がある）とは、ゼラチン分子内にカルボキシル基および／またはスルホ基を外来的に導入したゼラチンであればよく、カルボキシル基および／またはスルホ基以外にどのような基を有しているかは問わない。ゼラチン分子とカルボキシル基および／またはスルホ基とが直接結合していてもよいし、また、ゼラチン分子とカルボキシル基および／またはスルホ基とが直接結合していなくともよい。さらに、ゼラチン分子内に導入されるカルボキシル基および／またはスルホ基の数も特に限定されない。ゼラチン分子内に導入されるカルボキシル基および／またはスルホ基の数は、「修飾率」という指標を用いて表すことができる。ここで「修飾率」とは、ゼラチン分子内のアミノ基に導入されたカルボキシル基および／またはスルホ基の数の、原料となるゼラチン分子中のアミノ基の総数に対する割合をいう。すなわち、原料となるゼラチン分子中に１００個のアミノ基があったとして、そのアミノ基に導入されたカルボキシル基および／またはスルホ基の数が１０個であれば修飾率は１０％となる。なお、本明細書においては、カルボキシル基は「−ＣＯＯＨ」またはその脱プロトン型である「−ＣＯＯ⁻」を、スルホ基は「−ＳＯ_３Ｈ」またはその脱プロトン型である「−ＳＯ_３ ⁻」を意味するものとする。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」は、原料となるゼラチンを、カルボキシル基および／またはスルホ基を導入するための試薬を用いてアシル化することによって製造することができる。このアシル化反応は公知であり、例えば、（１）縮合剤を用いる方法、（２）（混合）酸無水物を用いる方法、（３）アシルハライドを用いる方法等が挙げられる。以下、これら（１）〜（３）の方法を具体的に説明する。

（１）縮合剤を用いる方法は、例えば、カルボン酸（例えば、コハク酸等のカルボキシ基で置換された脂肪族カルボン酸、シュウ酸、スルホ基で置換された脂肪族カルボン酸、スルホ酢酸等）とゼラチンを、溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、エチレングリコールモノエチルエステル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等単独で、またはそれらの任意の比率の混合溶媒等）中、または無溶媒で、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等）の存在下または非存在下、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）の存在下または非存在下、縮合剤（例えば、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（EDC）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（CDI）、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ素、１−プロピルホスホン酸環状無水物（1-propanephosphonic acid cyclic anhydride、PPA）等）を用い、１−ヒドロキシベンズトリアゾール（HOBt）を用いるかまたは用いないで、約０℃〜約４０℃で反応させることにより行なわれる。

（２）（混合）酸無水物を用いる方法は、例えば、カルボン酸（例えば、コハク酸等のカルボキシ基で置換された脂肪族カルボン酸、シュウ酸、スルホ基で置換された脂肪族カルボン酸、スルホ酢酸等）を有機溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等）中または無溶媒で、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等）の存在下、酸ハライド（例えば、塩化ピバロイル、塩化ｐ−トルエンスルホニル、塩化メタンスルホニル等）または酸誘導体（例えば、クロロギ酸エチル、クロロギ酸イソブチル等）と、約−２０℃〜約４０℃で反応させ、得られた混合酸無水物または市販の酸無水物（例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸等）とゼラチンを、溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、エチレングリコールモノエチルエステル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等単独で、またはそれらの任意の比率の混合溶媒等）中、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）の存在下または非存在下、約０℃〜約４０℃で反応させることにより行なわれる。

（３）アシルハライドを用いる方法は、例えば、カルボン酸（例えば、コハク酸等のカルボキシ基で置換された脂肪族カルボン酸、シュウ酸、スルホ基で置換された脂肪族カルボン酸、スルホ酢酸等）を有機溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等）中または無溶媒で、酸ハライド化剤（例えば、塩化オキザリル、塩化チオニル等）と約−２０℃〜還流温度で反応させ、得られたアシルハライドまたは市販のアシルハライド（例えば、コハク酸モノクロリド、塩化スルホアセチル等）とゼラチンを、溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、エチレングリコールモノエチルエステル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等単独で、またはそれらの任意の比率の混合溶媒）中、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等）の存在下、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）の存在下または非存在下、約０℃〜約４０℃の温度で反応させることにより行なわれる。また、得られたアシルハライドまたは市販のアシルハライド（例えば、コハク酸モノクロリド、塩化スルホアセチル等）とゼラチンを、溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、エチレングリコールモノエチルエステル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等単独で、またはそれらの任意の比率の混合溶媒）中、アルカリ水溶液（例えば、炭酸水素ナトリウム水溶液または水酸化ナトリウム水溶液等）を用いて、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）の存在下または非存在下、約０℃〜約４０℃で反応させることにより行なうこともできる。

