JPWO2007069414A1 - 線状の形態を有する細胞等を解析する方法及び神経細胞解析方法並びにそれら方法を実行する装置及びプログラム - Google Patents
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Abstract
神経細胞の3次元画像に基づき、神経細胞の形態解析を自動的に行う技術を提案する。まず、スケールスペース法を用いて樹状突起のトレースを行う。この際、σコンボリューションぼかしを利用して凹凸を減らし、樹状突起の中心線を同定する。次に、ヘステンソル法を用いて負の曲率を探す。全ての座標軸で負の曲率となる部分を「頭部」が占める領域であると判断する。この領域(頭部)の中心をスパインの位置とする。スパインの頭部は、楕円体と見なして近似を行う。これによって、楕円体の短径、中径及び長径をそれぞれ算出する。また、スパインの位置からそのスパインに最も近い樹状突起に垂線を降ろすことによって、その垂線を柱部分と認定する。このようにして得られた樹状突起と、スパイン頭部及び柱部とを合わせて最終的な神経細胞の形態が得られる。
Description
本発明は、線状の形態を有する細胞や、組織、器官を解析する方法に関する。特に、本発明は、神経細胞の解析方法に関する。特に、神経細胞の樹状突起の分岐の様子や、スパインの位置や形態、等を特定し、解析する方法に関する。
また、これらの方法を実行する装置、及び、その方法を実行するプログラムに関する。
従来から、神経細胞の解析は大きな労力を必要としていた。例えば、顕微鏡画像を基にした神経細胞の可視化解析は、熟練研究者の目で1個1個確認していく手作業によって、単一の神経細胞の形態情報をコンピュータに入力する等の方法がもっぱら採用されている。このような作業は、可視化に際して、可視化のための簡単なソフトウェアを用いる場合も多いが、結局、人手による作業が多くを占めているので、その作業量は膨大なものとなりがちであった。
例えば、1枚の画像解析を完了するのに数日を要する場合も珍しくはなかった。
これは、1個の神経細胞には、数十程度の樹状突起が存在し、各樹状突起上に数万程度のスパイン(シナプス後部)が存在するという複雑な形態を神経細胞がそなえているためである。このような複雑な構造のため、従来の画像処理アルゴリズムでは、自動的に神経細胞の形態を解析することは困難である。
先行特許文献の例
例えば、下記特許文献1には、線状構造を有する細胞体の評価方法が記載されている。この特許文献1に記載の方法は、画像データから、神経突起などの伸長度合いを取得する方法である。この方法は、細胞体の個数及び面積と、線状構造の長さ及び面積と、を画像処理によって求めることを特徴とするものである。
例えば、下記特許文献1には、線状構造を有する細胞体の評価方法が記載されている。この特許文献1に記載の方法は、画像データから、神経突起などの伸長度合いを取得する方法である。この方法は、細胞体の個数及び面積と、線状構造の長さ及び面積と、を画像処理によって求めることを特徴とするものである。
また、下記特許文献2には、蛍光標識を有するレポータ分子を用いて神経突起の成長に特異的に影響する化合物をスクリーニングする方法が、記載されている。この方法に用いられる光学分析システムや、試薬等も同特許文献2に記載されている。
また、下記特許文献3には、細胞スクリーニングの方法が記載されている。この方法においては、顕微鏡と、その画像をデジタル画像化するシステムと、細胞物質を区分するためのソフトウェア等が用いられている。
このスパインは、神経の活動に伴い増減し、「記憶」において重要な役割を果たすことが本願発明者らの研究により明らかになっている。このスパインを観察・解析することは、記憶の動作を解明し、種々の脳疾患の治療法の開発に寄与するものであり、医学上、重要な意味を持っている。
さて、このスパインは、1ニューロンあたり、数万個存在するので、それを人力で解析するのは極めて過大な労力が必要であった。特に、単にスパインの個数だけでなく、その形態まで観察し解析するためには熟練の技術者が何日も作業を続ける必要があった。
したがって、神経細胞の解析、特にスパインの増減まで含めた神経細胞の形態を高速に解析する手法が従来から望まれていた。
本願発明は、係る社会的な要請に鑑みなされたものであり、その目的は、神経細胞の3次元画像に基づき、神経細胞の形態解析を自動的に行う技術を提案することである。また、この技術を応用し、線状の形態を有する細胞等の形態を解析する方法・装置等を提供することである。
A.方法
(1)本発明は、上記課題を解決するために、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する方法において、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかしステップと、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度ステップと、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティングステップと、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する方法である。
(1)本発明は、上記課題を解決するために、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する方法において、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかしステップと、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度ステップと、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティングステップと、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する方法である。
このような構成によって、線状の形態を有する細胞等の形態を解析することができる。例えば、神経細胞や、(毛細)血管等の解析を好適に行うことができる。
(2)神経細胞の3次元画像に基づき、神経細胞の形態を解析する方法において、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかしステップと、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度ステップと、前記第1の中心度に基づき、神経細胞の樹状突起に近似した図形を求める樹状突起フィッティングステップと、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
このような構成によって、神経細胞の形態、特に樹状突起の形態を自動的に解析することができる。
(3)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記第1のぼかしステップは、前記第1のスケールσの値を変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法である。
(4)また、本発明は、上記(3)記載の神経細胞解析方法において、前記第1のぼかしステップは、前記第1のスケールσの値を0.2μm−5.0μmの範囲で変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法である。
樹状突起の形態を把握するために、σの値として0.2μm−5.0μmの範囲が好適である。
(5)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記第1の中心度ステップは、境界面の存在度を中心度として求めることを特徴とする神経細胞解析方法である。
中心度として境界面の存在度を用いたので、対象物の表面を良好に把握することができる。つまり、ここで言う境界面とは、対象物(樹状突起)の表面を意味する。
(6)また、本発明は、上記(2)2記載の神経細胞解析方法において、前記第1の中心度ステップは、はぎ取り法を用いて中心線を求めることを特徴とする神経細胞解析方法である。
従来のはぎ取り法を用いても、精度は多少落ちるものの、樹状突起の形態を同様に求めることが可能である。
(7)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記樹状突起フィッティングステップは、前記求めた中心度に基づき、スネークを樹状突起にフィッティングさせることを特徴とする神経細胞解析方法である。
B1.装置
(8)また、本発明は、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置において、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手段と、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手段と、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手段と、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する装置である。
