JPWO2008038625A1 - 微生物培養用培地および微生物培養方法 - Google Patents
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Abstract
抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を的確に増殖させることのできる微生物培養用培地および微生物培養方法を提供する。抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるための微生物培養用培地において、微生物培養用基礎培地中に、酸性白土または活性白土を含有する。微生物培養用培地にて、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させる微生物培養方法において、被検試料の溶液中に、酸性白土または活性白土を添加する。酸性白土または活性白土とともに、活性炭を併用することが好適である。
Description
本発明は、微生物培養用培地および微生物培養方法（以下、それぞれ単に「培地」および「培養方法」とも称する）に関し、詳しくは、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるための微生物培養用培地、および、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させる微生物培養方法に関する。
日本薬局方収載の微生物限度試験法において、被検試料である漢方生薬製剤や生薬中の微生物試験を行う場合、通常の市販培地での培養では、当該被検試料中に含まれる抗菌性物質（発育阻止物質）の存在のために、標的菌の増殖が悪く、試験法として機能しない場合があることが知られている。
このような場合、日本薬局方では、希釈・ろ過、中和または不活化などの手段によって、抗菌性物質の影響を除去しなければならないとの記載があるが、この場合、被検試料が完全に溶媒に溶解する製剤の場合にはメンブランフィルターによるろ過法等が適用できるものの、不溶物の場合には不活化か希釈しか手段がない。したがって、実際上は希釈以外の選択肢は少ないのが現状である。
また、例えば、非特許文献１では生薬や漢方エキスについて、また、非特許文献２では切断および粉末生薬について、それぞれ抗菌性があることが示されているが、いずれにおいても希釈による抗菌性物質の除去以外の解決法は提示されていない。
さらに、医薬、化粧品業界では、抗菌性物質の不活化のため、培地にレシチンとポリソルベートを添加する手法が汎用されており、レシチンとポリソルベートが予め添加されている培地（ＳＣＤＬＰ培地等）も市販されているが、この培地は高価であり、また、パラベン類や水銀系等の防腐剤の不活化に対しては効果が高いものの、漢方生薬製剤の不活化には効果が低いケースが多い。
さらに、発育阻害物質を吸着するための吸着材として活性炭を用いた培地が特殊培地として市販されているが、漢方生薬製剤、生薬、または香辛料等の抗菌作用を有する食品中の抗菌性物質の除去という点では必ずしも十分とはいえなかった。
防菌防黴 Vol.25, No.8,pp. 467-473, 1997 防菌防黴 Vol.31, No.9,pp. 517-525, 2003
防菌防黴 Vol.25, No.8,pp. 467-473, 1997 防菌防黴 Vol.31, No.9,pp. 517-525, 2003
漢方生薬製剤、生薬、または香辛料等の抗菌作用を有する食品中の微生物限度試験を行うに際し被検試料を希釈する場合、希釈を重ねることは、試験規模が同じ場合には感度が下がることを意味するため、品質保証上の問題、すなわち、疑陰性で出荷してしまうことによる経済的損失というリスクを、完全に解消することはできなかった。この点は、被検試料の希釈以外の抗菌性物質の影響除去手段においても同様であった。
そこで本発明の目的は、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を的確に増殖させることのできる微生物培養用培地および微生物培養方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、微生物培養用培地、または、被検試料調製時に使用する溶液に対し、酸性白土または活性白土を添加し、特には、さらに活性炭を添加することで、漢方生薬製剤や生薬等の被検試料中の抗菌性物質を吸着、低減して、抗菌性を減弱することが可能となることを見出して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の微生物培養用培地は、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるための微生物培養用培地において、微生物培養用基礎培地中に、酸性白土または活性白土を含有することを特徴とするものである。本発明の培地においては好適には、前記微生物培養用基礎培地中に、さらに活性炭を含有させる。
また、本発明の微生物培養方法は、微生物培養用培地にて、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させる微生物培養方法において、前記被検試料の溶液中に、酸性白土または活性白土を添加することを特徴とするものである。本発明の培養方法において好適には、前記溶液中に、さらに活性炭を添加する。
