JPWO2007055362A1 - ポリペプチドの検出又は定量方法、及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
J.Mass Spectrom.1998,33,967−983 Anal.Biochem.1994,222,149−155 J.Chromatogr.B 2002,775,247−255 Pharmaceutical Research 2000,17,1551−1557
(1)OFF相ポリペプチドAを逆相液体クロマトグラフに導入する工程、
(2)(1)で導入したOFF相ポリペプチドAを相転移させる手段により、ON相ポリペプチドAを生成する工程、
(3)(2)で生成したON相ポリペプチドAとカラム充填剤を相互作用させる工程、
(4)(3)で相互作用したON相ポリペプチドAを相転移させ、OFF相ポリペプチドAを生成する工程、
(5)(4)で生成したOFF相ポリペプチドAを溶出する工程、及び
(6)(5)で溶出したポリペプチドAを検出又は定量する工程。
一方で、カラム圧が高い場合に、保持時間の短いポリペプチドが、カラムから早く溶出する場合が存在することが判明した(実施例7及び15)。この原因としては、高いカラム圧によりポリペプチドの高次構造がより小さい臨界値を示す高次構造に変化するためと推察された。
より具体的には、例えば、移動相混合器において、容積比4%の酢酸を含むアセトニトリル−メタノール混合液(容積比1:1)である移動相1と、容積比4%の酢酸水溶液である移動相2を2:8の混合比で混合、攪拌することにより工程(2)を実行することができる(実施例1参照)。
酢酸の添加によって、生体由来試料中のポリペプチドの溶解度が向上する理由は明らかではないが、血漿中のポリペプチドとあるポリペプチドとの相互作用を阻害し、血漿中のポリペプチドとあるポリペプチドとの凝集を阻害することによるものと考えられる。すなわち、酢酸の添加により、インビトロにおいて、同一又は異種のポリペプチド間相互作用を阻害することができ、それらの凝集を阻害することができる。
(1)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第38番目までからなるポリペプチド、
(2)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第40番目までからなるポリペプチド、
(3)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第42番目までからなるポリペプチド、及び
(4)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第43番目までからなるポリペプチド。
添加する酢酸の量は、50%以上が好ましく、有機溶媒と組み合せて使用する場合には、有機溶媒量が、10%以上であり、酢酸の量が50%以上であるのが好ましい。
HPLC用アセトニトリル(関東化学)
HPLC用メタノール(関東化学)
HPLC用エタノール(関東化学)
HPLC用イソプロピルアルコール(2−プロパノール)(関東化学)
カラムクロマトグラム用 酢酸(ナカライテスク)
カラムクロマトグラム用 ギ酸(ナカライテスク)
トリフルオロ酢酸(TFA;ナカライテスク)
ジメチルスルホキシド(DMSO;ナカライテスク)
超純水(低総有機炭素水:Low TOC水)
下記ポリペプチドをペプチド研究所より購入して使用した。
・副腎皮質刺激ホルモンのアミノ酸配列第1番目から第24番目からなるポリペプチド(ACTH(1−24))*
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第16番目からなるポリペプチド
(amyloid β−protein(1−16))*
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第40番目からなるポリペプチド
(amyloid β−protein(1−40))*
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第42番目からなるポリペプチド*
(amyloid β−protein(1−42))*
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第43番目からなるポリペプチド
(amyloid β−protein(1−43))*
・成長ホルモン放出因子(GRF)*
・イソロイシルーセリルーブラジキニン(isoleucyl−seryl−bradykinin)*
・脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP−32)*
・インスリン(insulin)*
・C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP−53)*
・ミッドカインのアミノ酸配列第60番目から第121番目からなるポリペプチド(midkine(60−121))*
・ニューロメジンC(neuromedin C)*
・ニューロペプチドY(NPY)*
・ノシセプチン(nociceptin)*
・オキシトシン(oxytocin)*
・ウロコルチン(urocortin)*
・心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP(1−28))
・ミッドカイン(midkine)
・ラット好中球走化性因子−1(CINC−1/gro)
・副甲状腺ホルモン(PTH(1−84))
下記ポリペプチドをAmerican Peptide Company,Inc.より購入して使用した。
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第28番目からなるポリペプチド
(amyloid β−protein(1−28))*
・βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第38番目からなるポリペプチド
(amyloid β−protein(1−38))*
(*を付されたポリペプチドを、後述の実施例において、18種のポリペプチドと称呼する)
下記ポリペプチドをSigmaより購入して使用した。
・インターフェロン−γ(interferon−γ)
・オバルブミン(ovalbumin)
下記ポリペプチドをBACHEMより購入して使用した。
・アンジオテンシンII(angiotensin II)
・オバルブミンのアミノ酸配列第323番目から第339番目からなるポリペプチド(ovalbumin(323−339))
下記ポリペプチドをCalbiochemより購入して使用した。
・アミノ酸配列第4番目のチロシンがリン酸化されたアンジオテンシンII([Tyr(PO3H2)4]−angiotensin II)
四重極型タンデムMS装置:API365(アプライドバイオシステムズ)
LCシステム:LC600(GLサイエンス)
GRF及びインスリンは、容積比0.1%の酢酸水溶液で溶解することで、原液(100μM)を調製した。ウロコルチンは、容積比1%の酢酸水溶液で溶解することで、ウロコルチン原液(100μM)を調製した。amyloid β−protein(1−28)、(1−38)、(1−40)、(1−42)及び(1−43)は、DMSOに溶解し、原液(100μM)を調製した。[Tyr(PO3H2)4]−angiotensin II 及びovalbumin(323−339)は、水に溶解することでポリペプチド原液(1mM)を、angiotensin IIは、水に溶解することでポリペプチド原液(50mM)を調製した。また、midkine、CINC−1/gro及びPTH(1−84)は、水に溶解することでポリペプチド原液(10μM)を調製した。
更に、ovalbuminは、水に溶解することでポリペプチド原液(10mg/mL;約200μM)を調製した。その他のポリペプチドは、水に溶解することでポリペプチド原液(100μM)を調製した。
<試料調製>
ポリペプチド原液(100μM)10μLを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比2:80:10:10、4:80:10:10、2:50:25:25又は4:50:25:25)490μL又は990μL、又は酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比2:80:20、4:80:20、2:50:50又は4:50:50)490μL又は990μLに添加し、ポリペプチド試料溶液(1又は2μM)を調製した。ただし、[Tyr(PO3H2)4]−angiotensin II 及びovalbumin(323−339)原液を、水にて10倍希釈した後(100μM)、その10μLを用いて同様に1又は2μMの試料溶液を調製した。また、angiotensin II原液を、水にて50倍希釈した後(1mM)、その10μLを用いて1又は2μMの試料溶液を調製した。更に、midkine、CINC−1/gro及びPTH(1−84)原液(10μM)50μLを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:70:10:10又は4:40:25:25)450μLに添加し、ポリペプチド試料溶液(1又は2μM)を調製した。Ovalbumin原液(10mg/mL;約200μM)10μLを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:80:10:10又は4:50:25:25)490μL又は990μLに添加し、ポリペプチド試料溶液(1又は2mg/mL)を調製した。
<測定条件>
測定モード:ESI positive
サンプル導入法:インフュージョン法
流速:5μL/min
<モニターイオン設定>
検討に用いた全てのポリペプチドにおいて、多価イオンが認められた。この多価イオンのうちの一つを親イオンとして選択して、MS/MS測定のための娘イオンの選択を実施した。その際に、MS条件に関わるパラメーターの最適化を実施した。今回、測定に用いた各ポリペプチドのモニターイオン例を表1及び表2に示す。
<試料調製>
ウロコルチン原液(100μM)10μLを、90μLの容積比2%の酢酸水溶液に添加し、ウロコルチン試料溶液(10μM)を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液10μLを、容積比4%の酢酸を含む990μLの水−アセトニトリル混合液(容積比10:0、8:2、7:3、6:4、4:6又は2:8)に添加し、ウロコルチン試料溶液(100nM)を調製した。また、容積比4%の酢酸の代わりに容積比4%のギ酸、又は、容積比0.1%のTFAを含む水−アセトニトリル混合液(容積比10:0、8:2、7:3、6:4、4:6、2:8)及び酸を含まない水−アセトニトリル混合液(容積比10:0、8:2、7:3、6:4、4:6、2:8)を用いて、同様にアセトニトリル含量の異なるウロコルチン試料(100nM)を調製した。更に、100nMのウロコルチン試料溶液10μLを、990μLの同じ組成の溶液で希釈することにより、1nMのウロコルチン試料溶液を調製した。
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
C30逆相カラム(DevelosilC30−UG−3:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
