JPWO2008099829A1 - 実験動物の腸管癒着を形成する方法、腸管癒着実験動物の製造方法、腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法及び腸管癒着抑制剤 - Google Patents

実験動物の腸管癒着を形成する方法、腸管癒着実験動物の製造方法、腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法及び腸管癒着抑制剤 Download PDF

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Abstract

本発明の実験動物の腸管癒着を形成する方法は、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与える。これにより、所望の程度の腸管癒着を再現性良く形成可能な、実験動物の腸管癒着を形成する方法を提供することができる。また、本発明に係る腸管癒着抑制剤は、ＨＧＦ等のＩＦＮ−γ阻害物質を含み、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間に投与される。これにより、腸管癒着を抑制可能な腸管癒着抑制剤を提供することができる。

Description

本発明は、実験動物の腸管癒着を形成する方法、腸管癒着実験動物の製造方法、腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法及び腸管癒着抑制剤に関するものである。具体的には、制御された熱量で焼灼することによる、実験動物の腸管癒着を形成する方法及び腸管癒着実験動物の製造方法、当該実験動物の腸管癒着を形成する方法を利用する腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法及び腹腔内手術後の腸管癒着を抑制する腸管癒着抑制剤に関する。
腹腔内手術の術後に生じる腸管癒着は、しばしば腸閉塞等の術後合併症を引き起こし、問題となっている。なお、本明細書において「腸管癒着」とは、腸管癒着症の症状を意図し、具体的には、腸管の一部と当該腸管の他の部位との癒着及び腸管と他の臓器との癒着を意図する。
現在、腹腔内手術後に腸管癒着が形成されるメカニズムについて盛んに研究されている。例えば非特許文献１に記載のように、従来、腹腔内手術後の腸管癒着は、Ｔｈ１免疫応答によって発症すると考えられてきた。
また、腸管を手術侵襲することによって誘導され析出するｆｉｂｒｉｎに対して、線溶系が亢進すると癒着が回避されて、凝固系が亢進すると癒着が促進されることも報告されている。なお、線溶系を亢進する重要な因子として、ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（以下、「ｔＰＡ」と表記する）が知られており、凝固系を亢進する重要な因子としてｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １（以下、「ＰＡＩ」と表記する）が知られている（例えば非特許文献２等を参照）。
また、神経伝達因子の一つであるＳｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐは、手術侵襲によって誘導されて、線溶系を低下させることにより、腸管癒着を誘導及び／又は促進することが報告されている（例えば非特許文献３等を参照）。非特許文献３では、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐの受容体の一つであるＮＫ−１Ｒのアンタゴニストを用いて、腸管癒着を抑制することができたと開示されている。また、特許文献１には、ＨＧＦが腸管癒着の治療に使用できることが記載されている。なお、特許文献２には、ＨＧＦを用いて皮下組織と臓器との癒着を形成することが開示されている。
一方、腹腔内の手術後の腸管癒着を予防する方法としては、従来、侵襲部位に外科用癒着防止シートを置くことで腸管同士の接触や腸管と他の臓器との接触を遮断する方法が行なわれてきた。
以上のように、現在、腹腔内手術の術後に生じる腸管癒着の形成に関するメカニズムやその予防法が盛んに研究されている。このような腸管癒着に関する研究では、人為的にマウス等の実験動物に腸管癒着を形成させることが不可欠である。
従来、実験動物の腸管癒着を形成する方法としては、例えば腸管をガーゼ等で摩擦する方法（例えば非特許文献１等参照）、腸管を鉗子で結紮する方法等が用いられてきた。また、組織を癒着する方法に関しては、特許文献３及び４に開示されている。特許文献３には、胃食道接合における組織再生を行なう方法が開示されている。具体的には、傷口を電気焼灼カテーテルで傷つけた後に、傷つけた組織表面を密着状態に固定しておく方法が開示されている。特許文献４には、骨組織に超音波振動等の機械的振動を加えて、組織再生を促進する方法が開示されている。
日本国公表特許公報「特表２００３−５１７００７号（２０００年３月２１日公表）」 日本国公開特許公報「特開２００６−３３３９４２号（２００６年１２月１４日公開）」 日本国公表特許公報「特表２００３−５３３３１９号（２００３年１１月１１日公表）」 日本国公表特許公報「特表２００７−５００５２１号（２００７年１月１８日公表）」 Chung DR., Chitnis T., Panzo RJ., Kasper DL., Sayegh MH., Tzianabos AO., CD4+T cells regulate surgical and postinfectious adhesion formation, J. Exp. Med., 2002, 195, 1471-1478 Holmdahl L., The role of fibrinolysis in adhesion formation, Eur. J. Surg. Suppl., 1997, 577, 24-31 Reed KL., Fruin AB., Gower AC., Stucchi AF., Leeman SE., Becker JM., A neurokinin 1 receptor antagonist decreases postoperative peritoneal adhesion formation and increases peritoneal fibrinolytic activity, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004, 101, 9115-9120
しかしながら、従来の腸管癒着を形成する方法では、形成される腸管癒着の程度の再現性が低いという問題を生じる。
つまり、上述のガーゼで摩擦する方法等では、腸管に対して与える侵襲の程度の再現性が極めて低い。また、特許文献１及び２には傷口を治癒するための発明が開示されているのみであり、腸管癒着を形成するための発明は開示されていない。そのため、所望の程度の腸管癒着を再現性良く形成することができず、腸管癒着に関する研究を充分に進めることができなかった。
実際に、これまで腹腔内の手術後における腸管癒着のメカニズムに関しては、解明されていない事項も多く、また、誤って認識されている事項も存在した。例えば、後で詳述するように、本発明者らの検討により、腸管癒着は従来考えられていたＴｈ１免疫応答ではないことが判明した。
このような事情から、顕著な予防、治療効果を奏する薬剤や方法は得られていない。例えば、上述したＮＫ−１Ｒのアンタゴニストは、実験的にデータが示されただけであり、全く実用化されていない。侵襲部位に外科用癒着防止シートを置く方法等では、腸管癒着を抑制する効果や、予防する効果が充分でない。また、特許文献１にはどのようにＨＧＦを使用すれば腸管癒着を抑制できるのか一切開示されていない。特許文献２は皮下組織と臓器との癒着を抑制することが開示されているのみであり、腸管癒着の治療に資する発明は開示されていない。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、所望の程度の腸管癒着を再現性良く形成可能な、実験動物の腸管癒着を形成する方法及び腸管癒着実験動物の製造方法を提供することにある。さらには、腸管癒着抑制剤を効率的にスクリーニングすることが可能な腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法及び腸管癒着を抑制可能な腸管癒着抑制剤を提供することにある。
本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法は、上記課題を解決するために、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記腸管に与えられる侵襲の程度が一定になるように熱量を制御することを特徴としている。
本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法では、上記焼灼工程は、電気メスを用いて行なわれることがより好ましい。
本発明に係る腸管癒着実験動物の製造方法は、上記課題を解決するために、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記腸管に与えられる侵襲の程度が一定になるように熱量を制御することを特徴としている。
本発明に係る腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、下記の(i)〜(iii)の工程を含み、(i)実験動物の腸管の少なくとも一部の部位を焼灼する工程；(ii)上記実験動物に被験物質を投与する工程；(iii)腸管癒着の形成を確認する工程；上記(i)の工程では、上記腸管に与えられる侵襲の程度が一定になるように熱量を制御することを特徴としている。
本発明に係る腸管癒着抑制剤は、上記課題を解決するために、インターフェロンγ（以下、「ＩＦＮ−γ」と表記する）阻害物質を含み、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間に投与されることを特徴としている。