(8)また、本発明は、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置において、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手段と、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手段と、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手段と、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する装置である。
C1.プログラム
(9)また、本発明は、コンピュータを、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、前記コンピュータに、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手順と、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手順と、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手順と、を実行させることを特徴とするプログラムである。
(9)また、本発明は、コンピュータを、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、前記コンピュータに、前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手順と、前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手順と、前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手順と、を実行させることを特徴とするプログラムである。
A2.方法
(10)また、本発明は、上記(1)記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法において、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかしステップと、前記第2のぼかしステップによるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度ステップと、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出ステップと、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法である。
(10)また、本発明は、上記(1)記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法において、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかしステップと、前記第2のぼかしステップによるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度ステップと、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出ステップと、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法である。
ここで、棘状部位とは、棘状であればどのようなものでも含まれる。例えば、神経細胞上のスパインが典型的な一例である。
(11)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記3次元画像に対して、前記第1のスケールσと異なる所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかしステップと、前記第2のぼかしステップによるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度ステップと、前記第2の中心度に基づき、神経細胞のスパイン頭部の中心位置を検出するスパイン頭部検出ステップと、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(12)また、本発明は、上記(11)記載の神経細胞解析方法において、前記第2のスケールσの値を0.1μm−0.3μmの範囲で変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法である。
(13)また、本発明は、上記(11)記載の神経細胞解析方法において、前記スパイン頭部検出ステップは、前記第2の中心度の絶対値がピークを取る位置を、スパインの頭部の中心位置と判断することを特徴とする神経細胞解析方法である。
(14)また、本発明は、上記(11)記載の神経細胞解析方法において、前記スパイン頭部検出ステップは、前記樹状突起から所定の距離以内の位置を、スパインの頭部の中心位置と判断することを特徴とする神経細胞解析方法である。
(15)また、本発明は、上記(11)記載の神経細胞解析方法において、前記求めたスパイン頭部の中心位置から、最も近い前記樹状突起へ、垂線を降ろし、その垂線をスパインの柱部として求めるスパイン柱部検出ステップ、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(16)また、本発明は、上記(11)記載の神経細胞解析方法において、前記スパイン検出ステップは、ヘステンソルの固有値が全て負である領域をスパインの頭部の存在領域として求めることを特徴とする神経細胞解析方法である。
(17)また、本発明は、上記(16)記載の神経細胞解析方法において、前記スパイン検出ステップは、前記求めた存在領域を、楕円体で近似し、スパイン頭部の近似図形を求めることを特徴とする神経細胞解析方法である。
B2.装置
(18)また、本発明は、上記(8)記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置において、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手段と、前記第2のぼかし手段によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手段と、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手段と、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置である。
(18)また、本発明は、上記(8)記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置において、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手段と、前記第2のぼかし手段によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手段と、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手段と、を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置である。
C2.プログラム
(19)また、本発明は、上記(9)記載の、コンピュータを、線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手順と、前記第2のぼかし手順によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手順と、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手順と、を実行させることを特徴とするプログラムである。
(19)また、本発明は、上記(9)記載の、コンピュータを、線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手順と、前記第2のぼかし手順によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手順と、前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手順と、を実行させることを特徴とするプログラムである。
D. 神経細胞解析方法の他の例
(20)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記樹状突起フィッティングステップは、前記求めた中心度に基づき、中心度が最大の点を選択する第1選択ステップと、前記中心度が最大の点から所定距離離れた点の中で、前記中心度が最大の点を選択する第2選択ステップと、前記選択した2個の点を結び、初期スネークを構成するステップと、前記構成した初期スネークの端点から所定距離離れた点の中から、最大の中心度を持つ点を選択し、既存の端点と結び、前記スネークを成長させる成長ステップと、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(20)また、本発明は、上記(2)記載の神経細胞解析方法において、前記樹状突起フィッティングステップは、前記求めた中心度に基づき、中心度が最大の点を選択する第1選択ステップと、前記中心度が最大の点から所定距離離れた点の中で、前記中心度が最大の点を選択する第2選択ステップと、前記選択した2個の点を結び、初期スネークを構成するステップと、前記構成した初期スネークの端点から所定距離離れた点の中から、最大の中心度を持つ点を選択し、既存の端点と結び、前記スネークを成長させる成長ステップと、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(21)また、本発明は、上記(20)記載の神経細胞解析方法において、前記成長ステップにおいて、選択する点は、前記既存の端点との距離が所定の距離にある点であることを特徴とする神経細胞解析方法である。
