JPWO2007013401A1 - 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット - Google Patents
免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007013401A1 JPWO2007013401A1 JP2006536970A JP2006536970A JPWO2007013401A1 JP WO2007013401 A1 JPWO2007013401 A1 JP WO2007013401A1 JP 2006536970 A JP2006536970 A JP 2006536970A JP 2006536970 A JP2006536970 A JP 2006536970A JP WO2007013401 A1 JPWO2007013401 A1 JP WO2007013401A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cation exchange
- antibody
- immunoassay method
- particles
- sensitized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 57
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 57
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 14
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 55
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 42
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 38
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 38
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 16
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 11
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 8
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 claims description 7
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 claims description 7
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 claims description 3
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 claims description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 2
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 32
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 abstract description 16
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 abstract description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 9
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- -1 cotton Chemical compound 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002587 anti-hemolytic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 2
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710180319 Protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1275—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
抗体感作粒子を用いた免疫測定方法において、偽陽性の発生を防止する。 本発明の免疫測定方法は、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と検体とを混合し、抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定することにより前記検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、前記混合に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理することを含む。前記陽イオン交換物質としては、例えば、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質が使用でき、その形態は、特に制限されず、例えば、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラム等であってもよい。
Description
本発明は、免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キットに関する。
近年、抗原抗体反応を利用し、測定開始から数分〜数十分で測定項目を検出または定量可能な簡易検査試薬およびキットが開発されている。測定項目が感染症である場合、患者から採取した検体の感染の有無がその場で判明すれば、症状が早期のうちに患者を治療できる。このため、このような簡易検査試薬およびキットの重要性は、医療の現場において年々高まっている。
現在、簡易検査方法の１つとして、ラテックス凝集法（ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）等の免疫測定方法が広く用いられている。ラテックス凝集法は、抗体感作されたラテックス粒子と検体中の標的抗原とを抗原抗体反応によって結合・凝集させ、その凝集の度合いにより感染の有無を検出する方法である。この方法は、検体の濃度によっては、目視による凝集塊の判定や自動分析装置を用いた吸光度の測定による定量検査もできる。
しかしながら、ラテックス凝集法等の免疫測定方法を用いて検体（例えば、咽頭拭い液等）を分析する場合、偽陽性が生じる問題がある。すなわち、測定対象物質が検体中に存在しないにも係わらず、非特異的な反応により粒子が結合・凝集するため、陽性と判定してしまう問題である。このように、病原体の感染を特定する際に偽陽性が生じると、罹患に関して誤った情報を与えることになる。その結果、原因特定の遅延や不適切な治療を施すことになり、病状がより重篤になる等の重大な問題を引き起こすこともあり得る。したがって、偽陽性の発生の抑制は、極めて重要な課題である。