前記の方法によって製造される「本発明で用いる修飾ゼラチン」は、所望によって、引き続き、例えば、透析、限外濾過、分子量ふるい法等の精製や凍結乾燥等の処理を行ってもよい。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」を製造するための原料となるゼラチンは、天然に得られるものであっても、また、微生物を用いた発酵法、化学合成、あるいは遺伝子組換え操作により得られるものであってもよい。これらの材料を適当に混合して用いることもできる。天然のゼラチンは、ヒトをはじめ、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ等）、魚類（例えば、テラピア、タイ、マグロ、ナマズ、サメ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）等の各種動物の各採取部位に由来するコラーゲンから、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」として好ましくは、コハク化ゼラチンおよびスルホアセチル化ゼラチンが挙げられる。コハク化ゼラチンは、原料となるゼラチン分子の一つまたはそれ以上の任意のアミノ基（−ＮＨ_２）が、カルボキシエチルカルボニルアミノ基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ）となったゼラチンを意味する。また、スルホアセチル化ゼラチンとは、原料となるゼラチン分子の一つまたはそれ以上の任意のアミノ基（−ＮＨ_２）が、スルホメチルカルボニルアミノ基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−ＳＯ_３Ｈ）となったゼラチンを意味する。コハク化ゼラチンおよびスルホアセチル化ゼラチンは前記の方法により製造することができる。より具体的には、例えば、コハク化ゼラチンは、脱水ジメチルスルホキシドに溶解したゼラチンに、脱水ジメチルスルホキシドに溶解した無水コハク酸を滴加し、約３７℃で約０．５時間〜約２４時間反応させることにより製造することができる。また所望によって、引き続き、透析、凍結乾燥の処理を行ってもよい。スルホアセチル化ゼラチンは、水性緩衝液に溶解したゼラチンに、水性緩衝液に溶解したスルホ酢酸を滴加し、ｐＨを調節後、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（EDC）塩酸塩を添加して、約３７℃で約１８時間反応させることにより製造することができる。また所望によって、引き続き、透析、凍結乾燥の処理を行ってもよい。「本発明で用いる修飾ゼラチン」へのカルボキシル基やスルホ基の導入率（修飾率）は、「本発明で用いる修飾ゼラチン」を製造する際の、反応時間の長さと反応試薬の濃度を種々変更することによって、概ね５％〜８０％の範囲内で調節することができる。

後記の製造方法でも言及するが、本発明の組成物は、その目的（投与部位や徐放化の程度（例えば、ＳＤＦ−１を徐放させる期間、徐放させる速度等）等）に応じて、種々作りわけることが可能である。具体的な一例を示せば、例えば、生体内埋め込み投与用で、約二週間にわたってＳＤＦ−１を放出する本発明の組成物のひとつとして、後記の実施例で示すような本発明の組成物を例示することができる。かかる組成物を例にすれば、例えば、生体内への埋め込み投与用で、約二週間にわたってＳＤＦ−１を放出する本発明の組成物を製造するためには、「本発明で用いる修飾ゼラチン」として好ましいコハク化ゼラチンあるいはスルホアセチル化ゼラチンに、さらに以下に示す（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の三つの性状のうち何れか一つ、より好ましくは何れか二つ、特に好ましくは三つ全てを付与することが好ましい。（Ａ）等電点が約４．５乃至約５．０である；（Ｂ）修飾率が約１５％乃至約３０％である（好ましくは、コハク化ゼラチンの場合、約２５乃至約３０％であり、スルホアセチル化ゼラチンの場合、約２０％である。）；（Ｃ）平均分子量が約９万乃至約２０万（好ましくは約９万乃至約１１万であり、より好ましくは約１０万である。）である。これら三つ全ての条件を満たすコハク化ゼラチンあるいはスルホアセチル化ゼラチンを用いて製造した本発明の組成物は、後記の実施例でも明らかなとおり、ＳＤＦ−１の徐放化において、目的に合致した優れた効果を示すことができる。なお、等電点、修飾率、および平均分子量はいずれも公知の方法により測定することができる。また、原料となるゼラチンの平均分子量と修飾率を用いて、得られた「本発明で用いる修飾ゼラチン」の平均分子量を算出することもできる。また、これらの性状以外にも、例えば、ｐＨが約４〜約６であるという条件を満たすものも好ましい。「本発明で用いる修飾ゼラチン」が、ｐＨが約４〜約６であるという条件を具備することで、かかるゼラチンを用いて製造した本発明の組成物は、例えば、注射剤としての応用が容易となる。

「本発明で用いるハイドロゲル」として好ましくは、前記の好ましい「本発明で用いる修飾ゼラチン」を用いて製造したハイドロゲル、すなわち、コハク化ゼラチンハイドロゲルおよびスルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルが挙げられる。また、コハク化ゼラチンハイドロゲルとスルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルの任意の割合の混合物も同様に好ましい。

「本発明で用いるハイドロゲル」は、前記「本発明で用いる修飾ゼラチン」を、公知の反応に付して製造することができる。例えば、「本発明で用いる修飾ゼラチン」を、架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドや、例えば、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（EDC）等の水溶性カルボジイミド、あるいは、例えば、プロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基等の間に化学結合を作る縮合剤等）で架橋化したり、熱脱水、紫外線照射、ガンマ線照射、電子線照射等の処理を付して架橋化したりすることで製造することができる。また、これら以外にも、塩架橋、静電気的相互作用、水素結合、疎水性相互作用等を利用して架橋化し、製造することもできる。なお、架橋化する「本発明で用いる修飾ゼラチン」は単一の組成のものでなくともよい。すなわち、前記の好ましい「本発明で用いる修飾ゼラチン」を例にすれば、例えば、コハク化ゼラチンとスルホアセチル化ゼラチンの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化することによって製造したハイドロゲルも、「本発明で用いるハイドロゲル」に含まれる。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」を架橋剤で架橋化して「本発明で用いるハイドロゲル」を製造する際の、「本発明で用いる修飾ゼラチン」と架橋剤の濃度の好ましい範囲は、「本発明で用いる修飾ゼラチン」が約１重量％〜約２０重量％、架橋剤が約０．０１重量％〜約１重量％である。架橋化の反応条件は特に制限されないが、例えば、約０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３０℃で、約１時間〜約４８時間、好ましくは約１２時間〜約２４時間行えばよい。