本発明によれば、上記構成としたことにより、漢方生薬製剤、生薬、または香辛料等の抗菌作用を有する食品等の抗菌作用を有する被検試料中の標的菌を的確に増殖させることができ、結果としてこれら被検試料中に含まれる標的菌を容易に検出することができる微生物培養用培地および微生物培養方法を実現することが可能となった。
以下、本発明の好適実施形態について、詳細に説明する。
本発明においては、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるに際し、使用する微生物培養用培地、または、被検試料の溶液中に、酸性白土または活性白土を含有させる点が重要である。
本発明においては、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるに際し、使用する微生物培養用培地、または、被検試料の溶液中に、酸性白土または活性白土を含有させる点が重要である。
これにより、酸性白土または活性白土の吸着作用によって被検試料中に含まれる抗菌性物質を吸着することで、被検試料の抗菌性を低減させることができ、標的菌を的確に増殖させることができるため、従来のような希釈等の手段を用いることなく、容易に標的菌を検出することが可能となる。かかる酸性白土とは、モンモリロナイトを主とする白色または灰色の粘土であって、大きな比表面積と吸着能を有する多孔質構造を持つ物質であり、また、活性白土は、酸性白土を原料として、これを鉱酸で処理して得られる、酸性白土と同様に大きな比表面積と吸着能を有する多孔質構造を持つ物質である。酸性白土および活性白土はいずれも安価であるため、コスト的な観点からも、本発明のメリットは大きい。
具体的には、本発明の培地においては、微生物培養用基礎培地中に酸性白土または活性白土を含有させる。酸性白土または活性白土の添加量としては、被検試料や標的菌の種類、特性にもよるが、好適には培地の１〜２０重量％、より好適には３〜１０重量％程度である。酸性白土または活性白土の添加量が少なすぎると抗菌性の低減効果が不十分で、標的菌が十分増殖せず、検出が適切に行えなくなるおそれがある。一方、添加量が多すぎてもそれ以上の効果は望めない。
この場合、微生物培養用基礎培地中に、酸性白土または活性白土とともに、さらに活性炭を添加することで、抗菌性の低減効果をより高めることができ、標的菌の増殖をより促進することができる。活性炭の添加量としては、被検試料や標的菌の種類、特性にもよるが、好適には培地の１重量％以上５重量％未満、特には１〜３重量％とする。活性炭の添加量が１重量％未満では、添加による有意な増殖促進効果が得られず、一方、５重量％以上であると、却って標的菌の増殖が妨げられるおそれがある。
また、本発明の培養方法において具体的には、抗菌作用を有する被検試料の溶液中に酸性白土または活性白土を添加する。この場合の酸性白土または活性白土の添加量としては、被検試料や標的菌の種類、特性にもよるが、好適には上記溶液の１〜２０重量％、より好適には３〜１０重量％である。酸性白土または活性白土の添加量が少なすぎると抗菌性の低減効果が不十分で、標的菌が十分増殖せず、検出が適切に行えなくなるおそれがある。一方、添加量が多すぎてもそれ以上の効果は望めない。
この場合も、上記溶液中に、酸性白土または活性白土とともに、さらに活性炭を添加することで、抗菌性の低減効果をより高めて、標的菌の増殖をより促進することができる。活性炭の添加量としては、被検試料や標的菌の種類、特性にもよるが、好適には上記溶液の１重量％以上５重量％以下、特には１〜３重量％程度とする。活性炭の添加量が１重量％未満では、添加による有意な増殖促進効果が得られず、一方、５重量％より多いと、却って標的菌の増殖が妨げられるおそれがある。
本発明においては、酸性白土または活性白土を用いて被検試料中の抗菌性物質を吸着することで、被検試料中の標的菌の増殖抑制因子を除去する点のみが重要であり、それ以外の点については、常法に従い適宜実施することができ、特に制限されるものではない。
例えば、本発明において用いる微生物培養用基礎培地としては、日本薬局方に収載されている培地など、被検試料や標的菌に応じ通常使用される一般的な培地を適宜用いることができ、例えば、ＳＣＤ（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス）培地等を用いることができる。
本発明を適用し得る抗菌作用を有する被検試料としては、例えば、漢方生薬製剤、生薬、または香辛料等の抗菌作用を有する食品等が挙げられ、本発明は、このような従来法では十分増殖させることができなかったこれら被検試料中の標的菌についても的確に増殖させることができる点で特に有用である。したがって本発明によれば、これら漢方生薬製剤、生薬、または抗菌作用を有する食品中に特定の菌が含まれるか否かを容易に検出することが可能となる。この場合、漢方生薬製剤、生薬、または抗菌作用を有する食品を被検試料とする場合の溶液作成に用いる溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、ペプトン食塩緩衝液、培養に使用する液体培地などを用いることができる。
（実施例１）