(22)また、本発明は、上記(20)又は(21)記載の神経細胞解析方法において、前記成長ステップにおける選択する点を見つけられる場合、前記成長ステップにおける成長を続行し、前記選択する点を見つけられない場合は、前記成長ステップにおける成長を完了する制御ステップ、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(23)また、本発明は、上記(22)記載の神経細胞解析方法において、前記成長ステップにおける選択する点を見つけられる場合とは、前記選択する点を、画像中において既にスネークの内部と認定されている領域を除いた領域から見つけられる場合であることを特徴とする神経細胞解析方法である。
(24)また、本発明は、上記(20)、(21)、(22)又は(23)記載の神経細胞解析方法において、前記成長させたスネークの各ノードで直径を取得し、スネーク内部の領域を確定させる確定ステップ、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
(25)また、本発明は、上記(20)、(21)、(22)、(23)又は(24)記載の神経細胞解析方法において、前記成長させたスネークが、(a)3個以上のノードを有すること、(b)全ノードの平均中心度が、所定のそれまでに確定した樹状突起の平均中心度の所定の比率以上であること、の2条件をともに満たす場合に樹状突起として確定し、いずれかの条件を満たさない場合には、そのスネークを破棄し、前記第1選択ステップに戻り、中心度が最大の点を選択する動作を再び開始する繰り返し制御ステップ、を含むことを特徴とする神経細胞解析方法である。
以上述べたように、本発明によれば、線状の形態を有する細胞等の解析を効率的に実行することができる。特に、対象が神経細胞の場合は、その樹状突起の様子とともに、樹状突起上に表れるスパインの形態も効率的に解析することができる。
10 ゴミ
12 擬陽性
12 擬陽性
以下、本発明の好適な実施の形態を図面に基づき説明する。
1.神経の形態
図1に、神経細胞の形態の説明図が示されている。本実施の形態においては、神経細胞の形態は、対象となる神経細胞に蛍光色素をインジェクションし、これを共焦点顕微鏡によって観察することによって、神経細胞の画像データが得ている。この画像データは、1024×1024ドットの画像であり、1ドットが0.043μmの大きさである。
図1に、神経細胞の形態の説明図が示されている。本実施の形態においては、神経細胞の形態は、対象となる神経細胞に蛍光色素をインジェクションし、これを共焦点顕微鏡によって観察することによって、神経細胞の画像データが得ている。この画像データは、1024×1024ドットの画像であり、1ドットが0.043μmの大きさである。
そして、共焦点顕微鏡で観察する(撮影する)平面の位置を、奥行き方向(平面と垂直方向)に変化させることによって、奥行き方向に0.45μmずつ位置が異なる平面画像データを得ることができる。
この様子が、図2に示されている。本実施の形態では、0.45μmずつずれた位置の平面画像データを例えば30枚撮影している。これら30枚の1024×1024ドットの画像データ群は、神経細胞の形態を3次元的に表現しているので、これら30枚の画像データ群を本実施の形態では、「3次元画像データ」と呼ぶ。
さて、図1に示すように、神経細胞からは、周囲に向かって樹状突起が伸展しており、複雑な形態をなしている。そして、この樹状突起上には、スパイン(棘突起と呼ぶ場合がある)と呼ばれる突起が発生することが知られている。
スパインの形態を示す図が図1の(2)に示されている。このように、スパインは、数ミクロン程度の小さな突起であり、単一の神経に対しておよそ1万個程度あることが知られている。また、密度は、1スパイン/1μm程度である。
このスパインは、本願発明者らの研究によって、記憶に関して重要な働きをしていることが判明しており、その発生の様子を観察することは、記憶のメカニズムを探る上で極めて重要な事項となっている。ところが、このスパインは、1個の神経細胞あたり1万個程度存在し、スパインの形態を画像データから人手で解析するのは極めて繁雑な作業が必要であった。
本実施の形態では、神経細胞の形態を効率的に求めることができる手法を説明する。特に、樹状突起の形態、スパインの形態、を含む神経細胞の形態を効率的に求める手法を説明する。
2.スパインの形態
図3には、種々のスパインの形態を説明する図が示されている。この図に示すように、スパインは、thin、stubby、mushroom、filopodium、の4種類の形態が知られている。
図3には、種々のスパインの形態を説明する図が示されている。この図に示すように、スパインは、thin、stubby、mushroom、filopodium、の4種類の形態が知られている。
図4には、ストレス・ステロイド作用に伴うスパインの数の変化(密度の変化)の説明図が示されている。この図のグラフにおいて、黒はmushroom、斜線はthin、白はfilopodium、縦縞はstubbyの密度の変化をそれぞれ表す。
このように、ストレスを加えることによって、スパインの数(密度)が変化することが知られている。
3.従来のスパイン解析
現在、神経細胞の形態を調べる標準的な手法は、神経細胞の画像データから、手作業によって神経細胞の形態、特にスパインの個数等を求める手法である。典型的には、Neurolucida(商品名)という名のプログラムを用いて神経細胞の画像解析を行う。 この画像解析の様子が図5に示されている。図5(1)は、共焦点顕微鏡で得られた原画像である。この原画像に対して、操作者が目視でスパインの位置を決定し、スパインの柱部の長さと太さを決定していた。この様子が図5(2)の写真に示されている。
現在、神経細胞の形態を調べる標準的な手法は、神経細胞の画像データから、手作業によって神経細胞の形態、特にスパインの個数等を求める手法である。典型的には、Neurolucida(商品名)という名のプログラムを用いて神経細胞の画像解析を行う。 この画像解析の様子が図5に示されている。図5(1)は、共焦点顕微鏡で得られた原画像である。この原画像に対して、操作者が目視でスパインの位置を決定し、スパインの柱部の長さと太さを決定していた。この様子が図5(2)の写真に示されている。
しかしながら、スパインは、簡略化すれば、概ね、頭部(ヘッド)と、頭部と樹状突起を結ぶ柱部と、から構成されていることが知られている(図5(3)参照)。
望ましくはこの図5(3)に示すように、楕円体である頭部の幅w1、w2と、同じく頭部の長さ(楕円体の長辺)tと、柱部の長さhと、この柱部と樹状突起とのなす角度θlと、を各スパイン毎に求めることが好ましい。
上記従来の手法では、長さtと、幅w(w1とw2の平均値と考えられる値)しか判定できなかった。また、頭部の楕円体のパラメータ(従来の場合はw、t)を得るまで、計算をやり直す必要があり、操作者の操作労力が過大なものとなりがちであった。また、手作業の割合が多いため、膨大なデータには対応が困難であるという問題点もあった。
本実施の形態では、これらのパラメータの内、w1、w2、t、hを自動的に算出する例を示す。
4.本実施の形態における基本アルゴリズムとその特徴
本実施の形態においては、共焦点顕微鏡にて撮影したの画像(例えば1024ドット×1024ドット)を複数画面(例えば、20面−30面)用意し、3次元画像データを構成している。
本実施の形態においては、共焦点顕微鏡にて撮影したの画像(例えば1024ドット×1024ドット)を複数画面(例えば、20面−30面)用意し、3次元画像データを構成している。
これら3次元画像データを入力し、神経細胞の形態を迅速に得ることができる方法を提案する。本実施の形態における方法は、以下の3個の特徴的なステップを含むものである。この3ステップの概念図が図6に示されている。
(ステップ1)
樹状突起のトレース:スケールスペース法を用いて樹状突起のトレースを行う。この際、σコンボリューションぼかしを利用して凹凸を減らし、樹状突起の中心線を同定する。このステップ1の概念図が図6のステップ(1)に示されている。
樹状突起のトレース:スケールスペース法を用いて樹状突起のトレースを行う。この際、σコンボリューションぼかしを利用して凹凸を減らし、樹状突起の中心線を同定する。このステップ1の概念図が図6のステップ(1)に示されている。
(ステップ2)
スパイン位置の検出:ヘステンソル法を用いて負の曲率を探す。負の曲率となる部分が、ラグビーボール状の「頭部」に相当すると考えられるので、全ての座標軸で負の曲率となる部分を「頭部」であると判断する。本ステップ(2)におけるスパイン位置とは、この「頭部」の位置である。このステップ2の概念図が図6のステップ(2)に示されている。