なお、「本発明で用いる修飾ゼラチン」は架橋化し、「本発明で用いるハイドロゲル」とすることで水不溶性となるため、ＳＤＦ−１の徐放化という優れた効果を示すことが可能となる。前記したように、徐放化の程度は、等電点、修飾率、平均分子量等の「本発明で用いる修飾ゼラチン」の性状でも調節しうるが、「本発明で用いるハイドロゲル」を製造する際の、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の濃度、架橋剤の濃度、および／または架橋化の反応条件（例えば、温度、時間等）を調節し、架橋度を調節することによっても、徐放化の程度をその目的に応じて適宜変更することができる。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」の架橋化は、熱脱水処理を付しても行なうことができる。熱脱水処理による架橋化は、例えば、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液（約１０重量％程度が好適）をプラスチックシャーレに流延し、風乾してゼラチンフィルムを得、そのフィルムを減圧下（好ましくは約１０ｍｍＨｇ程度）、約１１０℃〜約１６０℃（好ましくは約１２０℃〜約１５０℃）で、約１時間〜約４８時間（好ましくは約６時間〜約２４時間）放置することによって行なうことができる。

「本発明で用いる修飾ゼラチン」の架橋化は、紫外線照射の処理を付しても行なうことができる。紫外線照射の処理による架橋化は、例えば、前記と同様に得られたゼラチンフィルムを殺菌ランプの下において、室温（好ましくは約０℃〜約４０℃）で放置することによって行うことができる。

同様に、ガンマ線照射、電子線照射等の処理によっても架橋化することができる。また、上述の架橋化反応を組み合わせて用いてもよい。

前記の方法によって製造される「本発明で用いるハイドロゲル」は、如何なる形状のものであってもよい。形状は、後記する本発明の組成物の用途に応じて、例えば、埋め込み投与用の埋込片とするのであれば、粒状、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、スティック状、ロッド状、球状、微粒子状、ペースト状というように、適切なものを選択すればよい。架橋化の手段を適宜変更することによって、例えば、粒状、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、スティック状、ロッド状、球状、微粒子状、ペースト状等の「本発明で用いるハイドロゲル」を製造することができる。また、架橋化反応によって得られた「本発明で用いるハイドロゲル」は、凍結乾燥することによって、スポンジ状成形体とすることができる。

前記の如き一定の形状を有する「本発明で用いるハイドロゲル」を製造する方法について詳述すると、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状の「本発明で用いるハイドロゲル」は、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液に架橋剤の水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤の水溶液に「カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチン」の水溶液を添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋化させることにより製造することができる。また、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液を予め鋳型でゲルに成型し、そこに架橋剤の水溶液を加えることでも製造することができる。架橋剤の水溶液の添加は、ゲルの乾燥後であってもよい。架橋化反応を停止させるには、例えば、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加すればよい。また、得られた「本発明で用いるハイドロゲル」は、例えば、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄することによって、反応に用いた試薬（架橋剤や低分子物質）を除去することができる。

球状、粒子状の「本発明で用いるハイドロゲル」は、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡｍｉｎｉＤ．Ｃ．スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置に「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて約２００ｒｐｍ〜約６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌することでＷ／Ｏ型エマルジョンとした後、これに架橋剤の水溶液を添加するか、あるいは、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサー（Advantec TME-21）、ホモジナイザー、ポリトロン（polytron PT10-35）等を使用）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製した後、これに架橋剤の水溶液を添加して、架橋化反応を行い、遠心分離によりハイドロゲル画分を回収した後に、例えば、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに例えば、２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋化反応を停止させることにより、製造することができる。得られた「本発明で用いるハイドロゲル」の粒子は、所望によってさらに、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水を用いて順次洗浄してもよい。なお、前記の工程において、「本発明で用いるハイドロゲル」の粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤等の添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度）等を行うこともできる。得られる「本発明で用いるハイドロゲル」の平均粒子径は、上述の粒子作製時における「本発明で用いる修飾ゼラチン」の濃度、「本発明で用いる修飾ゼラチン」の水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピード等により適宜変更することができる。一般に粒子径は約１μｍ〜約１ｍｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが約２０μｍ以下の微粒子状の「本発明で用いるハイドロゲル」を得ることもできる。

以上の工程によって得られた「本発明で用いるハイドロゲル」は、必要に応じて適宜大きさを調節し、凍結乾燥し、あるいはさらに滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、「本発明で用いるハイドロゲル」を蒸留水に入れ、液体窒素中で約３０分以上、または約−８０℃で約１時間以上凍結処理を行った後に、凍結乾燥機で約１日間〜約３日間乾燥させることにより行うことができる。