従来、この問題を解決するために、予め、ろ過フィルター等を用い、その孔径の大きさによって検体を篩い分けることにより、偽陽性の発生を抑制する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。しかしながら、この方法は、メンブレン固相を用いたＥＩＡ（酵素標識免疫測定方法）ではその効果を発揮するが、ラテックス凝集法のように抗体感作粒子を用いた免疫測定方法では充分な効果が得られなかった。
特開２００４−２８８７５号公報
そこで、本発明は、抗体感作粒子を用いた免疫測定方法において、偽陽性の発生を防止し、検出精度および定量精度の高い免疫測定方法、およびそれに用いる測定用キットの提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の免疫測定方法は、検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、検体と、前記検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子とを混合する工程、および、抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定する工程を含み、前記混合工程に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理する工程を含むことを特徴とする。
また、本発明の免疫測定用キットは、本発明の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と、陽イオン交換物質とを含むことを特徴とする。
このように、陽イオン交換物質を用いて検体を前処理すれば、非特異的な反応を防止できる。このため、偽陽性の発生を抑制することができ、検出精度および定量精度の高い免疫測定方法を実現できる。
つぎに、本発明について、詳しく説明する。
前記陽イオン交換物質は、特に制限されないが、例えば、強酸性陽イオン交換物質および弱酸性陽イオン交換物質があげられ、中でも、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質が好ましい。また、前記陽イオン交換物質は、官能基としてスルホン酸基およびカルボキシル基の双方を有してもよい。
前記陽イオン交換物質としては、例えば、陽イオン交換樹脂があげられ、中でも官能基としてスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を有する樹脂が好ましい。前記陽イオン交換樹脂の具体例としては、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂等があげられる。中でも、ポリエーテルスルホン、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂が好ましい。前記陽イオン交換樹脂の形状は、特に制限されず、例えば、球状、膜および繊維等があげられる。
前記陽イオン交換物質の形態は、特に制限されないが、例えば、陽イオン交換フィルターや陽イオン交換カラム等が好ましい。前記陽イオン交換フィルターとしては、例えば、球状の陽イオン交換樹脂を担体に担持させたフィルター、繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルター等があげられる。前記担体の材質は、例えば、綿等の陽イオン交換樹脂以外の材質が好ましく、その形状は、繊維状が好ましい。前記担体に陽イオン交換樹脂を担持させたフィルターとしては、例えば、粉末状のポリエーテルスルホンを脱脂綿等に担持させたフィルター等があげられる。また、前記繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルターは、例えば、ポリエーテルスルホン繊維で編まれたフィルター等があげられる。前記陽イオン交換カラムとしては、例えば、前記陽イオン交換樹脂を管に充填したもの等があげられる。
前記測定対象物質と反応する抗体は、特に制限されないが、例えば、測定対象物質に特異的に反応して結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体等があげられる。
前記抗体感作粒子は、例えば、粒子に前記抗体を感作させたものが使用できる。前記粒子は、特に制限されないが、不溶性担体粒子があげられ、前記不溶性担体粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子等のラテックス粒子、ポリプロピレン粒子、ポリエチレン粒子、ゼラチン粒子、金属コロイド等があげられ、中でも、ポリスチレンラテックス粒子が好ましい。前記抗体感作粒子は、前記ポリスチレンラテックス粒子に抗体を感作させた抗体感作ラテックス粒子が好ましい。なお、粒子への抗体の感作は、従来公知の方法により行うことができる。
また、本発明の免疫測定方法において、前記抗体感作粒子を備えたアセンブリを使用してもよい。前記アセンブリとしては、例えば、試薬を含む試薬パック等があげられ、前記試薬が前記抗体感作粒子を含むことが好ましい。前記試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状が好ましく、より好ましくは２つ以上の槽を備え、前記槽の少なくとも１つとして前記試薬を含む試薬槽を備える。前記試薬パックは、前記試薬槽に加えて、例えば、反応を行う反応槽、検体を入れる検体槽、廃液を入れる廃棄槽および分注チップ等を含むことが好ましい。このような槽を備えた試薬パックを使用することにより、例えば、試薬の調製等が不要となるため、検体の前処理と測定とを連続して行うことができる。その結果、測定がより一層簡便になり、また、自動化装置への適用も極めて容易になる。前記試薬パックとして、例えば、特開２００１−３１８１０１号公報に記載の免疫測定用カートリッジが使用できる。前記カートリッジは、例えば、前記試薬槽および反応槽を含み、さらに、検体槽、廃棄槽および分注チップ等を含んでもよい。前記試薬槽および反応槽の個数は、特に制限されず、１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。これらの槽の配置は、特に制限されないが、例えば、試薬槽および反応槽を複数備え、これらが直列に配置されている場合、前記試薬槽と前記反応槽とが交互に配置されていることが好ましい。また、前記試薬槽および前記反応槽の上部は、例えば、アルミ箔や高分子フィルム等でシールされていることが好ましい。前記試薬としては、例えば、後述する反応用緩衝液等が使用できる。
本発明において使用する免疫測定方法としては、例えば、ラテックス凝集法があげられる。本発明は、ラテックス凝集法において適用することが好ましい。
前記測定対象物質は、例えば、菌またはウイルス等があげられる。本発明の免疫測定方法において、前記菌または前記ウイルスの特定の抗原を検出若しくは定量することにより、前記菌または前記ウイルスを検出若しくは定量できる。前記菌および前記ウイルスの具体例としては、溶血性連鎖球菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、百日咳菌、クラミジア・トラコマティス、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）およびマイコプラズマ等があげられる。中でも、本発明の免疫測定方法は、溶血性連鎖球菌およびインフルエンザウイルスに有用である。
前記検体は、特に制限されないが、例えば、鼻汁由来検体および咽頭由来検体等があげられる。前記鼻汁由来検体は、例えば、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液および鼻腔洗浄液等があげられる。また、前記咽頭由来検体は、例えば、咽頭拭い液および唾液等があげられる。