スパイン位置の検出:ヘステンソル法を用いて負の曲率を探す。負の曲率となる部分が、ラグビーボール状の「頭部」に相当すると考えられるので、全ての座標軸で負の曲率となる部分を「頭部」であると判断する。本ステップ(2)におけるスパイン位置とは、この「頭部」の位置である。このステップ2の概念図が図6のステップ(2)に示されている。
(ステップ3)
スパインの頭部は、楕円体(三軸不等楕円体)で近似できると考えられるので、楕円体と見なして近似を行う。これによって、短径、中径及び長径をそれぞれ算出する。なお、主軸方向の径の内、最も長い径を長径(t)と呼び、2番目に長い径を中径(w2)、最も短い径を短径(w1)と呼ぶ。図5の(3)を参照されたい。
スパインの頭部は、楕円体(三軸不等楕円体)で近似できると考えられるので、楕円体と見なして近似を行う。これによって、短径、中径及び長径をそれぞれ算出する。なお、主軸方向の径の内、最も長い径を長径(t)と呼び、2番目に長い径を中径(w2)、最も短い径を短径(w1)と呼ぶ。図5の(3)を参照されたい。
また、スパインの柱部は、スパインからそのスパインに最も近い樹状突起に垂線を降ろすことによって、その垂線を柱部と認定する。このステップ3の概念図が図6のステップ(3)に示されている。
このようにして得られた樹状突起と、スパイン頭部及び柱部とを合わせて最終的な神経細胞の形態が得られる。
以下、本実施の形態の神経細胞解析方法の動作を、上記各特徴的なステップの動作原理を中心に説明する。
4−1. ステップ1:樹状突起のトレース
4−1−1.σコンボリューション
本実施の形態においては、スケール・スペースを用いて尺度非依存的な解析法を採用している。すなわち、対象物の大きさにあったスケールσを選択している。例えば、樹状突起をトレースする場合には、スケールσ=0.2−5.0μmの範囲で設定する。また、もしスパインが対象である場合には、σ=0.1−0.3μmの範囲で設定する。この結果、このスケールσより小さい凸凹構造を「σコンボリューション」でぼかしてノイズを除去するのである。
4−1−1.σコンボリューション
本実施の形態においては、スケール・スペースを用いて尺度非依存的な解析法を採用している。すなわち、対象物の大きさにあったスケールσを選択している。例えば、樹状突起をトレースする場合には、スケールσ=0.2−5.0μmの範囲で設定する。また、もしスパインが対象である場合には、σ=0.1−0.3μmの範囲で設定する。この結果、このスケールσより小さい凸凹構造を「σコンボリューション」でぼかしてノイズを除去するのである。
本ステップ1では、樹状突起のトレースを行うので、スケールσ=0.2−5.0μmに設定している。
このσコンボリューションの式は、以下の通りである。
ここで、Iは、画像を構成する各画素の輝度であり、K(σ)とのコンボリューションを取ることによって、ぼかしを与えている。K(σ)の式は上記式の通りである。ここで、Nは、正規化のための定数であって、カーネル関数K(σ)を空間全体で積分した結果が1となる用に定めた数である。例えば、2次元の場合は、N=1/(2πσ2)である。
なお、上記数1では、x軸方向のみが記されているが、同様の処理をy軸、z軸についても行う。
このσコンボリューションによるノイズ除去の様子が図7に示されている。図7(1)は、原画像データであり、図7(2)は、σ=0.5μmに設定した場合のσコンボリューションの結果である。図7(3)は、σ=1.0μmに設定した場合のσコンボリューションの結果である。図7(4)は、σ=2.0μmに設定した場合のσコンボリューションの結果である。本実施の形態においては、まず、神経細胞の樹状突起をトレースするためにノイズ除去をするので、σ=0.2μm−5.0μmの範囲でσを設定している。
実際には、σの値は、0.2μm−5.0μmの範囲でステップ的に変化させて複数のぼかし画像を作成する。例えば、σ=0.5μm、σ=0.6μm、σ=0.7μm、・・・のようにσを変化させて各σ毎にぼかし画像を生成する。後述する実施例では、より詳細なぼかし画像群の生成動作を説明している。
なお、ぼかし画像群は2種類作成している。第1に、上述した樹状突起をトレースするためのぼかし画像群である。第2に、スパイン頭部を検出するためのぼかし画像群である。
このスパイン頭部を検出するための第2のぼかし画像群は、変化させるσの値の範囲が0.1−0.3μmであることのみが異なり、その他は樹状突起用の第1のぼかし画像群と同様にして作成する。
4−1−2. 中心度変換
上記スケールスペース変換(σコンボリューション)でノイズ除去をした後、中心度変換を行って樹状突起のトレース、及びスパイン頭部の検出を行う。
上記スケールスペース変換(σコンボリューション)でノイズ除去をした後、中心度変換を行って樹状突起のトレース、及びスパイン頭部の検出を行う。
樹状突起のトレースの場合は、境界面の存在度を中心度として用いている。一方、スパイン頭部の検出の場合は、中心度としてヘステンソルの固有値の積を用いている。以下、樹状突起のトレースについて説明する。スパイン頭部の中心度の算出は、次節4−2において説明する。
樹状突起のトレース
まず、スケールスペース変換後のぼかし画像群の各画像に対して、各画素のヘステンソルを求め、その固有ベクトルを求める。この固有ベクトルの内、最小の固有値(負の値)に属するベクトルの方向(両側)に上述したσだけ「進んだ」位置(画素)の輝度の第1の勾配ベクトルを求める。同様にσだけ「後退した」位置(画素)の輝度の第2の勾配ベクトルを求める。
まず、スケールスペース変換後のぼかし画像群の各画像に対して、各画素のヘステンソルを求め、その固有ベクトルを求める。この固有ベクトルの内、最小の固有値(負の値)に属するベクトルの方向(両側)に上述したσだけ「進んだ」位置(画素)の輝度の第1の勾配ベクトルを求める。同様にσだけ「後退した」位置(画素)の輝度の第2の勾配ベクトルを求める。
そして、上記第1の勾配ベクトルと、上記固有ベクトルを正規化したベクトルと、の内積を求める。この値に−1を掛けたものを「第1のスケールσでの境界度」と呼ぶ。同様に、上記第2の勾配ベクトルと、上記固有ベクトルを正規化したベクトルと、の内積を求める。この値を「第2のスケールσでの境界度」と呼ぶ。
そして、「第1のスケールσでの境界度」と「第2のスケールσでの境界度」とのいずれか小さい方(正の値)をその画素における「中心度」とする。
この中心度は、境界面の存在度を表す尺度であり、境界面とは、対象物すなわち樹状突起の表面を言う。
さて、この中心度の輝度(値)が極大となる位置をトレースしていけば、樹状突起の幹線(中心線)と幅(太さ)をトレースすることができる。なお、幅(太さ)は、極大中心度を与えるスケールσの値である。
この中心度の画像が図8に示されている。図8(1)は、原画像データであり、図8(2)は、σ=0.5μmの場合に、各画素について求めた中心度の画像(中心度画像と呼ぶ)である。同様に、図8(2)は、σ=1.5μmの場合に、各画素について求めた中心度画像である。同様に、図8(3)は、σ=1.5μmの場合に、各画素について求めた中心度画像である。図8(4)は、σ=2.0μmの場合に、各画素について求めた中心度画像である。
このように、複数のぼかし画像群のそれぞれに対して、中心度画像をそれぞれ求める。
これらの図において、中心度が大きい値の画素(明るい画素)は、半径σのシリンダ図形がその画素を通っていることを示している。
すなわち、図8(2)−図8(4)の画像中、明るさの極大値をトレースした線が、樹状突起の中心線である。そして、その中心線を中心として半径σのシリンダ図形がその画素を通っていることを示している。
さて、シリンダ図形とは、簡単に言えば、円錐を所定の断面で切断した図形モデルであるが、詳しくは後述する。本実施の形態では、樹状突起をこのシリンダ図形を連結させることによって表現(近似)している。実際にシリンダ図形を連結させて樹状突起を表現した例を図9に示す。
本実施の形態においては、エネルギー関数として、中心度(medialness)と歪みとの和から成るエネルギー関数を定義し、このエネルギー最小問題を解くことによって実際の樹状突起にフィットさせている。
なお、フィット(又はフィッティング)とは、簡単に言えば近似することを言う。より詳細に言えば、「現実に存在する図形に、理想的な基本図形を対応させること」を意味する。また、「誤差を最小とするような、対応する基本図形を与える」ことでもある。
さて、本実施の形態におけるエネルギー関数の式を以下に示す。
スネークとは、位置、太さ、接続情報からなる節点(スナクセル)の集合である。ここで、接続情報とは、ある節点が他のどの節点とつながっているかを示す情報である。位置と太さを空間的パラメータと呼び、接続情報を位相的パラメータと呼ぶ。本実施の形態においては、接続情報は、近接する高々二つの節点と自動的に接続することで作成するので、フィッティングは空間的パラメータについてのみ行う。
空間的パラメータは位置(三次元)と太さ(一次元)の複合体なので、四次元の空間で考えるのが妥当である。そして、この四次元空間がスケールスペース(尺度空間)である。中心度を求めることは、この四次元空間内に「線図形の存在し得る度合い」をプロットすることに相当する。
上記式中、Eext(i) は、i番目の節点の位置と太さにおける中心度の符号を反転させたものである。この値が小さいということは、その節点のパラメータが指定する位置に、指定された太さの直線図形が通っていることを意味する。次に、Eint(i)は、i番目の節点の内部エネルギーを表す。これは、スネークを必要以上に曲げないようにするためのエネルギーで、この節点におけるスネークの曲率を用いる。この値が小さいということは、その節点においてスネークが直線的であることを意味する。αは分配定数で、フィッティングの最中には変化しない。αが大きい場合には中心度エネルギーの方を重視し、αが小さい場合には内部エネルギーの方を重視してフィッティングを行う。