本発明の組成物は、ＳＤＦ−１と、「本発明で用いるハイドロゲル」とを接触させることにより製造することができる。接触の方法はどのようなものであっても構わない。具体的な例を挙げれば、前記の工程で得られた「本発明で用いるハイドロゲル」の凍結乾燥体とＳＤＦ−１の水溶液とを接触させ、「本発明で用いるハイドロゲル」中にＳＤＦ−１を担持させることによって製造することができる。より具体的な例を挙げれば、前記の凍結乾燥した「本発明で用いるハイドロゲル」に、ＳＤＦ−１の水溶液を滴下するか、あるいは「本発明で用いるハイドロゲル」をＳＤＦ−１の水溶液中に含浸させて、「本発明で用いるハイドロゲル」中にＳＤＦ−１を担持させることにより得ることができる。この操作は、通常、約４℃〜約３７℃で約１５分間〜約１時間、好ましくは約４℃〜約２５℃で約１５分間〜約３０分間行われる。本工程によって「本発明で用いるハイドロゲル」は膨潤し、また、ＳＤＦ−１は物理化学的相互作用によって「本発明で用いるハイドロゲル」中に担持され固定される。

ここで、「本発明で用いるハイドロゲル」中に担持させるＳＤＦ−１の量は、「本発明で用いるハイドロゲル」の製造に用いた「本発明で用いる修飾ゼラチン」の量によって変化させることが好ましい。具体的には、「本発明で用いる修飾ゼラチン」に対しモル比で約1/10000〜約１であることが好ましく、より好ましくは約1/1000〜約1/10であり、さらに好ましくは約1/100〜約1/20であり、最も好ましくは約1/40である。例えば、「本発明で用いる修飾ゼラチン」１モルを用いて製造した「本発明で用いるハイドロゲル」に、約１０ミリモル〜約５０ミリモルのＳＤＦ−１を担持させた場合は、「本発明で用いる修飾ゼラチン」に対しモル比で約1/100〜約1/20であるということができる。

本発明の組成物中に担持されているＳＤＦ−１は、「本発明で用いるハイドロゲル」が生体内で分解されるに伴って、外部へと徐々に放出される。この放出速度は、（１）使用する「本発明で用いるハイドロゲル」の生体における分解性および吸収性の程度、（２）本発明の組成物中のＳＤＦ−１と「本発明で用いるハイドロゲル」の結合の強さの程度、および（３）「本発明で用いるハイドロゲル」の安定性により決定される。「本発明で用いるハイドロゲル」の生体における徐放化の程度が、「本発明で用いるハイドロゲル」作製時における架橋の程度で調節しうることは前記したが、かかる架橋の程度は、「含水率」を指標として数値化することができる。ここで「含水率」とは、ＳＤＦ−１の水溶液で膨潤させた「本発明で用いるハイドロゲル」の重量に対する、ハイドロゲル中の水の重量パーセントを意味する。「含水率」が大きければ大きいほど「本発明で用いるハイドロゲル」の架橋度は低くなり、易分解性となる。本発明の組成物が好ましい徐放性効果を示すための「含水率」は、例えば、約８０重量％〜約９９重量％が好ましく、約９５重量％〜約９８重量％がより好ましく、約９５〜約９６重量％がさらに好ましい。

本発明の組成物には、「本発明で用いるハイドロゲル」自体の安定性やＳＤＦ−１の安定性、ＳＤＦ−１放出の持続性向上等の目的に応じ、所望によって他の成分を加えることもできる。他の成分としては、例えば、アミノ糖あるいはその高分子量体やキトサンオリゴマー、塩基性アミノ酸あるいはそのオリゴマーや高分子量体、ポリアリルアミン、ポリジエチルアミノエチルアクリルアミド、ポリエチレンイミン等の塩基性高分子等が挙げられる。

また、本発明の組成物は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（例えば、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合し、製剤化することで、例えば、注射用、経口投与用、経鼻投与用、経皮投与用、直腸投与用、埋め込み投与用の組成物とすることが可能であり、このように製剤化した本発明の組成物は、医薬として用いることが可能である。

例えば、本発明の組成物を注射剤とするには、これらを分散剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ−６０等の界面活性剤、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等の多糖類等）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖、プロリン等）等の分散媒と共に水性懸濁剤とするか、あるいは、ゴマ油、コーン油等の植物油等の分散媒と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる注射剤とすることができる。かかる組成物の粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１μｍ〜約３００μｍ、好ましくは約０．５μｍ〜約１５０μｍの範囲、さらに好ましくは約１μｍ〜約１００μｍの範囲である。本発明の組成物を注射剤として用いる場合、特に、マイクロスフェア注射剤とすることが好ましい。マイクロスフェア注射剤とした本発明の組成物は、静脈、動脈等の血管は勿論のこと、筋肉内や、好ましくは皮下に注射して、局所でＳＤＦ−１を持続放出することが可能となる。マイクロスフェアの製造方法、使用方法等に関しては、必要に応じて、小石眞純監修「マイクロ／ナノ系カプセル・微粒子の開発と応用」（株）シーエムシー出版（２００３年）を参照すればよい。また、一般的な生理活性物質の徐放化に関しては、必要に応じて、宮尾興平著「ドラッグ・デリバリー・システムの実際」医薬ジャーナル社（１９８６年）を参照すればよい。