つぎに、本発明の測定用キットは、前述のとおり、本発明の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子および陽イオン交換物質を含む。
本発明の測定用キットは、さらに、試薬を含む試薬パックを含んでもよく、前記試薬が前記抗体感作粒子を含むことが好ましい。前記試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状が好ましく、より好ましくは２つ以上の槽を備え、前記槽として前記試薬を含む試薬槽を備えることである。さらに、前記試薬パックは、反応槽、検体槽、分注チップおよび廃棄槽等を含むことが好ましい。本発明の測定用キットが複数の槽を備えた試薬パックを含む場合、本発明の免疫測定方法をより一層簡便に実施でき、また、自動化装置への適用も極めて容易になる。
本発明の測定用キットは、その利便性をより一層向上させるために、さらに、例えば、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液等のうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
本発明の測定用キットとしては、例えば、前記免疫測定用カートリッジに、前記抗体感作粒子および陽イオン交換物質、並びに、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液の少なくとも１つを適宜封入したものがあげられる。
前記検体希釈液は、測定前に検体を希釈するための試薬であって、例えば、測定対象物質や検体等に応じて適宜決定できる。前記検体希釈液は、特に制限されないが、例えば、ＢＳＡやＮａＮ３等を含むＰＢＳ等があげられる。なお、検体の種類や量等によって、前記検体希釈液は省略してもよい。
前記反応用緩衝液は、例えば、測定対象物質等に応じて適宜決定でき特に制限されないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびリン酸緩衝液等があげられる。前記反応用緩衝液は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００等）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＮａＮ３等を含んでもよい。
前記検体採取器具は、例えば、前記分注チップを兼用してもよいし、綿棒等であってもよい。
前記検体抽出液は、例えば、核蛋白等の抽出に使用する試薬であって、測定対象物質や検体等に応じて適宜決定でき特に制限されないが、例えば、緩衝液等が使用できる。前記緩衝液は、例えば、ＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等があげられる。前記検体抽出液は、例えば、セミアルカリプロテアーゼ、ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、ＢＳＡ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＥＤＴＡ・２ＮａおよびＮａＮ３等を含んでもよい。
以下に、本発明の測定方法の一例について説明するが、以下の方法には制限されない。まず、検体として咽頭由来検体を使用し、測定対象物質が溶血性連鎖球菌である場合を例にあげて説明する。
まず、陽イオン交換物質を準備する。前記陽イオン交換物質としては、前述のものが使用できるが、例えば、ガラスフィルターの間に前記陽イオン交換フィルターを配置し、それをポリエチレンで形成されたノズル内に装填したもの等が好ましい。また、前記陽イオン交換物質として、市販の陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムを使用してもよい。
つぎに、咽頭から採取した咽頭由来検体を、例えば、２Ｍ亜硝酸ナトリウム液および１Ｍ酢酸液と混合した後、中和して検体液を調製する。検体量が微量である場合は、例えば、１重量％ＢＳＡおよび０．１重量％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）等の検体希釈液で検体を予め懸濁してもよい。
そして、前記検体液を、前記陽イオン交換物質を用いて陽イオン交換処理する。ついで、処理後の検体液、抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬および反応用緩衝液を混合し、その凝集度合いを検出する。凝集度合いの検出は、例えば、分光光度計等の自動的に制御された光学測定装置を用いた濁度測定により行ってもよいし、凝集の有無をスライドガラス上等で目視確認してもよい。前記抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬は、自家調製したものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。
つぎに、測定対象物質がインフルエンザウイルスである場合を例にあげて説明する。
インフルエンザウイルスについては、本発明の免疫測定方法により、例えば、Ａ型とＢ型の鑑別を行うことが好ましい。前記鑑別に使用する抗体は、例えば、核蛋白に対して特異的な抗体が好ましい。インフルエンザウイルス表面蛋白のヘマグルチニン等は抗原性が次々と変異するために、一定の抗ヘマグルチニン抗体を用いると、流行したウイルスの亜型によって反応性が相違し、場合によっては反応しなくなる可能性がある。しかしながら、核蛋白はＡ型やＢ型を分類する際の基本となる抗原性を維持しており亜型の種類に関わらず一定の反応性を示すため、Ａ型とＢ型の鑑別に適しているからである。核蛋白はウイルス粒子の脂質二層膜からなるエンベロープの内部に局在し、ウイルス表面には存在しないため、まず、例えば、超音波処理や凍結融解等の繰り返しによるウイルス粒子の物理的な破壊や、界面活性剤等による化学的な処理方法等により核蛋白を抽出することが好ましい。前記化学的な処理方法としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、一般名称：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）やｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（例えば、商品名：ＭＥＧＡ−８）等の非イオン性界面活性剤等で抽出する方法がある。ＥＩＡ法やイムノクロマト法等では、前記界面活性剤として、通常、Ｔｗｅｅｎ２０等が用いられるが、本発明のように抗体感作粒子の凝集を用いて抗原抗体反応を行う場合、粒子の凝集反応の反応性に及ぼす影響が少なく且つ抽出効果が高いことから、ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（例えば、商品名：ＭＥＧＡ−８）が好ましい。ついで、このようにして抽出した核蛋白を用いて、本発明の免疫測定方法により鑑別を行うことが好ましい。
つぎに、本発明の実施例について比較例とあわせて説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
１．抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬の調製
抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体および５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記抗体液０．５ｍＬと１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．５μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、前記抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体を前記ポリスチレンラテックス粒子に感作させた。ついで、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングした抗体感作ラテックス粒子をリン酸緩衝液で洗浄した後、前記ラテックス粒子をラテックス分散緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）、０．１重量％ＢＳＡ、０．１重量％ＮａＮ３）に分散させて、抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬（粒子濃度０．１％（ｗ／ｖ））を調製した。
抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体および５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記抗体液０．５ｍＬと１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．５μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、前記抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体を前記ポリスチレンラテックス粒子に感作させた。ついで、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングした抗体感作ラテックス粒子をリン酸緩衝液で洗浄した後、前記ラテックス粒子をラテックス分散緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）、０．１重量％ＢＳＡ、０．１重量％ＮａＮ３）に分散させて、抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬（粒子濃度０．１％（ｗ／ｖ））を調製した。
２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定
抗原は、ストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株をペニシリン処理したピシバニール（中外製薬社製）を用いた。検体希釈液（１重量％ＢＳＡおよび０．１重量％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（１０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、前記各濃度の抗原液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和することにより調製した。
抗原は、ストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株をペニシリン処理したピシバニール（中外製薬社製）を用いた。検体希釈液（１重量％ＢＳＡおよび０．１重量％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（１０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、前記各濃度の抗原液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和することにより調製した。
前記抗体感作ラテックス試薬６３μＬ、前記検体液１４μＬおよび反応用緩衝液６３μＬをキュベット内で混合し、免疫反応装置（商品名：スポットケム−ＩＭ、アークレイ社製）を用いて、３７℃で５分間、吸光度（測定波長６６０ｎｍ）の変化を測定した。その結果を、５分間の吸光度変化量（測定開始５分後の吸光度−測定開始直後の吸光度）として下記表１に示す。なお、前記反応用緩衝液は、下記組成のものを使用した。
（反応用緩衝液）
１．９重量％ ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％ ＢＳＡ
２重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％ ＮａＮ３
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
１．９重量％ ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％ ＢＳＡ
２重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％ ＮａＮ３
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
前記表１に示すように、溶血性連鎖球菌抗原濃度に応じて吸光度変化量が増加していることから、ラテックス凝集法により定量的に溶血性連鎖球菌量を測定できることが確認できた。
３．溶血性連鎖球菌陰性検体の測定
症状から判断して明らかに溶血性連鎖球菌に感染していない人から咽頭拭い液を採取した。その咽頭拭い液が溶菌性連鎖球菌陰性であることを、市販の溶菌性連鎖球菌検出キット（商品名：ストレップＡテストパック；プラスボットジャパン社製）を用いて確認した。ついで、前記陰性が確認された人から綿棒を用いて咽頭拭い液を採取し、下記の条件１で溶菌性連鎖球菌量を測定した。また、比較例１として、前記検体について下記の条件２で溶菌性連鎖球菌量を測定した。
症状から判断して明らかに溶血性連鎖球菌に感染していない人から咽頭拭い液を採取した。その咽頭拭い液が溶菌性連鎖球菌陰性であることを、市販の溶菌性連鎖球菌検出キット（商品名：ストレップＡテストパック；プラスボットジャパン社製）を用いて確認した。ついで、前記陰性が確認された人から綿棒を用いて咽頭拭い液を採取し、下記の条件１で溶菌性連鎖球菌量を測定した。また、比較例１として、前記検体について下記の条件２で溶菌性連鎖球菌量を測定した。
（条件１）
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。ついで、ポリエチレンで形成されたノズル内に、厚み１４０μｍのイオン交換メンブレンディスクフィルター（ＰＡＬＬ／日本ポール社製、商品名：Ｉ．Ｃ．Ｅ４５０（登録商標）（陽イオン交換樹脂：ポリエーテルスルホン、官能基：スルホン酸基、フィルターの孔径：０．４５μｍ））をガラスフィルターの間に配置した抽出ユニットを充填した。前記検体液をポリエチレンで形成された検体処理用チューブに入れた後、前記チューブに前記ノズルを装着した。ついで、前記検体液をノズルに通してろ過することにより陽イオン交換処理を行った。前記陽イオン交換処理後の検体液を用いて、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。ついで、ポリエチレンで形成されたノズル内に、厚み１４０μｍのイオン交換メンブレンディスクフィルター（ＰＡＬＬ／日本ポール社製、商品名：Ｉ．Ｃ．Ｅ４５０（登録商標）（陽イオン交換樹脂：ポリエーテルスルホン、官能基：スルホン酸基、フィルターの孔径：０．４５μｍ））をガラスフィルターの間に配置した抽出ユニットを充填した。前記検体液をポリエチレンで形成された検体処理用チューブに入れた後、前記チューブに前記ノズルを装着した。ついで、前記検体液をノズルに通してろ過することにより陽イオン交換処理を行った。前記陽イオン交換処理後の検体液を用いて、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（比較例１：条件２）