溶液中のアセトニトリル含量及び添加した酸は異なるが同濃度のウロコルチン試料を、従来、ポリペプチドの定量方法として用いられる逆相液体クロマトグラフ法(図1(A))及びC30カラムを用いて測定した。その結果、ウロコルチンのピーク面積は、一定ではなく、図2のように変化した。酸としてTFAを用いた場合を除き、ウロコルチンのピーク面積は、試料溶液中のアセトニトリル含量が30%で最大値を示した。一方、酸としてTFAを用いた場合は、試料溶液中のアセトニトリル含量が40%の時に、ウロコルチンピーク面積が最大値を示したが、その時のピーク面積は、他の酸を用いた時のピーク面積とほぼ変わらなかった。よって、ウロコルチンのピーク面積に与える酸の影響は、試料溶液中のアセトニトリル含量が与える影響よりも小さいと考えられた。
<試料調製>
ウロコルチン原液(100μM)10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、ウロコルチン試料溶液(1μM)を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液10μLを、990μLの下記混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液(10nM)を調製した。
水−アセトニトリル混合液(容積比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8又は1:9)
水−エタノール混合液(容積比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8又は1:9)
水−メタノール混合液(容積比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8又は1:9)
水−酢酸混合液(容積比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8又は1:9)
水−ギ酸混合液(容積比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8又は1:9)
移動相A:酢酸−水混合液(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移は、前述のアセトニトリルだけでなく、検討したすべての溶液で引き起こされることが示された(表5)。各溶液における相転移臨界値は、エタノールを用いた場合、容積比40%〜50%、メタノール及び酢酸を用いた場合、容積比60〜70%、ギ酸を用いた場合、容積比80%〜90%の間に存在すると考えられた。今回の結果から、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移に与える溶液中に含まれる有機溶媒の強さは、アセトニトリル>エタノール>メタノール及び酢酸>ギ酸の順であることが示された。ただし、高濃度のギ酸を用いた場合、時間とともにウロコルチンのピーク面積が小さくなる現象が認められ、ウロコルチンに存在するアミノ基のホルミル化が引き起こされていると考えられた。このことから、高濃度のギ酸を試料中に用いることはあまり好ましくないと考えられた。
<試料調製>
ウロコルチン原液(100μM)10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、ウロコルチン試料溶液(1μM)を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液10μLを、990μLの表6及び表7に示す混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液(10nM)を調製した。
移動相A:酢酸−水混合液(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法を用いて2種の有機溶媒を含むウロコルチン試料を測定した時に、カラムに保持されず素通りしたウロコルチンのピーク面積値を表9及び表10に示す。
X:水−有機溶媒A混合溶液中でのポリペプチドAの相転移臨界値を示す容積%
Y:水−有機溶媒B混合溶液中でのポリペプチドAの相転移臨界値を示す容積%
Z:水−有機溶媒C混合溶液中でのポリペプチドAの相転移臨界値を示す容積%
x:試料溶液中の有機溶媒A含量%
y:試料溶液中の有機溶媒B含量%
z:試料溶液中の有機溶媒C含量%
<試料調製>
ウロコルチン原液(100μM)10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、ウロコルチン試料溶液(1μM)を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液10μLを、990μLの表13に示す混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液(10nM)を調製した。
移動相A:酢酸−水混合液(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法を用いて3種の有機溶媒(アセトニトリル、酢酸及びメタノール)を含むウロコルチン試料を測定した時に、カラムに保持されず素通りしたウロコルチンのピーク面積値、及び、式(1)から算出した値fを表15に示す。今回の結果も、実施例3と同様、複数の有機溶媒を含む試料中のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移が式(a)に従っていることを示唆した。以上の結果から、水−各有機溶媒からなる混合溶媒を用いた場合のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値(容積%)をあらかじめ把握しておくことで、相転移臨界値が把握されている複数の有機溶媒を含む試料中のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能(ON相又はOFF相状態)の予測が可能であることが示された。
<試料調製>
検討に用いた全27種の各ポリペプチドのうち、angiotensin II 及びovalbumin(323−339)を除いた25種の各ポリペプチド原液(1mM、100μM、10μM又は10mg/mL)10μLを、それぞれ、990μLの下記混合液に添加し、各ポリペプチド試料溶液(10μM、1μM、100nM又は0.1mg/mL)を調製した。
水−アセトニトリル混合液(容積比=95:5,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6又は3:7)
水−エタノール混合液(容積比=95:5,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6又は3:7)
水−メタノール混合液(容積比=95:5,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6又は3:7)
水−酢酸混合液(容積比=95:5,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6又は3:7)
また、ovalbumin(323−339)原液(1mM)を水にて10倍希釈した溶液(100μM)及びangiotensin II原液(50mM)を水にて50倍希釈した溶液(1mM)10μLを990μLの前述の混合液に添加し、各ポリペプチド試料溶液(1μM又は10μM)を調製した。
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来システム(図1(A))を用いて各ポリペプチド溶液を測定した場合に認められたカラム充填剤への吸着能の相転移、つまり、測定対象ポリペプチドのピークが2本に分かれる現象が、検討に用いた全てのポリペプチドにおいて認められた。表17に、各ポリペプチドがクロマトグラム上で1本のピークとして認められる溶液中最大有機溶媒(酢酸を含む)含量を示す(カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値はこの値をやや上回ると考えられる)。ただし、今回の検討では水−有機溶媒混合液(容積比=95:5)を測定した場合でもクロマトグラム上で1本のピークとして認められなかった場合、5%以下(<5%)と表記した。
今回の結果から、ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移を引き起こす有機溶媒の強さは、ポリペプチドによってほとんど変わらず、アセトニトリル及びエタノールでほぼ等しく、次いでメタノールの順であった。一方、有機酸である酢酸が各ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移に与える影響の強さは、メタノールとほぼ同等もしくは若干弱いことが示唆された。また、これら溶液中最大有機溶媒含量と各ポリペプチドの保持時間との間に正の相関が認められたことから、ポリペプチドは、溶離液中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒及び有機酸によっても吸着能の相転移を引き起こすと予想された。従って、カラムに保持されたポリペプチドは、溶離液中に含まれる有機溶媒によって引き起こされる吸着能の相転移、つまり、カラム充填剤への吸着及び脱着を繰り返しながら溶出されていると考えられた。
<試料調製>
各ポリペプチド(表1の18種の各ポリペプチド)原液(100μM)10μLずつを、820μLの酢酸−水(容積比4:100)に添加し、ポリペプチド混合試料溶液(各1μM)を調製した。更に、その他9種のポリペプチド原液を酢酸−水(容積比4:100)に添加することで、各ポリペプチドの濃度が1μMとなるような別のポリペプチド混合試料溶液(各1μM)を調製した。ただし、オバルブミンの濃度は1mg/mLとなるように調製した。
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法(図1(A))で、グラジエント勾配を0.5、1、2、4、6、8、10%/minと変化させた時のポリペプチドの保持時間を測定した結果、カラムに保持されたポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間には、べき乗則が認められた(ただし、今回の測定条件下ではカラムにほとんど保持されないnociceptin及びamyloid β−protein(1−16)を除く)。例として、ウロコルチンの結果を図6に示す。このべき乗則に従って溶出されるポリペプチドの特徴は、グラジエント勾配を限りなく0%/minに近づけた場合(図6でx軸上を左に動いた場合)、その保持時間は限りなく無限大になる、つまり、ポリペプチドは溶出されないという点である。
次に、今回の測定条件下で、ポリペプチドAが「カラム充填剤への吸着能の相転移」によって溶出されると仮定すると、グラジエント勾配に関わらず、ポリペプチドAが溶出される瞬間の溶離液中の有機溶媒組成は一定、つまり、ポリペプチドAが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相A及びBの割合比は一定と考えられることから、測定システム全体のデッドボリューム及びポリペプチドAが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Bの割合%(VB)に関する式(3)及び(b)が成り立つと考えられる。
今回の検討で、グラジエント勾配が4%/min、6%/min及び8%/minの場合に得られた各ポリペプチドの保持時間を用いて、式(3)から測定システム全体のデッドボリュームを算出した結果を表19に示す。グラジエント勾配に関わらず、各ポリペプチドのデッドボリュームはほぼ3分で一定であり、かつ、ポリペプチドによらないことが示された。なお、分子量が小さくなるにつれて、デッドボリュームが若干大きくなる傾向が認められるが、これは、これらのペプチドがよりカラム細孔の内部まで到達できることによるものと考えられた。