Eext(i)は、上で述べたように、i番目の節点の位置、太さにおける中心度(但し符号は反転)である。スネークを必要以上に曲げないという拘束条件下で、この符号反転した中心度(エネルギー)を最小化することで、スケールスペース中の中心度の高い部分を通過するスネークを求めることができる。これがスネークのフィッティングである。フィッティングにおける変化パラメータは、空間的パラメータ(節点の位置と太さ)である。
中心度変換の変形例
樹状突起上のスパインが比較的大きい場合に、上で述べた中心度変換を行うと、スパインも棘として残ってしまうのでトレースが困難になる場合がある。そこで、従来から使用されているいわゆる「はぎ取り法」を用いて中心線を得ることも好ましい。
樹状突起上のスパインが比較的大きい場合に、上で述べた中心度変換を行うと、スパインも棘として残ってしまうのでトレースが困難になる場合がある。そこで、従来から使用されているいわゆる「はぎ取り法」を用いて中心線を得ることも好ましい。
はぎ取り法の説明図が図10に示されている。
はぎ取り法は、物体の中心線を求める手法の一つであり、物体を構成する点(画素)を外側から1画素ずつ削り取って中心線を残す方法である。このはぎ取り法を適用した例が図10に示されている。図10(1)は原画像データである。この原画像データを2値化し、その後、外周部から1画素ずつ画素を削り取っていく。その結果が図10(2)に示されている。
このはぎ取り法は、以下のような欠点が知られている。
(1)境界の凹凸が棘として残り、自動トレースが失敗する場合がある。
(2)はぎ取り結果が、スケールに依存してしまう。
しかし、本実施の形態では、スケールスペース法を用いてσコンボリューションによるぼかしを行っているので、中心度変換にこのはぎ取り法を用いても良好なトレースができる可能性が高い。
はぎ取り法による中心度変換では、得られた中心線に相当する画素に、例えば最大輝度の「255」等が代入され、それ以外の画素には最小値である「0」が代入される。これらの値は、正負値を用いて、「127」と「−128」とを採用しても良い。
4−2.ステップ2:スパイン位置の検出
4−2−1. スパイン頭部の位置
次にスケールσ=0.2μmで対角化したヘス・テンソルが3次元で負の固有値を示す位置を求めることによって、球状の部分とその中心を検出する。この球状の部分を検出することは、スパイン頭部の候補を抽出することに他ならない。
4−2−1. スパイン頭部の位置
次にスケールσ=0.2μmで対角化したヘス・テンソルが3次元で負の固有値を示す位置を求めることによって、球状の部分とその中心を検出する。この球状の部分を検出することは、スパイン頭部の候補を抽出することに他ならない。
なお、スケールσ=0.2μmで対角化とは、スケールσ= 0.2μmでぼかし変換を行った後に、求めたヘステンソルを対角化することを意味する。
さて、画像とは、空間の各点に輝度を対応付ける写像である。ヘステンソル(Hessian tensor)は、この輝度分布の二階微分であり、局所的な曲率を表す。
したがって、3次元画像中の負の曲率が、球状に盛り上がったスパインに対応する。本実施の形態では、このことに着目し、ヘステンソルを用いてスパインの存在領域を検出している。
ところで、一般に、ディジタル信号の微分は、差分に置き換えて計算する。例えば、分点公式などを使うのが一般的である。本実施の形態においてもそのような従来の手法を採用することも好ましい。
但し、本実施の形態においては、畳み込み積分の形で書けるぼかし変換を行っているので、画像への微分演算が、畳み込みカーネルへの微分演算に帰着する。すなわち、最初に微分したカーネル関数を用意し、これを畳み込み積分することで、ぼかし変換と微分を同時に行っている。この結果、演算量を節約でき、神経細胞の形態を迅速に求めることが可能となる。
ヘステンソルの式は、以下の通りである。
このようにして求めた固有値λ1、λ2、λ3から、その部分(画素)の曲率が判明する。球状図形の場合は、全ての固有値λ1、λ2、λ3が負であるので、その条件に合致するものだけを取り出して新たな画像を生成する。
すなわち、全ての固有値が負であるものは、その固有値の絶対値(−λ1・λ2・λ3)を画素の値として代入し、それ以外の画素に0を代入した新たな画像を生成する。この画像は、スパイン位置を検出するための中心度画像である。
中心度が0の画素は、そこがスパインの領域ではないことを意味し、中心度が非0の画素は、そこがスパインの存在する領域であることを意味する。
本実施の形態において特徴的なことは、スパイン位置の検出(存在する領域の検出と、スパイン頭部の中心位置の検出)のために、ヘステンソルの固有値の積を中心度として用いていることである。
このようにして、3次元で負の固有値を示す位置(画素)を求めることによって、スパインの頭部に相当する球状の部分(頭部が存在する領域)を求めることができる。また、固有値の積の絶対値のピーク位置からそのスパイン頭部の中心位置を検出することができる。
本実施の形態において特徴的なことは、スパイン頭部の検出において用いた「中心度変換」であり、特に、ヘステンソルの固有値の積を「中心度」として用いていることが大きな特徴である。
なお、スパイン頭部の「中心位置」は、上で述べたように、ピーク値すなわち固有値の積λ1・λ2・λ3の絶対値の極大値を与える点(画素)である。この様子が図11に示されている。図11(1)は原画像データであり、図11(2)は、固有値の積λ1・λ2・λ3の値を示す画像データが示されている。また、図11(2)においては、固有値の積λ1・λ2・λ3の極大値を取る位置が矢印で示されている。
さて、このようにして得られた球状の部分(固有値の値が全て負の画素)がスパインの頭部の候補となる。3次元画像中の負の曲率が球状のスパインの頭部に由来すると考えられるからである。
ところで、本実施の形態においては、候補を選択する際に、演算の適応範囲を先にフィットした樹状突起の周辺に限定している。このような限定を行うことで、擬陽性12の候補を除去している。この様子が図12に示されている。図12に示すように、本実施の形態では、候補の中心位置(上述したピーク値を与える点(画素))が樹状突起から距離8μm以上離れたものは、ゴミ10と見なしてスパイン頭部の候補から除外している。
なお、ヘステンソルの固有ベクトルは球状の部分を楕円体と考えた場合の主軸を示す。
4−2−2. スパイン頭部及び柱部の詳細な検出
次に、スパインの形態を詳細に解析するため、頭部を楕円体で近似して、その大きさのパラメータを取得する。スパイン頭部に対して、主軸の向きと各軸まわりの慣性モーメント解析から最も妥当な楕円体を得る。なお、主軸は、検出されたスパイン頭部の輝度中心における固有ベクトルの方向である。
次に、スパインの形態を詳細に解析するため、頭部を楕円体で近似して、その大きさのパラメータを取得する。スパイン頭部に対して、主軸の向きと各軸まわりの慣性モーメント解析から最も妥当な楕円体を得る。なお、主軸は、検出されたスパイン頭部の輝度中心における固有ベクトルの方向である。
このようにして得られた楕円体のパラメータによって、図5で説明したようにw1、w2、tが求められる。
なお、「主軸」とは、「二次曲面の主軸」のことであり、直感的には、「図形の最も特徴的な方向を指す直交軸」である。例えば、ラグビーボールのような図形の場合、一番長い方向と、それに直交する平面を張る二つの方向が主軸(合計3本)である。
二次元図形の場合には主軸は二本存在するが、三次元図形(実際のスパインの場合)では三本存在する。ちなみに、楕円体も二次曲面の一つである。
主軸の説明図が図13に示されている。この図においては、一方の矢印が楕円の長軸、他方が短軸を表している。なお、図13は平面であるので、便宜上、2本の主軸しか示していないが、実際のスパインでは主軸は3本存在する。ヘステンソルを対角化する基底は、この主軸と一致する。
また、主軸の方向に存在する境界面の位置を調べ、その条件で楕円体でフィットする手法も好適である。境界面とは対象物の表面を言い、ここではスパインの頭部の表面を言う。
境界面の位置を調べるとは、元図形に存在した境界面の位置を推定するため、画像(元図形が光学的ボケなどによって劣化したもの)の一階微分と、任意の方向ベクトルoとの内積を取り、この値が大きい所を「oに直交する境界面が存在する場所」とすることである。
この説明図が図14に示されている。この図14において、画像の一階微分−ΔIと、方向ベクトル(o1、o2)が示されている。また、両者の内積の大きさ(b1、b2)が記載されている。この図14の場合は、b1の大きさの方がb2より大きいので、実線のような境界が存在することが判明する。
なお、本特許では、楕円体とは、もちろん回転楕円体だけでなく、三軸不等楕円体も含む意である(図5参照)。
また、スパインの根元、すなわち、柱部が樹状突起と接続する部位は、蛍光が弱く特定することが困難な場合も多い。したがって、本実施の形態では、上述したように、スパインの頭部(中心位置)と樹状突起との最短距離を求めて、これをスパインの柱部と見なしている。このようにして得られた最短距離は、柱部の長さ、すなわちhとなる(図5参照)。
4−3.