本発明に係る腸管癒着抑制剤では、上記ＩＦＮ−γ阻害物質は、ＨＧＦ、ＩＦＮ−γ中和抗体、タキキニン阻害物質、及びｉＮＫＴ細胞が有するＩＦＮ−γを産生する機能を阻害する物質のうち少なくとも一つであることがより好ましい。
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
癒着の形成の程度がａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ０〜５の場合の、腸管を撮影した結果を示す図である。 手術類似侵襲施術後経時的に、ＢＡＬＢ／ｃ群の腸管細胞の組織をＨＥ染色（上段）及びＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色（下段）した結果を示す図である。 腸管癒着のための手術類似侵襲施術１週間後の、ＢＡＬＢ／ｃ群及びａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。 手術類似侵襲施術１週間後の、ＢＡＬＢ／ｃ群及びａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群の腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。 腸管癒着のための手術類似侵襲施術後の、ＮＫＴ-/-群及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、ＮＫＴ-/-及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔの腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。 ＢＡＬＢ／ｃ群に腸管癒着形成のための手術類似侵襲を施術した後の腸管ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を経時的に測定した結果を示す図である。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後のＣ５７ＢＬ／６群、ＩＦＮ−γ-/-群及びＩＦＮ−γ-/-＋ＩＦＮγ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔの腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、ＳＴＡＴ１-/-群、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図であり、図１１の（ａ）は、ＳＴＡＴ１-/-群の結果を示し、図１１の（ｂ）は、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群の結果を示す。 腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、ＳＴＡＴ１-/-、ＳＴＡＴ４-/-及びＳＴＡＴ６-/-の腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。 Ｔａｃ１-/-群に対して腸管癒着形成のための手術類似侵襲を施術した結果を示す図であり、図１３の（ａ）は、Ｔａｃ１-/-群の腸管癒着の程度を評価した結果を示し、図１３の（ｂ）は、Ｔａｃ１-/-群に対して上記手術類似侵襲を施術し、３時間後の腸管ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。 ＢＡＬＢ／ｃ群に腸管癒着形成のための手術類似侵襲を施術した後の腸管におけるｔＰＡｍＲＮＡ及びＰＡＩｍＲＮＡの発現量、血漿中のｔＰＡ及びＰＡＩの蛋白量を経時的に測定した結果を示す図であり、図１４の（ａ）はＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示し、図１４の（ｂ）はｔＰＡｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示し、図１４の（ｃ）は血漿中のＰＡＩの量を測定した結果を示し、図１４の（ｄ）は血漿中のｔＰＡ値を測定した結果を示す。 ＳＴＡＴ１-/-群に腸管癒着形成のための手術類似侵襲を施術し、１日後の腸管ＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ産生の抑制による腸管癒着形成の抑制を確認した結果を示す図であり、図１６の（ａ）、図１６の（ｂ）及び図１６の（ｃ）は、それぞれ、ＰＢＳのみを投与したＢＡＬＢ／ｃ群及びＨＧＦを投与したＢＡＬＢ／ｃ群における腸管癒着形成のための手術類似侵襲施術後の、腸管癒着の程度を評価した結果、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定した結果、ＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。 ＨＧＦの投与時期と腸管癒着形成との関係を調査した結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ中和抗体による腸管癒着抑制効果を確認した結果を示す図であり、図１８の（ａ）はＰＡＩｍＲＮＡの発現量を示し、図１８の（ｂ）は腸管癒着をＡｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｃｏｒｅにより評価した結果を示す。 タキキニンがＩＦＮ−γの産生を誘導するか確認した結果を示す図であり、図１９の（ａ）はＳＰの結果、図１９の（ｂ）はＮＫＡ及びＮＰＫの混合物、又はＳＰ、ＮＫＡ及びＮＰＫの混合物の結果を示す。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実験動物の腸管癒着を形成する方法〕
本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法は、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記腸管に与えられる侵襲の程度が一定になるように熱量を制御すればよい。
また、本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法は、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えてもよい。
焼灼された部位は、組織再生の際に、腸管の他の部位又は他の臓器と接触することで、これらと癒着する。また、当該部位に与えられる熱量を制御して、腸管に与えられる侵襲の程度を、侵襲する部位毎に、及び／又は実験動物の個体毎に、一定にすることで、所望の程度の腸管癒着を高い再現性で形成することができる。
ここで「実験動物」とは、実験で用いる動物であれば特に限定されるものではない。例えば、ラット、マウス、ウサギ、サル等の哺乳動物が挙げられる。特に、マウス、ラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられている。なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましい。また、上記実験動物は、実験の目的に応じて遺伝子を欠損させた遺伝子欠損動物（ノックアウト動物）、外来性の遺伝子が導入されたトランスジェニック動物などであってもよい。
上記焼灼工程では、実験動物を開腹して、腸管癒着の形成を目的とする部位を焼灼すればよい。腸管を焼灼した後は閉創して、しばらく時間が経過すれば当該実験動物に腸管癒着が形成される。腸管を焼灼してから、腸管癒着が形成されるまでの時間は、実験動物の種類や臓器の種類によって異なるが、例えば、実験動物としてマウスを用いた場合、５日〜７日後には腸管癒着が形成される。後に述べる実施例では、正常マウスの盲腸に対して本発明に係る実験動物に腸管癒着を形成させる方法を施した場合、７日後には腸管癒着の形成が確認された。
上記焼灼工程における上記腸管に与える熱量は、腸管に与えられる侵襲の程度が一定になるように制御すればよい。例えば、一定の量の熱量を、一定時間付加すれば、腸管に与えられる侵襲の程度が一定となるように制御できる。例えば、後述のように電気メス等を用いて、電熱により焼灼すれば、電圧及び／又は電流によって、所望の熱量に制御可能である。そして、当該電気メスの先端を腸管に接触させる時間を一定にすれば、腸管に与えられる侵襲の程度が一定となる。
上記焼灼工程で、焼灼する部位の位置や面積は、焼灼による損傷で腸管癒着が形成できなくならない限り、限定されるものではなく、形成を目的とする腸管癒着の位置や程度等に応じて設定すればよい。例えば、後述の電気メスを用いる場合、腸管癒着の形成を目的とする位置に、当該電気メスの先端を接触させるだけでもよい。
腸管を焼灼するために用いる器具としては、発生する熱量を調整することが可能であれば、特に限定されるものではない。例えば、モノポーラ電気メス、バイポーラ電気メス等の電気メスが好ましい。電気メスを用いて焼灼を行なえば、電流及び／又は電圧によって定量的に発する熱量を制御することができる。これにより、腸管に与える侵襲の程度が一定になるように制御しやすくなる。また、電流及び／又は電圧の微調整が可能であるため、焼灼により腸管に加えられる熱量の微調整も可能となる。よって、より高い再現性で、所望の程度に腸管癒着させることができる。また、焼灼する部位の微細な位置調整も可能であるため、所望の部位に腸管癒着を形成することができる。
従来は、上述のようにガーゼで摩擦したり、鉗子で結紮したりする等の方法が用いられ、形成される腸管癒着の程度の再現性を高める工夫がなされてこなかった。しかし、本発明者らは、侵襲の程度が一定になるように、焼灼による熱量を制御することで、再現性良く所望の程度の腸管癒着を形成することができることを見出した。そして、電気メス等を用いて電熱による侵襲を施せば、電流及び／又は電圧の定量的な調整により、侵襲の程度を再現性良く制御できることを見出し、本発明に想到した。また、そもそも、人為的に腸管癒着を形成するために電気メスを用いることが可能であるとは、当業者といえども想到し得ない技術的思想である。本発明は、このような新たな知見、技術的思想に基づく、当業者といえども容易に想到し得ない発明である。