続いて、実施例5の検討に用いた27種のポリペプチドに関して、式(b)から各ポリペプチドが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Bの割合%(VB)を算出した後、各ポリペプチドが溶出される瞬間の溶離液に含まれる各有機溶媒の含量を算出し、その各有機溶媒含量を式(a)に代入して算出した値fを算出した結果を表20に示す。なお、計算に用いた臨界有機溶媒含量(%)は、実施例5での臨界値を下回る最大有機溶媒含量(%)とピークが2本に分かれる最小有機溶媒含量(%)の中間値とした。ただし、臨界値を下回る最大有機溶媒含量(%)が5%以下の場合は、そのまま5%とした。計算の結果、各ポリペプチドはfがほぼ1となる溶離液中に存在して溶出されていることが示された。ペプチドの中には、f値が1.30〜2.03と1から大きく外れている場合も存在したが、これらのほとんどが、実施例5で臨界値を下回る最大有機溶媒含量(%)が5%以下を示したポリペプチドであり、式(a)において用いられている臨界有機溶媒含量(%)の1%の差の影響が大きいためであると考えられた。
以上の結果から、一般的にポリペプチドは、溶離液に含まれる各有機溶媒によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によってカラムから溶出されており、ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移と溶離液に含まれる各有機溶媒との関係は、実施例3で示した「複数の有機溶媒を含む試料中におけるポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移と各有機溶媒含量との関係を表す式(a)」と同様であることが示唆された。
V1=Cb+(T1−t0)・r1
V2=Cb+(T2−t0)・r2
Cb:初期測定条件での移動相Bの割合%
r1及びr2:グラジエント勾配(%/min)
T1:グラジエント勾配r1で測定した時のポリペプチドAの保持時間
T2:グラジエント勾配r2で測定した時のポリペプチドAの保持時間
t0:デッドボリューム(カラムの空隙率とHPLCシステムのインジェクターより先の空隙の和を流速で除した値)(分)
V1=V2とすると、
デッドボリュームt0は、
VB=(T1−t0)・r1
VB=(T2−t0)・r2
の両辺を加えた
2VB=(T1−t0)・r1+(T2−t0)・r2
に、デッドボリュームt0(式(3))を代入した結果、
よって、今回の結果から、測定開始時の有機溶媒含量を0%、グラジエント勾配を1%/minとして測定して得られた保持時間が、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示していることが示された。よって、各ポリペプチドの単独有機溶媒によって引き起こされる相転移の臨界値(含量)を求めるにあたって、実施例1〜5で行ったような、測定対象ポリペプチドのピークが2本に分かれる現象を確認するような煩雑な測定を実施しなくとも、単独の有機溶媒を有機溶媒系移動相として用いて1回測定することで、各ポリペプチドの相転移臨界値の近似値を得ることが可能であると考えられた。この測定方法では、複数のポリペプチドを添加した試料を測定することが可能であり、結果、複数のポリペプチドの相転移臨界値を同時に測定することが可能であると考えられた。
<試料調製>
各ポリペプチド(表1の18種の各ポリペプチド)原液(100μM)10μLずつを、820μLの酢酸−水混合液(容積比4:100)に添加し、ポリペプチド混合試料溶液(各1μM)を調製した。更に、その他9種のポリペプチド原液を酢酸−水(容積比4:100)に添加することで、各ポリペプチドの濃度が1μMとなるような別のポリペプチド混合溶液(各1μM)を調製した。ただし、オバルブミンの濃度は1mg/mLとなるように調製した。
移動相B:酢酸−アセトニトリル混合液(容積比4:100)、酢酸−メタノール混合液(容積比4:100)、酢酸−エタノール混合液(容積比4:100)、又は100%酢酸カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法(図1(A))を用い、今回用いた測定条件下で得られるグラジエント勾配1%/minの時の各保持時間は、実施例6で述べた通り、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示すことが示唆された。そこで、移動相Bの有機溶媒の種類を変更し、グラジエント勾配1%/minの時の各ポリペプチドが示す保持時間を、実施例5でピークが2本に分かれる現象から推定された相転移臨界値範囲と比較したところ、予想通り、得られた保持時間の大部分が推定臨界値範囲内に存在しており、ほぼ同じ傾向を示していた(表23)。従って、ポリペプチド溶液中の有機溶媒含量の変化によって惹起される吸着能の相転移と溶離液中の有機溶媒含量の変化によって惹起される吸着能の相転移は同質であることが示唆された。
今回の検討では、測定開始時に水系移動相に容積比約4%の酢酸が含まれていることと、検出される保持時間には約3分のデッドボリュームが含まれていることから、保持時間の短いポリペプチドでは、得られた値の取扱いに若干注意が必要であるが、今回用いたような測定条件下での保持時間から各有機溶媒が示す臨界値を推定する方法は、測定回数や、試料調製等の点で、ピークが2本に分かれる現象から推定する方法より簡便で正確であると考えられた。
<試料調製>
各ポリペプチド(表1の18種の各ポリペプチド)原液(100μM)10μLづつを、820μLの酢酸−水混合液(容積比4:100)に添加し、ポリペプチド混合試料溶液(各1μM)を調製した。
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4、C8、C18及びC30逆相カラム
(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
(Develosil300C8−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
(Develosil300ODS−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
(Develosil RPAQUEOUS−AR−3:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
各ポリペプチドの保持時間に与えるカラム固定相の影響を検討した結果、各ポリペプチドは、C4カラムを用いた場合に最も短い保持時間を示したが、カラム固定相によらずほぼ一定の保持時間を有していることが示された(表25)。今回の結果から、ポリペプチドの溶出が、低分子化合物の主要な分離要因であるカラム固定相との疎水性相互作用よりも、移動相中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒(有機酸を含む)によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によって大きく影響を受けていることが示唆された。
<試料調製>
各ポリペプチド(表1の18種の各ポリペプチド)原液(100μM)10μLづつを、820μLの酢酸−水混合液(容積比4:100)に添加し、ポリペプチド混合試料溶液(各1μM)を調製した。
移動相A:酢酸−水(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
カラム:C4逆相カラム(Develosil300C4−HG−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子径5μm)
カラム温度:20、30、40又は50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
一般的に、低分子化合物の測定においては、カラム温度を低くするにつれて低分子化合物とカラム固定相との疎水性相互作用が強くなり、保持時間がかなり長くなる。しかし、今回検討に用いた各ポリペプチドでは、より低いカラム温度でより長い保持時間を示したが、その差はほとんどの場合で小さかった(表27)。今回の結果から、ポリペプチドの溶出は、移動相中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒(有機酸を含む)によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によって大きく影響を受けると考えられた。一方、カラム温度を変化させることによっても「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」を引き起こすことが可能と考えられたが、試料溶液中又は移動相中のアセトニトリル等の有機溶媒が与える影響と比較すると極めて小さいと考えられた。
<試料調製>
ウロコルチン原液(100μM)10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、ウロコルチン試料溶液(1μM)を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:100:0、4:80:20、4:70:30、4:60:40、4:50:50、4:40:60又は4:20:80)に添加し、ウロコルチン試料溶液(10nM)を調製した。更に、同じ組成の水−アセトニトリル混合液を用いて10倍の希釈系列のウロコルチン試料溶液(0.1nM及び1nM)を調製した。
移動相A:酢酸−水(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
移動相C:酢酸
カラム:C30逆相カラム(RPAQUEOUS−AR−3:内径2.0mm、長さ35mm、粒子径3μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法及び本発明法で同濃度(0.1nM、1nM及び10nM)のウロコルチン試料を3回測定した場合のピーク面積、標準偏差及び変動係数(%)を表30、31及び32に示す。
<試料調製>
ウロコルチン濃度が10、30、100、300pM、1、3及び10nMの検量線試料を、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:100:0、4:80:20、4:70:30、4:60:40、4:50:50、4:40:60又は4:20:80)を用いて調製した。
移動相A:酢酸−水(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
移動相C:酢酸
カラム:C30逆相カラム(RPAQUEOUS−AR−3:内径2.0mm、長さ35mm、粒子径3μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
本発明法及び従来法を用いて、10、30、100、300pM、1、3及び10nMの検量線試料を測定し、検量線の作成を行った。検量線は、低分子化合物定量法バリデーション(非特許文献4)のガイドラインの基準に従い、検量線各点を自身の検量線にてback−calculateした値の真度を求め、検量線作成に用いた検量線サンプル数の75%以上の検量線サンプルにおいて、定量下限で±20%、その他で±15%以内となることを、検量線作成の基準とした。ただし、検量線の定量下限及び定量上限は必ず基準を満たすものとする。検量線の重み付けは濃度2乗分の1とし、最も定量下限の低い検量線を作成した。真度の算出方法は下記の通りである。