以上のようにして求めたスパイン頭部とその柱部、及び、樹状突起、を合成し、最終的な神経細胞の形態が得られる。
以上のようにして求めたスパイン頭部とその柱部、及び、樹状突起、を合成し、最終的な神経細胞の形態が得られる。
本実施の形態によれば、神経細胞の形態をスパインまで含めた形で得ることができるので、神経活動の研究、疾病の診断等の効率化に大きく資するものである。
「実施例1」
「実施例1」
5.実施例1:神経細胞形態自動高速解析プログラム
以上述べたような動作を、本願発明者らは、コンピュータ上のプログラムで実現し、その処理能力を実際に調べた。
以上述べたような動作を、本願発明者らは、コンピュータ上のプログラムで実現し、その処理能力を実際に調べた。
処理対象としては、1個の海馬をスライスしたものに、適宜薬物刺激を与えたものを用いた。このスライスを共焦点顕微鏡を用いて撮影した。その際、蛍光色素をインジェクションしておいた。
撮影の解像度は、1024×1024ドットで、画素あたりのビット数は8ビットであり、256階調の輝度を記録した画像データを得た。画素の間隔(画素の大きさ)は、0.043μmである。このような画像データを深さ方向(z方向)に0.45μmずつ変化させて30枚撮影した(図2参照)。
このようにして、1024×1024ドット(1画素8ビット)の画像データを深さ方向に30枚得た。これら画像群が、「3次元画像データ」である。
この3次元画像データ(30枚の画像データ)を、コンピュータに供給し、この3次元画像データに対して、本実施の形態で本願発明者らが作成したプログラムを適用し、神経の形態を出力させた。
本実施例におけるコンピュータの動作(プログラムの動作)を表すフローチャートが図15に示されている。
5−1.z軸MIP画像の作成
まず、図15のステップS15−1に示すように、上記入力した3次元画像データに基づき、z軸MIP画像を作成する。ここで、z軸MIP画像とは、所与の断層画像をz軸方向に投影してできる二次元画像で、その各点の輝度が、投影線上に並ぶ画素の最大輝度となるような画像のことである。MIPは、Max Intensity Projection(最大輝度投影)の略である。
まず、図15のステップS15−1に示すように、上記入力した3次元画像データに基づき、z軸MIP画像を作成する。ここで、z軸MIP画像とは、所与の断層画像をz軸方向に投影してできる二次元画像で、その各点の輝度が、投影線上に並ぶ画素の最大輝度となるような画像のことである。MIPは、Max Intensity Projection(最大輝度投影)の略である。
z軸MIP画像の概念図が図16に示されている。この図に示すように、30枚の画像データの同一の位置にある画素を取り出し(すなわち、30枚分の30画素)、その中から最も輝度の高い値を取り出し、その値を、z軸MIP画像の対応する位置の画素に代入する。すなわち、z軸MIP画像は、z軸上に並ぶ複数の画像から最大輝度の値を取り出して新たに作成した画像である。
なお、本実施例では、コンピュータの演算量を減少させるために3次元画像データを、2次元に投影してz軸MIP画像を作成しているが、原理的には、3次元画像データのまま処理をすることももちろん好ましい。
5−2.z軸MIP画像を段階的にぼかす(スケールスペース変換)
次に、図15のステップS15−2に示すように、z軸MIP画像を段階的にぼかした画像を作成する。具体的には、z軸MIP画像に対して上述したスケールスペース変換を適用する。この際、σの値を段階的に変化させて段階的にぼかした複数の画像群を作成する。例えば、σ=0.2μm、σ=0.3μm・・・などのように段階的なスケールσを用いて複数の画像群を作成する。
次に、図15のステップS15−2に示すように、z軸MIP画像を段階的にぼかした画像を作成する。具体的には、z軸MIP画像に対して上述したスケールスペース変換を適用する。この際、σの値を段階的に変化させて段階的にぼかした複数の画像群を作成する。例えば、σ=0.2μm、σ=0.3μm・・・などのように段階的なスケールσを用いて複数の画像群を作成する。
例えば、σの値を、0.2μmから5.0μmまで、0.1μmステップで変化させて、計49段階の画像群を作成する。これらの複数段階の画像群を、「ステップぼかし画像群」と呼ぶ。
5−3.各スケールの画像について中心度の計算を行う
次に、図15のステップS15−3に示すように、上記ステップぼかし画像群に基づき、中心度の計算を行う。
次に、図15のステップS15−3に示すように、上記ステップぼかし画像群に基づき、中心度の計算を行う。
まず、樹状突起を抽出するためには、境界線の存在度を中心度として用いる。中心度は、各画素毎に求める。そして、各画素毎にこの中心度の値を代入した画像を作成する。この画像を「中心度画像」と呼ぶ。
このような計算を、上記複数のステップぼかし画像群の各画像について行い、複数の「中心度画像」を作成する。
なお、本実施の形態において微分の演算がしばしば出てくるが、この微分は一般には、差分に置き換えて計算する。分点公式などを使うのが普通であり、本実施例でもそのような従来技術を利用することももちろん好ましい。
しかし、本実施例においては、畳み込み積分の形で書けるぼかし変換を行っているので、画像への微分演算が、畳み込みカーネルへの微分演算に帰着する。すなわち、最初に微分したカーネル関数を用意し、これを畳み込み積分することで、ぼかし変換と微分を同時に行っているのである。
この結果、本実施例によれば、コンピュータの演算量を減らすことができ、解析速度の向上を図ることができる。
5−4.中心度画像に対して、σ軸方向の最大中心度スケール投影を行う
次に、図15のステップS15−4に示すように、上記中心度画像に対して、σ軸方向での最大輝度の値を見つける。ここで、最大輝度とは、中心度の最大値を言う。そして、その最大輝度を与えるスケールσの値を取り出し、そのσの値を対応する画素に代入した「最大中心度スケール画像」を求める。
次に、図15のステップS15−4に示すように、上記中心度画像に対して、σ軸方向での最大輝度の値を見つける。ここで、最大輝度とは、中心度の最大値を言う。そして、その最大輝度を与えるスケールσの値を取り出し、そのσの値を対応する画素に代入した「最大中心度スケール画像」を求める。
上述したように、σの値を変化させた複数のステップぼかし画像群(例えば20枚)に対して、中心度画像がそれぞれ求められている。したがって、複数枚(例えば20枚)の中心度画像群が得られるので、それらの画像郡から同じ位置の画素であって最大輝度(最大中心度)の画素を求め、その最大輝度の値を与えるスケールσを、画素に代入した新たな画像を形成する。
この画像は、いわばσ軸上で最大輝度(最大中心度)の画素の位置(すなわちσの値)を代入した画像である。この画像を「最大中心度スケール画像」と呼ぶ。
したがって、作成した投影画像(最大中心度スケール画像)の各点の値は、σ=0.3μm、σ= 0.5μm、・・・のようになり、この値は、中心度が最も大きかったスケールσの位置を表す。
5−5.スネークを動かし、エネルギー極小となる位置を探す
次に、図15のステップS15−5に示すように、このようにして得られた最大中心度スケール画像中でスネークを動かし、エネルギー極小となる位置を探す。
次に、図15のステップS15−5に示すように、このようにして得られた最大中心度スケール画像中でスネークを動かし、エネルギー極小となる位置を探す。
さて、ここでは、スネークを複数のシリンダ図形を連結させて、太さが一様でない線図形としたものとして取り扱う。ここで、シリンダ図形とは、切頂円錐(truncated circular cone)」である。すなわち、任意の円錐を平面で切断して、頂点を含む部分を除去した図形をシリンダ図形と呼ぶ。このように、スネークとは、シリンダ図形によって構成されたものとして扱うのが便利である。
上述した最大中心度スケール画像中に存在する輝度の谷線(cleft line)を検出する。これによりスネークの空間パラメータの内、xy成分のフィッティングと太さのフィッティングが完了する。
5−6.スネークの調整
次に、図15のステップS15−6に示すように、完成したスネークを元の三次元断層画像中に戻し、z軸成分のフィッティングと太さの修正を行う。
次に、図15のステップS15−6に示すように、完成したスネークを元の三次元断層画像中に戻し、z軸成分のフィッティングと太さの修正を行う。
5−7.スパイン頭部の検出
上述のようにスネークを構成し、適宜調整することによって、樹状突起の形態の検出ができた。次に、上記ステップ5−4で最大中心度スケール画像から、樹状突起の「樹状」の部分が得られるので、この樹状の部分を除いた残りの画像中にスパインがあるはずである。したがってこの残存部分の画像中から、図15のステップS15−7に示すようにスパイン頭部の検出を行う。
上述のようにスネークを構成し、適宜調整することによって、樹状突起の形態の検出ができた。次に、上記ステップ5−4で最大中心度スケール画像から、樹状突起の「樹状」の部分が得られるので、この樹状の部分を除いた残りの画像中にスパインがあるはずである。したがってこの残存部分の画像中から、図15のステップS15−7に示すようにスパイン頭部の検出を行う。
まず、上記5−4(図15のステップS15−4)の処理後、ヘステンソルの固有値の積を求めて、ピーク位置の抽出を行い、これをスパイン頭部(の中心位置)とする。
上述したように、このような処理は、「樹状」部分以外の領域に対して行う。
そして、この中心位置を含むような楕円体であって、スパイン頭部との誤差を最小にするような楕円体を構成(すなわち近似)し、この楕円体をスパイン頭部と認定する。
また、スパイン頭部の中心位置から樹状突起へ垂線を降ろし、スパインの柱部を構成する。この垂線(柱部)の長さを調べることによって、柱部の長さ(h)を知ることができる。
このようにして得られたスパイン頭部(及び柱部)を先に抽出した樹状突起(すなわちスネーク)と合わせて神経細胞の形態の検出が完了する(ステップS15−8)。
本実施例では、以上のようにして、神経細胞の形態の検出を行っているので、スパインの形状を含む神経細胞の形状を効率よく観察することができる。
5−8.変形例
なお、本実施例では、途中で二次元に投影しているが、これはコンピュータにおける処理時間を削減するためであり、理論的には、三次元のまま計算することももちろん好ましい。その場合は、例えば上記中心度画像は四次元(たて・横・高さ・スケール)の画像になる。
「実施例2」
なお、本実施例では、途中で二次元に投影しているが、これはコンピュータにおける処理時間を削減するためであり、理論的には、三次元のまま計算することももちろん好ましい。その場合は、例えば上記中心度画像は四次元(たて・横・高さ・スケール)の画像になる。