本発明の組成物を無菌の注射剤とするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が用いられるが、特に限定されない。さらに、本発明の組成物の注射剤は、懸濁剤として、前記の組成以外に、例えば、賦形剤（例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖等）を加えて再分散した後、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して固型化することで、用時に注射用蒸留水あるいは適当な分散媒を加えて投与可能な、より安定した注射剤（いわゆる凍結乾燥製剤）を得ることができる。

本発明の組成物を経口投与剤とするには、自体公知の方法に従って、本発明の組成物を、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、炭酸カルシウム等）、結合剤（例えば、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００等）等を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ８０、ブルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製：西ドイツ：メタアクリル酸・アクリル酸共重合）、および酸化チタン、ベンガラ等の色素が用いられる。

また、本発明の組成物は、公知の方法に従って、固状、半固状または液状の経鼻投与剤とすることができる。例えば、本発明の組成物をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、グルコース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース等）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等）等を添加、混合して粉状の組成物とすることで、固状の経鼻投与剤とすることができる。また、前記注射剤とほぼ同様の操作を行うことで、油状あるいは水性の懸濁剤を調製し、液状の経鼻投与剤とすることができる。半固状の経鼻投与剤は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものを用いることができる。これらはいずれも、ｐＨ調整剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等）等を加えてもよい。

本発明の組成物を直腸投与剤、いわゆる坐剤とするには、公知の方法に従って、本発明の組成物を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とすることができる。かかる組成物に用いる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社）等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社）等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が用いられる。また、水性基剤としては、例えば、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコール等が、水性ゲル基剤としては、例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が用いられる。

本発明の組成物を埋め込み投与用の製剤とする場合には、本発明の組成物をそのまま、あるいは生分解性のシートでくるむように、目的に応じて種々の形状に製剤化すればよい。例えば、粒状、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、スティック状、ロッド状、球状、微粒子状、ペースト状等の固形、半固形製剤へと製剤化することができる。
また、上記以外にも、自体公知の方法に従って、本発明の組成物を経皮投与剤とすることもできる。

本発明の組成物は、上記したように、例えば、注射用、経口投与用、経鼻投与用、経皮投与用、直腸投与用、埋め込み投与用の組成物として製剤化しうるが、なかでも、注射用、経鼻投与用、経皮投与用、直腸投与用、または埋め込み投与用の組成物として用いることが好ましく、特に埋め込み投与用、あるいはマイクロスフェア皮下注射用の組成物として用いることが好ましい。

本発明の組成物は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して医薬として用いることができる。本発明の組成物の投与量は、ＳＤＦ−１放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、ＳＤＦ−１の有効量を持続的に放出しうる量でありさえすればよい。例えば、全身での薬効発現を期待するものであれば、ＳＤＦ−１量として１回当たり、成人１人当たり好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、数週間に１回、１か月に１回、または数か月（例、２ヶ月、３ヵ月、４ヵ月、６ヵ月など）に１回等適宜選ぶことができる。また、例えば、局所での薬効発現を期待するものであれば、ＳＤＦ−１量として１回当たり、成人１人当たり好ましくは、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、さらに好ましくは約０．１μｇ〜約１ｍｇの範囲から適宜選ぶことができる。また一回の投与で効果が不十分であった場合には、投与を複数回行うことも可能である。

本発明の組成物は、ケモカインであるＳＤＦ−１を少なくとも約１週間以上、好ましくは約２週間乃至約１ヶ月間、より好ましくは約１ヶ月間乃至約２ヶ月間、さらに好ましくは約２ヶ月間乃至約３ヶ月間持続的に放出しうるので、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内、欠損組織、臓器部位、あるいは障害臓器等に局所的に投与して、例えば、投与部位において血管前駆細胞を代表とする骨髄由来細胞を集積させて、血管新生を誘導することができる。
また、本発明の組成物は、軟骨、筋肉、皮膚真皮組織等の種々の組織の再生をも誘導することができる。

さらに本発明の組成物は、上記の作用メカニズムに基づいて、医薬として、種々の疾患、例えば、虚血性疾患や骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤として使用することができる。ここで、虚血性疾患としては、例えば、褥創、皮膚潰瘍、粘膜潰瘍、創傷、移植時拒絶反応、重症性肢虚血、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、心筋塞栓、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全等）、末梢動脈疾患、閉塞性動脈硬化症（ASO）、バージャー病、血管損傷、動脈閉塞症、動脈血栓症、組織性動脈閉塞症、動脈瘤、脳血管閉塞症、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、脳卒中、脳出血、もやもや病、脳血管性痴呆、アルツハイマー病、脳出血後遺症、脳梗塞後遺症、糖尿病ニューロパシー、血管狭窄等が挙げられる。また、骨疾患としては、例えば、外傷性骨折、疲労骨折、病的骨折（例えば、骨粗鬆症（例えば、原発性骨粗鬆症（老人性、閉経後、若年性）、続発性骨粗鬆症（例えば、甲状腺機能亢進症、クッシング症候群（ステロイド投与によるもの）、末端肥大症、性腺機能低下症（例えば、下垂体機能低下症、クリンフェルター（Klinfelter）症候群、ターナー（Turner）症候群等）、骨形成不全症、低ホスファターゼ症、ホモシスチン尿症、不動性骨粗鬆症等）等）、骨軟化症、悪性腫瘍、多発性骨髄腫、先天性骨形成不全、骨嚢胞症、可能性骨髄炎、大理石病、栄養障害等に伴う骨折等）等が挙げられる。なお本発明において、「治療」とは病態を治癒の方向へ導くことを意味し、「症状進展抑制」とは病態の悪化を抑制し進行をとどめることを意味する。