また、上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えることが好ましい。ＩＦＮ−γの発現が誘導されると、腸管癒着が形成される。これは本発明者らが見出した全く新たな知見である。より具体的には、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱が加えられると、神経ペプチドの一種であるタキキニン（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）が神経末端から放出される。次に、ｉＮＫＴ細胞がタキキニンによる刺激を受けてＩＦＮ−γを産生する。ＩＦＮ−γは、ＳＴＡＴ１を介して、ＰＡＩ発現を著明に誘導する結果、腸管癒着が形成されるのである。
一方、ガーゼで摩擦する方法、特許文献３及び４に開示されている従来の方法ではＩＦＮ−γの発現が誘導されるとは限らない。従来の方法では、癒着を形成させる部位に傷をつけたり、炎症を引き起こしたりした上で、傷、炎症等から回復する際の組織再生機能を利用する。しかし、傷、炎症を再現性良く与えることは困難である。
本発明では、ＩＦＮ−γの発現に基づいて、ひいてはＰＡＩの発現に基づいて腸管癒着を形成させることができるので、また、熱量であれば従来公知の熱を供給する装置（電気メス等）を用いれば定量的に制御できるので、所望のＩＦＮ−γの発現量に応じた熱量の熱を、複数の実験動物に等しく与えることにより再現性良く腸管癒着を形成できる。
なお、「ＩＦＮ−γの発現を誘導する」とは、ＩＦＮ−γの発現量を増加させることを意味し、当該実験動物では元々ＩＦＮ−γが発現していてもよくしていなくてもよい。
また、「ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量」とは、当業者であれば本明細書の記載に基づいて見出すことができる。即ち、実験動物に対して、任意の熱量を加えた後にＩＦＮ−γの発現が増加したか否かを確認すればよい。ＩＦＮ−γの発現が誘導されたか否かを確認する方法、つまり、ＩＦＮ−γの発現の増加を確認する方法については特に限定されないが、例えば後述の実施例に記載の方法に従ってもよい。また、ＤＮＡチップを用いてＩＦＮ−γをコードする遺伝子の発現量の増加を確認してもよいし、ＩＦＮ−γの抗体を用いたエライザ法等を利用してもよい。また、ＩＦＮ−γの発現の増加を確認する時期については特に限定されないが、焼灼の直後から１〜８時間後後が好ましく、１〜４時間後がさらに好ましく、３時間後が最も好ましい。例えば、以下に示す電力等の条件によれば、ＩＦＮ−γの発現を好適に誘導できる。
電気メスを用いる場合の使用条件は、形成させる腸管癒着の程度等に応じて設定すればよく、特に限定されるものではないが、例えば２８〜３２ワットが好ましく、さらに好ましくは２９〜３１ワットである。２８〜３２ワットにすることで、後述する腸管癒着抑制剤等の投与や遺伝子改変等を施していない正常なマウスであれば、好適に腸管癒着を形成することができ、また、焼灼する部位が過度に加熱されて損傷することを防ぐことができる。
また、電気メスを用いる場合、焼灼する部位に当該電子メスを接触させる時間は、電気メスのワット数や、形成させる腸管癒着の程度等に応じて設定すればよく、特に限定されるものではないが、例えば１．０〜１．３秒であることが好ましく、さらに好ましくは１．０〜１．１秒である。１．０〜１．３秒であれば、後述する腸管癒着抑制剤等の投与や遺伝子改変等を施していない正常なマウスであれば好適に腸管癒着を形成することができ、また、焼灼時間が長すぎることによる過度な加熱や、腸管が長時間、外気に露出されることを防ぐことで、腸管の損傷を防ぐことができる。
また、電気メスの周波数は３００〜７００ｋＨｚが好ましく、さらに好ましくは４００〜６００ｋＨｚである。この範囲であれば、腸管が過度に損傷することを防ぐことができる。本発明者らは後述の実施例において５００ｋＨｚとしている。
本発明に係る腸管癒着実験動物の製造方法は、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えればよい。具体的には、上述の本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法に関する説明に順じて行なえばよい。
〔腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法〕
本発明に係る腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法は、下記の(i)〜(iii)の工程を含み、(i)実験動物の腸管の少なくとも一部の部位を焼灼する工程；(ii)上記実験動物に被験物質を投与する工程；(iii)腸管癒着の形成を確認する工程；上記(i)の工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えればよい。
本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法によれば、再現性高く実験動物に腸管癒着を形成することができる。そのため、投与する被験物質による、形成される腸管癒着の程度の差を、正確に判定することができる。よって、腸管癒着抑制剤のスクリーニングを正確に行なうことができる。
上記(i)の工程は、上述の本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法の説明に準じて行なえばよい。
上記(ii)の工程は、上記(i)の工程の前後のいずれに行なってもよく、限定されるものではない。例えば、上記被験物質の使用用途が術前投与である場合は、上記(ii)の工程を、上記(i)の工程の前に行なえばよく、術後投与である場合は、上記(ii)の工程を、上記(i)の工程の後に行なえばよい。
また、上記(ii)の工程において、被験物質を投与する方法は、被験物質の種類、用途に応じて適宜設定すればよく、特に限定されるものではない。例えば、後の実施例ではＨＧＦを皮下注射した。また、静脈注射等によって投与してもよい。
上記(iii)の工程は、上記(i)及び(ii)の工程の後に行なえばよい。また、上記(iii)の工程で腸管癒着の形成を確認する方法としては特に限定されるものではなく、上記(i)の工程で焼灼した部位を肉眼で観察して評価すればよい。例えば、本発明者らは後の実施例で述べるように、肉眼で観察した上で、形成された腸管癒着の程度をａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅを用いて評価した。
〔腸管癒着抑制剤〕
本発明に係る腸管癒着抑制剤は、ＩＦＮ−γ阻害物質を含むものであればよい。また、投与時期については、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間がよい。
本発明者らが検討したところ、後の実施例で詳述するように、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ細胞；以下、「ｉＮＫＴ細胞」と表記する）で産生されるＩＦＮ−γが、腸管癒着の形成を促進することが判明した。そして、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γの産生を阻害することで、腹腔内の手術後の腸管癒着を抑制することができることを見出した。そもそも腸管癒着の形成は、従来、上述のようにＴｈ１の免疫応答であると考えられていた。後述のようにこれは誤った認識である。この認識では、ＩＦＮ−γの産生を抑制することで腸管癒着を抑制できることに、誰も想到しなかったであろう。本発明者らは、このような認識があったにもかかわらず、独自に腸管癒着形成のメカニズムを後述の実施例に記載のように検討し、本発明に係る腸管癒着抑制剤を完成させた。つまり、本発明に係る腸管癒着抑制剤は、全く新たな知見に基づく当業者といえども容易に想到し得ない発明である。
また、腸管癒着の要因となるＩＦＮ−γは、手術から１〜５時間後、特に３時間後に発現量が向上することを本発明者らは見出した。そこで、ＩＦＮ−γの発現を事前に抑制することで、腸管癒着の形成を抑制するために、本発明に係る腸管癒着抑制剤の投与時期は、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間に投与されるものであればよい。この期間に投与されることにより、腸管癒着の要因となるＩＦＮ−γの産生を阻害し、腸管癒着を良好に抑制できる。
また、本発明者らは、マウスを用いて、手術後１〜５時間後、特に３時間後にＩＦＮ−γの発現量が向上することを見出したが、この時間はヒト等の哺乳動物においても同様である。また、腸管に侵襲が与えられてから腸管癒着が形成されるまでの時間については、マウス、ヒトにおいて同様であることが知られている。従って、本発明に係る腸管癒着抑制剤は、マウス、ヒト等の様々な哺乳動物に対して適用可能である。
なお、ｉＮＫＴ細胞とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの一つである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉＮＫＴ細胞及びＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ細胞）に分類される（Yoshimoto T. and Paul WE. CD4pos, NK1.1pos T cells promptly produce interleukin 4 in response to in vivo challenge with anti-CD3, J. Exp. Med., 1994, 179,1285-1295）。
ここで、「ＩＦＮ−γ阻害物質」はＩＦＮ−γの正常な機能を損なわせるように作用する物質であれば特に限定されない。また、ＩＦＮ−γの産生を阻害する物質であってもよい。従って、「ＩＦＮ−γ阻害物質」には、ＩＦＮ−γ遺伝子からの転写を阻害する物質、ＩＦＮ−γｍＲＮＡからの翻訳を阻害する物質、ＩＦＮ−γタンパク質の成熟を阻害する物質、成熟したＩＦＮ−γタンパク質の機能発現を阻害する物質などが含まれる。