培地に対する酸性白土または活性白土の添加による効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である三物黄ゴン湯および大承気湯を用い、下記の表１中にそれぞれ示す条件で酸性白土または活性白土を添加したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（以下、ＳＣＤ培地）において、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、培地の組成による標的菌の増殖状況を確認するために黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加して、増菌培養後にフォーゲル・ジョンソン培地へ塗抹培養を行い、黄色ブドウ球菌定性反応が認められるかの判定を行った。
培地に対する酸性白土または活性白土の添加による効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である三物黄ゴン湯および大承気湯を用い、下記の表１中にそれぞれ示す条件で酸性白土または活性白土を添加したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（以下、ＳＣＤ培地）において、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、培地の組成による標的菌の増殖状況を確認するために黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加して、増菌培養後にフォーゲル・ジョンソン培地へ塗抹培養を行い、黄色ブドウ球菌定性反応が認められるかの判定を行った。
（従来例１）
従来例として、活性炭を添加した培地において、実施例と同様にして培養試験を行った。
従来例として、活性炭を添加した培地において、実施例と同様にして培養試験を行った。
（比較例１−１〜１−３）
比較例として、活性炭または活性白土のいずれも添加しない培地において、被検試料のみ、標的菌のみ、被検試料および標的菌の双方を、それぞれ添加して、培養試験を行った。
比較例として、活性炭または活性白土のいずれも添加しない培地において、被検試料のみ、標的菌のみ、被検試料および標的菌の双方を、それぞれ添加して、培養試験を行った。
（比較例１−４，１−５）
比較例として、代表的なイオン吸着剤であるセパビーズＳＰ−７００を添加した培地において、実施例と同様にして培養試験を行った。
比較例として、代表的なイオン吸着剤であるセパビーズＳＰ−７００を添加した培地において、実施例と同様にして培養試験を行った。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表１中に示す。
上記表１に示す結果より、通常の培地に被検試料としての漢方エキス製剤および標的菌を添加しても、標的菌の増殖は見られなかった。これに対し、培地に活性白土を添加した実施例においては、従来の活性炭（粉末）を用いた場合と同様に標的菌の増殖が確認され、また、酸性白土を添加した実施例においては、漢方エキス製剤の処方により標的菌の増殖が確認された。従って、酸性白土または活性白土の添加により、抗菌作用を有する漢方エキス製剤中の標的菌を的確に増殖させ得ることが確認できた。なお、顆粒状の活性炭およびイオン吸着剤においても、漢方エキス製剤の処方により効果が得られないものが観察された。
（実施例２，比較例２）
被検試料を変えた場合の活性白土添加培地の効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である五淋散および竜胆瀉肝湯をそれぞれ用い、下記の表２中に示す量で活性白土を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
被検試料を変えた場合の活性白土添加培地の効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である五淋散および竜胆瀉肝湯をそれぞれ用い、下記の表２中に示す量で活性白土を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表２中に示す。
上記表２に示す結果より、五淋散および竜胆瀉肝湯についても、培地に活性白土を添加することにより抗菌作用が抑制され、標的菌を増殖させることができることが確認できた。
（従来例３，実施例３，比較例３）
培地に活性白土に加えて活性炭を添加した場合の効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である潤腸湯、五淋散、竜胆瀉肝湯、通導散および大承気湯をそれぞれ用い、下記の表３中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
培地に活性白土に加えて活性炭を添加した場合の効果を確認するために、被検試料として漢方エキス製剤である潤腸湯、五淋散、竜胆瀉肝湯、通導散および大承気湯をそれぞれ用い、下記の表３中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表３中に示す。
上記表３に示す結果より、培地に活性白土に加えて活性炭を添加した実施例においては、活性炭のみを用いた場合以上に標的菌の増殖が確認され、活性白土とともに活性炭を添加することで、被検試料の抗菌作用をより効果的に抑制できることが確かめられた。
（実施例４，比較例４）