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
（１）コハク化ゼラチンの製造
牛骨由来アルカリ処理pI5ゼラチン（新田ゼラチン）（2ｇ）の脱水ジメチルスルホキシド（14ｇ）溶液に、撹拌しながら無水コハク酸（ナカライテスク：#324-07）（27ｍｇ）の脱水ジメチルスルホキシド（4.5ｇ）溶液を滴下し、３７℃で１時間撹拌した。反応液（ゼラチン終濃度：9.76wt％、無水コハク酸終濃度：0.13wt％）を透析膜（Viskase Companies, Inc.：#UC30-32-100）でつつみ、純水を溶媒として３日間透析した。透析終了後、反応液をトレイにあけ、−８０℃で凍結後、凍結乾燥機（EYELA：#FDU-830）を用いて凍結乾燥することで、以下の物性値を示すコハク化ゼラチンを得た。なお、得られたコハク化ゼラチンは、密封下４℃で保存した。
＜物性値＞
修飾率（スクシニル基導入率）：25〜30％；
等電点：4.72〜4.74；
平均分子量：約１０万。

（２）スルホアセチル化ゼラチンの製造
牛骨由来アルカリ処理pI5ゼラチン（新田ゼラチン）（2ｇ）のＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物：DOJINDO：#349-01623）バッファー（0.1Ｍ、ｐＨ5.0、38ｇ）溶液に、撹拌しながらスルホ酢酸（Aldrich：#242802）（4.44ｇ）のＭＥＳバッファー溶液を滴下した。水酸化ナトリウム水溶液（5Ｎ）を用いて、反応液のｐＨを5.0に調整したあと、ＥＤＣ塩酸塩（ナカライテスク：#15022-44）（0.364ｇ）を加え、ＭＥＳバッファーで全量を60ｍＬに調整し、３７℃で１８時間撹拌した。反応液（ゼラチン終濃度：9.76wt％、無水コハク酸終濃度：0.13wt％）を透析膜（Viskase Companies, Inc.：#UC30-32-100）でつつみ、純水を溶媒として３日間透析した。透析終了後、反応液をトレイにあけ、−８０℃で凍結後、凍結乾燥機（EYELA：#FDU-830）を用いて凍結乾燥することで、以下の物性値を示すスルホアセチル化ゼラチンを得た。なお、得られたスルホアセチル化ゼラチンは、密封下４℃で保存した。
＜物性値＞
修飾率（スルホアセチル基導入率）：20％；
等電点：4.57；
平均分子量：約１０万。

［実施例２］
（１）コハク化ゼラチンハイドロゲルの製造
水酸化ナトリウム水溶液（5Ｎ）を用いて、実施例１（１）で製造したコハク化ゼラチン（1.2ｇ）の水（22.8ｇ）溶液のｐＨを5.0に調整し、10ｍＬずつ遠沈管に分注した。各遠沈管に、25％グルタルアルデヒド水溶液（ナカライテスク：#17003-92）を45μＬずつ加え、３０秒間静かに撹拌した。反応液を5ｍＬずつバランスディッシュＭ（Bio-Bik）に分注し、アルミホイルで覆い、室温で３０分間放置後、４℃で１２時間架橋化を行うことでゲル化させた。剥がしたゲルをグリシン（ナカライテスク：17141-95）水溶液（0.1Ｍ、500ｍＬ）に投入し、室温で１時間振盪することにより架橋化反応を停止させた。洗浄操作としてグリシン水溶液を純水に置換し、室温で１時間の振盪を３回繰り返すことで、以下の物性値を示すコハク化ゼラチンハイドロゲルを得た。なお、得られたゲルは、−８０℃で凍結後、凍結乾燥機（EYELA：#FDU-830）を用いて凍結乾燥しエチレンオキシドガス滅菌を行って、コハク化ゼラチンハイドロゲルの無菌凍結乾燥体として、密封下４℃で保存した。なお、含水率（重量％）の測定は、Biomaterials, 19, 1781-9 (1998)に記載の方法で行うことができる。
＜物性値＞
含水率：97〜98％。