ＩＦＮ−γ阻害物質として、例えば、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；肝細胞増殖因子）、ＩＦＮ−γ中和抗体、タキキニン阻害物質、ｉＮＫＴ細胞が有するＩＦＮ−γを産生する機能を阻害する物質等が挙げられる。
ＩＦＮ−γ中和抗体は、従来公知の方法で得ればよく、例えば特開２００６-１９９６１４にＩＦＮ−γ中和抗体の取得方法が詳述されている。
タキキニン阻害物質としては、タキキニンの正常な機能を損なわせるように作用する物質であれば特に限定されない。従って、「タキキニン阻害物質」には、タキキニンをコードする遺伝子からの転写を阻害する物質、タキキニンのｍＲＮＡからの翻訳を阻害する物質、タキキニンの成熟を阻害する物質、成熟したタキキニンの機能発現を阻害する物質等が含まれる。例えば、タキキニンに対する中和抗体、アンタゴニスト、タキキニンの受容体であるＮＫ−１Ｒのアンタゴニスト等が挙げられる。なお、ＮＫ−１Ｒのアンタゴニストとしては、例えば、ＣＪ−１２，２５５(Ｐｆｉｚｅｒ社)、ＲＰ６７５８０（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔ， Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｅｒｃｈｅ ｄｅ Ｖｉｔｒｙ−Ａｌｆｏｒｔｖｉｌｌｅ)を使用できる。
なお、タキキニンの具体例としては、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ、ｎｅｏｒｏｋｉｎｉｎ Ａ、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ等が挙げられる。
ｉＮＫＴ細胞が有するＩＦＮ−γを産生する機能を阻害する物質としては、当該機能を損なわせるように作用する物質であれば特に限定されない。ｉＮＫＴ細胞自体を除去する物質であってもよく、当該機能のみを欠損させる物質であってもよい。例えば、抗ＮＫ１．１抗体、抗Ｌｙ４９Ｃ／Ｌｙ４９１抗体等が挙げられる。中でも抗ＮＫ１．１抗体は良好にｉＮＫＴ細胞を除去することができるので有利である。なお、抗ＮＫ１．１抗体については、抗ＮＫ１．１抗体産生ハイブリドーマ(ＰＫ１３６；ＡＴＣＣから入手)を用いて精製してもよい。また、抗Ｌｙ４９Ｃ／Ｌｙ４９１抗体はＢＤバイオサイエンス社等から市販のものを購入して使用してもよい。
ＨＧＦは、ＩＦＮ−γの産生を抑制する機能を有する。これは、本発明者らが見出し、Kuroiwa T., Kakishita E., Hamano T., Kataoka Y., Seto Y., Iwata N., Kaneda Y., Matsumoto K., Nakamura T., Ueki T., Fujimoto J., Iwasaki T., Hepatocyte growth factor ameliorates acute graft-versus-host disease and promotes hematopoietic function, J. Clin. Invest., 2001, 107(11), 1365-1373で報告している。そして、本発明者らは、後の実施例で詳述するように、ＨＧＦを術前投与することにより、効果的に腸管癒着を抑制することが可能であることを見出した。
本発明に係る腸管癒着抑制剤は、その用途に応じた様々な組成物とすることができる。例えば、経口、非経口のいずれの用途にも応じた組成物とすることができる。特に、手術により侵襲される部位に、局所的に投与するための組成物とすることが好ましく、中でも、静脈注射に用いる組成物とすることが好ましい。静脈注射に用いる組成物とする場合、従来公知の溶媒に、ＩＦＮ−γ阻害物質を含有させて用いればよい。当該溶媒としては、生体に悪影響を及ぼすものでない限り、限定されるものではなく、例えば、水性プロピレングリコール、ＰＢＳ等が挙げられる。換言すれば、本発明に係る腸管癒着抑制剤の用途としては、静脈注射のように局所的に投与することが好ましい。なお、従来技術の項で説明した外科用癒着防止シートに、含有させて又は塗布した上で、手術後の部位に貼ってもよい。
本発明に係る腸管癒着抑制剤中のＩＦＮ−γ阻害物質の含有量は、投与対象の状態、手術により与えられる侵襲の程度等に応じて、適宜設定すればよい。ＩＦＮ−γ阻害物質としてＨＧＦを用いて、静脈注射によって投与する場合は、例えば、１日の投与量が０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇとなるように含有させればよいが、これに限定されるものではない。
なお、本発明の範疇には、ＩＦＮ−γ阻害物質を、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間に投与する腸管癒着の抑制方法も含まれる。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
（腸管癒着マウスを製造するための手術類似侵襲）
後述する実施例では、以下の方法で、各マウスに対して腸管癒着形成のための手術類似侵襲（以下、単に「手術類似侵襲」と表記する）を施術した。
まず、マウスから、５ｍｍの腹部正中切開により盲腸を体外に取り出した。次に、取り出した盲腸の表面に、バイポーラ電気メス（泉工医科工業株式会社製、品番ＭＳ−１５００）の先端を１秒間接触させることで焼灼した。バイポーラ電気メスは３０Ｗ、周波数５００ｋＨｚ、負荷１５０Ωで用いた。焼灼後速やかに閉創した。
腸管癒着の形成は、上記手術類似侵襲の施術から７日経過後に開腹して、癒着形成を肉眼で観察することで確認した。
以下の実施例では、形成された腸管癒着の程度を５段階のａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅで評価した。各ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅが示す癒着形成の程度は以下の通りである。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ０；癒着無し。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ１；一箇所の薄い膜状の癒着の形成。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ２；二箇所以上の薄い癒着の形成。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ３；局所的に厚い癒着の形成。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ４；播種状に付着した厚い癒着の形成又は二箇所以上の局所的に厚い癒着の形成。
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ５；極めて厚く血管新生も認められる癒着の形成又は二箇所以上の、播種状に付着した厚い癒着の形成。
形成された腸管癒着の程度がａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ０〜５の場合の、それぞれの腸管を撮影した結果を図１に示す。図１は、癒着の形成の程度がａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ０〜５の場合の、腸管を撮影した結果を示す図であり、図１中の０〜５の数字は各腸管癒着の上記Ｓｃｏｒｅを示し、矢印は腸管癒着が形成された箇所を示す。
〔実施例１：腸管癒着を形成した腸管細胞の組織学的検討〕
（使用動物）
正常マウスとしてＢＡＬＢ／ｃを用いた。ＢＡＬＢ／ｃはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
（ＢＡＬＢ／ｃ群に対する手術類似侵襲）
まず、ＢＡＬＢ／ｃ群に上記手術類似侵襲を施した。次に、当該手術類似侵襲を施術する直前及び施術後経時的に、ＢＡＬＢ／ｃを開腹して焼灼部位を含む組織を切除して、パラフィン固定を行なった後、３μｍの厚さに薄切りした。なお、以下、マウスの表記の後に「群」と付した場合、１０匹〜１５匹を一群とする当該マウス群を示すものとする。
次に、薄切りして得た組織切片の炎症浸潤及び繊維化の程度を観察した。炎症浸潤の観察は、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色によって行なった。また、繊維化の程度は、Ｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色によりコラーゲン繊維を染色して行なった。
図２に、上記手術類似侵襲の施術から１日、３日、５日、７日経過後のＢＡＬＢ／ｃの腸管細胞の組織に対してＨＥ染色及びＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった結果を示す。なお、比較のため、上記手術類似侵襲の施術直前におけるそれぞれ染色の結果をも示す。
その結果、施術後３時間後（図示せず）から、焼灼部位のみならず腸管全周の粘膜下層にリンパ球浸潤を伴った炎症像が確認された。この炎症像は時間が経過するに伴い増強された。
また、図２に示すように、ＨＥ染色を行なった結果、施術後３日後から、腸管漿膜下と筋層との間に顕著なリンパ球浸潤が確認された。このリンパ球浸潤は時間の経過に伴い顕著に増加した。Ｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった結果では、施術後１日後から粘膜下及び漿膜下の繊維化が確認された。さらに、時間の経過に伴い繊維化の程度が増大したことが確認された。
また、上記手術類似侵襲施術後のＢＡＬＢ／ｃの腸管癒着形成を肉眼で観察したところ、１週間後にはａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ５に相当する顕著な癒着が確認された。