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和したものをそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和したものをそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
前記実施例１（条件１）および比較例１（条件２）の測定結果を、下記表２に示す。なお、同表において、吸光度変化量が０．００５０以上を陽性（＋）とし、０．００５０未満を陰性（−）と判定した。
前記表２に示すように、ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌の測定において、陽イオン交換処理を行わない比較例１（条件２）では、溶菌性連鎖球菌が陰性である検体を使用したにも関わらず、１４検体中１２検体で非特異的な凝集反応による偽陽性が生じた。一方、予め陽イオン交換処理を行った実施例１（条件１）では、１４検体すべてが本来の陰性結果となった。
この結果より、ラテックス凝集法による免疫凝集法において検体に予め陽イオン交換処理を施すことにより、非特異的反応が充分に抑制できることがわかった。
１．抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試薬の調製
抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．８ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記実施例１の抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬と同様にして、前記抗体液を用いて抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試薬を調製した。
抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．８ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記実施例１の抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬と同様にして、前記抗体液を用いて抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試薬を調製した。
２．ラテックス凝集法によるインフルエンザＡ型抗原の測定
抗原は、精製インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｋｉｅｖ／３０１／９４（Ｈ３Ｎ２）を用いた。実施例１で使用した検体希釈液を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（４μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、下記の組成の検体抽出液で前記各濃度の抗原液を１０倍希釈し、それを検体液として以下の測定に用いた。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液を前記検体抽出液で１０倍希釈することにより調製した。
抗原は、精製インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｋｉｅｖ／３０１／９４（Ｈ３Ｎ２）を用いた。実施例１で使用した検体希釈液を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（４μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、下記の組成の検体抽出液で前記各濃度の抗原液を１０倍希釈し、それを検体液として以下の測定に用いた。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液を前記検体抽出液で１０倍希釈することにより調製した。
（検体抽出液）
０．４ｍｇ／ｍＬ セミアルカリプロテアーゼ
１重量％ ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ
０．５重量％ ＢＳＡ
０．９重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
０．４ｍｇ／ｍＬ セミアルカリプロテアーゼ
１重量％ ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ
０．５重量％ ＢＳＡ
０．９重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
前記抗体感作ラテックス試薬５６μＬ、前記検体液２８μＬおよび反応用緩衝液５６μＬをキュベット内で混合し、前記実施例１と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。その結果を下記表３に示す。なお、前記反応用緩衝液は、下記組成のものを使用した。
（反応用緩衝液）
２．１重量％ ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％ ＢＳＡ
０．９重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％ ＮａＮ３
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
２．１重量％ ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％ ＢＳＡ
０．９重量％ ＮａＣｌ
０．１重量％ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％ ＮａＮ３
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）
前記表３に示すように、インフルエンザＡ型ウイルス濃度に応じて、吸光度変化量が増加していることから、ラテックス凝集法により定量的にインフルエンザＡ型ウイルス量を測定できることが確認できた。
３．インフルエンザＡ型ウイルス陰性検体の測定
症状から判断して明らかにインフルエンザＡ型ウイルスに感染していない人から鼻腔吸引液を採取した。その鼻腔吸引液がインフルエンザＡ型ウイルス陰性であることを、市販のインフルエンザウイルス検出キット（商品名：キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ；日本ベクトン・ディキンソン社製）を用いて確認した。陰性が確認された人から採取した鼻腔吸引液を綿棒にからませ、前記検体抽出液１ｍＬに懸濁した（以下、「懸濁液」という）。前記懸濁液を使用し、下記の条件１および２でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。また、比較例２として、前記検体について下記の条件３でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。