「実施例2」
6.実施例2:改良された神経細胞解析方法
6−1.背景
上述した実施例1では、樹状突起のトレース(4−1−2.)の際にスネーク(関数)を用いている(数2)が、計算量が過大になりがちであり、計算が長時間に渡ってしまう場合もある。特に、細かい構造が多数存在する場合に、それらを全て正確に求めるのには、膨大な時間がかかる場合もある。上記5−5.で述べたようにスネークを動かしてエネルギー最小の位置を探す作業は計算量が非常に大きなものとなる傾向にある。その結果、診断に支障が出る恐れも想定される。
6−1.背景
上述した実施例1では、樹状突起のトレース(4−1−2.)の際にスネーク(関数)を用いている(数2)が、計算量が過大になりがちであり、計算が長時間に渡ってしまう場合もある。特に、細かい構造が多数存在する場合に、それらを全て正確に求めるのには、膨大な時間がかかる場合もある。上記5−5.で述べたようにスネークを動かしてエネルギー最小の位置を探す作業は計算量が非常に大きなものとなる傾向にある。その結果、診断に支障が出る恐れも想定される。
そこで、より迅速に樹状突起のトレース等の演算を行うための改良された手法を以下実施例2として提案する。
6−2.原理
本実施例2で提案する方法は、スケールスペース法とfacet(切子)モデルとを組み合わせて、画像中から線状図形を検出する方法である。Facet モデルとは、ピクセルの大きさよりも微細な構造について論じるための枠組みであり、各ピクセルの内部を多項式で近似して、その集合として画像を捉えることを特徴とする。
本実施例2で提案する方法は、スケールスペース法とfacet(切子)モデルとを組み合わせて、画像中から線状図形を検出する方法である。Facet モデルとは、ピクセルの大きさよりも微細な構造について論じるための枠組みであり、各ピクセルの内部を多項式で近似して、その集合として画像を捉えることを特徴とする。
ただし、直感的な理解を助けるため、一階微分と二階微分を標準基底で表示し、それぞれgrad f、H と表した。ここで、さらに二階微分テンソル(ヘステンソル)の対角化基底を取って表示すると、上式(数7)はさらに簡略化されて、
と表すことができる。ここで、
は、ヘステンソルの二つの固有値のうち、大きいほうと小さいほうをそれぞれ表しており、
は対応する方向の微分係数を表す。今、注目しているピクセルの上を線状図形が通過しているとき、その図形の大きさを十分に捉えうるスケールのもとで、ヘステンソルの固有値は一方が大きな負の値を取り、他方が0に近い値を取る。この時、小さい方の固有値(負の固有値)に属する固有ベクトルは線状図形の法線方向を示し、法線方向の主軸と呼ばれる。これに対し、大きい方の固有値に属する固有ベクトルは接線方向を示すので、接線方向の主軸と呼ばれる。もし、ピクセルが図形の中心線上にあるならば、そこは尾根状になっているはずであるので、法線方向で極値を取らなければならない。すなわち、
の直線上で
を解いて、極値の位置
を得るが、この変位
が注目するピクセル内に存在しなくてはならない。したがって、定義域のすべての点について上記の変位を求め、それがピクセル内に含まれるか調べることで、その点が中心線上にありうるかどうか判別することができる。
6.3 処理フロー
以下、具体的な処理の流れをフローチャートに基づき説明する。図16には実施例2に係る動作を表すフローチャートが示されている。この処理フローは、樹状突起のトレースの処理フローであり、上述した4−1−2.の「樹状突起のトレース」で説明した処理に代わる処理であり、具体的には、5−1.から5−5.にいたる処理の変形例と考えることができる。
以下、具体的な処理の流れをフローチャートに基づき説明する。図16には実施例2に係る動作を表すフローチャートが示されている。この処理フローは、樹状突起のトレースの処理フローであり、上述した4−1−2.の「樹状突起のトレース」で説明した処理に代わる処理であり、具体的には、5−1.から5−5.にいたる処理の変形例と考えることができる。
まず、ステップS16−1においては、最適なスケールの選択を行う。スケールの選択方法については後に詳述する。
次に、ステップS16−2において、MIP(Max Intensity Projection)画像を作成する。
ステップS16−6においては、中心度がゼロでない点で、その上を通る線状図形の直径を求める。直径は、以下のサブプロセスによって求めることができる。
(ステップa)注目している点をOとし、そこから法線方向の両側に等距離だけ進んで得られる二点をA、B とする。
ステップS16−7においては、上記ステップS16−5で得られた中心度の画像を走査し、中心度が最大の点を選び出す。さらに、この点から1μm離れた点の中で最大の中心度を持つ点を選び出す。選び出したこれら2点を直線で結んで最初のスネークとする。これを初期スネーク(又は「初期のスネーク」)と呼ぶ。
ステップS16−8においては、(初期)スネークの両端に、新しい端点を順次追加・接続し、スネークを成長させる。ただし、新しい端点は以下の条件により選出される。
(条件a)これまでの端点から新しい端点までの距離は1μm。
(条件b)これまでの端点と新しい端点とを結んだ直線は、伸長前のそれに対して±30度以内の角度をなす。
(条件c)上記(条件a)、(条件b)を満たす点の中で、最大の中心度を持つ点を新しい端点とする。新しい端点をスネークに加える。
(条件d)端点をスネークに加えていき、スネーク(の端点)が画像の境界及び除外領域に到達したら、新しい端点の探索を停止する。画像中で新しい端点となる点を見つけられない場合に停止するのである。スネークの両方の端で探索が停止した場合に、新たな端点の探索は終了し、スネークの成長は完了し、最終的なスネークが作成される。
なお、このようにして見つかった端点は、最終的にはスネークのノード(節点)となり、一番最後に見つかった端点は、スネークの両端の端点となる。
ステップS16−9においては、作成したスネークの各点(ノード、節点)で直径を取得し、スネーク内部の領域を確定する。この内部領域を画像の除外領域に追加する。
ステップS16−10においては、作成したスネークが3つ以上のノードからなり、かつ、全ノードの平均中心度が、これまでに確定した樹状突起のそれの10%以上である場合は、この得られたスネークを樹状突起として確定する。
一方、この条件を満たさない場合は、ここで作成したスネークを破棄してステップS16−7に処理が戻る。この操作は、画像からスネークが取り出せなくなるまで、もしくは最初に決めた回数だけ繰り返して終了する。
以上のようにして樹状突起のトレースを行う。
スケールの選択
上述したように、ステップS16−1におけるスケールの選択方法についてその詳細を述べる。スケール範囲σ=0.1μm?3.0μmで、操作者が自由に値を選べるようにし、操作者が選択した値に対してステップS16−2から、S16−6までを実行する。
上述したように、ステップS16−1におけるスケールの選択方法についてその詳細を述べる。スケール範囲σ=0.1μm?3.0μmで、操作者が自由に値を選べるようにし、操作者が選択した値に対してステップS16−2から、S16−6までを実行する。
ステップS16−6中の(ステップe)で得られた境界度積のピークの高さ(位置ではない)を各点に対してプロットして得られた画像を操作者に対して表示する。
操作者はこの画像を見、この得られた画像が適切に中心線を表していると判断した場合は、ステップS16−7以下の処理が実行される。適切に表していないと判断した場合には、再び別のスケールの選択を行うため、ステップS16−1の処理に移行する。
本実施例2によれば、スネークのフィッティングに代えて、スネークの端点を順次追加して成長させる処理を実行しているため、計算量を減らすことができ、迅速な診断に寄与するものである。
7.その他の変形例・応用例
(1)上述した実施の形態では、神経細胞の解析方法について説明した。しかしながら、この手法は、神経細胞のように線状、樹状の形態を有する他の細胞、組織、器官であればそのまま利用できることは言うまでもない。
(1)上述した実施の形態では、神経細胞の解析方法について説明した。しかしながら、この手法は、神経細胞のように線状、樹状の形態を有する他の細胞、組織、器官であればそのまま利用できることは言うまでもない。
例えば、毛細血管のように網状に形成されている組織に対しても、本実施の形態の手法を応用することが可能である。
特に、本実施の形態の手法によれば、線状の形態の上に、棘状の部位が発生するような場合も、その棘状部位を効率的に解析することが可能である。棘状部位とは典型的にはスパインが挙げられる。
(2)また、本実施の形態では、細胞の形態の3次元画像を入力として用いた。このような3次元画像は、共焦点顕微鏡を用いて容易に撮影することが可能であるが、他の手法・装置で3次元画像を得てもかまわない。例えば、2光子顕微鏡等その他の種々のイメージング装置を利用可能である。
(3)また、上記実施例では、コンピュータにプログラムをインストールし、神経細胞の3次元画像データを、このコンピュータで解析する例を説明したが、このプログラムは、コンピュータのハードディスク等に予めインストールしておくことが好ましい。また、プログラムは、CDROM等に記録しておき、所望のコンピュータに供給することが好適であるが、ネットワークを介してコンピュータにインストールすることも好ましい。
また、入力となる3次元画像データは、一般的な2次元の画像フォーマットの画像を複数枚用いる手法で実現し、コンピュータに供給することが好ましい。もちろん、特定の3次元データ専用のデータフォーマットを適宜作成することも好ましい。
この3次元画像データは、CDROMや各種磁気ディスク、光ディスク、半導体記憶装置に一旦格納してから、コンピュータに供給することが好ましい。また、顕微鏡とコンピュータとを通信回線で接続して、3次元画像データを転送する構成を採用することも好ましい。
(4)また、上記実施例では、汎用的なコンピュータを用いて、神経細胞解析装置を実現したが、専用ハードウェアを用いて神経細胞解析装置を構築することも好ましい。
特に、顕微鏡と一体構造にする場合や、検査装置に組み込む場合には、汎用的なコンピュータにプログラムをインストールする構成よりも、専用の装置を構成した方が便利である場合もある。
Claims (25)
- 線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する方法において、
前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかしステップと、