従来法及び本発明法で作成した検量線を表37及び表38に示す。
<試料調製>
表1の18種のポリペプチドのうち、amyloid β−protein(1−16)、amyloid β−protein(1−28)、amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−42)、amyloid β−protein(1−43)及びinsulinを除く12種ポリペプチド原液(100μM)10μLを、990μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、各ポリペプチド試料溶液(1μM)を調製した。更に、この各ポリペプチド試料溶液10μLを、990μLの容積比4%の酢酸を含む990μLの水−アセトニトリル混合液(容積比1:1)に添加し、各ポリペプチド試料溶液(10nM)を調製した。更に、同組成の溶液を用いて10、30、100、300pM、1及び3nMの検量線用試料を調製した。
移動相A:酢酸−水混合液(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比70:15:15)
カラム:C30逆相カラム(RPAQUEOUS−AR−5:内径2.0mm、長さ35mm、粒子径5μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
実際に各ポリペプチド試料を測定したところ、ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第60番目から第121番目からなるポリペプチドについては検量線が作成できなかったが、その他のポリペプチドでは、定量下限が10pM又は30pMの検量線が作成できた(表41)。各検量線から求められたサンプル濃度の真度は、前項で述べた±15%(定量下限±20%)の基準を満たしていた。各ポリペプチドの定量下限のクロマトグラムを図8−1,図8−2に示す。ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第60番目から第121番目からなるポリペプチドとをカラムに保持させるのに最低限必要な水系移動相の割合%に、94%を境に明確な差その他のポリペプチドの間には、本発明法を用いて各ポリペプチドが認められた。従って、ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第60番目から第121番目からなるポリペプチドの検量線が作成できなかった原因として、今回用いた測定条件下ではこれらポリペプチドのカラムへの保持が不十分であり、カラムに十分保持させるためには今回用いた測定条件より水系移動相の割合を大きくすることが必要と考えられた。
<試料調製>
前述の18種の各ポリペプチド原液(100μM)10μLずつを、下記溶液(A)〜(D)9.82mLにそれぞれ添加し、ポリペプチド混合試料溶液(100nM)を調製した。
(A)水
(B)酢酸−水(4:96,v/v)
(C)酢酸−水−アセトニトリル(4:66:30,v/v/v)
(D)酢酸−水−アセトニトリル(4:46:50,v/v/v)
更に、このポリペプチド混合試料溶液100μLを、同じ組成の溶液900μLに添加し、ポリペプチド混合試料溶液(10nM)を調製した。更に、同様の操作にて、1nMのポリペプチド混合試料溶液を調製した。
移動相A:酢酸−水混合液(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液(容積比4:50:50)
移動相C:酢酸
カラム:C30逆相カラム(RPAQUEOUS−AR−3:内径2.0mm、長さ35mm、粒子径3μm)
カラム温度:50℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法を用いてアセトニトリル含量が30%もしくは50%のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、ポリペプチド濃度に関わらずポリペプチド18種全てはカラムにほとんど保持されなかった(図9のC及びD)。一方、従来法を用いてアセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、すべてのポリペプチドはカラムに保持されたが、濃度の減少に伴い、保持の強いポリペプチドのピークが全く認められなくなった(図9のA及びB)。
次に、本発明法を用いてアセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合は、従来法とほぼ同様の結果が得られた(図10のA及びB)。しかし、従来法では全てのポリペプチドはほとんどカラムに保持されなかったアセトニトリル含量30%及び50%のポリペプチド混合試料溶液を、本発明法にて測定した場合、1nMの低濃度試料においても、保持の強いポリペプチドのピークが認められ、その大きさは、ほぼ濃度に比例していた(図10のC及びD)。
イソロイシル−セリル−ブラジキニンのピーク面積は、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、従来法及び本発明法共に同じ値を示した。一方、アセトニトリル含量が30%及び50%のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、従来法ではピーク面積の減少が認められたが、本発明法を用いた場合、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合と同様のピーク面積が得られた。従来法でのピーク面積が小さくなった原因としては、試料溶液中に含まれる臨界値以上のアセトニトリルにより、カラム充填剤への吸着能を失ったままカラムに導入されたイソロイシル−セリル−ブラジキニンのほとんどがカラムを素通りしたためであると考えられた。イソロイシル−セリル−ブラジキニンは、今回検討したポリペプチドの中では、カラムでの保持が比較的弱いポリペプチドであり、低濃度での容器等への吸着が比較的小さいと考えられた。
次に、従来法を用いて、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合のウロコルチンのピーク面積は、濃度の減少に伴い極端に小さくなった。特に水だけを用いて調製した混合試料を測定した場合、100nM以外ではピークが認められなかった。この原因としては、希釈系列調製時の容器等への吸着及びLC導入時のシリンジへの吸着により、ウロコルチンのほとんどが失われたと考えられた。アセトニトリル含量が30%及び50%のポリペプチド混合試料溶液(100nM)を測定した場合、そのピーク面積は、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合と比較すると小さかったが、より低濃度(1nM及び10nM)測定時にもウロコルチンのピークは認められ、しかも、ピーク面積はほぼ濃度に比例していた。
本発明法を用いて、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合のウロコルチンのピーク面積は、従来法同様、濃度の減少に伴い極端に小さくなった。しかし、アセトニトリル含量が30%及び50%のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、ウロコルチンのピーク面積は、従来法にて得られたピーク面積よりも大きく、かつ、濃度に比例していた。
以上の結果から、溶液中のポリペプチドが固体への吸着能を失った状態(例えば、臨界値以上のアセトニトリル含量を含む溶液中)で扱うことにより、低濃度でのポリペプチドの吸着を回避することが可能であることが示された。また、この状態の試料溶液を本発明法を用いて測定することにより、複数のポリペプチドを同時定量することが可能であることが示された。
<試料調製>
4.0mLの水−アセトニトリル(容積比90:10,80:20,70:30,60:50又は50:50)溶液に0.11mgのウロコルチンを溶解して、5.9μMのウロコルチン溶液(E)を調製した。
一方、isoleucyl−seryl−bradykinin 25mgを水2.5mLに溶解し、7.9mMの保存溶液を調製した。この溶液40μLを、4.0mLの水−アセトニトリル(容積比100:0,95:5,90:10,85:15又は80:20)に添加し、79μmMの溶液を調製した。
Urocortin及びisoleucyl−seryl−bradykininの250−200nMのCDスペクトルを得るために、試料を10mm角型石英セル(JASCO;東京)に移し、J−720型円二色性分散計(JASCO;東京)を用いた。各試料とも6回測定(step resolution 1nm,1s each step)し、その平均化したスペクトルを得た。
アセトニトリル含量の異なるウロコルチン溶液のCDスペクトルを図12に示す。CDスペクトルは、いずれの測定温度においても、溶液中アセトニトリル含量が10%から40%まで増加すると共に、200−240nMのスペクトル強度が大きく減少しており、特に、222nM付近のスペクトル強度の減少から、ウロコルチンはヘリックスな構造を取っていると考えられた。一方で、溶液中アセトニトリル含量が40%から50%まで増加しても、CDスペクトルに大きな変化は認められなかった。このアセトニトリル含量40%以上における変化は、実施例1で認められた保持時間1.5分のピークの出現と相関していると考えられた。従って、ウロコルチンの吸着能の相転移は、アセトニトリルを含めた様々な有機溶媒によってウロコルチンの立体構造が変化することに伴って引き起こされていると推察された。
<試料調製>
100μMの20種ポリペプチド原液10μLづつ、10μM及び10mg/mLの4種ポリペプチド原液100μLづつ、[Tyr(PO3H2)4]−angiotensin II 及びovalbumin(323−339)原液(各1mM)を水にて10倍希釈した溶液(100μM)10μLづつ、及び、angiotensin II原液(50mM)を水にて50倍希釈した後に更に水で10倍希釈した溶液(100μM)10μLを1本のエッペンドルフチューブに集め、更に370μLの水に添加して、最終濃度が各1μM(ただしオバルブミンの濃度は1mg/mL)となるような27種ポリペプチド混合試料溶液を調製した。
移動相A:酢酸−水(容積比4:100)
移動相B:酢酸−アセトニトリル(容積比4:100)、酢酸−メタノール(容積比4:100)、酢酸−エタノール(容積比4:100)、酢酸−イソプロピルアルコール(容積比4:100)、又は100%酢酸
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径3.0mm、長さ100mm)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
従来法(図1(A))で、グラジエント勾配を0.5、1、2、4、6、8、10%/minと変化させた時のポリペプチドの保持時間を測定した結果、検討に用いた分子量1007から45kDの全てのポリペプチドについて、移動相に用いた有機溶媒の種類に関わらず、カラムに保持されたポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間に良好なべき乗則が認められた(表44)。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。更に、このamyloid β−protein混合溶液(各1μM)200μLを300μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各400nM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)10μLを、490μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。
ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)100μLを、400μLのアセトニトリル又はメタノールに添加し、攪拌後、20,000×gで15分間(4℃)遠心し、上清を得た。
amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を用いて得られた上清をマウス血漿試料とした。
ブランクマウス血漿を用いて得られた上清990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各400nM)10μLを添加し、リファレンス試料(各4nM)を調製した。
移動相A:酢酸−水(容積比4:100)
移動相B:100%酢酸
移動相C:水−酢酸−アセトニトリル−メタノール(容積比20:4:40:40)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径3.0mm、長さ100mm)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし、30〜39.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率は、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比(%)とした。
低分子化合物を分析する際に一般的に用いられているアセトニトリル又はメタノールを用いた除タンパク質前処理法にてamyloid β−protein添加マウス血漿を処理した場合、4種のamyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率は表48の通り低い値を示した。メタノールを用いた場合よりもアセトニトリルを用いた場合に回収率はより低くなり、特に、amyloid β−protein(1−42)及び(1−43)の回収率は0%を示した。この各amyloid β−proteinの低回収率の原因は、有機溶媒を用いた除タンパク質操作時にアルブミンにような高分子ポリペプチドの凝集過程に各amyloid β−proteinが取り込まれたため、又は、これら高分子ポリペプチドと各amyloid β−proteinとの共沈が原因と考えられた。従って、このような有機溶媒による除タンパク質法を用いたマウス血漿中amyloid β−proteinの高感度定量は困難であると考えられた。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。更に、このamyloid β−protein混合溶液(各1μM)50μLを450μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)10μLを、490μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿試料(20nM)を調製した。
水、ブランクマウス血漿又はamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)50μLに対して、950μLの水−酢酸−メタノール(容積比20:70:10、20:60:20、20:50:30、20:40:40又は20:30:50)を加え十分に攪拌した。その混合溶液400μLを市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。
amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を用いて得られたろ過液300μLに対して300μLの水−アセトニトリル(容積比20:80)を添加してマウス血漿試料を調製した。
ブランクマウス血漿を用いて得られたろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)10μLを添加した。このろ過液(各1nM)300μLに対して300μLの水−アセトニトリル(容積比20:80)を添加してリファレンス試料(各0.5nM)を調製した。
マウス血漿の代わりに水を用いて得られたろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)10μLを添加した。このろ過液(各1nM)300μLに対して300μLの水−アセトニトリル(容積比20:80)を添加してコントロールろ過試料(各0.5nM)を調製した。
水50μLを、950μLの水−酢酸−メタノール(容積比20:70:10、20:60:20、20:50:30、20:40:40又は20:30:50)に添加した後、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)10μLを添加した。更に、この溶液(各1nM)300μLに対して300μLの水−アセトニトリル(容積比20:80)を添加してコントロール試料(各0.5nM)を調製した。
移動相A:水
移動相B:酢酸−メタノール−アセトニトリル(容積比10:45:45)
移動相C:水−酢酸−メタノール−アセトニトリル(容積比40:20:20:20)
カラム:ノンポーラスC30逆相カラム(N.P.C30−5:内径2.0mm、長さ100mm、粒子経5μm:野村化学による特注カラム)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min
グラジエント:
前処理操作時に用いたバイオマックス−PB限外ろ過メンブレン通過時の各amyloid β−proteinの回収率(透過率)は、コントロール試料を測定した時に得られたピーク面積に対するコントロールろ過試料を測定した時に得られたピーク面積の比(%)とした。一方、各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率は、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比(%)とした。
実施例16の結果から、アセトニトリル又はメタノール等の有機溶媒を用いてアルブミンのような高分子ポリペプチドを凝集させる一方で、目的とするポリペプチドを効率よく血漿から回収することは困難と考えられた。そこで、血漿中の高分子ポリペプチドを凝集させずに、かつ、目的のポリペプチドをOFF相とする前処理法として、酢酸と有機溶媒とを組み合わせた血漿希釈法を検討した。これは、高含量の酢酸を含む溶液中(血漿に対する希釈倍率にもよるが一般的に20%程度以上)では、有機溶媒が含まれていても、血漿中ポリペプチドは凝集せず溶解した状態となるという新しい知見を基に考案した方法である。今回検討に用いた混合溶液にて希釈された血漿は、全て無色透明であり、血漿中ポリペプチドは凝集していないと考えられた。一方、血漿を水とみなした場合の希釈されたマウス血漿試料(=ろ過液)中の酢酸及びメタノール含量から計算した値fから、各amyloid β−proteinはその試料(=ろ過液)中でカラム充填剤に対する吸着能を失っていることが示唆された(表50)。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例15で得られたグラジエント勾配1%/minの時の保持時間を用いた。従って、各amyloid β−proteinは、試料調製時に接触するような容器等に対して吸着能を失っていると考えられることから、バイオマックス−PB限外ろ過メンブレンに対しても吸着能も失っていると予想された。
実際に、各試料を測定した結果、OFF相(f>1)を示す希釈されたマウス血漿試料(=ろ過液)中に存在する各amyloid β−proteinのバイオマックス−PB限外ろ過メンブレンからの回収率は、予想通りほぼ100%±15%であった(表52)。従って、各amyloid β−proteinがOFF相(f>1)を示す溶液中でバイオマックス−PB限外ろ過メンブレンに対しても吸着能を失っていることが示唆された。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。まず、このamyloid β−protein混合溶液(各1μM)50μLを200μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各200nM)を調製した。次に、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)50μLを450μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)を調製した。加えて、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)40μLを960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各40nM)を調製した。更に、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)20μLを980μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各20nM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)20μLを、980μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。
100倍希釈:ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)10μLを、990μLの水−酢酸−アセトニトリル(容積比19:40:40)に添加した。50倍希釈:ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)20μLを、980μLの水−酢酸−アセトニトリル(容積比18:40:40)に添加した。20倍希釈:ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)50μLを、950μLの水−酢酸−アセトニトリル(容積比15:40:40)に添加した。10倍希釈:ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)100μLを900μLの水−酢酸−アセトニトリル(容積比10:40:40)に添加した。
希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、その400μLを市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やした。
amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を用いて得られた各ろ過液をマウス血漿試料とした(100倍希釈マウス血漿試料、50倍希釈マウス血漿試料、20倍希釈マウス血漿試料及び10倍希釈マウス血漿試料)。