症状から判断して明らかにインフルエンザＡ型ウイルスに感染していない人から鼻腔吸引液を採取した。その鼻腔吸引液がインフルエンザＡ型ウイルス陰性であることを、市販のインフルエンザウイルス検出キット（商品名：キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ；日本ベクトン・ディキンソン社製）を用いて確認した。陰性が確認された人から採取した鼻腔吸引液を綿棒にからませ、前記検体抽出液１ｍＬに懸濁した（以下、「懸濁液」という）。前記懸濁液を使用し、下記の条件１および２でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。また、比較例２として、前記検体について下記の条件３でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。
（実施例２−１：条件１）
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＳＰ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：スルホン酸基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＳＰ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：スルホン酸基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（実施例２−２：条件２）
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＣＭ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：カルボキシル基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＣＭ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：カルボキシル基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
（比較例２：条件３）
前記懸濁液をそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
前記懸濁液をそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。
前記条件１〜３の測定結果を下記表４に示す。同表の実施例において、検体番号１〜４が、条件１の方法で陽イオン交換処理を施した検体の測定結果であり（実施例２−１）、検体番号５〜７が、条件２の方法で陽イオン交換処理を施した検体の測定結果である（実施例２−２）。なお、同表において、吸光度変化量が０．００５０以上を陽性（＋）とし、０．００５０未満を陰性（−）と判定した。
前記表４に示すように、ラテックス凝集法によるインフルエンザＡ型ウイルスの測定において、陽イオン交換処理を行わない比較例２（条件３）では、インフルエンザＡ型ウイルスが陰性である検体を使用したにも関わらず、７検体中すべての検体で非特異的な凝集反応による偽陽性が生じた。一方、陽イオン交換処理を行った実施例２（条件１および２）では、すべての検体が本来の陰性結果となった。
この結果より、ラテックス凝集法による免疫凝集法において、検体に陽イオン交換処理を施すことにより、非特異的反応が充分に抑制できることがわかった。
なお、以上の実施例１および２では、予め陰性を確認した検体を用いて本発明の測定方法を行った例を示したが、本発明の測定方法によれば、陽性の検体では、陽性反応が検出されることがわかっている。
以上説明したように、本発明の免疫測定方法および測定用キットによれば、非特異的な反応を防止できるため、偽陽性が発生することなく、検出および定量精度の高い免疫測定方法を実現できる。したがって、本発明の免疫測定方法は、例えば、医学および生物学等の広い分野に適用でき、中でも、臨床検査の分野に特に有用である。
Claims (22)
- 検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、
検体と、前記検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子とを混合する工程、および、
抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定する工程を含み、
前記混合工程に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理する工程を含む免疫測定方法。 - 前記陽イオン交換物質が、陽イオン交換樹脂である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記陽イオン交換物質が、強酸性陽イオン交換物質および弱酸性陽イオン交換物質の少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記陽イオン交換物質が、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記陽イオン交換樹脂が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂から選択される少なくとも１つである請求の範囲２記載の免疫測定方法。
- 前記陽イオン交換物質の形態が、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムの少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記陽イオン交換フィルターが、球状の陽イオン交換樹脂を担体に担持させたフィルターまたは繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルターである請求の範囲６記載の免疫測定方法。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲９記載の免疫測定方法。
- 前記測定対象物質が、菌またはウイルスである請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 前記測定対象物質が、溶血性連鎖球菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、百日咳菌、クラミジア・トラコマティス、コロナウイルスおよびマイコプラズマからなる群から選択される少なくとも１つである請求の範囲１記載の免疫測定方法。
- 請求の範囲１記載の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と、陽イオン交換物質とを含む免疫測定用キット。
- 前記陽イオン交換物質が、陽イオン交換樹脂である請求の範囲１３記載の測定用キット。
- 前記陽イオン交換物質が、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質である請求の範囲１４記載の測定用キット。
- 前記陽イオン交換樹脂が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂から選択される少なくとも１つである請求の範囲１４記載の測定用キット。
- 前記陽イオン交換物質の形態が、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムの少なくとも一方である請求の範囲１３記載の測定用キット。
- 前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である請求の範囲１３記載の測定用キット。