（２）スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルの製造
水酸化ナトリウム水溶液（1Ｎ）を用いて、実施例１（２）で製造したスルホアセチル化ゼラチン（1.2ｇ）の水（22.8ｇ）溶液のｐＨを5.0に調整し、10ｍＬずつ遠沈管に分注した。各遠沈管に、25％グルタルアルデヒド水溶液（ナカライテスク：#17003-92）を40μＬずつ加え、３０秒間静かに撹拌した。反応液を5ｍＬずつバランスディッシュＭ（Bio-Bik）に分注し、アルミホイルで覆い、室温で３０分間放置後、４℃で１２時間架橋化を行うことでゲル化させた。剥がしたゲルをグリシン（ナカライテスク：17141-95）水溶液（0.1Ｍ、500ｍＬ）に投入し、室温で１時間振盪することにより架橋化反応を停止させた。洗浄操作としてグリシン水溶液を純水に置換し、室温で１時間の振盪を３回繰り返すことで、以下の物性値を示すスルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルを得た。なお、得られたゲルは、−８０℃で凍結後、凍結乾燥機（EYELA：#FDU-830）を用いて凍結乾燥しエチレンオキシドガス滅菌を行って、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルの無菌凍結乾燥体として、密封下４℃で保存した。なお、含水率（重量％）の測定は、Biomaterials, 19, 1781-9 (1998)に記載の方法で行うことができる。
＜物性値＞
含水率：98％。

（３）その他のゼラチンハイドロゲルの製造
自体公知の方法を用いて製造した、デシル化ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、エチレンジアミン導入ゼラチン、スペルミン導入ゼラチンを原料として、実施例２（１）または２（２）と同様の操作を行い、各種ゼラチンハイドロゲルの無菌凍結乾燥体を得た。

［実施例３］ＳＤＦ−１／ハイドロゲル複合体（埋め込み投与用製剤）の製造
クロラミンＴ法を用いて放射（¹²⁵I）ラベルしたＳＤＦ−１（ヒト遺伝子組み換え型ＳＤＦ−１α、R&D systems Inc.）（20μＬ）を、実施例２（１）、２（２）および２（３）で製造した各種ゼラチンハイドロゲルの凍結乾燥体（2ｍｇ）に滴下し、４℃で１２時間静置することにより、ＳＤＦ−１／ハイドロゲル複合体（埋め込み投与用製剤）を得た。

［実施例４］マウス背部皮下埋め込みによる徐放作用の検討
実施例３で製造した各種ＳＤＦ−１／ハイドロゲル複合体をマウス背部皮下に埋め込み、２４時間後にゲルを摘出した。ゲル中に残存する放射活性を測定することで、残存しているＳＤＦ−１量を算出した。

＜結果＞
結果を図１に示す。埋め込み２４時間後の残存率から、ＳＤＦ−１の徐放化という目的において、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲルとコハク化ゼラチンハイドロゲルは、他のゼラチンハイドロゲルに比べて優れた成績を示した。なお、図１において、略号の意味は以下のとおりである。
sulfo：ＳＤＦ−１／スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル複合体；
succ：ＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体；
C11：ＳＤＦ−１／デシル化ゼラチンハイドロゲル複合体；
pI=5：ＳＤＦ−１／アルカリ処理ゼラチンハイドロゲル複合体；
pI=9：ＳＤＦ−１／酸処理ゼラチンハイドロゲル複合体；
E50：ＳＤＦ−１／エチレンジアミン導入ゼラチンハイドロゲル複合体；
SM50：ＳＤＦ−１／スペルミン導入ゼラチンハイドロゲル複合体。

［実施例５］マウス背部皮下埋め込みによる徐放作用（経時変化）の検討
実施例３で製造したＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体をマウス背部皮下に埋め込み、経時的にゲルおよび周辺組織を摘出した。ゲル中に残存する放射活性を測定することで、残存しているＳＤＦ−１量を算出した。

＜結果＞
結果を図２に示す。ＳＤＦ−１をコハク化ゼラチンハイドロゲルに担持させた群では、埋め込み７〜１０日後においてもＳＤＦ−１が放出されており、単にＳＤＦ−１の水溶液を投与した群と比較して、優れた徐放活性を示した。なお、図２において、略号の意味は以下のとおりである。
SDF-1/Gel：ＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体；
SDF-1/soln：ＳＤＦ−１水溶液。

［実施例６］マウス背部皮下埋め込みによる血管新生誘導作用の検討
マウス背部皮膚組織に、ガラス窓をもつチャンバーを取り付けた。皮膚に対して皮下組織を残して６ｍｍ直径の円形皮膚欠損を作製し、実施例３と同様の操作を行って別途製造した、非放射ラベルの各種ＳＤＦ−１（5μｇ相当）／ゼラチンハイドロゲル複合体を移植・留置した。経時的に皮下組織を顕微鏡下で観察し、誘導される血管数を計測した。

＜結果＞
結果を図３に示す。ＳＤＦ−１をコハク化ゼラチンハイドロゲルに担持させた群では、埋め込み４日後において、他のハイドロゲルを用いた群に比較して多くの血管新生誘導が観察された。他のハイドロゲルを用いた群の血管新生誘導は、ＳＤＦ−１の水溶液を投与した群、ハイドロゲルのみの投与群（ＳＤＦ−１無し）と同程度であった。なお、図３において、略号の意味は以下のとおりである。
SDF-1/soln：ＳＤＦ−１水溶液；
PBS/Gel：ハイドロゲルのみ（ＳＤＦ−１の代わりにＰＢＳ（リン酸緩衝液）を使用）；
succ：ＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体；
C11：ＳＤＦ−１／デシル化ゼラチンハイドロゲル複合体；
pI=5：ＳＤＦ−１／アルカリ処理ゼラチンハイドロゲル複合体；
pI=9：ＳＤＦ−１／酸処理ゼラチンハイドロゲル複合体；
E50：ＳＤＦ−１／エチレンジアミン導入ゼラチンハイドロゲル複合体；
SM50：ＳＤＦ−１／スペルミン導入ゼラチンハイドロゲル複合体；
SDF-1/Gel：ＳＤＦ−１／各種ゼラチンハイドロゲル複合体。