被検試料として桂枝茯苓丸、抑肝散、大建中湯をそれぞれ用い、下記の表４中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
被検試料として桂枝茯苓丸、抑肝散、大建中湯をそれぞれ用い、下記の表４中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、上記実施例１と同様に試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応有の場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表４に示す。
上記表４に示す結果より、培地に活性白土に加えて活性炭を添加した実施例においては標的菌の良好な増殖による定性反応が常時確認されたが、活性炭のみを用いた場合や何も添加しない場合では安定的な定性反応が確認できず、活性白土とともに活性炭を添加することで、被検試料の抗菌作用をより効果的に抑制し、安定的な試験結果を得られることが確かめられた。
（実施例５，比較例５）
被検試料として桂枝茯苓丸、抑肝散、大建中湯をそれぞれ用い、下記の表５中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、United States Pharmacopeia 30,<62>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMSに準拠して試験・評価した。
被検試料として桂枝茯苓丸、抑肝散、大建中湯をそれぞれ用い、下記の表５中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）において黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）を添加し、United States Pharmacopeia 30,<62>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMSに準拠して試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応有の場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表５に示す。
上記表５に示す結果より、培地に活性白土に加えて活性炭を添加した実施例においては標的菌の良好な増殖による定性反応が常時確認されたが、活性炭のみを用いた場合や何も添加しない場合では安定的な定性反応が確認できず、活性白土とともに活性炭を添加することで、被検試料の抗菌作用をより効果的に抑制し、安定的な試験結果が得られることが確かめられた。
（比較例６，実施例６，従来例６）
活性炭（粉末）のみを５重量％で培地に添加した場合と、活性白土のみを５重量％で培地に添加した場合の微生物の生育に対する影響を確認するために、ＳＣＤ培地と、これに活性白土または活性炭を各５重量％添加した培地とをそれぞれ準備し、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、標的菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa IFO 13275）とし、増菌培養後に、黄色ブドウ球菌はフォーゲル・ジョンソンカンテン培地へ、緑膿菌はＮＡＣカンテン培地へ塗抹、培養を行い、黄色ブドウ球菌または緑膿菌の定性反応が認められるか否かの判定を行った。
活性炭（粉末）のみを５重量％で培地に添加した場合と、活性白土のみを５重量％で培地に添加した場合の微生物の生育に対する影響を確認するために、ＳＣＤ培地と、これに活性白土または活性炭を各５重量％添加した培地とをそれぞれ準備し、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、標的菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa IFO 13275）とし、増菌培養後に、黄色ブドウ球菌はフォーゲル・ジョンソンカンテン培地へ、緑膿菌はＮＡＣカンテン培地へ塗抹、培養を行い、黄色ブドウ球菌または緑膿菌の定性反応が認められるか否かの判定を行った。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。実施例、比較例および従来例の各々に対し、１０サンプルずつ試験を行なった。得られた結果を、下記の表６中に示す。
上記表６に示す結果より、活性炭を５重量％添加した培地では、黄色ブドウ球菌のコロニー産生が弱くなっているサンプルがあることがわかる。これは、活性炭の添加量が多すぎると、培地成分の吸着が生じ、これにより、増殖に悪影響を与えているものと考えられる。一方、活性白土については、添加量を１０重量％に増加した場合でも、悪影響は見られなかった。
（実施例７，比較例７，従来例７）
活性炭および活性白土の培地に対する影響をより詳細に確認するために、ＳＣＤ培地と、これに活性白土および／または活性炭を下記表７中に示す所定量にて添加した培地とをそれぞれ準備して、日本薬局方収載の微生物限度試験法に準じて、２４時間振とう培養後培地内の菌濃度測定を行った。標的菌としては、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa IFO 13275）を用い、約１００ｃｆｕの菌数を初発菌として添加した。得られた結果を、下記の表７中に示す。なお、下記表中の「％」は「重量％」を示す。