100倍希釈リファレンス試料:ブランクマウス血漿を用いて得られた100倍希釈ろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各20nM)10μLを添加して調製した(各0.2nM)。50倍希釈リファレンス試料:ブランクマウス血漿を用いて得られた50倍希釈ろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各40nM)10μLを添加して調製した(各0.4nM)。20倍希釈リファレンス試料:ブランクマウス血漿を用いて得られた20倍希釈ろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各100nM)10μLを添加して調製した(各1nM)。10倍希釈リファレンス試料:ブランクマウス血漿を用いて得られた10倍希釈ろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各200nM)10μLを添加して調製した(各2nM)。
移動相A:酢酸−水(4:100;v/v)
移動相B:100%酢酸
移動相C:水−酢酸−アセトニトリル−メタノール(20:4:40:40;v/v/v/v)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径3.0mm、長さ100mm)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし、30〜39.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率を、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比(%)として算出した。
希釈倍率の異なる各試料を測定した結果、各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率は、希釈倍率の増加と共に増加した(表56)。全てのマウス血漿試料中で各amyloid β−proteinが物質に対する吸着能を失っているにも関わらず、このように回収率が変化した原因として、実施例17での考察と同様に、各amyloid β−proteinがメンブレンで分画される分子量10,000以上の高分子ポリペプチドと強く相互作用しているためにろ過液に回収されなかったことが考えられた。今回の結果から、希釈倍率を増加させることで(ポリペプチド濃度を低下させることで)、ポリペプチド間の相互作用が弱くなると考えられた。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。このamyloid β−protein混合溶液(各1μM)20μLを980μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各20nM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)10μLを、490μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。
ブランクマウス血漿及びamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)10μLを、990μLの表57に示す希釈用混合溶液に添加した。希釈された血漿を十分に攪拌後、その400μLを市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やした。
amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を用いて得られたろ過液をマウス血漿試料とした。
ブランクマウス血漿を用いて得られた100倍希釈ろ過液990μLに、amyloid β−protein混合溶液(各20nM)10μLを添加し、リファレンス試料(各0.2nM)を調製した。
移動相A:酢酸−水(4:100;v/v)
移動相B:酢酸
移動相C:水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液(容積比20:4:40:40)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径2.1mm、長さ100mm)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし、30〜39.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率を、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比(%)として算出した。
有機溶媒の種類に関わらず、各amyloid β−proteinのマウス血漿からの回収率は、希釈用溶液中の酢酸含量の増加と共に増加した(表65)。一方で、希釈用混合溶液中の酢酸含量が低い(30%〜40%程度)場合、希釈混合溶液中の水含量が増加すると共に、回収率が増加する傾向が認められた。しかし、酢酸含量が高く(60%以上)、水含量が20%以上の場合に、回収率に大きな差は認められなかった。今回の結果からも、希釈用混合溶液中の酢酸が、ポリペプチドの物質に対する吸着能を相転移させつつも、ポリペプチド間の相互作用をも阻害することで、各amyloid β−proteinマウス血漿からの回収率が上昇したと考えられた。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)10μLを、490μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。このamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えて、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)を調製した。同様に、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)150μLにブランクマウス血漿150μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(2.5nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(2.5nM)150μLにブランクマウス血漿150μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(1.25nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(1.25nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(0.625nM)を調製した。
amyloid β−protein添加マウス血漿30μLを、1500μLの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)には、内部標準(IS)ポリペプチドとしてNPY(10nM)が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、その400μL以下を市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、1.2mL以上のろ過液を得た。
amyloid β−protein添加マウス血漿(0.625、1.25、2.5、5、10及び20nM)を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した(n=1)。
amyloid β−protein添加マウス血漿(1.25及び5nM)を用いて得られたろ過液を、それぞれ、オートサンプラー中安定性評価用試料として調製した(n=3)。
移動相A:酢酸−水(4:100;v/v)
移動相B:酢酸
移動相C:水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液(容積比20:20:30:30)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径2.1mm、長さ100mm)
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし、30.1〜39.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
検量線は、y軸にISであるNPYのピーク面積に対する各amyloid β−proteinのピーク面積を、x軸にamyloid β−protein濃度(nM)を用い、濃度分の1(1/x)を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出(back−calculate)した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度(%)として表し、定量下限(LLOQ)以外で真度が±15%以内、定量下限(LLOQ)では±20%となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの75%以上(この中にLLOQ及び定量上限が含まれる)がこの基準を満たすこととした。
オートサンプラー中安定性評価用試料(1.25及び5nM各n=3)は、調製直後から20℃に設定したオートサンプラー中に放置し、放置後28時間及び37時間に測定を実施した。安定性(%)は、検量線から得られた濃度の理論値に対する割合(真度)(%)として表した。
濃度に比例した各amyloid β−proteinのピーク面積が得られ、また、LLOQを含めて理論値の±15%以内の良好な真度を有する濃度範囲が40倍の検量線が得られた(表65)。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)20μLを、980μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。このamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えて、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)を調製した。同様に、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)100μLにブランクマウス血漿150μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(2nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(2nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(1nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(1nM)100μLにブランクマウス血漿100μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(0.5nM)を調製した。一方、安定性評価用試料として、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)450μLにブランクマウス血漿150μLを加えたamyloid β−protein添加マウス血漿(15nM)を2本調製した。
amyloid β−protein添加マウス血漿30μLを、1500μLの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)には、内部標準(IS)ポリペプチドとしてNPY(10nM)が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、各溶液400μL以下を市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、1.2mL以上のろ過液を得た。
amyloid β−protein添加マウス血漿(0.5、1、2、5、10及び20nM)を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した(n=1)。
安定性評価用マウス血漿(15nM)は、調製直後から、氷冷(4℃)及び室温下で放置し、調製後0.5時間、1時間、2時間及び4時間に、水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液を用いた血漿希釈法を用いて血漿中安定性評価用試料を調製した(n=1)。
移動相A:酢酸−水(4:100;v/v)
移動相B:酢酸
移動相C:水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液(容積比20:20:30:30)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径2.1mm、長さ100mm)2本直列
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし、33.1〜44.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
検量線は、y軸にISであるNPYのピーク面積に対する各amyloid β−proteinのピーク面積を、x軸にamyloid β−protein濃度(nM)を用い、濃度分の1(1/x)を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出(back−calculate)した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度(%)として表し、定量下限(LLOQ)以外で真度が±15%以内、定量下限(LLOQ)では±20%となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの75%以上(この中にLLOQ及び定量上限が含まれる)がこの基準を満たすこととした。
マウス血漿中amyloid β−proteinの安定性は、検量線から得られた濃度の理論値に対する割合(真度)(%)として表した。
今回用いた測定条件下では、amyloid β−protein(1−38)の溶出位置に夾雑ピークが認められたことから、その他の3種のamyloid β−proteinについて評価した。その結果、濃度に比例した各amyloid β−proteinのピーク面積が得られ、また、LLOQを含めて理論値の±15%以内の良好な真度を有する濃度範囲が40倍の検量線が得られた(表68)。
<amyloid β−protein標準溶液の調製>
amyloid β−protein(1−38)、amyloid β−protein(1−40)、amyloid β−protein(1−42)及びamyloid β−protein(1−43)保存溶液(0.1mM)各10μLを、960μLの酢酸−水−アセトニトリル混合液(容積比4:50:50)に添加し、amyloid β−protein混合溶液(各1μM)を調製した。
amyloid β−protein混合溶液(各1μM)10μLを、490μLのブランクマウス血漿(Non−Sterile Mouse Plasma in Heparin,Sodium;Rockland)に添加し、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)を調製した。このamyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)200μLにブランクマウス血漿200μLを加えて、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)を調製した。同様に、amyloid β−protein添加マウス血漿(10nM)200μLにブランクマウス血漿200μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(5nM)200μLにブランクマウス血漿300μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(2nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(2nM)200μLにブランクマウス血漿200μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(1nM)を、amyloid β−protein添加マウス血漿(1nM)200μLにブランクマウス血漿200μLを加えてamyloid β−protein添加マウス血漿(0.5nM)を調製した。QC試料用として、amyloid β−protein添加マウス血漿(20nM)150μLにブランクマウス血漿50μLを加えて、amyloid β−protein添加マウス血漿(15nM)を調製した。
amyloid β−protein添加マウス血漿30μLを、1500μLの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液(容積比30:60:10)には、内部標準(IS)ポリペプチドとしてNPY(10nM)が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、各溶液400μL以下を市販のウルトラフリーMC遠心式フィルターユニット(バイオマックス−PB限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット;分画分子量10,000)に添加し、6,000×gで60分間以上(35℃)遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、1.2mL以上のろ過液を得た。
amyloid β−protein添加マウス血漿(0.5、1、2、5、10及び20nM)を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した(n=1)。
amyloid β−protein添加マウス血漿(0.5、1、5及び15nM)を用いて得られたろ過液を、それぞれ、LLOQ、LQC、MQC及びHQC試料として調製した(n=5)。
移動相A:酢酸−水(4:100;v/v)
移動相B:酢酸
移動相C:水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液(容積比20:20:30:30)
カラム:C18逆相カラム(Chromolith Performance RP−18e:内径2.1mm、長さ100mm)2本直列
カラム温度:60℃
流速:0.2mL/min(ただし0.1〜10分の間0.25mL/min、30〜39.9分の間0.6mL/min)
グラジエント:
検量線は、y軸にISであるNPYのピーク面積に対する各amyloid β−proteinのピーク面積を、x軸にamyloid β−protein濃度(nM)を用い、濃度分の1(1/x)を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出(back−calculate)した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度(%)として表し、定量下限(LLOQ)以外で真度が±15%以内、定量下限(LLOQ)では±20%となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの75%以上(この中にLLOQ及び定量上限が含まれる)がこの基準を満たすこととした。
真度(%)は、QC試料(n=5)を測定した時に得られた平均濃度の理論濃度に対する割合(%)として表し、精度は、変動係数(CV%)として表した。真度(%)の許容基準は、定量下限(LLOQ)以外で理論値±15%以内、定量下限(LLOQ)では理論値±20%となることとした。精度の許容基準は、CV%が定量下限(LLOQ)以外で15%以内、定量下限(LLOQ)で20%以内とした。
今回用いた測定条件下では、amyloid β−protein(1−38)の溶出位置に夾雑ピークが認められたことから、その他の3種のamyloid β−proteinについて評価した。その結果、濃度に比例したamyloid β−protein(1−40)、(1−42)及び(1−43)のピーク面積が得られ、また、LLOQを含めて理論値の±15%以内の良好な真度を有する濃度範囲が40倍の検量線が得られた(表71)。更に、QCサンプルを測定したところ、許容基準を満たす真度及び精度が得られた(表72)。
Claims (24)
- 逆相液体クロマトグラフを用いるあるポリペプチド(ポリペプチドA)の検出又は定量方法であって、以下の工程を含むポリペプチドの検出又は定量方法;
(1)OFF相ポリペプチドAを逆相液体クロマトグラフに導入する工程、
(2)(1)で導入したOFF相ポリペプチドAを相転移させる手段により、ON相ポリペプチドAを生成する工程、
(3)(2)で生成したON相ポリペプチドAとカラム充填剤を相互作用させる工程、
(4)(3)で相互作用したON相ポリペプチドAを相転移させ、OFF相ポリペプチドAを生成する工程、
(5)(4)で生成したOFF相ポリペプチドAを溶出する工程、及び
(6)(5)で溶出したポリペプチドAを検出又は定量する工程。 - OFF相ポリペプチドAが、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、DMSO、THF、酢酸、ギ酸及びTFAから選ばれる1種又は2種以上の有機溶媒(有機溶媒1、・・・、有機溶媒n(nは1以上7以下の整数))を含む溶液に存在するポリペプチドAであって、下記式(1)が成立している溶液(OFF相溶液)に存在するポリペプチドAである、請求項1に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
(式(1)において、X1は水−有機溶媒1混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、Xnは水−有機溶媒n混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、x1はOFF相溶液における有機溶媒1の容積比(%)、xnはOFF相溶液における有機溶媒nの容積比(%)をそれぞれ示す) - ON相ポリペプチドAが以下の群より選ばれる溶液に存在するポリペプチドAである、請求項1に記載のポリペプチドの検出又は定量方法;
(1)有機溶媒を含まない水溶液、及び
(2)アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、DMSO、THF、酢酸、ギ酸及びTFAから選ばれる1種又は2種以上の有機溶媒(有機溶媒1、・・・、有機溶媒n(nは1以上7以下の整数))を含む溶液であって、下記式(2)が成立している溶液(ON相溶液)。
(式(2)において、X1は水−有機溶媒1混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、Xnは水−有機溶媒n混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、x1はON相溶液における有機溶媒1の容積比(%)、xnはON相溶液における有機溶媒nの容積比(%)をそれぞれ示す) - OFF相ポリペプチドAが下記(A)で示されるポリペプチドAであって、かつ、ON相ポリペプチドAが下記(B)で示されるポリペプチドAである、請求項1に記載のポリペプチドの検出又は定量方法;
(A)アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、DMSO、THF、酢酸、ギ酸及びTFAから選ばれる1種又は2種以上の有機溶媒(有機溶媒1、・・・、有機溶媒n(nは1以上7以下の整数))を含む溶液に存在するポリペプチドAであって、下記式(1)が成立している溶液(OFF相溶液)に存在するポリペプチドA、
(式(1)において、X1は水−有機溶媒1混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、Xnは水−有機溶媒n混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、x1はOFF相溶液における有機溶媒1の容積比(%)、xnはOFF相溶液における有機溶媒nの容積比(%)をそれぞれ示す)及び
(B)有機溶媒を含まない水溶液、又は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、DMSO、THF、酢酸、ギ酸及びTFAから選ばれる1種又は2種以上の有機溶媒(有機溶媒1、・・・、有機溶媒n(nは1以上7以下の整数))を含む溶液であって、下記式(2)が成立している溶液(ON相溶液)に存在するポリペプチドA。
(式(2)において、X1は水−有機溶媒1混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、Xnは水−有機溶媒n混合溶液におけるポリペプチドAの相転移臨界値(%)、x1はON相溶液における有機溶媒1の容積比(%)、xnはON相溶液における有機溶媒nの容積比(%)をそれぞれ示す) - OFF相溶液に含まれる有機溶媒及びON相溶液に含まれる有機溶媒から選ばれる各々の有機溶媒と水の混合溶液におけるポリペプチドAの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を決定する工程を含む、請求項4に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
- ポリペプチドAの分子量が1万Da以下である、請求項1から5のうちいずれか1項に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
- ポリペプチドAが、以下の群より選ばれるいずれか1のポリペプチドである、請求項1から5のうちいずれか1項に記載のポリペプチドの検出又は定量方法;
(1)副腎皮質刺激ホルモンのアミノ酸配列第1番目から第24番目からなるポリペプチド、
(2)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第16番目からなるポリペプチド、
(3)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第28番目からなるポリペプチド、
(4)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第38番目からなるポリペプチド、
(5)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第40番目からなるポリペプチド、
(6)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第42番目からなるポリペプチド、
(7)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第43番目からなるポリペプチド、
(8)成長ホルモン放出因子、
(9)イソロイシル−セリル−ブラジキニン、
(10)インスリン、
(11)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP−32)、
(12)C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP−53)、
(13)ミッドカインのアミノ酸配列第60番目から第121番目からなるポリペプチド、
(14)ニューロメジンC、
(15)ニューロペプチドY(NPY)、
(16)ノシセプチン、
(17)オキシトシン、
(18)ウロコルチン、
(19)ミッドカイン、
(20)インターフェロン−γ、
(21)心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP(1−28))、
(22)ラット好中球走化性因子−1(CINC−1/gro)、
(23)副甲状腺ホルモン(PTH(1−84))、
(24)オバルブミンのアミノ酸配列第323番目から第339番目からなるポリペプチド、
(25)オバルブミン、
(26)アンジオテンシンII、及び
(27)アミノ酸配列第4番目のチロシンがリン酸化されたアンジオテンシンII。 - ポリペプチドAを検出又は定量する工程が、逆相液体クロマトグラフに接続されている質量分析計に備わるポリペプチドの検出又は定量手段によりポリペプチドAを検出又は定量する工程である、請求項1から7のうちいずれか1項に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
- 少なくとも、ある移動相(移動相1)を供給する移動相供給器(移動相1供給器)、移動相1とは異なる移動相(移動相2)を供給する移動相供給器(移動相2供給器)、移動相1供給器と送液管を介して接続する試料注入器、該移動相2供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器、該移動相混合器と送液管を介して接続する逆相分析カラム、並びに該逆相分析カラムと接続されるポリペプチドの検出又は定量器を有する逆相液体クロマトグラフ。
- 少なくとも、ある移動相(移動相1)を供給する移動相供給器(移動相1供給器)、移動相1とは異なる移動相(移動相2)を供給する移動相供給器(移動相2供給器)、移動相1供給器と送液管を介して接続する試料注入器、該移動相2供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器、該移動相混合器と送液管を介して接続する逆相分析カラム、並びに該逆相分析カラムと送液管を介して接続される質量分析計を有する液体クロマトグラフ/質量分析計(LC−MS)又は液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計(LC−MS/MS)。
- 少なくとも、ある移動相(移動相1)を供給する移動相供給器(移動相1供給器)、移動相1とは異なる移動相(移動相2)を供給する移動相供給器(移動相2供給器)、移動相1供給器と送液管を介して接続する試料注入器、該移動相2供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器、該移動相混合器と送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続されるスイッチングバルブ、並びに該スイッチングバルブと接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ/質量分析計(LC−MS)又は液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計(LC−MS/MS)。
- 少なくとも、ある移動相(移動相1)を供給する移動相供給器(移動相1供給器)、移動相1とは異なる移動相(移動相2)を供給する移動相供給器(移動相2供給器)、移動相1及び2とはそれぞれ異なる移動相(移動相3)を供給する移動相供給器(移動相3供給器)、移動相1供給器と移動相2供給器とを送液管を介して接続する移動相混合器(混合器A)、混合器Aと送液管を介して接続する試料注入器、該移動相3供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器(混合器B)、混合器Bと送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ/質量分析計(LC−MS)又は液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計(LC−MS/MS)。
- 少なくとも、ある移動相(移動相1)を供給する移動相供給器(移動相1供給器)、移動相1とは異なる移動相(移動相2)を供給する移動相供給器(移動相2供給器)、移動相1及び2とはそれぞれ異なる移動相(移動相3)を供給する移動相供給器(移動相3供給器)、移動相1供給器と移動相2供給器とを送液管を介して接続する混合器(混合器A)、混合器Aと送液管を介して接続する試料注入器、該移動相3供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器(混合器B)、混合器Bと送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続されるスイッチングバルブ、並びに該スイッチングバルブと接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ/質量分析計(LC−MS)又は液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計(LC−MS/MS)。
- 生体由来試料に酢酸を添加する工程を含む、該試料に含まれるあるポリペプチドの溶解度を向上させる方法。
- 血漿由来試料に酢酸を添加する工程を含む、該試料に含まれるあるポリペプチドの溶解度を向上させる方法。
- インビトロにおいて、酢酸を用いることを手段とする、あるポリペプチドと血漿ポリペプチドの相互作用を阻害する方法。
- インビトロにおいて、酢酸を用いることを手段とする、あるポリペプチドと血漿ポリペプチドとの凝集を抑制する方法。
- 血漿由来試料に酢酸を添加する工程を含む、該試料に含まれるあるポリペプチドと該ポリペプチドと同一又は異なるある血漿ポリペプチドとの相互作用を阻害する方法。
- 血漿由来試料に酢酸を添加する工程を含む、該試料に含まれるあるポリペプチドと該ポリペプチドと同一又は異なるある血漿ポリペプチドとの凝集を抑制する方法。
- あるポリペプチド(ポリペプチドA)を含む血漿由来試料に、アセトニトリル、メタノール、エタノール及びイソプロピルアルコールから選ばれる1種又は2種以上の有機溶媒と酢酸とを添加する工程を含む、OFF相ポリペプチドA試料の調製方法。
- あるポリペプチドがβアミロイド又はその部分ポリペプチドである、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- あるポリペプチドが下記の群より選ばれる少なくともいずれか1のポリペプチドである、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法:
(1)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第38番目までからなるポリペプチド、
(2)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第40番目までからなるポリペプチド、
(3)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第42番目までからなるポリペプチド、及び
(4)βアミロイドのアミノ酸配列第1番目から第43番目までからなるポリペプチド。 - 血漿ポリペプチドが分子量1万Da以上のポリペプチドである、請求項15〜22のいずれか1項に記載の方法。
- インビトロにおいて、酢酸を用いることを手段とする、ポリペプチド間相互作用を阻害する方法。
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