なお、上記手術類似侵襲施術後の肉眼的及び組織学的な癒着形成は、正常マウスであればＣ５７ＢＬ／６、Ｂ６／１２９、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮでもＢＡＬＢ／ｃと同様であった。Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ６／１２９、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮはいずれもＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
〔実施例２：ＣＤ４＋Ｔ細胞の腸管癒着形成に対する関与について〕
（使用動物）
本実施例では、正常マウスとしてＢＡＬＢ／ｃを用いた。また、ＢＡＬＢ／ｃからＣＤ４＋Ｔ細胞を除去したマウス（以下、「ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ」と表記する）を用いた。
ＢＡＬＢ／ｃからＣＤ４＋Ｔ細胞の除去は、上記手術類似侵襲の施術２週間前から、０．５ｍｇの抗ＣＤ４＋抗体を、１匹当たり１週間に２回投与することにより行なった。これによりＢＡＬＢ／Ｃの脾臓細胞に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞の９８％以上が除去された。
（ＢＡＬＢ／ｃ群及びａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群の腸管癒着形成）
まず、ＢＡＬＢ／ｃ群及びａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群に上記手術類似侵襲を施術した。
次に、施術から７日経過後に開腹して腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより腸管癒着の程度を評価した。その結果を図３に示す。図３は上記手術類似侵襲施術後のＢＡＬＢ／ｃ群及びａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。
図３に示すように、ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂ群では腸管癒着の程度がＳｃｏｒｅ０又は１であった。つまり、腸管癒着が全く形成されないか、形成されたとしても極めて軽度のものであった。
また、上記手術類似侵襲の施術前及び施術から１週間後の、ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂの腸管細胞に対して実施例１に記載の方法と同様の方法でＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった。その結果を図４に示す。図４は、ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂの腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図であり、比較のため、ＢＡＬＢ／ｃの腸管に対してＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった結果をも示している。また、図４において「Ｎｏｎ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ」と示した図は、上記手術類似侵襲の施術前の、ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂの腸管細胞に対するＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色の結果を示す。
図４に示すように、ａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂでは、繊維化は全く認められなかった。なお、上記手術類似侵襲の施術から１週間経過後のａｎｔｉ−ＣＤ４Ａｂの腸管細胞を、実施例１に記載の方法と同様にしてＨＥ染色を行なった結果、腸管漿膜下のリンパ球浸潤も全く認められなかった。
この結果から、腸管癒着形成にはＣＤ４＋Ｔ細胞が関与していることが確認できた。
〔実施例３：ｉＮＫＴ細胞の腸管癒着形成に対する関与について〕
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、上述のように２種類に分類される。ここでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ｉＮＫＴ細胞の腸管癒着に対する関与を検討した。
（使用動物）
本実施例では、ｉＮＫＴ細胞欠損マウス（以下、「ＮＫＴ-/-」と表記する）及びＮＫＴ-/-にＢＡＬＢ／ｃ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を１匹当たり１×１０７個、尾静脈より移入したマウス（以下、「ＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ」と表記する）を用いた。
ＮＫＴ-/-は、理化学研究所横浜研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター 谷口克博士より恵与された。
（ＮＫＴ-/-群及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成）
まず、ＮＫＴ-/-群及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群に上記手術類似侵襲を施術した。次に、施術から７日経過後に開腹して腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより腸管癒着の程度を評価した。その結果を図５に示す。図５は、上記手術類似侵襲施術後のＮＫＴ-/-群及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図であり、比較のため実施例２で行なった、ＢＡＬＢ／ｃ群に対する上記手術類似侵襲の施術の結果をも示している。
図５に示すように、ＮＫＴ-/-群ではａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約１であった。一方、ＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群ではａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約５であった。
さらに、ＮＫＴ-/-及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔに対して、上記手術類似侵襲の施術前及び施術から１週間後に、実施例２に記載の方法と同様の方法でＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった。その結果を図６に示す。図６は、上記手術類似侵襲施術後の、ＮＫＴ-/-及びＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔの腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。
図６に示すように、ＮＫＴ-/-では、繊維化の形成は全く認められなかった。一方、ＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔでは繊維化の形成が認められた。なお、上記手術類似侵襲の施術後１週間後の、ＮＫＴ-/-の腸管に対して実施例２に記載の方法と同様の方法でＨＥ染色を行なった結果、腸管漿膜下のリンパ球浸潤も全く認められなかった。
以上の結果から、腸管癒着形成にｉＮＫＴ細胞が関与していることが確認できた。
〔実施例４：腸管癒着形成に関与する因子について〕
本実施例では、ＩＦＮ−γが腸管癒着形成に関与する因子であることを確認した。
（使用動物）
本実施例では、正常マウスとしてＣ５７ＢＬ／６を用いた。また、ＩＦＮ−γ欠損マウス（以下、「ＩＦＮγ-/-」と表記する）及びＩＦＮγ-/-に対して、施術一日前に浸透圧ポンプを皮下に装着させて、１週間で１匹当たり１００μｇのＩＦＮ−γを投与したマウス（以下、「ＩＦＮγ-/-＋ＩＦＮγ」と表記する）を用いた。ＩＦＮγ-/-は、東京大学医科学研究所 岩倉洋一郎教授より恵与された。
（ＩＦＮ−γをコードするｍＲＮＡの発現量の測定）
まず、Ｃ５７ＢＬ／６群に上記手術類似侵襲を施術した。次に、施術後の焼灼部位から経時的にｍＲＮＡを精製した。そして、精製したサンプルをｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲに供して、ＩＦＮ−γをコードするｍＲＮＡ（以下、「ＩＦＮ−γｍＲＮＡ」と表記する。）の発現量を測定した。なお、上記ｍＲＮＡの精製には、ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、品番７４１０６）を用いた。
ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ社製のｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（品番ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ０４-３４２-０５４-００１）を用いた。ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲでＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定するための試薬としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製、品番Ｍｍ００８０１７７８−ｍ１）を用いて、付属の説明書に従い調整した。温度条件は、９５℃で１０分間解離反応を行なった後、９５℃で１秒間、６０℃で２０秒間を４５サイクル繰り返した。その結果を図７に示す。図７は、ＢＡＬＢ／ｃ群に上記手術類似侵襲を施術した後の腸管におけるＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を経時的に測定した結果を示す図である。