［実施例７］キメラマウスを用いた血管前駆細胞集積作用の検討
ＧＦＰ発現マウスから骨髄細胞を採取し、この細胞をＸ線照射正常マウスに移植して、キメラマウスを作製した。このマウスに、実施例３と同様の操作を行って別途製造した、非放射ラベルのＳＤＦ−１（5μｇ相当）／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体を埋め込み、４８時間後にゲル周辺に集積したＧＦＰ陽性細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞（血管前駆細胞）数を計数した。
なお、血管前駆細胞の集積は、ＳＤＦ−１の受容体であるＣＸＣＲ４の組織中での発現レベルを、周知のＰＣＲ法あるいはノーザンブロット法で測定することによって評価することもできる。

＜結果＞
ＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体を投与した群では、単にＳＤＦ−１の水溶液を投与した群と比較して、有意にＣＤ３４陽性細胞（血管前駆細胞）数が増加した。これは、ＳＤＦ−１の徐放化により、血管新生能力のある細胞の局所への集積が増え、その結果として、血管新生が増強されたことによるものである。

［実施例８］ＳＤＦ−１／コハク化ゼラチンハイドロゲル複合体の増骨作用の検討
含水率９７．９％のコハク化ゼラチンハイドロゲルにＳＤＦ−１水溶液を含浸させ、ＮＺＷウサギ（２．５〜３ｋｇ，雄）の尺骨に作製した欠損部（２０ｍｍ）に移植する。６週間後に摘出して、軟X線撮影、ｐＱＣＴによる骨密度測定を行い、断面のヘマトキシリン・エオジン染色切片を作製する。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

本発明で開示する（１）ＳＤＦ−１と、（２）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物は、安全で、種々の剤形に製剤化することにより医薬として利用可能である。該組成物は、ケモカインであるＳＤＦ−１を生体内で徐放化させるので、例えば、該組成物を注射し、経鼻投与し、経皮投与し、直腸投与し、あるいは埋め込み投与することで、血管新生を誘導したり、あるいは軟骨、筋肉、皮膚真皮組織等の種々の組織の再生を誘導することが可能となる。また、例えば、虚血性疾患や骨疾患等を治療および／または症状進展抑制することが可能となる。

Claims

（１）ＳＤＦ−１と、（２）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルとを含有してなる徐放性組成物。
カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルがコハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物である請求項１記載の徐放性組成物。
コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、等電点約４．５乃至約５．０のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる請求項２記載の徐放性組成物。
コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、修飾率約１５％乃至約３０％のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる請求項２記載の徐放性組成物。
コハク化ゼラチンハイドロゲル、スルホアセチル化ゼラチンハイドロゲル、またはそれらの任意の割合の混合物が、平均分子量約９万乃至約１１万のコハク化ゼラチン、スルホアセチル化ゼラチン、またはそれらの任意の割合の混合物を架橋剤で架橋化してなる請求項２記載の徐放性組成物。
ＳＤＦ−１が、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、またはそれらの任意の割合の混合物である請求項１記載の徐放性組成物。
注射用、経鼻投与用、経皮投与用、直腸投与用、または埋め込み投与用である請求項１記載の徐放性組成物。
埋め込み投与用である請求項７記載の徐放性組成物。
含水率が約９５％乃至約９８％である請求項８記載の徐放性組成物。
少なくとも１週間以上にわたってＳＤＦ−１を放出する請求項８記載の徐放性組成物。
約１ヶ月間乃至約２ヶ月間にわたってＳＤＦ−１を放出する請求項１０記載の徐放性組成物。
注射用が、マイクロスフェア皮下注射用である請求項７記載の徐放性組成物。
虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制用である請求項１記載の徐放性組成物。
（１）カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンの水溶液と、架橋剤の水溶液とを混合し、カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲルを調製する工程；（２）工程（１）で得られた修飾ゼラチンからなるハイドロゲルを凍結乾燥する工程；および（３）工程（２）で得られた修飾ゼラチンからなるハイドロゲルの凍結乾燥体とＳＤＦ−１の水溶液とを接触させ、前記修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中にＳＤＦ−１を担持せしめる工程、を含むことを特徴とする、請求項８記載の徐放性組成物の製造方法。
カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチン１モルに対し、約１０ミリモル乃至約５０ミリモルのＳＤＦ−１を、カルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中に担持せしめる請求項１４記載の製造方法。
請求項１記載の徐放性組成物を含有してなる医薬。
虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤である請求項１６記載の医薬。
請求項１６記載の医薬の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制方法。
虚血性疾患または骨疾患の治療および／または症状進展抑制剤を製造するための請求項１６記載の医薬の使用。
ＳＤＦ−１の生体内での放出を徐放化させる方法であって、ＳＤＦ−１をカルボキシル基および／またはスルホ基を有する修飾ゼラチンからなるハイドロゲル中に担持せしめる工程を有することを特徴とする方法。