活性炭および活性白土の培地に対する影響をより詳細に確認するために、ＳＣＤ培地と、これに活性白土および／または活性炭を下記表７中に示す所定量にて添加した培地とをそれぞれ準備して、日本薬局方収載の微生物限度試験法に準じて、２４時間振とう培養後培地内の菌濃度測定を行った。標的菌としては、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa IFO 13275）を用い、約１００ｃｆｕの菌数を初発菌として添加した。得られた結果を、下記の表７中に示す。なお、下記表中の「％」は「重量％」を示す。
上記表７に示す結果より、活性炭３重量％と活性白土５重量％の２つを同時に添加した培地では、黄色ブドウ球菌および緑膿菌のいずれについても、試験菌の増殖能は無添加の培地とほぼ同等であった。これに対し、活性炭のみを添加した培地では特に黄色ブドウ球菌にて増殖能が低下していることから、活性白土を添加することで、活性炭の添加による増殖能の低下を抑制できることが確認できた。
（実施例８，比較例８）
被検試料として桂枝茯苓丸を用い、米国薬局方収載の微生物限度試験を想定したケースとして、ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）、無添加のＳＣＤ培地、ＳＣＤ培地に０．５重量％レシチンおよび４．０重量％ポリソルベート２０を添加したもの（LPSCD培地）をそれぞれ準備して、これを試料溶解溶液として用い、United StatesPharmacopeia 28,<61> MICROBIAＬ LIMIT TESTSに準拠して試験を行い、定型集落の生成を比較した。培養時試料濃度は０．０１ｇ／ｍＬとし、標的菌としては、Staphylococcus aureusＡＴＣＣ６５３８を用いた。
被検試料として桂枝茯苓丸を用い、米国薬局方収載の微生物限度試験を想定したケースとして、ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）、無添加のＳＣＤ培地、ＳＣＤ培地に０．５重量％レシチンおよび４．０重量％ポリソルベート２０を添加したもの（LPSCD培地）をそれぞれ準備して、これを試料溶解溶液として用い、United StatesPharmacopeia 28,<61> MICROBIAＬ LIMIT TESTSに準拠して試験を行い、定型集落の生成を比較した。培養時試料濃度は０．０１ｇ／ｍＬとし、標的菌としては、Staphylococcus aureusＡＴＣＣ６５３８を用いた。
結果はコロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表８中に示す。
上記表８に示す結果より、米国薬局方にて例示されている不活化培地であるＬＰＳＣＤ培地を試料溶解溶液として用い、さらにそれでの培養を実施した場合、定型集落は見られず、抗菌性物質による影響を抑制することはできなかったのに対し、活性白土および活性炭を添加したＩＳＣＤ培地をそれに用いた場合では定型集落が形成されており、抗菌性物質の影響が抑制されていることが確かめられた。
（実施例９，比較例９）
被検試料として桂枝茯苓丸を用い、下記の表９中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）においてSalmonella enterica spp. enterica serotype abony ACM5080を添加し、United States Pharmacopeia30,<62>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMSに準拠して試験・評価した。
被検試料として桂枝茯苓丸を用い、下記の表９中に示す量で活性白土および活性炭を添加した培地（基礎培地：ＳＣＤ培地）においてSalmonella enterica spp. enterica serotype abony ACM5080を添加し、United States Pharmacopeia30,<62>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMSに準拠して試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表９中に示す。
上記表９に示す結果より、培地に活性白土に加えて活性炭を添加した実施例においては標的菌の増殖が確認されたが、活性炭のみを用いた場合では増殖が確認できず、活性白土とともに活性炭を添加することで、被検試料の抗菌作用をより効果的に抑制できることが確かめられた。
（実施例１０，比較例１０）
被検試料として食品である山葵または茶を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、ペプトン緩衝液中に、チューブ山葵または茶（夾雑菌の妨害を防止するためオートクレーブ滅菌したもの）をそれぞれ１０ｇ，１ｇ，０．１ｇにて添加して、溶液量が１００ｍＬとなるよう調製し、１０倍，１００倍，１０００倍の被検試料溶液を作製した。ＳＣＤ培地，レシチン・ポリソルベート添加ＳＣＤ培地（ＳＣＤＬＰ培地），ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）の各培地９０ｍＬに試料溶液１０ｍＬを添加し、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）とし、上記実施例１と同様に試験・評価した。