図７に示すように、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現が確認された。また施術から３時間後でＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量が最大となった。
また、Ｃ５７ＢＬ／６群、ＩＦＮγ-/-群及びＩＦＮγ-/-＋ＩＦＮγ群に、上記手術類似侵襲を施術した。施術から７日後にそれぞれのマウスを開腹して、腸管癒着形成を肉眼で観察してａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅで評価した。その結果を図８に示す。図８は、上記手術類似侵襲施術後の、Ｃ５７ＢＬ／６群、ＩＦＮ−γ-/-群及びＩＦＮ−γ-/-＋ＩＦＮγ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。
図８に示すように、ＩＦＮ−γ-/-群ではａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約１であったが、ＩＦＮ−γ-/-＋ＩＦＮγではａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約５であった。
以上の結果から、施術から３時間後という早期に、腸管から産生誘導されるＩＦＮ−γが、腸管の癒着形成に関与していることが示された。
〔実施例５：腸管癒着形成に対するＩＦＮ−γの関与について〕
本実施例では、腸管癒着形成に対するＩＦＮ−γの関与を詳細に確認した。
（使用動物）
本実施例では、実施例３で用いたＮＫＴ-/-に、ＩＦＮγ-/-由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移入したマウス（以下、「ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ」と表記する）を用いた。
（ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成）
まず、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ群に上記手術類似侵襲を施術した。次に、施術から７日経過後に開腹して腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより腸管癒着の程度を評価した。その結果を図９に示す。図９は、上記手術類似侵襲後の、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図であり、比較のため実施例２で行なった、ＮＫＴ-/-＋ＷＴＣＤ４Ｔ群に対する上記手術類似侵襲の施術の結果をも示している。
図９に示すように、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔ群では、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約２であった。
また、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔに対して、上記手術類似侵襲の施術前及び施術から１週間後に、実施例２に記載の方法と同様の方法でＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった。その結果を図１０に示す。図１０は、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔの腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図である。
図１０に示すように、ＮＫＴ-/-＋ＩＦＮγ-/-ＣＤ４Ｔでは、繊維化の形成は全く認められなかった。
以上の結果から、腸管癒着には、ｉＮＫＴ細胞から産生誘導されるＩＦＮ−γが関与していることが確認できた。
〔実施例６：腸管癒着形成に対するＳＴＡＴ１の関与について〕
本実施例では、腸管癒着形成に対するＩＦＮ−γの関与について、ＩＦＮ−γの細胞内シグナル伝達に必須の転写因子であるＳＴＡＴ１を欠損させたマウスを用いて、より詳細に確認した。
また、上述のように腸管癒着は、従来、Ｔｈ１の免疫応答と考えられていた（例えば、非特許文献１等を参照）。そこで本実施例では、Ｔｈ１の誘導に必須の転写因子であるＳＴＡＴ４、Ｔｈ２の誘導に必須の転写因子であるＳＴＡＴ６の腸管癒着形成に対する関与も併せて確認した。
（使用動物）
本実施例では、ＳＴＡＴ１を欠損させたマウス（以下、「ＳＴＡＴ１-/-」と表記する）、ＳＴＡＴ４を欠損させたマウス（以下、「ＳＴＡＴ４-/-」と表記する）及びＳＴＡＴ６を欠損させたマウス（以下、「ＳＴＡＴ６-/-」と表記する）を用いた。
ＳＴＡＴ１-/-及びＳＴＡＴ４-/-は、東京医科大学難治性免疫疾患センター 善本隆之助教授より恵与された。また、ＳＴＡＴ６-/-は、大阪大学微生物研究所 審良静男教授より恵与された。
また、正常マウスとしてＢ６／１２９及びＢＡＬＢ／ｃを用いた。
（ＳＴＡＴ１-/-群、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群の腸管癒着形成）
まず、ＳＴＡＴ１-/-群、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群に上記手術類似侵襲を施術した。
次に、施術から７日経過後に、それぞれのマウスを開腹して腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより腸管癒着の程度を評価した。その結果を図１１に示す。図１１は、上記手術類似侵襲施術後の、ＳＴＡＴ１-/-群、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群の腸管癒着形成を評価した結果を示す図である。なお、図１１の（ａ）は、ＳＴＡＴ１-/-群に対して上記手術類似侵襲を施術した結果を示し、比較のためＢ６／１２９群に対して上記手術類似侵襲を施術した結果を示す。また、図１１の（ｂ）は、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群に対して上記手術類似侵襲を施術した結果を示し、比較のためＢＡＬＢ／ｃ群に対して上記手術類似侵襲を施術した結果をも示す。
図１１に示すように、ＳＴＡＴ１-/-群では、ほとんど腸管癒着が確認されず、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均は約１であったが、ＳＴＡＴ４-/-群及びＳＴＡＴ６-/-群では、それぞれａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均が約５となった。
また、ＳＴＡＴ１-/-、ＳＴＡＴ４-/-及びＳＴＡＴ６-/-に対して、上記手術類似侵襲の施術前及び施術から１週間後に、実施例２に記載の方法と同様の方法でＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行なった。その結果を図１２に示す。図１２は、ＳＴＡＴ１-/-、ＳＴＡＴ４-/-及びＳＴＡＴ６-/-の腸管細胞の組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果を示す図であり、比較のためＢ６／１２９の腸管細胞をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色した結果をも示す。
図１２に示すようにＳＴＡＴ１-/-では、繊維化が確認されなかったが、ＳＴＡＴ４-/-及びＳＴＡＴ６-/-では、繊維化が確認された。
以上の結果から、ＩＦＮ−γのシグナル伝達に必須の転写因子であるＳＴＡＴ１が、腸管癒着形成に関与していることが確認できた。
〔実施例７：タキキニンによるＩＦＮ−γ産生の確認〕
本実施例では、sｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐを含むタキキニンによるＩＦＮ−γ産生の機構を確認した。上述のように、sｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐを含むタキキニンは、手術等の物理的刺激が加わることで、神経末端から分泌される神経伝達因子の一つである。
（使用動物）
本実施例では、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐを含むタキキニンの産生を制御する遺伝子であるｔａｃ１を欠損させたマウス（以下、「Ｔａｃ１-/-」と表記する。）を用いた。Ｔａｃ１-/-は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
（Ｔａｃ１-/-群の腸管癒着形成）
まず、Ｔａｃ１-/-群に、上記手術類似侵襲を施術した。
次に、施術から７日経過後に開腹して、腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより腸管癒着の程度を評価した。
また、実施例３と同様の方法で、上記手術類似侵襲を施術後のＴａｃ１-/-の焼灼部位から経時的にｍＲＮＡを精製してｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲに供して、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定した。
これらの結果を図１３に示す。図１３は、Ｔａｃ１-/-群に上記手術類似侵襲を施術した結果を示す図であり、図１３の（ａ）は、Ｔａｃ１-/-群の腸管癒着の程度を評価した結果を示し、図１３の（ｂ）は、Ｔａｃ１-/-群に対して上記手術類似侵襲を施術し、３時間後のＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。なお、図１３には、比較のため正常マウス群（Ｃ５７ＢＬ／６）に対して上記手術類似侵襲を施術して、腸管癒着の程度をａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅで評価した結果及びＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量を測定した結果をも示す。