- 前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲１８記載の測定用キット。
- さらに、試薬を含む試薬パックを含み、前記試薬が前記抗体感作粒子を含む請求の範囲１３記載の測定用キット。
- 前記試薬パックが、使い捨て可能なカートリッジ形状である請求の範囲２０記載の測定用キット。
- さらに、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液からなる群から選択される少なくとも１つを含む請求の範囲１３記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006536970A JP4969245B2 (ja) | 2005-07-25 | 2006-07-24 | 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005214895 | 2005-07-25 | ||
| JP2005214895 | 2005-07-25 | ||
| PCT/JP2006/314575 WO2007013401A1 (ja) | 2005-07-25 | 2006-07-24 | 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット |
| JP2006536970A JP4969245B2 (ja) | 2005-07-25 | 2006-07-24 | 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007013401A1 true JPWO2007013401A1 (ja) | 2009-02-05 |
| JP4969245B2 JP4969245B2 (ja) | 2012-07-04 |
Family
ID=37683298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006536970A Expired - Fee Related JP4969245B2 (ja) | 2005-07-25 | 2006-07-24 | 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080166701A1 (ja) |
| EP (1) | EP1867991B1 (ja) |
| JP (1) | JP4969245B2 (ja) |
| CN (1) | CN101147065A (ja) |
| AT (1) | ATE524738T1 (ja) |
| WO (1) | WO2007013401A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113049837A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-29 | 捷和泰（北京）生物科技有限公司 | 全血pct免疫比浊试剂 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104407145B (zh) * | 2014-10-28 | 2016-06-01 | 绍兴市疾病预防控制中心 | 肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备及应用 |
| CN104807995B (zh) * | 2015-05-13 | 2017-02-22 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的连续检测法gldh检测试剂 |
| JP6601932B2 (ja) | 2017-03-27 | 2019-11-06 | 日本ハム株式会社 | 体液による抗原抗体反応阻害を防止する物質 |
| WO2021252810A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Checkable Medical Incorporated | In vitro diagnostic device |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5587048A (en) * | 1978-12-25 | 1980-07-01 | Takeda Chem Ind Ltd | Preprocessing method and preprocessing agent for tested liquid for diagnostic reaction of pregnancy |
| JPS60188847A (ja) * | 1984-02-27 | 1985-09-26 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | 連鎖球菌ａの検出用試験セット及び検出方法 |
| JPH11248709A (ja) * | 1998-03-05 | 1999-09-17 | Denka Seiken Co Ltd | 抗原の測定方法 |
| JP2001318101A (ja) * | 2000-05-08 | 2001-11-16 | Arkray Inc | カートリッジ |
| US20020196435A1 (en) * | 2000-11-22 | 2002-12-26 | Cohen David Samuel | Apparatus and methods for separating agglutinants and disperse particles |
| WO2004003268A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Mosaic Systems Bv | Functional porous fibres |
| JP2005514014A (ja) * | 2001-12-20 | 2005-05-19 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 陰イオン交換を使用して、生物学的混合物から有機分子を除去するための方法およびデバイス |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1026621A (ja) * | 1996-07-12 | 1998-01-27 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | イムノアッセイ法 |
-
2006
- 2006-07-24 AT AT06781487T patent/ATE524738T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-07-24 WO PCT/JP2006/314575 patent/WO2007013401A1/ja active Application Filing
- 2006-07-24 US US11/885,131 patent/US20080166701A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-24 EP EP06781487A patent/EP1867991B1/en not_active Not-in-force