被検試料として食品である山葵または茶を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、ペプトン緩衝液中に、チューブ山葵または茶（夾雑菌の妨害を防止するためオートクレーブ滅菌したもの）をそれぞれ１０ｇ，１ｇ，０．１ｇにて添加して、溶液量が１００ｍＬとなるよう調製し、１０倍，１００倍，１０００倍の被検試料溶液を作製した。ＳＣＤ培地，レシチン・ポリソルベート添加ＳＣＤ培地（ＳＣＤＬＰ培地），ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）の各培地９０ｍＬに試料溶液１０ｍＬを添加し、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）とし、上記実施例１と同様に試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表１０中に示す。
上記表１０に示す結果より、ＳＣＤ培地およびＳＣＤＬＰ培地においては、山葵および茶のいずれについても高濃度の１０倍液については標的菌のコロニーが生成せず、抗菌性物質の影響を抑制できなかったのに対し、活性白土および活性炭を添加したＩＳＣＤ培地においては、全濃度の溶液についてコロニーが生成しており、抗菌性物質の影響が抑制されていることが確かめられた。これにより、本発明の培地においては、漢方生薬製剤のみならず、山葵や茶に含まれる抗菌性物質についても吸着、低減して、抗菌性を抑制でき、食品微生物試験の改良へも応用できることが確認された。
（実施例１１，比較例１１）
被検試料として食品の乾燥香辛料を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、以下の試験を実施した。ターメリック粉末、粉末胡椒、乾燥バジルリーフをそれぞれ１０ｇ，５ｇ，０．５ｇ秤取し、溶液量が１００ｍＬとなるよう調製し、１０倍，２０倍，２００倍の被検試料溶液を作製した。この被検試料溶液それぞれ１０ｍＬを日本薬局方収載の生薬の微生物限度試験法に記載されている７．５％食塩加ＳＣＤ培地、７．５％食塩加ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（７．５％食塩加ＳＣＤＡＡ培地）、７．５％食塩加ＳＣＤＢ培地に活性白土５重量％を添加したもの（７．５％食塩加ＳＣＤＡ培地）９０ｍＬに添加し、日本薬局方収載の生薬の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じて、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）とし、上記実施例１と同様に試験・評価した。
被検試料として食品の乾燥香辛料を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、以下の試験を実施した。ターメリック粉末、粉末胡椒、乾燥バジルリーフをそれぞれ１０ｇ，５ｇ，０．５ｇ秤取し、溶液量が１００ｍＬとなるよう調製し、１０倍，２０倍，２００倍の被検試料溶液を作製した。この被検試料溶液それぞれ１０ｍＬを日本薬局方収載の生薬の微生物限度試験法に記載されている７．５％食塩加ＳＣＤ培地、７．５％食塩加ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（７．５％食塩加ＳＣＤＡＡ培地）、７．５％食塩加ＳＣＤＢ培地に活性白土５重量％を添加したもの（７．５％食塩加ＳＣＤＡ培地）９０ｍＬに添加し、日本薬局方収載の生薬の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じて、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）とし、上記実施例１と同様に試験・評価した。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表１１中に示す。
上記表１１に示す結果より、７．５％食塩加ＳＣＤ培地においては、ターメリック粉末、粉末胡椒、乾燥バジルリーフのいずれについても高濃度の１０倍液、２０倍液に関して標的菌のコロニーが生成せず、抗菌性物質の影響を抑制できなかったのに対し、活性白土および活性炭を添加した７．５％食塩加ＳＣＤＡＡ培地においては全サンプル全濃度の溶液について、活性白土を添加した７．５％食塩加ＳＣＤＡ培地においては乾燥バジルリーフ全濃度の溶液について、コロニーが生成しており、抗菌性物質の影響が抑制されていることが確かめられた。これにより、本発明の培地においては、漢方生薬製剤のみならず、乾燥香辛料に含まれる抗菌性物質についても吸着、低減して、抗菌性を抑制でき、食品微生物試験の改良へも応用できることが確認された。
（実施例１２，比較例１２）