図１３の（ａ）に示すように、Ｔａｃ１-/-群では、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅは０又は１であった。また、図１３の（ｂ）に示すように、Ｔａｃ１-/-では、ＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現が誘導されないことが確認された。
以上の結果から、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐを含むタキキニンは、腸管癒着形成に必須のＩＦＮ−γの産生誘導に関与していることが示唆された。
〔実施例８：腸管癒着形成にＳＴＡＴ１が関与するメカニズムについて〕
本実施例では、腸管癒着形成にＳＴＡＴ１が関与するメカニズムについて、ＳＴＡＴ１とｔＰＡ及びＰＡＩとの関係等から確認した。
（使用動物）
本実施例では、正常マウスとしてＢＡＬＢ／ｃを用いた。また、実施例６に記載のＳＴＡＴ１-/-を用いた。
（ｔＰＡ及びＰＡＩの腸管癒着形成に対する関与）
腸管癒着形成に関与するメカニズムを明らかにするため、まず、腸管癒着形成に対するｔＰＡ及びＰＡＩの関与を確認した。
上述のように、線溶系が亢進すると癒着は回避され、凝固系が亢進すると癒着が形成されると考えられている。そして、ｔＰＡは線溶系を亢進する因子であり、ＰＡＩ凝固系を亢進する因子である。
まず、ＢＡＬＢ／ｃに上記手術類似侵襲を施術した。
次に、施術後のＢＡＬＢ／ｃ群におけるｔＰＡをコードするｍＲＮＡ（以下、「ｔＰＡｍＲＮＡ」と表記する）及びＰＡＩをコードするｍＲＮＡ（以下、「ＰＡＩｍＲＮＡ」と表記する）の発現量を測定した。具体的には、ｔＰＡｍＲＮＡの発現量を測定するための試薬又はＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定するための試薬実施例４と同様の方法でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。なお、ＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定するための試薬としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製、品番Ｍｍ００４３５８６０−ｍ１）を用い、ＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定するための試薬としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製、品番４３２２１７１）を用いた。
この結果を図１４に示す。図１４はＢＡＬＢ／ｃ群に上記手術類似侵襲を施術した後のｔＰＡｍＲＮＡ及びＰＡＩｍＲＮＡの発現量、血漿中のｔＰＡ及びＰＡＩの蛋白量を経時的に測定した結果を示す図であり、図１４の（ａ）はＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示し、図１４の（ｂ）はｔＰＡｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示し、図１４の（ｃ）は血漿中のＰＡＩの量を測定した結果を示し、図１４の（ｄ）は血漿中のｔＰＡ値を測定した結果を示す。
なお、血漿中のＰＡＩ値とｔＰＡ値との値はＥＬＩＳＡにて測定した。具体的には、血漿中のＰＡＩ値はＭｏｕｓｅ ＰＡＩ‐１ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（インノヴァティブ社製、品番ＩＭＰＡＩＫＴ）を用いた。また、血漿中のｔＰＡ値はＭｏｕｓｅ ｔＰＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（オックスフォードバイオメディカルリサーチ社製、品番ＰＡ９２）を用いた。
図１４の（ａ）に示すように、施術から１日後にＰＡＩｍＲＮＡの発現量は著明に増加した。また、図１４の（ｂ）に示すように、ｔＰＡｍＲＮＡの発現量は施術から１日後に著明に減少した。
図１４の（ｃ）に示すように、施術から１日後に血漿中のＰＡＩ値は著明に増加した。また、図１４の（ｄ）に示すように、血漿中のｔＰＡ値は施術から１日後に著明に減少した。このことからＰＡＩの腸管癒着に対する関与が示された。
（ＳＴＡＴ１及びＰＡＩの腸管癒着形成に対する関与）
次に、腸管癒着形成に対するＳＴＡＴ１及びＰＡＩの関与を検討した。
まず、ＳＴＡＴ１-/-群に上記手術類似侵襲を施術した。
次に、施術後１日後におけるＳＴＡＴ１-/-のＰＡＩｍＲＮＡの発現量を、上述のＢＡＬＢ／ｃでＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した方法と同様の方法で測定した。その結果を図１５に示す。図１５はＳＴＡＴ１-/-に上記手術類似侵襲を施術した後のＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す図であり、比較のためコントロールマウスであるＢ６／１２９に上記手術類似侵襲を施術してから１日後の、ＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果をも示す。
図１５に示すように、Ｂ６／１２９群に比較してＳＴＡＴ１-/-群のＰＡＩｍＲＮＡの発現量は、極めて低いことが示された。
以上の結果から、手術侵襲によって腸管から産生誘導されるＩＦＮ−γは、ＳＴＡＴ１を介して、ＰＡＩ発現を著明に誘導する結果、腸管癒着の形成に関与することが示された。
〔実施例９：ＩＦＮ−γ阻害物質による腸管癒着形成の抑制〕
本実施例では、ＩＦＮ−γ産生を阻害することにより、腸管癒着の形成を抑制できるか否かを確認した。
（使用動物）
本実施例ではＢＡＬＢ／ｃを用いた。
（ＨＧＦによる腸管癒着形成の抑制）
ＩＦＮ−γ阻害物質としてＨＧＦを用いて、ＨＧＦの投与と、ＢＡＬＢ／ｃの腸管癒着形成との関係を調べた。
まず、手術類似侵襲を施術する１日前に、ＰＢＳ２００μｌ又はＨＧＦ２０μｇをＢＡＬＢ／ｃ群に皮下注射することで投与した。
ＰＢＳのみを投与したＢＡＬＢ／ｃ群及びＨＧＦ２０μｇを投与したＢＡＬＢ／ｃ群のそれぞれのマウスに、上記手術類似侵襲を施術した後、７日経過後の腸管癒着の形成を肉眼で観察して、ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅを用いて評価した。
また、手術類似侵襲を施術する１日前に、ＰＢＳ２００μｌ又はＨＧＦ２０μｇをＢＡＬＢ／ｃ群に皮下注射して、施術から３時間後のＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量及び１日後のＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した。ＩＦＮ−γｍＲＮＡ及びＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定する方法は実施例４及び８に記載の方法と同様にした。
なお、ＨＧＦ２０μｇの皮下注射は、ＨＧＦ２０μｇをＰＢＳに溶解して２００μｌに調整した溶液を皮下注射することで行なった。
これらの結果を図１６に示す。図１６は、ＩＦＮ−γ産生の抑制による腸管癒着形成の抑制を確認した結果を示す図であり、図１６の（ａ）はＨＧＦの投与と腸管癒着形成との関係を示す。図１６の（ｂ）と図１６の（ｃ）は、それぞれ、ＰＢＳを投与したＢＡＬＢ／ｃ群及びＨＧＦを投与したＢＡＬＢ／ｃ群における、上記手術類似侵襲施術後のＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現量及びＰＡＩｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。なお、図１６において、ＰＢＳのみを投与したＢＡＬＢ／ｃ群は「ＰＢＳ」と表記して、ＨＧＦ２０μｇを投与したＢＡＬＢ／ｃ群は「ＨＧＦ２０」と表記した。
図１６の（ａ）に示すように、上記手術類似侵襲を施術する１日前にＨＧＦ２０μｇを投与した群では、癒着は形成されないか、極軽度であった（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ０〜１）。また、図１６の（ｂ）及び図１６の（ｃ）に示すように、手術類似侵襲を施術する１日前にＨＧＦ２０μｇを投与した群では、施術から３時間後のＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現と１日後のＰＡＩｍＲＮＡ発現が、ＰＢＳ投与群に比べて著しく低下しているのを認めた。
以上の結果から、手術侵襲による腸管からのＩＦＮ−γの産生とそれに続くＰＡＩの産生誘導は、ＨＧＦの術前投与によって、抑制することが可能であることが確認された。つまり、ＨＧＦは腸管癒着形成を抑制できることが示された。これにより、ＨＧＦによるＩＦＮ−γの産生を抑制することで、術後の腸管癒着形成を予防するという全く新たな治療法を提供できることが示された。
なお、これまで説明した実施例で使用したマウスは、大学等から恵与されたものを用いたが、Takeda K, Tsutsui H, Yoshimoto T, Adachi O, Yoshida N, Kishimoto T, Okamura H, Nakanishi K, Akira S, Defective NK Cell Activity and Th1 Response in IL-18-Deficient Mice, Immunity, 1998, 8, 383-390に記載のＩＬ−１８欠損マウスの製造方法に基づいて、所望の遺伝子を欠損させることで得ることも可能である。
〔実施例１０：本発明に係る腸管癒着抑制剤の投与時期について〕