前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度ステップと、
前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティングステップと、
を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する方法。 - 神経細胞の3次元画像に基づき、神経細胞の形態を解析する方法において、
前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかしステップと、
前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度ステップと、
前記第1の中心度に基づき、神経細胞の樹状突起に近似した図形を求める樹状突起フィッティングステップと、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記第1のぼかしステップは、
前記第1のスケールσの値を変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項3記載の神経細胞解析方法において、
前記第1のぼかしステップは、
前記第1のスケールσの値を0.2μm−5.0μmの範囲で変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記第1の中心度ステップは、境界面の存在度を中心度として求めることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記第1の中心度ステップは、はぎ取り法を用いて中心線を求めることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記樹状突起フィッティングステップは、前記求めた中心度に基づき、スネークを樹状突起にフィッティングさせることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置において、
前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手段と、
前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手段と、
前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手段と、
を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞又は組織又は器官を解析する装置。 - コンピュータを、線状の形態を有する細胞又は組織又は器官である解析対象物の3次元画像に基づき、前記対象物を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、前記コンピュータに、
前記3次元画像に対して、所定の第1のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第1のぼかし手順と、
前記スケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、第1の中心度を求める第1の中心度手順と、
前記第1の中心度に基づき、前記対象物の線状の形態に近似した図形を求める線状形態フィッティング手順と、
を、実行させることを特徴とするプログラム。 - 請求項1記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法において、
前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかしステップと、
前記第2のぼかしステップによるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度ステップと、
前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出ステップと、
を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する方法。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記3次元画像に対して、第1のスケールσとは異なる所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかしステップと、
前記第2のぼかしステップによるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度ステップと、
前記第2の中心度に基づき、神経細胞のスパイン頭部の中心位置を検出するスパイン頭部検出ステップと、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項11記載の神経細胞解析方法において、
前記第2のスケールσの値を0.1μm−0.3μmの範囲で変化させてスケールスペース変換を行い、各スケールσに対する複数のぼかし画像群を生成することを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項11記載の神経細胞解析方法において、
前記スパイン頭部検出ステップは、前記第2の中心度の絶対値がピークを取る位置を、スパインの頭部の中心位置と判断することを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項11記載の神経細胞解析方法において、
前記スパイン頭部検出ステップは、前記樹状突起から所定の距離以内の位置を、スパインの頭部の中心位置と判断することを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項11記載の神経細胞解析方法において、
前記求めたスパイン頭部の中心位置から、最も近い前記樹状突起へ、垂線を降ろし、その垂線をスパインの柱部として求めるスパイン柱部検出ステップ、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項11記載の神経細胞解析方法において、
前記スパイン検出ステップは、ヘステンソルの固有値が全て負である領域をスパインの頭部の存在領域として求めることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項16記載の神経細胞解析方法において、
前記スパイン検出ステップは、前記求めた存在領域を、楕円体で近似し、スパイン頭部の近似図形を求めることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項9記載の線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置において、
前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手段と、
前記第2のぼかし手段によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手段と、
前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手段と、
を含むことを特徴とする線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置。 - 請求項10記載の、コンピュータを、線状の形態を有する細胞・組織又は器官を解析する装置として動作させるプログラムにおいて、
前記3次元画像に対して、所定の第2のスケールσに基づきスケールスペース変換を行う第2のぼかし手順と、
前記第2のぼかし手順によるスケールスペース変換後の前記3次元画像の各画素に対して、ヘステンソルの固有値の積を第2の中心度として求める第2の中心度手順と、
前記第2の中心度に基づき、前記線状の形態の上に存在する棘状部位の検出を行う棘状部位検出手順と、
を実行させることを特徴とするプログラム。 - 請求項2記載の神経細胞解析方法において、
前記樹状突起フィッティングステップは、
前記求めた中心度に基づき、中心度が最大の点を選択する第1選択ステップと、
前記中心度が最大の点から所定距離離れた点の中で、前記中心度が最大の点を選択する第2選択ステップと、
前記選択した2個の点を結び、初期スネークを構成するステップと、
前記構成した初期スネークの端点から所定距離離れた点の中から、最大の中心度を持つ点を選択し、既存の端点と結び、前記スネークを成長させる成長ステップと、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項20記載の神経細胞解析方法において、
前記成長ステップにおいて、
選択する点は、前記既存の端点との距離が所定の距離にある点であることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項20又は21記載の神経細胞解析方法において、
前記成長ステップにおける選択する点を見つけられる場合、前記成長ステップにおける成長を続行し、前記選択する点を見つけられない場合は、前記成長ステップにおける成長を完了する制御ステップ、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項22記載の神経細胞解析方法において、
前記成長ステップにおける選択する点を見つけられる場合とは、前記選択する点を、画像中において既にスネークの内部と認定されている領域を除いた領域から見つけられる場合であることを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項20、21、22、又は23記載の神経細胞解析方法において、
前記成長させたスネークの各ノードで直径を取得し、スネーク内部の領域を確定させる確定ステップ、
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。 - 請求項20、21、22、23、又は24記載の神経細胞解析方法において、
前記成長させたスネークが、
(1)3個以上のノードを有すること、
(2)全ノードの平均中心度が、所定のそれまでに確定した樹状突起の平均中心度の所定の比率以上であること、
の2条件をともに満たす場合に樹状突起として確定し、いずれかの条件を満たさない場合には、そのスネークを破棄し、前記第1選択ステップに戻り、中心度が最大の点を選択する動作を再び開始する繰り返し制御ステップ
を含むことを特徴とする神経細胞解析方法。
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