被検試料として抗生物質を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、以下の試験を実施した。クロラムフェニコールを、２５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌの濃度で、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されているＳＣＤ培地、ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）、乳糖ブイヨン培地（以下、ＬＢ培地）、ＬＢ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＬＢ培地）にそれぞれ添加した。日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は、ＳＣＤ培地およびＩＳＣＤ培地には黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）、ＬＢ培地及びＩＬＢ培地には大腸菌（Escherichia coli IFO 3972）を使用し、増菌培養後はフォーゲル・ジョンソンカンテン培地（黄色ブドウ球菌）およびマッコンキーカンテン培地（大腸菌）へ塗抹、培養を行い、定性反応が認められるか否かの判定を行った。
被検試料として抗生物質を用いた場合の培地による標的菌の培養状況を確認するために、以下の試験を実施した。クロラムフェニコールを、２５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌの濃度で、日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されているＳＣＤ培地、ＳＣＤ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＳＣＤ培地）、乳糖ブイヨン培地（以下、ＬＢ培地）、ＬＢ培地に活性炭３重量％および活性白土５重量％を添加したもの（ＩＬＢ培地）にそれぞれ添加した。日本薬局方収載の微生物限度試験法に記載されている「培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験」に準じ、試験菌の増殖状況を確認した。使用菌種は、ＳＣＤ培地およびＩＳＣＤ培地には黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO 13276）、ＬＢ培地及びＩＬＢ培地には大腸菌（Escherichia coli IFO 3972）を使用し、増菌培養後はフォーゲル・ジョンソンカンテン培地（黄色ブドウ球菌）およびマッコンキーカンテン培地（大腸菌）へ塗抹、培養を行い、定性反応が認められるか否かの判定を行った。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表１２中に示す。なお、下記表中の「％」は「重量％」を示す。
上記表１２に示す結果より、黄色ブドウ球菌、大腸菌ともに、通常のＳＣＤ培地およびＬＢ培地と比較して、ＩＳＣＤ培地およびＩＬＢ培地において１００倍高い濃度の抗生物質が含まれる培地の培養においても集落生成および定性反応が生じており、抗生物質の影響が抑制されていることが確かめられた。これにより、本発明の培地においては、漢方生薬製剤のみならず、抗生物質含有の試料についても抗菌性を抑制できることが確認され、一般医薬品微生物試験の改良へも応用できることが確認された。
（実施例１３）
活性白土と活性炭を配合した培地において、活性白土５％に対して活性炭を１％または２％配合した際の微生物培養効果を確認するため、被検試料として漢方エキス製剤である潤腸湯、五淋散、竜胆瀉肝湯、通導散および大承気湯をそれぞれ用いて、実施例３に記載の方法で試験・評価を行った。
活性白土と活性炭を配合した培地において、活性白土５％に対して活性炭を１％または２％配合した際の微生物培養効果を確認するため、被検試料として漢方エキス製剤である潤腸湯、五淋散、竜胆瀉肝湯、通導散および大承気湯をそれぞれ用いて、実施例３に記載の方法で試験・評価を行った。
結果は、コロニー産生且つ定性反応ありの場合を○、コロニー産生のみまたは弱い定性反応ありの場合を△、コロニー産生なしの場合を×とした。得られた結果を、下記の表１３中に示す。
上記表１３に示す結果より、培地に活性白土を５重量％加えた場合には、活性炭の配合量が１重量％であったとしても十分に標的菌の増殖が確認され、被検試料の抗菌作用を効果的に抑制できることが確かめられた。
Claims (6)
- 抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させるための微生物培養用培地において、微生物培養用基礎培地中に、酸性白土または活性白土を含有することを特徴とする微生物培養用培地。
- 前記微生物培養用基礎培地中に、さらに活性炭を含有する請求項１記載の微生物培養用培地。
- 前記抗菌作用を有する被検試料が、漢方生薬製剤、生薬および抗菌作用を有する食品からなる群から選ばれる請求項１または２記載の微生物培養用培地。
- 微生物培養用培地にて、抗菌作用を有する被検試料に含まれる標的菌を増殖させる微生物培養方法において、前記被検試料の溶液中に、酸性白土または活性白土を添加することを特徴とする微生物培養方法。
- 前記溶液中に、さらに活性炭を添加する請求項３記載の微生物培養方法。
- 前記抗菌作用を有する被検試料が、漢方生薬製剤、生薬および抗菌作用を有する食品からなる群から選ばれる請求項４または５記載の微生物培養方法。
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