ＨＧＦ２０μｇをＰＢＳに溶解して２００μｌに調整した溶液の投与時期を変更した以外は、実施例９に記載した方法と同じ方法で、腸管癒着形成の抑制効果を確認した。投与時期としては、手術類似侵襲の施術から３０分、１、３、５日後とした。それぞれの投与時期、実施例９の投与時期（施術の１日前）、及び比較のためＰＢＳのみを投与した結果を図１７に示す。図１７は、ＨＧＦの投与時期と腸管癒着形成との関係を調査した結果を示す図であり、横軸は投与時期を示し、縦軸はＡｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｃｏｒｅを示す。なお、ＰＢＳのみの投与は施術の１日前に行なった。なお、ＨＧＦについてはペプロテック社から購入したヒトＨＧＦをＰＢＳに調整して使用した。
図１７に示されるように、施術の１日前、施術から３０分後にＨＧＦを添加した場合、極めて良好に腸管癒着を抑制した。
一方、施術から１日以降に投与しても腸管癒着抑制効果が得られなかった。これは、ＨＧＦは腸管癒着の治療効果を有していないことも示している。つまり、実施例１では腸管癒着は術後７日後に確認されたと説明したが、実際には術後３日後から徐々に形成され始める。しかし、本実施例で示したように術後１日以降に投与しても、術後７日後にはａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ５の腸管癒着が確認された。このことから、ＨＧＦ等のＩＦＮ−γ阻害物質は腸管癒着が形成された後にこれを治療する効果ではなく、腸管癒着の形成を予め防ぐ効果に極めて優れていることが示された。
この結果から、ＨＧＦを術前又は術直後投与することにより、手術侵襲によって腸管から産生誘導されるＩＦＮ−γの産生を抑制する結果、ＰＡＩの発現を抑制し、腸管癒着の形成を予防できることが示された。
〔実施例１１：ＩＦＮ−γ阻害物質による腸管癒着形成の抑制２〕
本実施例では、ＩＦＮ−γ阻害物質としてＩＦＮ−γ中和抗体を用い、該ＩＦＮ−γ中和抗体を、２ｍｇ／ｂｏｄｙとなるように投与した以外は実施例９に記載した方法と同じ方法で、腸管癒着形成の抑制効果を確認した。
なお、ＩＦＮ−γ中和抗体はＩＦＮ−γ中和抗体産生ハイブリドーマ（ＸＭＧ１．２;ＡＴＣＣより入手)から得た。また、比較のため、ＩＦＮ−γ中和抗体の代わりにｃｏｎｔｒｏｌ Ａｂを使用した以外は同じ方法で腸管癒着の抑制効果を確認した。ｃｏｎｔｒｏｌ ＡｂとしてはＢＤバイオサイエンス社から購入したｒａｔ ＩｇＧ１を用いた。
結果を図１８に示す。図１８は、ＩＦＮ−γ中和抗体による腸管癒着抑制効果を確認した結果を示す図であり、図１８の（ａ）はＰＡＩｍＲＮＡの発現量を示し、図１８の（ｂ）は腸管癒着をＡｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｃｏｒｅにより評価した結果を示す。
図１８に示されるように、ＩＦＮ−γ中和抗体の投与群においては、ＰＡＩｍＲＮＡの発現量がコントロールに比べて顕著に低下し、腸管癒着は形成されないか、軽度（Ｓｃｏｒｅ２）であった。
また、施術から１日後にＩＦＮ−γ中和抗体を投与して、腸管癒着が形成されるか確認したが、腸管癒着抑制効果は確認できなかった（図示せず）。
これらの結果から、ＩＦＮ−γ中和抗体を術前投与することにより、手術侵襲によって腸管から産生誘導されるＩＦＮ−γの産生が抑制される結果、ＰＡＩの発現が抑制され、腸管癒着の形成を予防できることが示された。
〔実施例１２：タキキニンによるＩＦＮ−γ産生誘導〕
本実施例ではタキキニンがＩＦＮ−γの産生を誘導するか否か確認した。
タキキニンとして、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ（以下、「ＳＰ」という）、ｎｅｏｒｏｋｉｎｉｎ Ａ（以下、「ＮＫＡ」という）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ（以下、「ＮＰＫ」）を用いた。
まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ＩＬ−２の存在下において、Ｃ５６ＢＬ／６マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＮＫＴ-/-マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＳＰ、ＮＫＡ及びＮＰＫの混合物（以下、「ＮＫＡ＋ＮＰＫ」という）、又はＳＰ、ＮＫＡ及びＮＰＫの混合物（以下、「ＳＰ＋ＮＫＡ＋ＮＰＫ」という）を添加して４日間培養した。
なお、上記培養液として、１０重量％ウシ胎児血清、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、 １００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０を用いた。
具体的には、ＳＰについては１１、３３、１００μＭとなるように上記培養液に溶解した。また、ＮＫＡ＋ＮＰＫについては、ＮＫＡ、ＮＰＫを、それぞれ５０μＭ、５０μＭとなるように上記培養液に溶解した。ＳＰ＋ＮＫＡ＋ＮＰＫについては、ＳＰ、ＮＫＡ、ＮＰＫをそれぞれ３３μＭ、５０μＭ、５０μＭとなるように上記培養液に溶解した。
次に、培養上清中のＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を図１９に示す。図１９はタキキニンがＩＦＮ−γの産生を誘導するか確認した結果を示す図であり、図１９の（ａ）はＳＰの結果、図１９の（ｂ）はＮＫＡ＋ＮＰＫ、又はＳＰ＋ＮＫＡ＋ＮＰＫの結果を示す。また、図１９の（ａ）及び（ｂ）において横軸は添加したタキキニンを示し、縦軸はＩＦＮ−γの産生量を示す。また、図１９において、「ＷＴ」は正常Ｃ５６ＢＬ／６マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた結果を示し、「ＮＫＴ-/-」はＮＫＴ-/-マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた結果を示す。
図１９に示されるように、正常Ｃ５６ＢＬ／６マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞はｔａｃｈｙｋｉｎｉｎに反応して顕著なＩＦＮ−γ産生を誘導した。一方、ＮＫＴ-/-マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＩＦＮ−γ産生は著しく低値であった。以上の結果から、タキキニンはｉＮＫＴ細胞を刺激してＩＦＮ−γの産生を誘導することが示された。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法は、以上のように、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えるので、所望の程度の腸管癒着を再現性良く形成することができるという効果を奏する。
また、本発明に係る腸管癒着実験動物の製造方法は、以上のように、実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えるので、所望の程度の腸管癒着を再現性良く形成可能な腸管癒着実験動物の製造方法を提供することができる。
また、本発明に係る腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法は、以上のように、(i)実験動物の腸管の少なくとも一部の部位を焼灼する工程、(ii)上記実験動物に被験物質を投与する工程、(iii)腸管癒着の形成を確認する工程を含み、上記(i)の工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えるので、腸管癒着抑制剤を効率的にスクリーニングすることができるという効果を奏する。
また、本発明に係る腸管癒着抑制剤は、ＩＦＮ−γ阻害物質を含むので、腹腔内の手術後の腸管癒着を抑制することができるという効果を奏する。
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
以上のように、本発明に係る実験動物の腸管癒着を形成する方法は、所望の程度の腸管癒着を再現性高く形成することができるので、腸管癒着の形成に関する医薬品の開発等に好適に用いることができるので医薬品産業に利用可能である。また、本発明に係る腸管癒着抑制剤は好適に腹腔内手術後の腸管癒着を抑制できるので医薬品産業に利用可能である。

Claims (6)

  1. ＩＦＮ−γ阻害物質を含み、腸管が侵襲される手術の１日前から当該手術の３０分後までの間に投与されることを特徴とする腸管癒着抑制剤。
  2. 上記ＩＦＮ−γ阻害物質は、ＨＧＦ、ＩＦＮ−γ中和抗体、タキキニン阻害物質、及びｉＮＫＴ細胞が有するＩＦＮ−γを産生する機能を阻害する物質のうち少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の腸管癒着抑制剤。
  3. 実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、
    上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えることを特徴とする実験動物の腸管癒着を形成する方法。
  4. 上記焼灼工程は、電気メスを用いて行なわれることを特徴とする請求項３に記載の実験動物の腸管癒着を形成する方法。
  5. 実験動物の腸管を焼灼する焼灼工程を含み、
    上記焼灼工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えることを特徴とする腸管癒着実験動物の製造方法。
  6. 下記の(i)〜(iii)の工程を含み、
    (i)実験動物の腸管を焼灼する工程；
    (ii)上記実験動物に被験物質を投与する工程；
    (iii)腸管癒着の形成を確認する工程；
    上記(i)の工程では、上記実験動物が有する腸管に、ＩＦＮ−γの発現を誘導する熱量の熱を与えることを特徴とする腸管癒着抑制剤のスクリーニング方法。
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