- 2006-07-24 JP JP2006536970A patent/JP4969245B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-24 CN CNA2006800096351A patent/CN101147065A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5587048A (en) * | 1978-12-25 | 1980-07-01 | Takeda Chem Ind Ltd | Preprocessing method and preprocessing agent for tested liquid for diagnostic reaction of pregnancy |
| JPS60188847A (ja) * | 1984-02-27 | 1985-09-26 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | 連鎖球菌ａの検出用試験セット及び検出方法 |
| JPH11248709A (ja) * | 1998-03-05 | 1999-09-17 | Denka Seiken Co Ltd | 抗原の測定方法 |
| JP2001318101A (ja) * | 2000-05-08 | 2001-11-16 | Arkray Inc | カートリッジ |
| US20020196435A1 (en) * | 2000-11-22 | 2002-12-26 | Cohen David Samuel | Apparatus and methods for separating agglutinants and disperse particles |
| JP2005514014A (ja) * | 2001-12-20 | 2005-05-19 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 陰イオン交換を使用して、生物学的混合物から有機分子を除去するための方法およびデバイス |
| WO2004003268A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Mosaic Systems Bv | Functional porous fibres |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113049837A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-29 | 捷和泰（北京）生物科技有限公司 | 全血pct免疫比浊试剂 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101147065A (zh) | 2008-03-19 |
| ATE524738T1 (de) | 2011-09-15 |
| JP4969245B2 (ja) | 2012-07-04 |
| EP1867991A1 (en) | 2007-12-19 |
| EP1867991B1 (en) | 2011-09-14 |
| US20080166701A1 (en) | 2008-07-10 |
| EP1867991A4 (en) | 2008-06-04 |
| WO2007013401A1 (ja) | 2007-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4617431B2 (ja) | 検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法 | |
| JP3853317B2 (ja) | 複数感染症の同時検出診断キットおよびその製造方法 | |
| JP5351054B2 (ja) | 不溶性担体粒子の製造方法、不溶性担体粒子、測定試薬、検体分析用具および免疫比濁法 | |
| JP7192146B2 (ja) | 免疫検査方法及び濃縮用治具 | |
| JP2008524604A (ja) | 減少した試料マトリックス効果を有するアッセイ方法及び装置 | |
| JP4969245B2 (ja) | 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット | |
| Cui et al. | Reagent free detection of SARS-CoV-2 using an antibody-based microwave sensor in a microfluidic platform | |
| TWI696833B (zh) | 有機著色微粒子、診斷藥套組及體外診斷方法 | |
| Qian et al. | Hand-powered centrifugal micropipette-tip with distance-based quantification for on-site testing of SARS-CoV-2 virus | |
| JPH0743384B2 (ja) | アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 | |
| WO2013146977A1 (ja) | 免疫分析方法及び試薬 | |
| JP4199606B2 (ja) | 免疫クロマトグラフィー検査用検体前処理液、免疫クロマトグラフィー検査方法及び免疫クロマトグラフィー検査キット | |
| Chen et al. | Osmotic processor for enabling sensitive and rapid biomarker detection via lateral flow assays | |
| CN109633168A (zh) | 乙型肝炎病毒e抗原、e抗体联合检测试剂盒 | |
| JP2007121204A (ja) | 塩基性多糖類を含有する免疫測定法用検体処理液組成物及びキット、並びにこれらを用いる免疫測定法 | |
| JP3786543B2 (ja) | 免疫学的測定試薬 | |
| Nabatiyan et al. | A lateral flow-based ultra-sensitive p24 HIV assay utilizing fluorescent microparticles | |
| WO2021247335A1 (en) | Viral diagnostics | |
| JPS6224745B2 (ja) | ||
| JP3968287B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| WO2024038863A1 (ja) | 免疫分析方法及び試薬 | |
| CN109613239B (zh) | A群轮状病毒检测试纸 | |
| JP2004117068A (ja) | 免疫測定試薬および免疫測定方法 | |
| JPS6262291B2 (ja) | ||
| JP2004117022A (ja) | 免疫測定における非特異反応抑制方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090624 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120220 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120329 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120403 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150413 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |