JPWO2006085407A1 - Ｈｃｖ量に関連する遺伝子のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
多量のＨＣＶを含む高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、 （ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、 （ｃ）前記低ウイルス群組織よりも高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ を含む前記方法。
Description
本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡの高ウイルス群において発現亢進している遺伝子および低ウイルス群において発現亢進している遺伝子をスクリーニングする方法に関する。
肝炎ウイルスは、肝疾患の主な原因である。特に、慢性肝疾患の八割はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染が原因となっている。ＨＣＶの感染の７０〜８０％は、一過性感染で終わらず持続感染が成立する。その後、慢性肝炎、肝硬変を経て、２０〜３０年かけて肝細胞癌に進展する。したがって、肝細胞癌発症の高危険群である、Ｃ型慢性肝炎の段階での根治が望ましい。現在、抗ウイルス薬としてインターフェロン（ＩＦＮ）が認可され使用されている。しかし、約３０％にしか効果がないため、依然として有効な治療法はない状況である。
ＨＣＶそのものによる細胞障害性はほとんどないにも拘わらず、重篤な肝疾患を引き起こすことが知られている。Ｃ型肝炎の肝障害は、ＨＣＶを排除しようとする宿主免疫反応により引き起こされている。しかし、免疫応答が不十分なため、ＨＣＶを完全に排除することができず持続感染につながると考えられている。たとえ、ＨＣＶを完全に排除できなくとも、ウイルス量を抑えることができれば病態の進展を食い止めることができるはずである。一般にＨＣＶの増殖能は低いが、中には肝臓ウイルス量が１０００倍以上多い症例が存在する。この肝臓ウイルス量の違いが何に起因するかは明らかではない。
ＨＣＶそのものによる細胞障害性はほとんどないにも拘わらず、重篤な肝疾患を引き起こすことが知られている。Ｃ型肝炎の肝障害は、ＨＣＶを排除しようとする宿主免疫反応により引き起こされている。しかし、免疫応答が不十分なため、ＨＣＶを完全に排除することができず持続感染につながると考えられている。たとえ、ＨＣＶを完全に排除できなくとも、ウイルス量を抑えることができれば病態の進展を食い止めることができるはずである。一般にＨＣＶの増殖能は低いが、中には肝臓ウイルス量が１０００倍以上多い症例が存在する。この肝臓ウイルス量の違いが何に起因するかは明らかではない。
上記の通り、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス量は、症例により違いがある。本発明者は、これらの違いが何によるものかを明らかにすれば、自然経過における抗ウイルス作用機構を知ることができるとともに、抗ウイルス治療薬開発に役立つ標的分子を明らかにできると考えた。
本発明者は、上記課題を解決するために、ヒト慢性肝炎症例から、高ウイルス量と低ウイルス量の症例を複数選別し、この２群間でどのような遺伝子の発現に差が生じているのかを、２つの方法により調べた。（１）細胞にウイルスが感染すると、ウイルスの排除機構としてＩＦＮが誘導される。そのＩＦＮは、様々な抗ウイルス作用分子を誘導してウイルス排除に向かう。この宿主防御反応の強弱が、肝臓ＨＣＶ量の多い、または、少ない状況を作り出している要因であるか調べるため、ウイルス量の異なる２群間で、ＩＦＮ下流遺伝子およびそれを介しておこるアポトーシスに関与するＢｃｌ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＡＸ）の発現量を比較した。（２）ウイルス量のコントロールに関与する新規の遺伝子を探し出すため、高ウイルス群と低ウイルス群症例を各４例選びＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いた網羅的発現解析を行った。鋭意研究の結果、ヒト慢性肝炎組織から高ウイルス量および低ウイルス量の症例を複数選び、ウイルス側及び宿主側からの要因を検討することによって、高ウイルス量および低ウイルス量で高発現する遺伝子を見出す方法の確立に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）多量のＨＣＶを含む高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記低ウイルス群組織よりも高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。
（２）少量のＨＣＶを含む低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記高ウイルス群組織よりも低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。
（３）遺伝子の発現量の測定がマイクロアレイおよび／またはリアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする、（１）または（２）記載の方法。
（４）高ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、低ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、（１）記載の方法。
（５）低ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、高ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、（２）記載の方法。
（６）低ウイルス群組織又は高ウイルス群組織を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類することを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号５４〜１３１で表される塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号５４〜１３１で表される塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号１３２〜１７０で表される塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号１３２〜１７０で表される塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（８）以下の（ａ）〜（ｈ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｅ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｆ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｇ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｈ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（９）マイクロアレイの形態である、（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の検査薬。
本発明者は、上記課題を解決するために、ヒト慢性肝炎症例から、高ウイルス量と低ウイルス量の症例を複数選別し、この２群間でどのような遺伝子の発現に差が生じているのかを、２つの方法により調べた。（１）細胞にウイルスが感染すると、ウイルスの排除機構としてＩＦＮが誘導される。そのＩＦＮは、様々な抗ウイルス作用分子を誘導してウイルス排除に向かう。この宿主防御反応の強弱が、肝臓ＨＣＶ量の多い、または、少ない状況を作り出している要因であるか調べるため、ウイルス量の異なる２群間で、ＩＦＮ下流遺伝子およびそれを介しておこるアポトーシスに関与するＢｃｌ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＡＸ）の発現量を比較した。（２）ウイルス量のコントロールに関与する新規の遺伝子を探し出すため、高ウイルス群と低ウイルス群症例を各４例選びＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いた網羅的発現解析を行った。鋭意研究の結果、ヒト慢性肝炎組織から高ウイルス量および低ウイルス量の症例を複数選び、ウイルス側及び宿主側からの要因を検討することによって、高ウイルス量および低ウイルス量で高発現する遺伝子を見出す方法の確立に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）多量のＨＣＶを含む高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記低ウイルス群組織よりも高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。
（２）少量のＨＣＶを含む低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記高ウイルス群組織よりも低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。
（３）遺伝子の発現量の測定がマイクロアレイおよび／またはリアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする、（１）または（２）記載の方法。
（４）高ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、低ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、（１）記載の方法。
（５）低ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、高ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、（２）記載の方法。
（６）低ウイルス群組織又は高ウイルス群組織を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類することを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号５４〜１３１で表される塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号５４〜１３１で表される塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号１３２〜１７０で表される塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号１３２〜１７０で表される塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（８）以下の（ａ）〜（ｈ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｅ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｆ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｇ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｈ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（９）マイクロアレイの形態である、（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の検査薬。
図１は、インターフェロン作用機構を示す図である。ウイルス感染によりインターフェロン（ＩＦＮ）α／βが誘導されると、Ｊａｋ‐Ｓｔａｔシグナル伝達系を介して転写因子ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆａｃｔｏｒ（ＩＳＧＦ）３が誘導される。この転写因子がＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＳＲＥ）に結合し、ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ＩＳＧ）の転写が誘導される。ここでは４つのＩＳＧ‐ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＭｘＡ），２’，５’ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＯＡＳ），ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＲ），ｐ５３−の誘導を示す。ＭｘＡはウイルスＲＮＡに結合し、ＲＮＡ複製を阻害する。ＯＡＳやＰＫＲは宿主細胞内反応をｓｈｕｔ−ｏｆｆすることによりウイルス増殖を抑制する。ｐ５３はＢｃｌ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＡＸ）を介して宿主細胞のアポトーシスを誘導し、ウイルス増殖を抑制する。これら宿主のウイルス感染防御反応に対し、ＨＣＶタンパク質は複数の抑制機構をもって対抗している。
図２は、肝臓ＨＣＶ ＲＮＡの定量結果を示す図である。低ウイルス群（Ｌｏｗ）１５例（慢性肝炎９例、肝硬変６例）、高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）１９例（慢性肝炎９例、肝硬変１０例）のＨＣＶ ＲＮＡ量を示した。グラフ棒の下にＨＣＶ遺伝子型を示す。記載のない症例は、すべて１ｂ型である。また「＋２ａ」は、１ｂ型と２ａ型との二重感染を意味する。黒棒は慢性肝炎、斜線棒は肝硬変、「▼」はｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析に用いた症例を示す。
図３は、高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）と低ウイルス群（Ｌｏｗ）とで発現量に差があった遺伝子を示す図である。高ウイルス群１４例（慢性肝炎５例と肝硬変９例）と低ウイルス群１１例（慢性肝炎６例と肝硬変５例）とを用いて発現量を比較した。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにて有意差を検定した（ｐ＜０．０５）。横線は有意差のあった慢性肝炎症例の中央値を示す。「●」は慢性肝炎患者由来の遺伝子発現量を示し、「○」は肝硬変患者由来の遺伝子発現量を示す。
図４は、高ウイルス群と低ウイルス群とで発現量に差のある遺伝子の求め方を示す図である。慢性肝炎高ウイルス群４例と低ウイルス群４例とを用いた８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙについて、二群間の比較で２倍以上発現量に差のあった遺伝子を探し出した。用いたｍｉｃｒｏａｒｒａｙ１枚には約４７，０００遺伝子以上を網羅する５４，６７５ｐｒｏｂｅが載っている。少なくとも１枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで発現有りの表記がでたｐｒｏｂｅを選択し（２８，５０５）、２群間の比較で３種類のパラメトリック検定を行った。それぞれで有意に発現量が異なるｐｒｏｂｅ数を求めた。いずれの検定でも選ばれた共通ｐｒｏｂｅ６８３個について、２群間で２倍以上差のあるｐｒｏｂｅを選び、さらに発現量の多い群４枚とも発現有りの表記がでたｐｒｏｂｅを選んだ。最終的には遺伝子として、高ウイルス群に発現優位のものを高ウイルス遺伝子、低ウイルス群に発現優位のものを低ウイルス遺伝子とした。
図５は、クラスタリング解析によるＣｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅを示す図である。２群間で発現量に差のあった遺伝子１１７遺伝子（Ａ）と肝臓に発現していた２８，５０５ｐｒｏｂｅ（Ｂ）とを用いて８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのクラスタリングを行った。ｍｉｃｒｏａｒｒａｙは、高ウイルス群のなかでウイルス量の多い順にＨ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４とし、低ウイルス群でウイルス量の少ない順にＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４とした。
図６は、内在性コントロール遺伝子の発現定量の結果を示す図である。（Ａ）ＧＡＰＤＨとＲＰＬ３４のシグナルを８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで比較した。ｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ後のシグナル値を用いた。（Ｂ）３４例の肝臓ｃＤＮＡにおける１８Ｓ ｒＲＮＡ，ＲＰＬ３４，ＧＡＰＤＨ量をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて定量した。発現量は各遺伝子の中央値を１とした補正値で表した。「○」は低ウイルス群、「●」は高ウイルス群を示す。
図７は、高ウイルス遺伝子および低ウイルス遺伝子のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現定量の結果を示す図である。各３つの高ウイルス遺伝子（Ａ，Ｂ，Ｃ）と低ウイルス遺伝子（Ｄ，Ｅ，Ｆ）について、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにより発現定量を行い、慢性肝炎高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）９例と低ウイルス群（Ｌｏｗ）９例とで比較した。ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに用いた各４例は、灰色丸で示した。遺伝子の発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡで補正した値を用いた。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにて有意差を検定した（ｐ＜０．０５）。横線は慢性肝炎９症例の中央値を示す。
図８は、１１７ｐｒｏｂｅの遺伝子構造上の位置と分類を示す図である。ボックス（□）と白矢印により、ｅｘｏｎ５個からなる遺伝子とその方向を示す。黒矢印はｍｉｃｒｏａｒｒａｙに使用されたｐｒｏｂｅの位置とその方向を示す。（５）は遺伝子が同定されていない領域に、転写産物が証明されている場合を示す。右の数字は、高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個の各分類別遺伝子数を示す。
図９は、慢性肝炎における遺伝子発現量の解析の概要を示す図である。
図１０は、肝硬変における遺伝子発現量の解析の概要を示す図である。
図１１は、慢性肝炎と肝硬変において共通に発現する遺伝子の有無を解析した結果を示す図である。
図１２は、クラスタリング解析結果を示す図である。
図１３は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに使用されたｐｒｏｂｅの遺伝子構造上の位置と分類を示す図である。
図１４は、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１５は、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１６は、肝硬変における低ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１７は、癌部と非癌部におけるＨＣＶ量の定量結果を示す図である。
図１８は、受容体関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。
図１９は、受容体関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。
図２は、肝臓ＨＣＶ ＲＮＡの定量結果を示す図である。低ウイルス群（Ｌｏｗ）１５例（慢性肝炎９例、肝硬変６例）、高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）１９例（慢性肝炎９例、肝硬変１０例）のＨＣＶ ＲＮＡ量を示した。グラフ棒の下にＨＣＶ遺伝子型を示す。記載のない症例は、すべて１ｂ型である。また「＋２ａ」は、１ｂ型と２ａ型との二重感染を意味する。黒棒は慢性肝炎、斜線棒は肝硬変、「▼」はｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析に用いた症例を示す。
図３は、高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）と低ウイルス群（Ｌｏｗ）とで発現量に差があった遺伝子を示す図である。高ウイルス群１４例（慢性肝炎５例と肝硬変９例）と低ウイルス群１１例（慢性肝炎６例と肝硬変５例）とを用いて発現量を比較した。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにて有意差を検定した（ｐ＜０．０５）。横線は有意差のあった慢性肝炎症例の中央値を示す。「●」は慢性肝炎患者由来の遺伝子発現量を示し、「○」は肝硬変患者由来の遺伝子発現量を示す。
図４は、高ウイルス群と低ウイルス群とで発現量に差のある遺伝子の求め方を示す図である。慢性肝炎高ウイルス群４例と低ウイルス群４例とを用いた８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙについて、二群間の比較で２倍以上発現量に差のあった遺伝子を探し出した。用いたｍｉｃｒｏａｒｒａｙ１枚には約４７，０００遺伝子以上を網羅する５４，６７５ｐｒｏｂｅが載っている。少なくとも１枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで発現有りの表記がでたｐｒｏｂｅを選択し（２８，５０５）、２群間の比較で３種類のパラメトリック検定を行った。それぞれで有意に発現量が異なるｐｒｏｂｅ数を求めた。いずれの検定でも選ばれた共通ｐｒｏｂｅ６８３個について、２群間で２倍以上差のあるｐｒｏｂｅを選び、さらに発現量の多い群４枚とも発現有りの表記がでたｐｒｏｂｅを選んだ。最終的には遺伝子として、高ウイルス群に発現優位のものを高ウイルス遺伝子、低ウイルス群に発現優位のものを低ウイルス遺伝子とした。
図５は、クラスタリング解析によるＣｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅを示す図である。２群間で発現量に差のあった遺伝子１１７遺伝子（Ａ）と肝臓に発現していた２８，５０５ｐｒｏｂｅ（Ｂ）とを用いて８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのクラスタリングを行った。ｍｉｃｒｏａｒｒａｙは、高ウイルス群のなかでウイルス量の多い順にＨ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４とし、低ウイルス群でウイルス量の少ない順にＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４とした。
図６は、内在性コントロール遺伝子の発現定量の結果を示す図である。（Ａ）ＧＡＰＤＨとＲＰＬ３４のシグナルを８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで比較した。ｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ後のシグナル値を用いた。（Ｂ）３４例の肝臓ｃＤＮＡにおける１８Ｓ ｒＲＮＡ，ＲＰＬ３４，ＧＡＰＤＨ量をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて定量した。発現量は各遺伝子の中央値を１とした補正値で表した。「○」は低ウイルス群、「●」は高ウイルス群を示す。
図７は、高ウイルス遺伝子および低ウイルス遺伝子のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現定量の結果を示す図である。各３つの高ウイルス遺伝子（Ａ，Ｂ，Ｃ）と低ウイルス遺伝子（Ｄ，Ｅ，Ｆ）について、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにより発現定量を行い、慢性肝炎高ウイルス群（Ｈｉｇｈ）９例と低ウイルス群（Ｌｏｗ）９例とで比較した。ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに用いた各４例は、灰色丸で示した。遺伝子の発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡで補正した値を用いた。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにて有意差を検定した（ｐ＜０．０５）。横線は慢性肝炎９症例の中央値を示す。
図８は、１１７ｐｒｏｂｅの遺伝子構造上の位置と分類を示す図である。ボックス（□）と白矢印により、ｅｘｏｎ５個からなる遺伝子とその方向を示す。黒矢印はｍｉｃｒｏａｒｒａｙに使用されたｐｒｏｂｅの位置とその方向を示す。（５）は遺伝子が同定されていない領域に、転写産物が証明されている場合を示す。右の数字は、高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個の各分類別遺伝子数を示す。
図９は、慢性肝炎における遺伝子発現量の解析の概要を示す図である。
図１０は、肝硬変における遺伝子発現量の解析の概要を示す図である。
図１１は、慢性肝炎と肝硬変において共通に発現する遺伝子の有無を解析した結果を示す図である。
図１２は、クラスタリング解析結果を示す図である。
図１３は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに使用されたｐｒｏｂｅの遺伝子構造上の位置と分類を示す図である。
図１４は、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１５は、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１６は、肝硬変における低ウイルス遺伝子について発現の検証を行った結果を示す図である。
図１７は、癌部と非癌部におけるＨＣＶ量の定量結果を示す図である。
図１８は、受容体関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。
図１９は、受容体関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定するものではない。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．本発明の概要
ＨＣＶに感染した慢性肝炎、肝硬変肝組織において、ウイルス量の多い症例と少ない症例が存在することが知られている。本発明者は、このウイルス量の違いが宿主側の何に起因するかを明らかにする目的で、ヒト慢性肝炎組織のさまざまな遺伝子の発現レベルを調べ、ウイルス増殖に関連する宿主側要因を検討した。
具体的には、本発明者は、対象症例であるＣ型肝細胞癌の非癌部組織を、ＨＣＶ ＲＮＡ量の多い高ウイルス群と、ＨＣＶ ＲＮＡ量の少ない低ウイルス群とに選別し、この２群間での遺伝子の発現レベルを解析し、それぞれの群において発現が亢進している遺伝子を見出した。
したがって、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ量の多い高ウイルス群において、発現亢進している遺伝子のスクリーニング方法、および、ＨＣＶ ＲＮＡ量の少ない低ウイルス群において、発現亢進している遺伝子のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、高ウイルス群又は低ウイルス群において発現亢進している遺伝子を含む、ウイルス量に関連する病態の検査薬を提供する。
２．高ウイルス群および低ウイルス群
本発明の方法の好ましい態様においては、まず、解析対象をＨＣＶ ＲＮＡ量によって、高ウイルス群または低ウイルス群に分類する。
（１）試料
本発明の方法の対象となる組織は、Ｃ型肝細胞癌患者の非癌部組織である。また、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した慢性肝炎、肝硬変の組織であってもよい。組織は採取後すぐに本発明の方法を実施しない場合は、液体窒素で凍結して、−８０℃にて保存することもできる。
続いて、組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。組織からＲＮＡを抽出する方法は、当業者であれば適宜選択することができるが、例えばＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることができる。
（２）ＨＣＶ ＲＮＡ量の測定
ＨＣＶ ＲＮＡ量は、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲによって測定することができる。ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲには、例えば、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いることができる。
ＨＣＶ ＲＮＡ量の測定は、２．（１）で得られたＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの例えば５０ｎｇ相当を用いて実施することができる。そのとき、プライマーとしては、例えば
Ｆｏｒｗａｒｄ（５’−３’）：ＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣ （配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−３’）：ＧＣＡＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ （配列番号２）
を０．３μＭ用いてもよい。
ＨＣＶ全長を組み込んだプラスミドＤＮＡを用いて検量線を作成し、ＨＣＶ ＲＮＡ量の定量に用いる。
本発明において、ＨＣＶ ＲＮＡ量は、「ｕｎｉｔ」で表す。「ｕｎｉｔ」は、検量線作成に用いたプラスミドＤＮＡ量をｃｏｐｙ数に換算し、検量線から肝組織由来のｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡコピー数を求め、１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値を意味する。
「１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値」は、ある肝臓由来のｃＤＮＡ（標準サンプル）中の１８Ｓ ｒＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで測定して、標準サンプルｃＤＮＡに対する検量線を作成したときの、肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ相当における標準サンプルｃＤＮＡ量を意味する。肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ相当における標準サンプルｃＤＮＡ量は検量線から求めることができる。
例えば、肝組織由来のｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡコピー数が８０００であり、肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ当りの１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値が０．２ｎｇのときは、４００００ｕｎｉｔとなる（８０００×１／０．２＝４００００）。
（３）対象症例の選別
本発明において、「低ウイルス群」とは、ＨＣＶ ＲＮＡ量が３００ｕｎｉｔ以下の症例を意味する。
本発明において、「高ウイルス群」とは、ＨＣＶ ＲＮＡ量が３００００ｕｎｉｔ以上の症例を意味する。
３．遺伝子の発現量の測定
本発明の方法は、ＨＣＶ ＲＮＡ量によって、解析対象を前記の高ウイルス群と低ウイルス群とに選別して行うことを特徴とする。
さらに、本発明は、高ウイルス群および低ウイルス群をＨＣＶ遺伝子型によって選別することもできる。すなわち、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型の４つのＨＣＶ遺伝子型特異的ＰＣＲを行うことでＨＣＶ遺伝子型を明らかにし、ＨＣＶの特定の遺伝子型に注目して、宿主遺伝子の発現量解析を行うこともできる。
また、高ウイルス群および低ウイルス群から慢性肝炎または肝硬変の症例のみを抽出して、宿主遺伝子の発現量解析を行うこともできる。
本発明の遺伝子スクリーニング方法において、遺伝子の発現量の測定にはオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはリアルタイムＰＣＲを用いることができる。
また、高ウイルス群または低ウイルス群で発現亢進する遺伝子をオリゴヌクレオチドマイクロアレイで選択した後、これらの遺伝子の中から高ウイルス群または低ウイルス群で発現亢進する遺伝子をリアルタイムＰＣＲでさらに絞って選択することもできる。
（１）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ
（ａ）発現解析方法
宿主の遺伝子の発現量を測定するために、まず、２．（１）で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからｂｉｏｔｉｎ−標識ｃＲＮＡを合成する。合成は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓのマニュアルを一部改変して実施することができる（実施例２（１）参照）。得られたｃＲＮＡは、標的遺伝子サンプルとして使用するために、適宜精製し、断片化する。精製、断片化は、当業者であれば容易に実施することができる。
マイクロアレイは、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）などの市販品を用いることが好ましいが、これに限定されるわけではない。
次に、作製したｃＲＮＡ断片を標的遺伝子サンプルとしてアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ、洗浄、染色には、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）などの機器を用いることもできる。ハイブリダイズ、洗浄、染色の方法は、市販アレイであれば、添付のマニュアルにしたがうことが好ましい。
続いて、スキャナー（たとえば、Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））にて遺伝子発現のシグナルを読み取り、解析する。遺伝子発現シグナルの解析には、ソフトウェアを用いることが好ましく、ソフトウェアには、例えば、Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）を挙げることができる。
シグナル値の補正は、マイクロアレイ毎に中央値を１とする「ｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ」を行い、つづいて、遺伝子毎に中央値を１とする「ｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ」を行うことが好ましい。
（ｂ）統計学的解析
本発明において、分割表の検定は、χ２検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いる。また、２群間の有意差検定は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いることが好ましい。
（ｃ）発現解析手順
高ウイルス群において発現亢進している遺伝子を選択する方法、および低ウイルス群において発現亢進している遺伝子を選択する方法を以下に示す。
同時に複数試料で発現解析を行う場合は、まず、複数枚のマイクロアレイのうち、少なくとも１枚で発現の確認された（「ｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇ」の出た）プローブを抽出することができる。このプローブに対応する遺伝子が、ＨＣＶに感染した患者の肝臓に発現している遺伝子である。
ここで「プローブ」は、マイクロアレイにセットした、遺伝子の一部を意味する。「プローブに対応する遺伝子」とは、プローブの元となった遺伝子を意味する。
次に、高ウイルス群と低ウイルス群との２群間で発現に有意な差がある遺伝子を抽出するために、パラメトリック検定を行うことができる。例えば、２群で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、あるいは、少ないｒｅｐｌｉｃａｔｅからできるだけ正確な母分散を見積もるため、ｒｅｐｌｉｃａｔｅを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算するＣｒｏｓｓ−ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌのパラメトリック検定が挙げられる。本発明において、検定は１種類でもよいし、複数種類でもよいが、複数行うことが好ましい。
複数の検定を行う場合は、これらの検定で抽出されたプローブの重複を調べるために、Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍを作製することが好ましい。
続いて、１種類の検定で抽出されたプローブ、または複数の検定で共通に抽出されたプローブを対象にして、２群間で発現亢進の程度が２倍以上、すなわち、２群間での発現量に２倍以上差のあるプローブを選択できる。発現亢進の程度の差は、好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。選択されたプローブのうち、高ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が、高ウイルス群において発現亢進している遺伝子（以下「高ウイルス遺伝子」ともいう）であり、低ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が、低ウイルス群において発現亢進している遺伝子（以下「低ウイルス遺伝子」ともいう）である。
また、場合によっては、さらに、複数枚のマイクロアレイのすべてにおいて、または高発現群のマイクロアレイのすべてにおいてｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇのついているものに絞って、プローブを抽出することもできる。また、プローブの対応する遺伝子が同一であり重複するものや、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては測定できない遺伝子（例えば、ｒＲＮＡなど）を除くこともできる。このように選択されるプローブにおいても、高ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が高ウイルス遺伝子であり、低ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が低ウイルス遺伝子である。
本発明者は、上記方法により、高ウイルス遺伝子として７８個（表５）、および低ウイルス遺伝子として３９個（表６Ａ）の、計１１７個の遺伝子を選択することができた（実施例２）。そのうち、２群間で２．５倍以上差のあった遺伝子をさらに表３および表４に示す。
また、高ウイルス群及び低ウイルス群のそれぞれについて、慢性肝炎と肝硬変に分類して４つの群とし、それぞれの群の遺伝子発現を解析した結果、慢性肝炎高ウイルス遺伝子として６６個（表１０）、慢性肝炎低ウイルス遺伝子として２１個（表１１）、肝硬変高ウイルス遺伝子として２７個（表１２）、肝硬変低ウイルス遺伝子として１７個（表１３）を得た（実施例５）。
（２）リアルタイムＰＣＲ
（ａ）発現解析方法
本発明において、リアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子の発現量を測定する場合は、まず、上記２．（１）で得られたＲＮＡを、適宜ＤＮａｓｅＩ処理し、精製して、ランダムプライマーと逆転写酵素とでｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素は、例えばＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｕｒｇ，ＭＤ）を用いることができる。また、ランダムプライマーの代わりにＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いることもできる。
リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の発現量の測定は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）やＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）などの市販の機器を用いて行うことができる。
反応は例えば、１０ｎｇ相当のｃＤＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＭの各種遺伝子プライマーを含む２５μｌ反応液中で、９５℃、１０ｍｉｎのｐｒｅｈｅａｔ後、９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ ６０ｓｅｃを４５ｃｙｃｌｅ行うことができる。このとき、１８Ｓ ｒＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子の定量には、例えば０．２５ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行うことができる。
反応に用いるプライマーは、当業者であればソフトウェアを用いて適宜設計することができる。代表的なソフトウェア「ｐｒｉｍｅｒ３」のＵＲＬを下記に示す。
（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）
ｐｒｉｍｅｒ３を用いて設計したプライマーの例を下記の表１に示す。
ある肝臓ｃＤＮＡを定量用の標準サンプルに用いて検量線を作成し、各種遺伝子の定量に用いる。例えば、各遺伝子で最も高い発現を示す肝臓ｃＤＮＡを標準サンプルとし、そのｃＤＮＡの量を定量値に用いることができる。測定対象のサンプルのｃＤＮＡを一定量、遺伝子ＸのリアルタイムＰＣＲにかけて、そのサンプルが検量線から５ｎｇと評価できれば、そのサンプルには標準サンプルｃＤＮＡの５ｎｇに含まれる遺伝子Ｘ ｍＲＮＡと等量の遺伝子Ｘ ｍＲＮＡが存在することになる。
本発明において、各遺伝子発現量は、検量線から得られた測定対象サンプル中の各遺伝子発現定量値を内在性コントロール遺伝子発現定量値（例えば上記測定対象サンプル中の１８ｓ ｒＲＮＡの定量値）で除した相対値で表すことができる。
（ｂ）内在性コントロール遺伝子
本発明において「内在性コントロール遺伝子」は、１８Ｓ ｒＲＮＡ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）を用いることができるが、発現量のばらつきが小さい点で１８Ｓ ｒＲＮＡが好ましい。
（ｃ）発現解析手順
上記のように、宿主の各遺伝子の発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡで補正した値を用いることができる。補正の後、低ウイルス群の発現量と高ウイルス群の発現量とを比較する。例えば、高ウイルス群の発現量の中央値を低ウイルス群の中央値で割ったときの値が、２以上、好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上の遺伝子を高ウイルス遺伝子として選択することができる。逆に、低ウイルス群の中央値を高ウイルス群の発現量の中央値で割ったときの値が、２以上、好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上の遺伝子を低ウイルス遺伝子として選択することができる。
また、このとき、２群間でＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行い、上記遺伝子の中でも、有意差（Ｐ＜０．０５）の遺伝子を選択することがより好ましい。
４．高ウイルス遺伝子および低ウイルス遺伝子
（１）高ウイルス遺伝子
高ウイルス遺伝子では、ＨＣＶを排除しようとする高ウイルス群の宿主防御機能の能力を超えて誘導された遺伝子が含まれていると考えられる。したがって、高ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶ側にとって増殖有利に働くと予想される因子が存在する可能性がある。
すなわち、本発明によってスクリーニングされる高ウイルス遺伝子の発現を抑制すれば、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することが可能となるだろう。高ウイルス遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス増殖抑制剤やＣ型肝炎ウイルス増殖抑制方法の開発につながることが予想される。
（２）低ウイルス遺伝子
低ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。すなわち、本発明によってスクリーニングされる低ウイルス遺伝子の発現を亢進すれば、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することが可能となる。低ウイルス遺伝子の発現を亢進することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス増殖抑制剤やＣ型肝炎ウイルス増殖抑制方法の開発につながることが期待できる。
（３）疾患別に発現する遺伝子
本発明においては、上記高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類して発現量の解析を行うことができる。例えば、患者背景因子として慢性肝炎症例と肝硬変症例に分類し、それぞれの項目（性別、年齢、病期等）についてウイルス量を指標として２群間の比較を行うことができる。
なお、本発明においては高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類するという順序でもよく、病態（慢性肝炎由来及び肝硬変）を分類した後に高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を分類するという順序でもよく、順序に限定されるものではない。すなわち、本発明における遺伝子発現解析は、遺伝子群が、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子群（ＣＨＨ群）、慢性肝炎における低ウイルス遺伝子群（ＣＨＬ群）、肝硬変における高ウイルス遺伝子群（ＬＣＨ群）、及び肝硬変における低ウイルス遺伝子群（ＬＣＬ群）の４通りに分類されている限り、分類の順序は問わないものとする。
（４）解析された遺伝子
本発明において解析された遺伝子を以下に示す。
＜高ウイルス遺伝子＞（表５）
（ａ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
＜低ウイルス遺伝子＞（表６）
（ｃ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
また、疾患別に分類したときの遺伝子群を以下に示す。
（ｉ）ＣＨＨ遺伝子群（表１０）
（ａ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｉ）ＣＨＬ遺伝子群）（表１１）
（ｃ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｉｉ）ＬＣＨ遺伝子群（表１２）
（ｅ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｆ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｖ）ＬＣＬ遺伝子群（表１３）
（ｇ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｈ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
上記各遺伝子において、「ストリンジェントな条件」とは、核酸同士がハイブリダイズしたときの洗浄条件であってバッファーの塩濃度と温度により規定される条件である。例えば、０．５〜２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの濃度で３７〜５２℃の条件を挙げることができ、よりストリンジェントな条件としては、例えば２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃の条件、０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで４２℃の条件等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブの濃度や長さ、あるいは反応時間等の諸条件を加味し、適切な条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等を参照することができる。
本発明において遺伝子が「発現が亢進する」とは、リアルタイムＰＣＲにより定量解析を行い、得られた定量値が比較したいウイルス量の異なる群よりも高い場合を言う。
５．病態検査薬
本発明において解析された、ＣＨＨ遺伝子群、ＣＨＬ遺伝子群、ＬＣＨ遺伝子群またはＬＣＬ遺伝子群に属するそれぞれの遺伝子は、ＣＨＨ遺伝子群及びＣＨＬ遺伝子群については慢性肝炎におけるウイルス量のマーカーとなり、ＬＣＨ遺伝子群及びＬＣＬ遺伝子群は肝硬変におけるウイルス量のマーカーとなり得る。したがって、患者等から得られた肝組織からこれらの遺伝子の発現量を解析することで、どの疾患でどの程度ウイルスが増殖している病態か、どの程度肝機能を維持し、どのような抗ウイルス反応を惹起できるかなどを判断することができる。
また、本発明において解析された遺伝子は、患者等の肝組織から得られた遺伝子とのハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーションによってシグナルを検出することで、ウイルス量に関連したどの病態にあるかを判断することができる。ハイブリダイゼーション条件および標識方法は、当業者に周知であり、本明細書に記載の方法のほか、任意の方法を採用することができる。
従って、上記遺伝子は、ウイルス量に関連する病態の検査薬として使用することができる。上記遺伝子をマイクロアレイに搭載することで、簡易かつ網羅的に遺伝子の発現量解析を行うことが可能である。
本発明において、上記遺伝子は緩衝液（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、標識試薬（例えば蛍光標識試薬）等とともにキットの形態で使用することができる。上記遺伝子が搭載されたマイクロアレイをキットに含めることもできる。
以下、本発明を具体的な例を挙げて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．本発明の概要
ＨＣＶに感染した慢性肝炎、肝硬変肝組織において、ウイルス量の多い症例と少ない症例が存在することが知られている。本発明者は、このウイルス量の違いが宿主側の何に起因するかを明らかにする目的で、ヒト慢性肝炎組織のさまざまな遺伝子の発現レベルを調べ、ウイルス増殖に関連する宿主側要因を検討した。
具体的には、本発明者は、対象症例であるＣ型肝細胞癌の非癌部組織を、ＨＣＶ ＲＮＡ量の多い高ウイルス群と、ＨＣＶ ＲＮＡ量の少ない低ウイルス群とに選別し、この２群間での遺伝子の発現レベルを解析し、それぞれの群において発現が亢進している遺伝子を見出した。
したがって、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ量の多い高ウイルス群において、発現亢進している遺伝子のスクリーニング方法、および、ＨＣＶ ＲＮＡ量の少ない低ウイルス群において、発現亢進している遺伝子のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、高ウイルス群又は低ウイルス群において発現亢進している遺伝子を含む、ウイルス量に関連する病態の検査薬を提供する。
２．高ウイルス群および低ウイルス群
本発明の方法の好ましい態様においては、まず、解析対象をＨＣＶ ＲＮＡ量によって、高ウイルス群または低ウイルス群に分類する。
（１）試料
本発明の方法の対象となる組織は、Ｃ型肝細胞癌患者の非癌部組織である。また、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した慢性肝炎、肝硬変の組織であってもよい。組織は採取後すぐに本発明の方法を実施しない場合は、液体窒素で凍結して、−８０℃にて保存することもできる。
続いて、組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。組織からＲＮＡを抽出する方法は、当業者であれば適宜選択することができるが、例えばＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることができる。
（２）ＨＣＶ ＲＮＡ量の測定
ＨＣＶ ＲＮＡ量は、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲによって測定することができる。ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲには、例えば、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いることができる。
ＨＣＶ ＲＮＡ量の測定は、２．（１）で得られたＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの例えば５０ｎｇ相当を用いて実施することができる。そのとき、プライマーとしては、例えば
Ｆｏｒｗａｒｄ（５’−３’）：ＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣ （配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−３’）：ＧＣＡＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ （配列番号２）
を０．３μＭ用いてもよい。
ＨＣＶ全長を組み込んだプラスミドＤＮＡを用いて検量線を作成し、ＨＣＶ ＲＮＡ量の定量に用いる。
本発明において、ＨＣＶ ＲＮＡ量は、「ｕｎｉｔ」で表す。「ｕｎｉｔ」は、検量線作成に用いたプラスミドＤＮＡ量をｃｏｐｙ数に換算し、検量線から肝組織由来のｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡコピー数を求め、１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値を意味する。
「１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値」は、ある肝臓由来のｃＤＮＡ（標準サンプル）中の１８Ｓ ｒＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで測定して、標準サンプルｃＤＮＡに対する検量線を作成したときの、肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ相当における標準サンプルｃＤＮＡ量を意味する。肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ相当における標準サンプルｃＤＮＡ量は検量線から求めることができる。
例えば、肝組織由来のｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡコピー数が８０００であり、肝組織由来のｃＤＮＡ０．２５ｎｇ当りの１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値が０．２ｎｇのときは、４００００ｕｎｉｔとなる（８０００×１／０．２＝４００００）。
（３）対象症例の選別
本発明において、「低ウイルス群」とは、ＨＣＶ ＲＮＡ量が３００ｕｎｉｔ以下の症例を意味する。
本発明において、「高ウイルス群」とは、ＨＣＶ ＲＮＡ量が３００００ｕｎｉｔ以上の症例を意味する。
３．遺伝子の発現量の測定
本発明の方法は、ＨＣＶ ＲＮＡ量によって、解析対象を前記の高ウイルス群と低ウイルス群とに選別して行うことを特徴とする。
さらに、本発明は、高ウイルス群および低ウイルス群をＨＣＶ遺伝子型によって選別することもできる。すなわち、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型の４つのＨＣＶ遺伝子型特異的ＰＣＲを行うことでＨＣＶ遺伝子型を明らかにし、ＨＣＶの特定の遺伝子型に注目して、宿主遺伝子の発現量解析を行うこともできる。
また、高ウイルス群および低ウイルス群から慢性肝炎または肝硬変の症例のみを抽出して、宿主遺伝子の発現量解析を行うこともできる。
本発明の遺伝子スクリーニング方法において、遺伝子の発現量の測定にはオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはリアルタイムＰＣＲを用いることができる。
また、高ウイルス群または低ウイルス群で発現亢進する遺伝子をオリゴヌクレオチドマイクロアレイで選択した後、これらの遺伝子の中から高ウイルス群または低ウイルス群で発現亢進する遺伝子をリアルタイムＰＣＲでさらに絞って選択することもできる。
（１）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ
（ａ）発現解析方法
宿主の遺伝子の発現量を測定するために、まず、２．（１）で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからｂｉｏｔｉｎ−標識ｃＲＮＡを合成する。合成は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓのマニュアルを一部改変して実施することができる（実施例２（１）参照）。得られたｃＲＮＡは、標的遺伝子サンプルとして使用するために、適宜精製し、断片化する。精製、断片化は、当業者であれば容易に実施することができる。
マイクロアレイは、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）などの市販品を用いることが好ましいが、これに限定されるわけではない。
次に、作製したｃＲＮＡ断片を標的遺伝子サンプルとしてアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ、洗浄、染色には、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）などの機器を用いることもできる。ハイブリダイズ、洗浄、染色の方法は、市販アレイであれば、添付のマニュアルにしたがうことが好ましい。
続いて、スキャナー（たとえば、Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））にて遺伝子発現のシグナルを読み取り、解析する。遺伝子発現シグナルの解析には、ソフトウェアを用いることが好ましく、ソフトウェアには、例えば、Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）を挙げることができる。
シグナル値の補正は、マイクロアレイ毎に中央値を１とする「ｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ」を行い、つづいて、遺伝子毎に中央値を１とする「ｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ」を行うことが好ましい。
（ｂ）統計学的解析
本発明において、分割表の検定は、χ２検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いる。また、２群間の有意差検定は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いることが好ましい。
（ｃ）発現解析手順
高ウイルス群において発現亢進している遺伝子を選択する方法、および低ウイルス群において発現亢進している遺伝子を選択する方法を以下に示す。
同時に複数試料で発現解析を行う場合は、まず、複数枚のマイクロアレイのうち、少なくとも１枚で発現の確認された（「ｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇ」の出た）プローブを抽出することができる。このプローブに対応する遺伝子が、ＨＣＶに感染した患者の肝臓に発現している遺伝子である。
ここで「プローブ」は、マイクロアレイにセットした、遺伝子の一部を意味する。「プローブに対応する遺伝子」とは、プローブの元となった遺伝子を意味する。
次に、高ウイルス群と低ウイルス群との２群間で発現に有意な差がある遺伝子を抽出するために、パラメトリック検定を行うことができる。例えば、２群で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、あるいは、少ないｒｅｐｌｉｃａｔｅからできるだけ正確な母分散を見積もるため、ｒｅｐｌｉｃａｔｅを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算するＣｒｏｓｓ−ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌのパラメトリック検定が挙げられる。本発明において、検定は１種類でもよいし、複数種類でもよいが、複数行うことが好ましい。
複数の検定を行う場合は、これらの検定で抽出されたプローブの重複を調べるために、Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍを作製することが好ましい。
続いて、１種類の検定で抽出されたプローブ、または複数の検定で共通に抽出されたプローブを対象にして、２群間で発現亢進の程度が２倍以上、すなわち、２群間での発現量に２倍以上差のあるプローブを選択できる。発現亢進の程度の差は、好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。選択されたプローブのうち、高ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が、高ウイルス群において発現亢進している遺伝子（以下「高ウイルス遺伝子」ともいう）であり、低ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が、低ウイルス群において発現亢進している遺伝子（以下「低ウイルス遺伝子」ともいう）である。
また、場合によっては、さらに、複数枚のマイクロアレイのすべてにおいて、または高発現群のマイクロアレイのすべてにおいてｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇのついているものに絞って、プローブを抽出することもできる。また、プローブの対応する遺伝子が同一であり重複するものや、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては測定できない遺伝子（例えば、ｒＲＮＡなど）を除くこともできる。このように選択されるプローブにおいても、高ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が高ウイルス遺伝子であり、低ウイルス群において発現亢進しているプローブに対応する遺伝子が低ウイルス遺伝子である。
本発明者は、上記方法により、高ウイルス遺伝子として７８個（表５）、および低ウイルス遺伝子として３９個（表６Ａ）の、計１１７個の遺伝子を選択することができた（実施例２）。そのうち、２群間で２．５倍以上差のあった遺伝子をさらに表３および表４に示す。
また、高ウイルス群及び低ウイルス群のそれぞれについて、慢性肝炎と肝硬変に分類して４つの群とし、それぞれの群の遺伝子発現を解析した結果、慢性肝炎高ウイルス遺伝子として６６個（表１０）、慢性肝炎低ウイルス遺伝子として２１個（表１１）、肝硬変高ウイルス遺伝子として２７個（表１２）、肝硬変低ウイルス遺伝子として１７個（表１３）を得た（実施例５）。
（２）リアルタイムＰＣＲ
（ａ）発現解析方法
本発明において、リアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子の発現量を測定する場合は、まず、上記２．（１）で得られたＲＮＡを、適宜ＤＮａｓｅＩ処理し、精製して、ランダムプライマーと逆転写酵素とでｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素は、例えばＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｕｒｇ，ＭＤ）を用いることができる。また、ランダムプライマーの代わりにＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いることもできる。
リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の発現量の測定は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）やＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）などの市販の機器を用いて行うことができる。
反応は例えば、１０ｎｇ相当のｃＤＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＭの各種遺伝子プライマーを含む２５μｌ反応液中で、９５℃、１０ｍｉｎのｐｒｅｈｅａｔ後、９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ ６０ｓｅｃを４５ｃｙｃｌｅ行うことができる。このとき、１８Ｓ ｒＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子の定量には、例えば０．２５ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行うことができる。
反応に用いるプライマーは、当業者であればソフトウェアを用いて適宜設計することができる。代表的なソフトウェア「ｐｒｉｍｅｒ３」のＵＲＬを下記に示す。
（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）
ｐｒｉｍｅｒ３を用いて設計したプライマーの例を下記の表１に示す。
ある肝臓ｃＤＮＡを定量用の標準サンプルに用いて検量線を作成し、各種遺伝子の定量に用いる。例えば、各遺伝子で最も高い発現を示す肝臓ｃＤＮＡを標準サンプルとし、そのｃＤＮＡの量を定量値に用いることができる。測定対象のサンプルのｃＤＮＡを一定量、遺伝子ＸのリアルタイムＰＣＲにかけて、そのサンプルが検量線から５ｎｇと評価できれば、そのサンプルには標準サンプルｃＤＮＡの５ｎｇに含まれる遺伝子Ｘ ｍＲＮＡと等量の遺伝子Ｘ ｍＲＮＡが存在することになる。
本発明において、各遺伝子発現量は、検量線から得られた測定対象サンプル中の各遺伝子発現定量値を内在性コントロール遺伝子発現定量値（例えば上記測定対象サンプル中の１８ｓ ｒＲＮＡの定量値）で除した相対値で表すことができる。
（ｂ）内在性コントロール遺伝子
本発明において「内在性コントロール遺伝子」は、１８Ｓ ｒＲＮＡ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）を用いることができるが、発現量のばらつきが小さい点で１８Ｓ ｒＲＮＡが好ましい。
（ｃ）発現解析手順
上記のように、宿主の各遺伝子の発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡで補正した値を用いることができる。補正の後、低ウイルス群の発現量と高ウイルス群の発現量とを比較する。例えば、高ウイルス群の発現量の中央値を低ウイルス群の中央値で割ったときの値が、２以上、好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上の遺伝子を高ウイルス遺伝子として選択することができる。逆に、低ウイルス群の中央値を高ウイルス群の発現量の中央値で割ったときの値が、２以上、好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上の遺伝子を低ウイルス遺伝子として選択することができる。
また、このとき、２群間でＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行い、上記遺伝子の中でも、有意差（Ｐ＜０．０５）の遺伝子を選択することがより好ましい。
４．高ウイルス遺伝子および低ウイルス遺伝子
（１）高ウイルス遺伝子
高ウイルス遺伝子では、ＨＣＶを排除しようとする高ウイルス群の宿主防御機能の能力を超えて誘導された遺伝子が含まれていると考えられる。したがって、高ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶ側にとって増殖有利に働くと予想される因子が存在する可能性がある。
すなわち、本発明によってスクリーニングされる高ウイルス遺伝子の発現を抑制すれば、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することが可能となるだろう。高ウイルス遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス増殖抑制剤やＣ型肝炎ウイルス増殖抑制方法の開発につながることが予想される。
（２）低ウイルス遺伝子
低ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。すなわち、本発明によってスクリーニングされる低ウイルス遺伝子の発現を亢進すれば、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することが可能となる。低ウイルス遺伝子の発現を亢進することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス増殖抑制剤やＣ型肝炎ウイルス増殖抑制方法の開発につながることが期待できる。
（３）疾患別に発現する遺伝子
本発明においては、上記高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類して発現量の解析を行うことができる。例えば、患者背景因子として慢性肝炎症例と肝硬変症例に分類し、それぞれの項目（性別、年齢、病期等）についてウイルス量を指標として２群間の比較を行うことができる。
なお、本発明においては高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類するという順序でもよく、病態（慢性肝炎由来及び肝硬変）を分類した後に高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子を分類するという順序でもよく、順序に限定されるものではない。すなわち、本発明における遺伝子発現解析は、遺伝子群が、慢性肝炎における高ウイルス遺伝子群（ＣＨＨ群）、慢性肝炎における低ウイルス遺伝子群（ＣＨＬ群）、肝硬変における高ウイルス遺伝子群（ＬＣＨ群）、及び肝硬変における低ウイルス遺伝子群（ＬＣＬ群）の４通りに分類されている限り、分類の順序は問わないものとする。
（４）解析された遺伝子
本発明において解析された遺伝子を以下に示す。
＜高ウイルス遺伝子＞（表５）
（ａ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
＜低ウイルス遺伝子＞（表６）
（ｃ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
また、疾患別に分類したときの遺伝子群を以下に示す。
（ｉ）ＣＨＨ遺伝子群（表１０）
（ａ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｉ）ＣＨＬ遺伝子群）（表１１）
（ｃ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｉｉ）ＬＣＨ遺伝子群（表１２）
（ｅ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｆ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｉｖ）ＬＣＬ遺伝子群（表１３）
（ｇ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｈ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
上記各遺伝子において、「ストリンジェントな条件」とは、核酸同士がハイブリダイズしたときの洗浄条件であってバッファーの塩濃度と温度により規定される条件である。例えば、０．５〜２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの濃度で３７〜５２℃の条件を挙げることができ、よりストリンジェントな条件としては、例えば２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃の条件、０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで４２℃の条件等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブの濃度や長さ、あるいは反応時間等の諸条件を加味し、適切な条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等を参照することができる。
本発明において遺伝子が「発現が亢進する」とは、リアルタイムＰＣＲにより定量解析を行い、得られた定量値が比較したいウイルス量の異なる群よりも高い場合を言う。
５．病態検査薬
本発明において解析された、ＣＨＨ遺伝子群、ＣＨＬ遺伝子群、ＬＣＨ遺伝子群またはＬＣＬ遺伝子群に属するそれぞれの遺伝子は、ＣＨＨ遺伝子群及びＣＨＬ遺伝子群については慢性肝炎におけるウイルス量のマーカーとなり、ＬＣＨ遺伝子群及びＬＣＬ遺伝子群は肝硬変におけるウイルス量のマーカーとなり得る。したがって、患者等から得られた肝組織からこれらの遺伝子の発現量を解析することで、どの疾患でどの程度ウイルスが増殖している病態か、どの程度肝機能を維持し、どのような抗ウイルス反応を惹起できるかなどを判断することができる。
また、本発明において解析された遺伝子は、患者等の肝組織から得られた遺伝子とのハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーションによってシグナルを検出することで、ウイルス量に関連したどの病態にあるかを判断することができる。ハイブリダイゼーション条件および標識方法は、当業者に周知であり、本明細書に記載の方法のほか、任意の方法を採用することができる。
従って、上記遺伝子は、ウイルス量に関連する病態の検査薬として使用することができる。上記遺伝子をマイクロアレイに搭載することで、簡易かつ網羅的に遺伝子の発現量解析を行うことが可能である。
本発明において、上記遺伝子は緩衝液（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、標識試薬（例えば蛍光標識試薬）等とともにキットの形態で使用することができる。上記遺伝子が搭載されたマイクロアレイをキットに含めることもできる。
以下、本発明を具体的な例を挙げて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
（１） 肝臓組織
５９例のＣ型肝細胞癌患者の癌切除術検体より非癌部組織を分離し、速やかに液体窒素で凍結し−８０℃にて保存した。検体の研究使用に関しては、各患者より同意を得て行った。
（２） ＲＮＡ抽出とＲＮＡ発現定量
約０．１ｇの肝臓組織にＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を２ｍｌ加え、ポリトロンでホモゲナイズ後、取り扱い説明書に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの質的評価を行うため、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＲＮＡ ６０００ ｎａｎｏ ａｓｓａｙ ｃｈｉｐを用いて電気泳動解析を行った。
抽出したＲＮＡに混在するＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅＩ処理を行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２０μｇに対しＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）１０ｕｎｉｔを加え、５０μｌ中で３７℃，２０ｍｉｎ反応後、ＴｒｉｚｏｌにてＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅＩ処理後のＲＮＡ １０μｇを用いて、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒとＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｕｒｇ，ＭＤ）２５ｕｎｉｔを加え１００μｌ中でｃＤＮＡを合成した。
実施例中のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現定量は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いた。１０ｎｇ相当のｃＤＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＭの各種遺伝子ｐｒｉｍｅｒを含む２５μｌ反応液中で、９５℃、１０ｍｉｎのｐｒｅｈｅａｔ後、９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ ６０ｓｅｃを４５ｃｙｃｌｅ行った。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにおいて、ＨＣＶ ＲＮＡの定量は５０ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行い、１８Ｓ ｒＲＮＡの定量は０．２５ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行った。また、ＨＣＶ ｐｒｉｍｅｒは０．３μＭで行った。
定量用標準サンプルは、肝臓ｃＤＮＡおよびＨＣＶ全長を組み込んだプラスミドＤＮＡ（標準プラスミドＤＮＡ）を５倍の系列希釈で５点用意し、検量線を作成後、得られた検量線を絶対定量解析に用いた。各遺伝子毎に、最も高い発現を示した肝臓ｃＤＮＡを標準サンプルとし、そのｃＤＮＡを定量値算出用の検量線作成に用いた。ＨＣＶ ＲＮＡ定量値は、標準プラスミドＤＮＡ量をウイルスのｃｏｐｙ数に換算し、ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡ ｃｏｐｙ数を求め、１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値を「ｕｎｉｔ」として表記した。内在性コントロール遺伝子として、３つのハウスキーピング遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）を用いた。各遺伝子発現量は、各遺伝子発現定量値を内在性コントロール遺伝子発現定量値で除した相対値で表した。用いたｐｒｉｍｅｒ配列の一部は、ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いてデザインした。（表１）。
（３） ＨＣＶ遺伝子型の決定
ｃＤＮＡ１００ｎｇを用いて、岡本らのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型の４つのＨＣＶ遺伝子型特異的ＰＣＲを行った。第一ラウンドＰＣＲは、共通配列ｐｒｉｍｅｒで２０μｌ中３５ｃｙｃｌｅ ＰＣＲを行った。その反応液１μｌを用いて共通ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒと各型別ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒで第二ラウンドＰＣＲを２０μｌ中で３５ｃｙｃｌｅ行った。用いたｐｒｉｍｅｒ配列を表１に示す。ＰＣＲ産物５μｌを３％アガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物の大きさより１ａ型が４９ｂｐ、１ｂ型が１４４ｂｐ、２ａ型が１７４ｂｐ、２ｂ型が１２３ｂｐであることから、ＨＣＶ遺伝子型を決定した。
（４） 対象症例の選別
５９例の肝臓ＨＣＶ ＲＮＡを定量した結果、定量値は、０〜３７２，０６８ｕｎｉｔの範囲で分布した。ウイルス量が、３００ｕｎｉｔ以下の症例を低ウイルス群とし、３００００ｕｎｉｔ以上を高ウイルス群として、５９例を群分けした。
その結果、低ウイルス群は１５例で、その内訳は慢性肝炎（ＣＨ）９例と肝硬変（ＬＣ）６例であった。高ウイルス群は１９例で、その内訳は慢性肝炎９例と肝硬変１０例であった（図２）。
選別した３４例（ＣＨ＋ＬＣ）とその中の慢性肝炎症例（ＣＨ）１８例について、患者の背景因子を高ウイルス群と低ウイルス群とで比較した（表２）。
表２に示すように、３４例（ＣＨ＋ＬＣ）において、肝硬変（ＬＣ）の割合、性比、年齢の分布、肝細胞癌の進行度の分布については、ウイルス量の違いでわけた２群間に差はなかった。肝機能を表す血液検査結果（「Ｌｉｖｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」）も、軽度の肝障害を示す値であるが、２群間で有意差は認められなかった。以上より、この３４症例を用いてウイルス量が１０００倍異なる肝臓で、どのような遺伝子発現レベルの違いがあるのか、解析することが可能と考えた。
ただし、３４例におけるＨＣＶ遺伝子型の分布（「ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ」）は、２群間で有意に異なり、２型ＨＣＶが低ウイルス群に偏っていたことから（ｐ＝０．００１）、一部ＨＣＶ遺伝子型の違いによる差が反映されることを考慮する必要がある。そこで、以下の実施例（実施例３（１）を除く）では、１ｂ型の２３例で比較解析を行うことにした。
また明らかに病態が進行している肝硬変の影響も考慮する必要があると考え、慢性肝炎（ＣＨ）１８例でのウイルス量の違いも独立して解析することにした。
５９例のＣ型肝細胞癌患者の癌切除術検体より非癌部組織を分離し、速やかに液体窒素で凍結し−８０℃にて保存した。検体の研究使用に関しては、各患者より同意を得て行った。
（２） ＲＮＡ抽出とＲＮＡ発現定量
約０．１ｇの肝臓組織にＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を２ｍｌ加え、ポリトロンでホモゲナイズ後、取り扱い説明書に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの質的評価を行うため、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＲＮＡ ６０００ ｎａｎｏ ａｓｓａｙ ｃｈｉｐを用いて電気泳動解析を行った。
抽出したＲＮＡに混在するＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅＩ処理を行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２０μｇに対しＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）１０ｕｎｉｔを加え、５０μｌ中で３７℃，２０ｍｉｎ反応後、ＴｒｉｚｏｌにてＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅＩ処理後のＲＮＡ １０μｇを用いて、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒとＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｕｒｇ，ＭＤ）２５ｕｎｉｔを加え１００μｌ中でｃＤＮＡを合成した。
実施例中のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現定量は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｏｒｔａｌｋｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いた。１０ｎｇ相当のｃＤＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＭの各種遺伝子ｐｒｉｍｅｒを含む２５μｌ反応液中で、９５℃、１０ｍｉｎのｐｒｅｈｅａｔ後、９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ ６０ｓｅｃを４５ｃｙｃｌｅ行った。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにおいて、ＨＣＶ ＲＮＡの定量は５０ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行い、１８Ｓ ｒＲＮＡの定量は０．２５ｎｇ相当のｃＤＮＡを用いて行った。また、ＨＣＶ ｐｒｉｍｅｒは０．３μＭで行った。
定量用標準サンプルは、肝臓ｃＤＮＡおよびＨＣＶ全長を組み込んだプラスミドＤＮＡ（標準プラスミドＤＮＡ）を５倍の系列希釈で５点用意し、検量線を作成後、得られた検量線を絶対定量解析に用いた。各遺伝子毎に、最も高い発現を示した肝臓ｃＤＮＡを標準サンプルとし、そのｃＤＮＡを定量値算出用の検量線作成に用いた。ＨＣＶ ＲＮＡ定量値は、標準プラスミドＤＮＡ量をウイルスのｃｏｐｙ数に換算し、ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶ ＲＮＡ ｃｏｐｙ数を求め、１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値を「ｕｎｉｔ」として表記した。内在性コントロール遺伝子として、３つのハウスキーピング遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）を用いた。各遺伝子発現量は、各遺伝子発現定量値を内在性コントロール遺伝子発現定量値で除した相対値で表した。用いたｐｒｉｍｅｒ配列の一部は、ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いてデザインした。（表１）。
ｃＤＮＡ１００ｎｇを用いて、岡本らのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型の４つのＨＣＶ遺伝子型特異的ＰＣＲを行った。第一ラウンドＰＣＲは、共通配列ｐｒｉｍｅｒで２０μｌ中３５ｃｙｃｌｅ ＰＣＲを行った。その反応液１μｌを用いて共通ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒと各型別ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒで第二ラウンドＰＣＲを２０μｌ中で３５ｃｙｃｌｅ行った。用いたｐｒｉｍｅｒ配列を表１に示す。ＰＣＲ産物５μｌを３％アガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物の大きさより１ａ型が４９ｂｐ、１ｂ型が１４４ｂｐ、２ａ型が１７４ｂｐ、２ｂ型が１２３ｂｐであることから、ＨＣＶ遺伝子型を決定した。
（４） 対象症例の選別
５９例の肝臓ＨＣＶ ＲＮＡを定量した結果、定量値は、０〜３７２，０６８ｕｎｉｔの範囲で分布した。ウイルス量が、３００ｕｎｉｔ以下の症例を低ウイルス群とし、３００００ｕｎｉｔ以上を高ウイルス群として、５９例を群分けした。
その結果、低ウイルス群は１５例で、その内訳は慢性肝炎（ＣＨ）９例と肝硬変（ＬＣ）６例であった。高ウイルス群は１９例で、その内訳は慢性肝炎９例と肝硬変１０例であった（図２）。
選別した３４例（ＣＨ＋ＬＣ）とその中の慢性肝炎症例（ＣＨ）１８例について、患者の背景因子を高ウイルス群と低ウイルス群とで比較した（表２）。
ただし、３４例におけるＨＣＶ遺伝子型の分布（「ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ」）は、２群間で有意に異なり、２型ＨＣＶが低ウイルス群に偏っていたことから（ｐ＝０．００１）、一部ＨＣＶ遺伝子型の違いによる差が反映されることを考慮する必要がある。そこで、以下の実施例（実施例３（１）を除く）では、１ｂ型の２３例で比較解析を行うことにした。
また明らかに病態が進行している肝硬変の影響も考慮する必要があると考え、慢性肝炎（ＣＨ）１８例でのウイルス量の違いも独立して解析することにした。
（１） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによる発現解析方法
慢性肝炎症例の高ウイルス群、低ウイルス群より各４例を選別し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡよりｂｉｏｔｉｎ−標識ｃＲＮＡを以下のように合成した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓのマニュアルを一部改変して次のように行った。まず、１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ存在下、４２℃，２ｈｒにてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。マニュアルに従ってｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成後、半分量を用いてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を基本にした以下の組成の反応液を含む４３μｌの反応液を３７℃で９ｈｒインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い、ｂｉｏｔｉｎ−ｃＲＮＡを合成した。
その後、ｂｉｏｔｉｎ−ｃＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。ｃＲＮＡのｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎはマニュアルにしたがった。
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を８枚用いて、マニュアルに従ってＦｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりハイブリダイゼーション、洗浄、染色を行い、Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にて読みとりを行った。各遺伝子発現シグナルは、Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）を用いて解析した。シグナル値の補正は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙごとに中央値を１とするｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、その後遺伝子ごとに中央値を１とするｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った。
（２） インターフェロン下流遺伝子の発現解析
ＩＦＮ作用機構がうまく働いているかいないかでウイルス量に差が出るのか、を調べるために、抗ウイルス作用を示す５つの遺伝子（ＭｘＡ、ＯＡＳ、ＰＫＲ、ｐ５３、ＢＡＸ）（図１）の発現量を高ウイルス群と低ウイルス群の２群間で比較した。
図３に示すように、慢性肝炎１１例で比較すると高ウイルス群において、ＯＡＳ、ＭｘＡ、ＢＡＸの発現が有意に上がっていた（Ｐ＜０．０５）。肝硬変１４例や全体２５例では２群間の有意差は認められなかった。また、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ単独の９例で比較しても、有意差は認められなかった。このように慢性肝炎症例だけで有意差がみられた。
図３からも明らかなように、高ウイルス群の症例のなかに、３遺伝子について特に発現が上がっているものが存在した。この症例を除くと、いずれの遺伝子についても有意差は認められなかった。このことより、サンプリングエラーによる有意差も考えられ、慢性肝炎症例数を増やし、再現性を確かめる必要があると考える。
図３の結果は、内在性コントロール遺伝子として１８Ｓ ｒＲＮＡを用いたときの発現量の測定結果である。よく用いられるＧＡＰＤＨと１８Ｓ ｒＲＮＡとで、一定ｃＤＮＡ量あたりの発現量を比較したところ、ＧＡＰＤＨでは症例間に差が大きく、１８ＳｒＲＮＡの方が症例間の差が少なかった（図６Ｂ）。よって１８Ｓ ｒＲＮＡをコントロール遺伝子として各遺伝子発現量を評価した（後述）。
上記の結果では、予想外にも慢性肝炎高ウイルス群にＩＦＮ誘導性遺伝子の発現が増加していた。これはウイルス量が多いため、結果的にＩＦＮ及びＩＦＮ下流の遺伝子が誘導されたことによると考えられる。本実施例の系においては、ＩＦＮ下流の抗ウイルス作用関連遺伝子がウイルス量の抑制に関与しているわけではなく、宿主細胞の他の因子がウイルス量制御に関与していることが示唆された。
そこで、既知の抗ウイルス作用因子ではなく、何がウイルス量の低下に関与しているのかを知る目的で、下記の（３）ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いた網羅的発現解析により、ＨＣＶのウイルス量に関連する宿主遺伝子の検討を行った。
（３） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現解析結果
図２「▼」印に示した８例（慢性肝炎症例の高ウイルス群４例と低ウイルス群４例）を用いて、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによる発現解析を行った。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用い、ヒトの約４７，０００個以上の転写産物に相当する５４，６７５プローブ（ｐｒｏｂｅ）を対象とした。高ウイルス群４枚と低ウイルス群４枚とで発現が有意に異なる遺伝子の求め方を図４に示す。
まず、８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのうち少なくとも１枚で発現ありの表記（ｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇ）が出たｐｒｏｂｅを抽出した。その結果２８，５０５ｐｒｏｂｅが選ばれた（図４（ａ））。これが、肝臓（詳しくは慢性肝炎の肝臓）に発現している遺伝子である。さらに、２８，５０５ｐｒｏｂｅより、高ウイルス群と低ウイルス群との２群間で発現に有意な差がある遺伝子を抽出するため、３種類のパラメトリック検定を行った（図４（ｂ））。２群で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔでは１，７１０ｐｒｏｂｅｓが抽出され、分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔでは１，３２７ｐｒｏｂｅｓが抽出された。また、少ないｒｅｐｌｉｃａｔｅからできるだけ正確な母分散を見積もるため、ｒｅｐｌｉｃａｔｅを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算するＣｒｏｓｓ−ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌのパラメトリック検定では、１，０６９ｐｒｏｂｅｓが抽出された。これらのｐｒｏｂｅの重複を調べるために、Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍを作製した（図４）。Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔの１，３２７ｐｒｏｂｅは、すべてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔの１，７１０ｐｒｏｂｅに含まれていた。そして、３種類の検定で共通に抽出された６８３ｐｒｏｂｅｓを対象に、２群間で２倍以上発現に差があるｐｒｏｂｅを選んだ（図４（ｃ））。その結果、高ウイルス群に発現が２倍以上増加していたｐｒｏｂｅは１５８個、低ウイルス群で有意に発現が２倍以上増加していたｐｒｏｂｅは１３６個であった（図４（ｄ））。さらに、発現量の多い群４枚ともにｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇがついているｐｒｏｂｅを絞った（図４（ｅ））。それぞれ８０個と４１個になり、これらの中で、ｐｒｏｂｅが同一遺伝子として重複するものやｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては測定できないはずの遺伝子を除いた。
結局、高ウイルス群で発現亢進している遺伝子（高ウイルス遺伝子）として７８個、低ウイルス群で発現亢進している遺伝子（低ウイルス遺伝子）として３９個が選ばれた（図４（ｆ））。
この１１７個の遺伝子で８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのクラスタリング解析を行い、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅを作成した（図５Ａ）。２８，５０５ｐｒｏｂｅによるＣｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅ（図５Ｂ）とは異なり、高ウイルス群と低ウイルス群に症例を区別できる遺伝子リストであることが示された。
肝臓で発現する遺伝子全体では感染したウイルス量と関連する特徴は捉えることはできず、限られた遺伝子だけが感染したウイルス量に関連することがわかった。表３と表４に、高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個のうち、２群間で２．５倍以上差のあった遺伝子を示す（表３）（表４）。
また、高ウイルス遺伝子７８個すべてを表５に、低ウイルス遺伝子３９個すべてを表６に示した。
表５および表６（１）、（２）において、「ａ」はｍｉｃｒｏａｒｒａｙのｐｒｏｂｅが由来する遺伝子で、発現変化した遺伝子そのものではない場合もあることを、「ｂ」は、遺伝子の構造上のｐｒｏｂｅの位置より、５つのカテゴリーに分類したことを、「ｃ」は、このｐｒｏｂｅ配列とホモロジーのある他の遺伝子が検出されてことを示している。また、「Ａ」は遺伝子のｅｘｏｎ配列を、「Ｂ」は遺伝子のｉｎｔｒｏｎで遺伝子と同方向の配列を、「Ｃ」は遺伝子のｉｎｔｒｏｎで、遺伝子と反対方向の配列を、「Ｄ」は遺伝子に隣接する同方向の配列を、「Ｅ」は遺伝子のないところの配列を示している。
慢性肝炎症例の高ウイルス群、低ウイルス群より各４例を選別し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡよりｂｉｏｔｉｎ−標識ｃＲＮＡを以下のように合成した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓのマニュアルを一部改変して次のように行った。まず、１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ存在下、４２℃，２ｈｒにてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。マニュアルに従ってｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成後、半分量を用いてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を基本にした以下の組成の反応液を含む４３μｌの反応液を３７℃で９ｈｒインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い、ｂｉｏｔｉｎ−ｃＲＮＡを合成した。
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を８枚用いて、マニュアルに従ってＦｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりハイブリダイゼーション、洗浄、染色を行い、Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にて読みとりを行った。各遺伝子発現シグナルは、Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）を用いて解析した。シグナル値の補正は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙごとに中央値を１とするｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、その後遺伝子ごとに中央値を１とするｐｅｒ ｇｅｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った。
（２） インターフェロン下流遺伝子の発現解析
ＩＦＮ作用機構がうまく働いているかいないかでウイルス量に差が出るのか、を調べるために、抗ウイルス作用を示す５つの遺伝子（ＭｘＡ、ＯＡＳ、ＰＫＲ、ｐ５３、ＢＡＸ）（図１）の発現量を高ウイルス群と低ウイルス群の２群間で比較した。
図３に示すように、慢性肝炎１１例で比較すると高ウイルス群において、ＯＡＳ、ＭｘＡ、ＢＡＸの発現が有意に上がっていた（Ｐ＜０．０５）。肝硬変１４例や全体２５例では２群間の有意差は認められなかった。また、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ単独の９例で比較しても、有意差は認められなかった。このように慢性肝炎症例だけで有意差がみられた。
図３からも明らかなように、高ウイルス群の症例のなかに、３遺伝子について特に発現が上がっているものが存在した。この症例を除くと、いずれの遺伝子についても有意差は認められなかった。このことより、サンプリングエラーによる有意差も考えられ、慢性肝炎症例数を増やし、再現性を確かめる必要があると考える。
図３の結果は、内在性コントロール遺伝子として１８Ｓ ｒＲＮＡを用いたときの発現量の測定結果である。よく用いられるＧＡＰＤＨと１８Ｓ ｒＲＮＡとで、一定ｃＤＮＡ量あたりの発現量を比較したところ、ＧＡＰＤＨでは症例間に差が大きく、１８ＳｒＲＮＡの方が症例間の差が少なかった（図６Ｂ）。よって１８Ｓ ｒＲＮＡをコントロール遺伝子として各遺伝子発現量を評価した（後述）。
上記の結果では、予想外にも慢性肝炎高ウイルス群にＩＦＮ誘導性遺伝子の発現が増加していた。これはウイルス量が多いため、結果的にＩＦＮ及びＩＦＮ下流の遺伝子が誘導されたことによると考えられる。本実施例の系においては、ＩＦＮ下流の抗ウイルス作用関連遺伝子がウイルス量の抑制に関与しているわけではなく、宿主細胞の他の因子がウイルス量制御に関与していることが示唆された。
そこで、既知の抗ウイルス作用因子ではなく、何がウイルス量の低下に関与しているのかを知る目的で、下記の（３）ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いた網羅的発現解析により、ＨＣＶのウイルス量に関連する宿主遺伝子の検討を行った。
（３） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現解析結果
図２「▼」印に示した８例（慢性肝炎症例の高ウイルス群４例と低ウイルス群４例）を用いて、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによる発現解析を行った。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用い、ヒトの約４７，０００個以上の転写産物に相当する５４，６７５プローブ（ｐｒｏｂｅ）を対象とした。高ウイルス群４枚と低ウイルス群４枚とで発現が有意に異なる遺伝子の求め方を図４に示す。
まず、８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのうち少なくとも１枚で発現ありの表記（ｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇ）が出たｐｒｏｂｅを抽出した。その結果２８，５０５ｐｒｏｂｅが選ばれた（図４（ａ））。これが、肝臓（詳しくは慢性肝炎の肝臓）に発現している遺伝子である。さらに、２８，５０５ｐｒｏｂｅより、高ウイルス群と低ウイルス群との２群間で発現に有意な差がある遺伝子を抽出するため、３種類のパラメトリック検定を行った（図４（ｂ））。２群で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔでは１，７１０ｐｒｏｂｅｓが抽出され、分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔでは１，３２７ｐｒｏｂｅｓが抽出された。また、少ないｒｅｐｌｉｃａｔｅからできるだけ正確な母分散を見積もるため、ｒｅｐｌｉｃａｔｅを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算するＣｒｏｓｓ−ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌのパラメトリック検定では、１，０６９ｐｒｏｂｅｓが抽出された。これらのｐｒｏｂｅの重複を調べるために、Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍを作製した（図４）。Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔの１，３２７ｐｒｏｂｅは、すべてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔの１，７１０ｐｒｏｂｅに含まれていた。そして、３種類の検定で共通に抽出された６８３ｐｒｏｂｅｓを対象に、２群間で２倍以上発現に差があるｐｒｏｂｅを選んだ（図４（ｃ））。その結果、高ウイルス群に発現が２倍以上増加していたｐｒｏｂｅは１５８個、低ウイルス群で有意に発現が２倍以上増加していたｐｒｏｂｅは１３６個であった（図４（ｄ））。さらに、発現量の多い群４枚ともにｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇがついているｐｒｏｂｅを絞った（図４（ｅ））。それぞれ８０個と４１個になり、これらの中で、ｐｒｏｂｅが同一遺伝子として重複するものやｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては測定できないはずの遺伝子を除いた。
結局、高ウイルス群で発現亢進している遺伝子（高ウイルス遺伝子）として７８個、低ウイルス群で発現亢進している遺伝子（低ウイルス遺伝子）として３９個が選ばれた（図４（ｆ））。
この１１７個の遺伝子で８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙのクラスタリング解析を行い、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅを作成した（図５Ａ）。２８，５０５ｐｒｏｂｅによるＣｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｒｅｅ（図５Ｂ）とは異なり、高ウイルス群と低ウイルス群に症例を区別できる遺伝子リストであることが示された。
肝臓で発現する遺伝子全体では感染したウイルス量と関連する特徴は捉えることはできず、限られた遺伝子だけが感染したウイルス量に関連することがわかった。表３と表４に、高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個のうち、２群間で２．５倍以上差のあった遺伝子を示す（表３）（表４）。
表５および表６（１）、（２）において、「ａ」はｍｉｃｒｏａｒｒａｙのｐｒｏｂｅが由来する遺伝子で、発現変化した遺伝子そのものではない場合もあることを、「ｂ」は、遺伝子の構造上のｐｒｏｂｅの位置より、５つのカテゴリーに分類したことを、「ｃ」は、このｐｒｏｂｅ配列とホモロジーのある他の遺伝子が検出されてことを示している。また、「Ａ」は遺伝子のｅｘｏｎ配列を、「Ｂ」は遺伝子のｉｎｔｒｏｎで遺伝子と同方向の配列を、「Ｃ」は遺伝子のｉｎｔｒｏｎで、遺伝子と反対方向の配列を、「Ｄ」は遺伝子に隣接する同方向の配列を、「Ｅ」は遺伝子のないところの配列を示している。
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析
８症例のｍｉｃｒｏａｒｒａｙの比較で見いだされた遺伝子１１７個（実施例２）が、確かにＨＣＶ量の違いに相関するものかを調べるために、３４症例の肝臓ｃＤＮＡを用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析を行った。
（１）内在性コントロール遺伝子
遺伝子の発現量の評価に用いるコントロール遺伝子として、細胞あたり一定量発現するといわれているｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅが用いられる。β−ａｃｔｉｎやＧＡＰＤＨ遺伝子が代表的な遺伝子である。しかし、様々な病態や状態の組織、細胞を調べると、必ずしもこれらの遺伝子が一定発現するとはいえない。最近では１８Ｓ ｒＲＮＡなどが用いられるようになっている。本実施例では、対象とする肝炎組織で一定発現する遺伝子を、８例のｍｉｃｒｏａｒｒａｙから独自に検討してみた。
今回用いたＨＧ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０ ａｒｒａｙには、これに載っているｐｒｏｂｅのうち、コントロール遺伝子として１００個の遺伝子がリストされている。そのうち８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙ全てにｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇの付いている遺伝子は９１個であった。この中から、８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで発現レベルに差がなく、なおかつＧＡＰＤＨと同様の発現レベルを示す遺伝子を探した。その結果ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）が選ばれた。同じｍｉｃｒｏａｒｒａｙ上のＧＡＰＤＨ発現シグナルと比較すると、ＲＰＬ３４の方が確かに発現レベルのバラつきが少なかった（図６Ａ）。
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析では１８Ｓ ｒＲＮＡの評価をすることができない。そこで、ＲＰＬ３４と１８Ｓ ｒＲＮＡとではどちらがコントロール遺伝子として適しているかを明らかにするために、全３４症例でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにより発現量を比較した。図６ＢにＧＡＰＤＨも含めて３遺伝子の発現量の比較を示す。ｃＤＮＡ一定量あたりの発現量を比較したところ、１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量のばらつきが、ＰＲＬ３４とＧＡＰＤＨと比較して最も小さかった。よって本実施例では、内在性コントロール遺伝子として１８Ｓ ｒＲＮＡを用いて、以下の遺伝子発現の評価を行った。
（２）高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子の発現定量比較
高ウイルス遺伝子８個、低ウイルス遺伝子５個を選び、慢性肝炎１８例（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに用いた８例を含む）と肝硬変１６例を対象に、高ウイルス群と低ウイルス群との間で発現量の比較を行った。表７にその結果を示す。
二群間比較は、マイクロアレイ解析に用いた慢性肝炎（ＣＨ）８例と全慢性肝炎（ＣＨ）１８例と全肝硬変（ＬＣ）１６例とにわけて行った。遺伝子の発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡで補正した値を用いた。高ウイルス群：低ウイルス群の例数を括弧内に示す。表７の「Ｈｉｇｈ」の欄に高ウイルス遺伝子８個の結果を、表７の「Ｌｏｗ」の欄に低ウイルス遺伝子５個の結果を示した。
Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ（ＦＣ）は、各群中央値で比較したときの値を示す。例えば、高ウイルス遺伝子であれば、当該遺伝子の高ウイルス群の中央値を低ウイルス群の中央値で除した値を示している。 また、２群間でＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行い、有意差（Ｐ＜０．０５）のあった遺伝子の値は破線で囲んだ。逆転変化で有意差を示したものは、実線で囲んだ。
表７に示すように、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析において、高ウイルス遺伝子は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによる発現解析結果とほぼ一致し、慢性肝炎（ＣＨ）１８例においては８遺伝子とも高ウイルス遺伝子として有意差を認めた（表７）。しかし肝硬変（ＬＣ）では発現量に差は認められなかった。これらの遺伝子は、低ウイルス症例で発現が減少していなかったためである。このことから、感染しているウイルス量が少ない慢性肝炎と肝硬変とでは、ウイルス量を制御する機構は異なり、共通のメカニズムを単純には追跡できないことがわかった。
図７には慢性肝炎での代表的な比較結果を示す。図７のＡ〜Ｃに示す高ウイルス遺伝子は、図３に示したＩＦＮ下流の遺伝子とは異なり、高ウイルス群と低ウイルス群とで明らかに発現量の有意差を認める遺伝子であった。しかし、低ウイルス遺伝子は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現結果と同様の結果が５個中２個に認められるが、結局慢性肝炎で有意に差を認めるのは１個となった（表７）。この遺伝子ＳＥＬＥは肝硬変でも差のある傾向を示した（表７）。図７のＤおよびＥに上記２つの遺伝子ＳＥＬＥおよびＦＬＪ４６１５４２の結果を示す。また、Ｎ８０１４５は慢性肝炎で逆の有意差、すなわち高ウイルス遺伝子として認められた（Ｆ）。ＳＥＬＥ以外の遺伝子では、肝硬変症例で有意に差のある遺伝子は見出されなかった。
低ウイルス遺伝子の中には、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現解析の８例では差のある遺伝子として抽出されても、慢性肝炎１８例では差のある遺伝子とはいえない遺伝子が含まれている可能性が示唆された。また、一部の低ウイルス遺伝子では、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙとｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲとで同じような有意差を示すことができない遺伝子も存在した。設計したｐｒｉｍｅｒでは効率よくＰＣＲできない、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙのｐｒｏｂｅにクロスハイブリダイゼーションする遺伝子があるなどの可能性が考えられる。
８症例のｍｉｃｒｏａｒｒａｙの比較で見いだされた遺伝子１１７個（実施例２）が、確かにＨＣＶ量の違いに相関するものかを調べるために、３４症例の肝臓ｃＤＮＡを用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析を行った。
（１）内在性コントロール遺伝子
遺伝子の発現量の評価に用いるコントロール遺伝子として、細胞あたり一定量発現するといわれているｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅが用いられる。β−ａｃｔｉｎやＧＡＰＤＨ遺伝子が代表的な遺伝子である。しかし、様々な病態や状態の組織、細胞を調べると、必ずしもこれらの遺伝子が一定発現するとはいえない。最近では１８Ｓ ｒＲＮＡなどが用いられるようになっている。本実施例では、対象とする肝炎組織で一定発現する遺伝子を、８例のｍｉｃｒｏａｒｒａｙから独自に検討してみた。
今回用いたＨＧ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０ ａｒｒａｙには、これに載っているｐｒｏｂｅのうち、コントロール遺伝子として１００個の遺伝子がリストされている。そのうち８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙ全てにｐｒｅｓｅｎｔ ｆｌａｇの付いている遺伝子は９１個であった。この中から、８枚のｍｉｃｒｏａｒｒａｙで発現レベルに差がなく、なおかつＧＡＰＤＨと同様の発現レベルを示す遺伝子を探した。その結果ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３４（ＲＰＬ３４）が選ばれた。同じｍｉｃｒｏａｒｒａｙ上のＧＡＰＤＨ発現シグナルと比較すると、ＲＰＬ３４の方が確かに発現レベルのバラつきが少なかった（図６Ａ）。
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析では１８Ｓ ｒＲＮＡの評価をすることができない。そこで、ＲＰＬ３４と１８Ｓ ｒＲＮＡとではどちらがコントロール遺伝子として適しているかを明らかにするために、全３４症例でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにより発現量を比較した。図６ＢにＧＡＰＤＨも含めて３遺伝子の発現量の比較を示す。ｃＤＮＡ一定量あたりの発現量を比較したところ、１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量のばらつきが、ＰＲＬ３４とＧＡＰＤＨと比較して最も小さかった。よって本実施例では、内在性コントロール遺伝子として１８Ｓ ｒＲＮＡを用いて、以下の遺伝子発現の評価を行った。
（２）高ウイルス遺伝子と低ウイルス遺伝子の発現定量比較
高ウイルス遺伝子８個、低ウイルス遺伝子５個を選び、慢性肝炎１８例（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙに用いた８例を含む）と肝硬変１６例を対象に、高ウイルス群と低ウイルス群との間で発現量の比較を行った。表７にその結果を示す。
Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ（ＦＣ）は、各群中央値で比較したときの値を示す。例えば、高ウイルス遺伝子であれば、当該遺伝子の高ウイルス群の中央値を低ウイルス群の中央値で除した値を示している。 また、２群間でＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行い、有意差（Ｐ＜０．０５）のあった遺伝子の値は破線で囲んだ。逆転変化で有意差を示したものは、実線で囲んだ。
表７に示すように、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析において、高ウイルス遺伝子は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙによる発現解析結果とほぼ一致し、慢性肝炎（ＣＨ）１８例においては８遺伝子とも高ウイルス遺伝子として有意差を認めた（表７）。しかし肝硬変（ＬＣ）では発現量に差は認められなかった。これらの遺伝子は、低ウイルス症例で発現が減少していなかったためである。このことから、感染しているウイルス量が少ない慢性肝炎と肝硬変とでは、ウイルス量を制御する機構は異なり、共通のメカニズムを単純には追跡できないことがわかった。
図７には慢性肝炎での代表的な比較結果を示す。図７のＡ〜Ｃに示す高ウイルス遺伝子は、図３に示したＩＦＮ下流の遺伝子とは異なり、高ウイルス群と低ウイルス群とで明らかに発現量の有意差を認める遺伝子であった。しかし、低ウイルス遺伝子は、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現結果と同様の結果が５個中２個に認められるが、結局慢性肝炎で有意に差を認めるのは１個となった（表７）。この遺伝子ＳＥＬＥは肝硬変でも差のある傾向を示した（表７）。図７のＤおよびＥに上記２つの遺伝子ＳＥＬＥおよびＦＬＪ４６１５４２の結果を示す。また、Ｎ８０１４５は慢性肝炎で逆の有意差、すなわち高ウイルス遺伝子として認められた（Ｆ）。ＳＥＬＥ以外の遺伝子では、肝硬変症例で有意に差のある遺伝子は見出されなかった。
低ウイルス遺伝子の中には、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの発現解析の８例では差のある遺伝子として抽出されても、慢性肝炎１８例では差のある遺伝子とはいえない遺伝子が含まれている可能性が示唆された。また、一部の低ウイルス遺伝子では、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙとｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲとで同じような有意差を示すことができない遺伝子も存在した。設計したｐｒｉｍｅｒでは効率よくＰＣＲできない、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙのｐｒｏｂｅにクロスハイブリダイゼーションする遺伝子があるなどの可能性が考えられる。
１１７遺伝子の分類
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙで抽出された発現に差のある遺伝子１１７個について、既知の遺伝子、未知の遺伝子、さらに既知遺伝子の機能について分類した。
（Ａ）構造分類
図８に、最新遺伝子情報にもとづく１１７ｐｒｏｂｅの構造上の分類を示す。遺伝子の分類は次の５つのカテゴリーが考えられる。
（１）同定済みの遺伝子または遺伝子として予想されている配列がｐｒｏｂｅの場合、
（２）遺伝子領域内であるが、イントロン配列がｐｒｏｂｅの場合、
（３）上記（２）のｐｒｏｂｅの相補鎖がｐｒｏｂｅの場合、
（４）遺伝子に隣接する外側の配列がｐｒｏｂｅの場合、
（５）遺伝子が想定されていない領域がｐｒｏｂｅの場合
である。（１）は該当遺伝子の転写産物を意味する。（２）は該当遺伝子の選択的スプライシング転写産物か、あるいは新たな転写産物の可能性がある。（３）はその干渉ＲＮＡとしての転写産物か、あるいは新たな転写産物の可能性がある。（４）は該当遺伝子の転写産物か、新たな転写産物の可能性がある。（５）は未知の転写産物と考えられる。
高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個を、これらのカテゴリーに従って分類した（図８）。
高ウイルス遺伝子の半数は遺伝子転写産物で、８割が遺伝子関連領域の転写産物であった。低ウイルス遺伝子は逆に遺伝子未同定の領域の転写産物が６割を占めていた。これら未知の転写産物が数多く発現増強していることが、ウイルス抑制状態と関連するかどうか、興味深いところである。
（Ｂ）機能分類
まず、ＩＮＦ誘導性遺伝子が差のある遺伝子として見いだされているかを検討した。ＩＮＦ誘導性遺伝子として知られている２３９個の遺伝子のうち、２個だけが高ウイルス遺伝子の中に存在した。このことは高ウイルス症例でさえ、ＩＦＮがそれほど強く作動していないことを示している。持続感染が成立してしまった慢性肝炎では、ＩＦＮ以外の宿主遺伝子がウイルス量のコントロールに関与していることが示唆された。
既知の高ウイルス遺伝子３６個の中で、６個は、Ｔ細胞活性、免疫細胞やリンパ球の増殖、リンパ球の走化性などの炎症反応、免疫反応を増強する遺伝子であった。このような遺伝子が発現していることは、ＨＣＶを排除しようとする宿主防御反応が働いていることを示すものである。これらは、ウイルス量が多い結果、誘導された遺伝子と考えられる。しかし、それにも拘わらずウイルスは排除されず、宿主はウイルス量の多い状態を保っている。高ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶ側にとって増殖有利に働くと予想される因子が存在する可能性がある。
低ウイルス遺伝子では、セリンプロテアーゼ阻害活性領域を持つ遺伝子、プロテオソームに関与する遺伝子が存在した。ウイルス増殖阻害が予想される遺伝子である。また、高ウイルス遺伝子とは別の炎症に関与する遺伝子も含まれていた。しかし、低ウイルス遺伝子では機能のわからない未知遺伝子が半分以上占めていた。これらの中に、ＨＣＶの干渉ＲＮＡとして働く転写産物が含まれていないか、ＨＣＶ９．５ｋｂの配列との相同性を調べてみた。しかし、低ウイルス遺伝子にはそのような配列は存在しなかった。低ウイルス遺伝子には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。
ここで見出された遺伝子には、ウイルス量に関わる原因遺伝子と結果遺伝子とが両方存在すると考えられる。どの遺伝子がウイルス量のコントロールに関与している原因遺伝子であるかは、ＨＣＶ感染増殖実験系を用いて、遺伝子が実際ウイルス量に影響するかどうか、因果関係を明らかにしていく必要がある。
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙで抽出された発現に差のある遺伝子１１７個について、既知の遺伝子、未知の遺伝子、さらに既知遺伝子の機能について分類した。
（Ａ）構造分類
図８に、最新遺伝子情報にもとづく１１７ｐｒｏｂｅの構造上の分類を示す。遺伝子の分類は次の５つのカテゴリーが考えられる。
（１）同定済みの遺伝子または遺伝子として予想されている配列がｐｒｏｂｅの場合、
（２）遺伝子領域内であるが、イントロン配列がｐｒｏｂｅの場合、
（３）上記（２）のｐｒｏｂｅの相補鎖がｐｒｏｂｅの場合、
（４）遺伝子に隣接する外側の配列がｐｒｏｂｅの場合、
（５）遺伝子が想定されていない領域がｐｒｏｂｅの場合
である。（１）は該当遺伝子の転写産物を意味する。（２）は該当遺伝子の選択的スプライシング転写産物か、あるいは新たな転写産物の可能性がある。（３）はその干渉ＲＮＡとしての転写産物か、あるいは新たな転写産物の可能性がある。（４）は該当遺伝子の転写産物か、新たな転写産物の可能性がある。（５）は未知の転写産物と考えられる。
高ウイルス遺伝子７８個と低ウイルス遺伝子３９個を、これらのカテゴリーに従って分類した（図８）。
高ウイルス遺伝子の半数は遺伝子転写産物で、８割が遺伝子関連領域の転写産物であった。低ウイルス遺伝子は逆に遺伝子未同定の領域の転写産物が６割を占めていた。これら未知の転写産物が数多く発現増強していることが、ウイルス抑制状態と関連するかどうか、興味深いところである。
（Ｂ）機能分類
まず、ＩＮＦ誘導性遺伝子が差のある遺伝子として見いだされているかを検討した。ＩＮＦ誘導性遺伝子として知られている２３９個の遺伝子のうち、２個だけが高ウイルス遺伝子の中に存在した。このことは高ウイルス症例でさえ、ＩＦＮがそれほど強く作動していないことを示している。持続感染が成立してしまった慢性肝炎では、ＩＦＮ以外の宿主遺伝子がウイルス量のコントロールに関与していることが示唆された。
既知の高ウイルス遺伝子３６個の中で、６個は、Ｔ細胞活性、免疫細胞やリンパ球の増殖、リンパ球の走化性などの炎症反応、免疫反応を増強する遺伝子であった。このような遺伝子が発現していることは、ＨＣＶを排除しようとする宿主防御反応が働いていることを示すものである。これらは、ウイルス量が多い結果、誘導された遺伝子と考えられる。しかし、それにも拘わらずウイルスは排除されず、宿主はウイルス量の多い状態を保っている。高ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶ側にとって増殖有利に働くと予想される因子が存在する可能性がある。
低ウイルス遺伝子では、セリンプロテアーゼ阻害活性領域を持つ遺伝子、プロテオソームに関与する遺伝子が存在した。ウイルス増殖阻害が予想される遺伝子である。また、高ウイルス遺伝子とは別の炎症に関与する遺伝子も含まれていた。しかし、低ウイルス遺伝子では機能のわからない未知遺伝子が半分以上占めていた。これらの中に、ＨＣＶの干渉ＲＮＡとして働く転写産物が含まれていないか、ＨＣＶ９．５ｋｂの配列との相同性を調べてみた。しかし、低ウイルス遺伝子にはそのような配列は存在しなかった。低ウイルス遺伝子には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。
ここで見出された遺伝子には、ウイルス量に関わる原因遺伝子と結果遺伝子とが両方存在すると考えられる。どの遺伝子がウイルス量のコントロールに関与している原因遺伝子であるかは、ＨＣＶ感染増殖実験系を用いて、遺伝子が実際ウイルス量に影響するかどうか、因果関係を明らかにしていく必要がある。
本実施例では、実施例１及び２と同様にＨＣＶの定量を行い、また実施例１及び２よりも症例数を増やして２つの病態に分けてウイルス量と関連する遺伝子を検討した。
まず肝臓ウイルス量を定量し、症例の選別を行った。方法を以下に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は、実施例１と同様である。
ウイルス量は、ウイルス遺伝子の定量で求めた。材料は、肝細胞癌症例５９例の非癌部組織を用い、なるべく肝細胞癌ステージの低いＩ，およびＩＩを選択した。
組織からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡの混在を除くためＤＮａｓｅＩ処理をおこなった。その後、ランダムプライマーによりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲにて遺伝子定量をおこなった。ＨＣＶ ＲＮＡの定量は、ＨＣＶの遺伝子配列が保存されていて、効率よくＰＣＲがかかった、３’端に近い領域を用いた。また肝臓ｍＲＮＡの定量も同様の方法で行った。ＨＣＶ ＲＮＡ量やｍＲＮＡ量は、細胞あたりの量に標準化するために１８Ｓ ｒＲＮＡの定量も行い、この値で除した値を各ＲＮＡ量とした。ＨＣＶ ＲＮＡ定量の結果を表８に示す。
肝臓ＨＣＶ量は、４〜４８００００ｕｎｉｔの範囲で分布した。その中から、３００００ｕｎｉｔ以上の２０症例を高ウイルス群とし、３００ｕｎｉｔ以下の１５症例を低ウイルス群とした。
実施例２において行ったインターフェロン下流の遺伝子の発現解析から、ＣＨとＬＣでは異なる遺伝子発現パターンを示したことより、本実施例では、２つの病態に分けて、ウイルス量と関連する遺伝子を検討した。選別した高ウイルス群と低ウイルス群とで患者背景因子を比較した。患者背景因子として慢性肝炎１８例、肝硬変１７例に分けて、それぞれの項目についてウイルス量による２群間で比較を行った。有意差検定値を表９の「Ｐ」の欄に示す。
肝硬変の高ウイルス群では肝細胞癌の進展度が低い症例が多くみられたが、肝機能レベルなど他は２群間に有意差はなかった。ウイルスの遺伝子型については低ウイルス群側に２型のＨＣＶが偏って分布した。従ってＨＣＶの遺伝子型の違いも考慮に入れる必要があると考え、遺伝子発現量を比較する際には遺伝子型別解析も平行して行った。
遺伝子発現の違いを肝臓組織に発現する全ｍＲＮＡを対象に網羅的に調べるため、最新バージョンのオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた。
方法は、実施例２と同様にして行った。
用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）には、ヒト全遺伝子と思われる約４７０００遺伝子に相当する５４６７５プローブが張り付いている。本実施例では、慢性肝炎の高ウイルス群を５例、低ウイルス群を５例とし、また、新たに肝硬変高ウイルス群７例、低ウイルス群３例を加えた。各病態で１０枚ずつ合計２０枚のマイクロアレイを使い、慢性肝炎では５：５、肝硬変では７：３の２群間比較を行い、発現に差のある遺伝子を同定した。
図９は、マイクロアレイ解析結果を用いて発現量に差のある遺伝子を求める方法の概要図である。実施例２では高ウイルス群、低ウイルス群各４症例で解析したが、本実施例では、各群５症例にして解析した。
その結果、５４６７５プローブのうち、１０枚中１枚でも発現有りと表記されたｐｒｏｂｅを選び出すと、２９０７０ｐｒｏｂｅであった。この２９０７０ｐｒｏｂｅが、肝臓に発現している遺伝子と考えられる。
次に２群間で有意に差のある遺伝子を抽出するため、３種類のパラメトッリク検定を行った。２群間で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで１６３７ｐｒｏｂｅ、２群間で分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで１３６７ｐｒｏｂｅが抽出された。また少ないレプリケートからできるだけ正確な母分散を見積もるため、レプリケートを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算したＣｒｏｓｓ ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌ適用のパラメトリック検定を行い９８２ｐｒｏｂｅを抽出した。この３種類の検定で重複した７１４ｐｒｏｂｅが、信頼性の高い差のあるｐｒｏｂｅと考えた。さらに、この７１４ｐｒｏｂｅのうち、２群間で発現量が２倍以上差のあるｐｒｏｂｅを求めたところ、高ウイルス群側に２倍以上発現の高くなっているｐｒｏｂｅは１４３個で、更に高ウイルス群の全てのアレイに発現有りと表記された、遺伝子発現が明確なプローブだけにすると、高ウイルス遺伝子として６９ｐｒｏｂｅとなった。遺伝子として整理すると６６遺伝子となり（表１０）、これらを高ウイルス遺伝子と呼ぶ。同様の操作により、低ウイルス遺伝子は２１遺伝子となった（表１１）。これら９３ｐｒｏｂｅ、８７遺伝子が、ウイルス量に関連して発現変化を示した遺伝子となる。
表１０〜１３に、それぞれ慢性肝炎高ウイルス遺伝子、慢性肝炎低ウイルス遺伝子、肝硬変高ウイルス遺伝子、肝硬変低ウイルス遺伝子をリストした。
実施例２の解析結果と比較したところ、高ウイルス遺伝子は３５ｐｒｏｂｅが重複しており、低ウイルス遺伝子では１９ｐｒｏｂｅが重複していた。これらの重複した遺伝子は、症例を増やすことで発現量の差が２倍にも満たなくなることから、症例を増やすことで、より信頼性の高い遺伝子として抽出されたものであると考えられる。なお表１０及び１１の「Ｏｖｅｒｌａｐ」の欄にこれら重複遺伝子をマークした。
肝硬変において高ウイルス群７例、低ウイルス群３例で，同様の解析をした。その結果、高ウイルス遺伝子は、２７遺伝子、低ウイルス遺伝子は１７遺伝子が抽出された（図１０）。
慢性肝炎と肝硬変からそれぞれ抽出されたウイルス量に関連する遺伝子には、共通なものがあるかを検討した。その結果、高ウイルス遺伝子に１遺伝子の重複があった（図１１）。他は、重複が認められなかった。
まず肝臓ウイルス量を定量し、症例の選別を行った。方法を以下に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は、実施例１と同様である。
ウイルス量は、ウイルス遺伝子の定量で求めた。材料は、肝細胞癌症例５９例の非癌部組織を用い、なるべく肝細胞癌ステージの低いＩ，およびＩＩを選択した。
組織からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡの混在を除くためＤＮａｓｅＩ処理をおこなった。その後、ランダムプライマーによりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲにて遺伝子定量をおこなった。ＨＣＶ ＲＮＡの定量は、ＨＣＶの遺伝子配列が保存されていて、効率よくＰＣＲがかかった、３’端に近い領域を用いた。また肝臓ｍＲＮＡの定量も同様の方法で行った。ＨＣＶ ＲＮＡ量やｍＲＮＡ量は、細胞あたりの量に標準化するために１８Ｓ ｒＲＮＡの定量も行い、この値で除した値を各ＲＮＡ量とした。ＨＣＶ ＲＮＡ定量の結果を表８に示す。
実施例２において行ったインターフェロン下流の遺伝子の発現解析から、ＣＨとＬＣでは異なる遺伝子発現パターンを示したことより、本実施例では、２つの病態に分けて、ウイルス量と関連する遺伝子を検討した。選別した高ウイルス群と低ウイルス群とで患者背景因子を比較した。患者背景因子として慢性肝炎１８例、肝硬変１７例に分けて、それぞれの項目についてウイルス量による２群間で比較を行った。有意差検定値を表９の「Ｐ」の欄に示す。
遺伝子発現の違いを肝臓組織に発現する全ｍＲＮＡを対象に網羅的に調べるため、最新バージョンのオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた。
方法は、実施例２と同様にして行った。
用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）には、ヒト全遺伝子と思われる約４７０００遺伝子に相当する５４６７５プローブが張り付いている。本実施例では、慢性肝炎の高ウイルス群を５例、低ウイルス群を５例とし、また、新たに肝硬変高ウイルス群７例、低ウイルス群３例を加えた。各病態で１０枚ずつ合計２０枚のマイクロアレイを使い、慢性肝炎では５：５、肝硬変では７：３の２群間比較を行い、発現に差のある遺伝子を同定した。
図９は、マイクロアレイ解析結果を用いて発現量に差のある遺伝子を求める方法の概要図である。実施例２では高ウイルス群、低ウイルス群各４症例で解析したが、本実施例では、各群５症例にして解析した。
その結果、５４６７５プローブのうち、１０枚中１枚でも発現有りと表記されたｐｒｏｂｅを選び出すと、２９０７０ｐｒｏｂｅであった。この２９０７０ｐｒｏｂｅが、肝臓に発現している遺伝子と考えられる。
次に２群間で有意に差のある遺伝子を抽出するため、３種類のパラメトッリク検定を行った。２群間で分散が等しいと仮定するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで１６３７ｐｒｏｂｅ、２群間で分散が等しくないと仮定するＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで１３６７ｐｒｏｂｅが抽出された。また少ないレプリケートからできるだけ正確な母分散を見積もるため、レプリケートを増やした時に収束するであろう標準偏差を予測計算したＣｒｏｓｓ ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌ適用のパラメトリック検定を行い９８２ｐｒｏｂｅを抽出した。この３種類の検定で重複した７１４ｐｒｏｂｅが、信頼性の高い差のあるｐｒｏｂｅと考えた。さらに、この７１４ｐｒｏｂｅのうち、２群間で発現量が２倍以上差のあるｐｒｏｂｅを求めたところ、高ウイルス群側に２倍以上発現の高くなっているｐｒｏｂｅは１４３個で、更に高ウイルス群の全てのアレイに発現有りと表記された、遺伝子発現が明確なプローブだけにすると、高ウイルス遺伝子として６９ｐｒｏｂｅとなった。遺伝子として整理すると６６遺伝子となり（表１０）、これらを高ウイルス遺伝子と呼ぶ。同様の操作により、低ウイルス遺伝子は２１遺伝子となった（表１１）。これら９３ｐｒｏｂｅ、８７遺伝子が、ウイルス量に関連して発現変化を示した遺伝子となる。
表１０〜１３に、それぞれ慢性肝炎高ウイルス遺伝子、慢性肝炎低ウイルス遺伝子、肝硬変高ウイルス遺伝子、肝硬変低ウイルス遺伝子をリストした。
肝硬変において高ウイルス群７例、低ウイルス群３例で，同様の解析をした。その結果、高ウイルス遺伝子は、２７遺伝子、低ウイルス遺伝子は１７遺伝子が抽出された（図１０）。
慢性肝炎と肝硬変からそれぞれ抽出されたウイルス量に関連する遺伝子には、共通なものがあるかを検討した。その結果、高ウイルス遺伝子に１遺伝子の重複があった（図１１）。他は、重複が認められなかった。
本実施例では、抽出された遺伝子の発現パターンが、ウイルス量の違いを見分ける遺伝子として有効であるか、クラスタリング解析を行った。特にサンプルの近縁関係がどのように解析されるかに注目した。
その結果、慢性肝炎遺伝子８７遺伝子は、高ウイルス遺伝子６６個と低ウイルス遺伝子２１個にクラスター分類されており、慢性肝炎１０症例も低ウイルス（Ｌ）群と高ウイルス（Ｈ）群とに、きれいにクラスター分類できることが示された（図１２）。また、同様に肝硬変遺伝子４４遺伝子で肝硬変１０症例を解析すると３例と７例の２群のきれいにクラスター分類できた。しかし、慢性肝炎遺伝子で肝硬変症例を解析した場合と肝硬変遺伝子で慢性肝炎症例を解析した場合では、１０症例のクラスター分類は正しく行うことができなかった。従って、ウイルス量に関連する遺伝子は慢性肝炎と肝硬変とでは異なることが示された。
その結果、慢性肝炎遺伝子８７遺伝子は、高ウイルス遺伝子６６個と低ウイルス遺伝子２１個にクラスター分類されており、慢性肝炎１０症例も低ウイルス（Ｌ）群と高ウイルス（Ｈ）群とに、きれいにクラスター分類できることが示された（図１２）。また、同様に肝硬変遺伝子４４遺伝子で肝硬変１０症例を解析すると３例と７例の２群のきれいにクラスター分類できた。しかし、慢性肝炎遺伝子で肝硬変症例を解析した場合と肝硬変遺伝子で慢性肝炎症例を解析した場合では、１０症例のクラスター分類は正しく行うことができなかった。従って、ウイルス量に関連する遺伝子は慢性肝炎と肝硬変とでは異なることが示された。
抽出した遺伝子（表１０〜１３）が、ウイルス量関連遺伝子であることを検証するために、その一部の遺伝子を適宜選択してリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの発現定量を行った。
表１４に、用いたプライマー配列を示す。
検証し得た抽出遺伝子の評価を表１５に示す。
高ウイルス群と低ウイルス群での発現量比較をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにて行った。慢性肝炎と肝硬変のそれぞれで解析できた結果をＰ値で示す。Ｐ値空欄は未測定であることを示す。低ウイルス群をＨＣＶ遺伝子型別に分け、２群間比較も行った。
検証結果の例を図１４〜１６に示す。左パネルは、低ウイルス群を遺伝子型１型と２型にわけて高ウイルス癌と比較した図である。右パネルは、低ウイルス群全体をまとめて高ウイルス群と比較した図である。図は、箱ひげ図であり、各群における測定値の分布を示している。下からひげ下端が１０パーセンタイル、箱下端が２５パーセンタイル、箱の中線が５０パーセンタイル、箱上端が７５パーセンタイル、ひげ上端が９０パーセンタイルを表す。欄外Ｐ値は、ウイルス量の２群間比較の結果でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定による。左パネルは、低ウイルス群をＨＣＶ遺伝子型１型と２型に分け、高ウイルス群との比較を行った結果を示す。
図１４において、ＯＡＳＬは、慢性肝炎と肝硬変で共通に見いだされた高ウイルス遺伝子である。この遺伝子は、慢性肝炎でのみ検証された。ＳＮＡＩ２も慢性肝炎高ウイルス遺伝子として検証できた。いずれの遺伝子もＨＣＶ遺伝子型によらず、低ウイルス群では低発現を示した。
図１５は、慢性肝炎高ウイルス（ＣＨＨ）遺伝子の例である。図１５において、ＣＸＣＬ６はＨＣＶ遺伝子型１ｂ型低ウイルス群でのみ発現抑制がみられた。ＡＫ０２５９６７は、肝硬変では低ウイルス遺伝子であった。
図１６は、肝硬変低ウイルス（ＬＣＬ）遺伝子の例である。図１６において、両遺伝子共、肝硬変低ウイルス遺伝子として検証できたが、慢性肝炎では高ウイルス遺伝子であった。
表１４に、用いたプライマー配列を示す。
検証結果の例を図１４〜１６に示す。左パネルは、低ウイルス群を遺伝子型１型と２型にわけて高ウイルス癌と比較した図である。右パネルは、低ウイルス群全体をまとめて高ウイルス群と比較した図である。図は、箱ひげ図であり、各群における測定値の分布を示している。下からひげ下端が１０パーセンタイル、箱下端が２５パーセンタイル、箱の中線が５０パーセンタイル、箱上端が７５パーセンタイル、ひげ上端が９０パーセンタイルを表す。欄外Ｐ値は、ウイルス量の２群間比較の結果でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定による。左パネルは、低ウイルス群をＨＣＶ遺伝子型１型と２型に分け、高ウイルス群との比較を行った結果を示す。
図１４において、ＯＡＳＬは、慢性肝炎と肝硬変で共通に見いだされた高ウイルス遺伝子である。この遺伝子は、慢性肝炎でのみ検証された。ＳＮＡＩ２も慢性肝炎高ウイルス遺伝子として検証できた。いずれの遺伝子もＨＣＶ遺伝子型によらず、低ウイルス群では低発現を示した。
図１５は、慢性肝炎高ウイルス（ＣＨＨ）遺伝子の例である。図１５において、ＣＸＣＬ６はＨＣＶ遺伝子型１ｂ型低ウイルス群でのみ発現抑制がみられた。ＡＫ０２５９６７は、肝硬変では低ウイルス遺伝子であった。
図１６は、肝硬変低ウイルス（ＬＣＬ）遺伝子の例である。図１６において、両遺伝子共、肝硬変低ウイルス遺伝子として検証できたが、慢性肝炎では高ウイルス遺伝子であった。
ＨＣＶは約９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡを持つ一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶゲノムには多くの遺伝子型が存在しており、現在までに６種類以上の遺伝子型に分けられている。またＨＣＶは直径５０〜６０ｎｍの球状のウイルスでコア粒子をエンベロープが包み込む構造をとっている。
ＨＣＶは肝細胞に受容体を介して吸着し、細胞質にエンドサイトーシスで侵入したあと脱殻してＲＮＡを放出する。このＲＮＡはすぐにｍＲＮＡとしてリボゾームと結合し約３０００アミノ酸からなる前駆体蛋白質が翻訳される。小胞体膜上で翻訳された前駆体タンパク質は、細胞のシグナラーゼとウイルス自身がコードする２種類のプロテアーゼによって３種の構造蛋白質と７種の非構造蛋白質として産生される。合成されたウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、ウイルスＲＮＡは＋鎖から−鎖が複製され、さらに＋鎖が複製される。＋鎖ＲＮＡはコアタンパク質に取り込まれ、小胞体内に向かってエンベロープをかぶりながら粒子形成が起こる。ウイルス粒子はゴルジ装置を通って細胞膜に達し、肝細胞の外へ放出されると考えられている。
これらの過程で、ウイルス量を制御する第一ステップとして細胞への吸着と侵入過程が考えられる。そこで、本実施例では、ウイルス量の違いがウイルス受容体発現およびエンドサイトーシス関連遺伝子発現と関連するかどうか、検討した。
方法は、以下の通り行った。まず肝臓ウイルス量を定量し、症例の選別を行った。方法を以下に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は、実施例１と同様である。
ウイルス量は、ウイルス遺伝子の定量で求めた。材料は、肝細胞癌症例５０例の癌部および非癌部組織を用い、なるべく肝細胞癌ステージの低いＩ，およびＩＩを選択した。
組織からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡの混在を除くためＤＮａｓｅＩ処理をおこなった。その後、ランダムプライマーによりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲにて遺伝子定量をおこなった。ＨＣＶ ＲＮＡの定量は、ＨＣＶの遺伝子配列が保存されていて、効率よくＰＣＲ増幅ができた、３’端に近い領域を用いた。また肝臓ｍＲＮＡの定量も同様の方法で行った。ＨＣＶ ＲＮＡ量やｍＲＮＡ量は、細胞あたりの量に標準化するために１８Ｓ ｒＲＮＡの定量も行い、この値で除した値を各ＲＮＡ量とした。
その結果、ウイルス量の違いは、非癌部肝組織だけでなく、癌部でも多様であることが分かった（図１７）。図１７は、肝臓ＨＣＶ ＲＮＡ定量の結果について、縦軸に癌部のＨＣＶ量、横軸に非癌部のＨＣＶ量をとってあらわしたグラフである。
実線は非癌部（ＮＴ）に対し癌部（Ｔ）の量が１の場合を示し、点線は１／４（Ｔ／ＮＴ、実線の下側）と４倍（実線の上側）を表す。非癌部ＨＣＶは数十から数十万単位まで幅広く分布している。これに対し、癌部ＨＣＶは同量かもしくは低下が見られ、１／４以下になる症例が５０症例中２９例（５８％）存在することが分かった。癌部では半分以上の症例で、ＨＣＶが感染しにくいか増えにくいと言える。そこで、ウイルス量の違いについて、非癌部同志の違いだけでなく、癌部同志での違いについても検討した。非癌部・癌部ともにウイルス量が多い症例が７例（領域１の症例）、癌部のウイルス量が非癌部の１００分の１以下になる症例が７例（領域２の症例）、非癌部・癌部ともにウイルス量が少ない症例が１１例（領域３）について、ウイルス受容体およびその関連遺伝子について発現量を比較した。
なお、図１７において、ＨＣＶ遺伝子型別については、「●」は１ｂ、「○」は２ａ、「◇」は２ｂ、「■」は１ｂと２ａの重感染を示す。
受容体のリガンド別に分類すると、ＨＣＶエンベロープタンパク質を認識する受容体としてＣＤ８１、ヘパラン硫酸が知られている。ヘパラン硫酸については、ヘパラン硫酸合成に関わる糖転移酵素の３分子を測定した。ＨＣＶエンベロープタンパク質の糖鎖を認識する受容体として、Ｃ型レクチンのＤＣ−ＳＩＧＮ，Ｌ−ＳＩＧＮ，ＡＳＧＲ及びＭＢＬ２があり、それぞれマンノースやガラクトースなどが認識分子となっている。ＨＣＶ粒子が血中のＬＤＬ、ＨＤＬと結合し複合体形成をしているため、これらの受容体であるＬＤＬＲ及びＳＣＡＲＢ１がＨＣＶ受容体として働くことも示唆されている。また、ＳＣＡＲＢ１はＥ２蛋白を直接認識しているとも考えられている。
そこで、発現量については、８個の受容体候補に関連して１１分子のｍＲＮＡを測定した。
エンドサイトーシス関連分子には、クラスリンタンパク質とアダプタータンパク質がある。リガンドが受容体に結合すると、細胞膜内で受容体の近くに存在しているアダプタータンパク質であるＡＰ２が受容体の周りに集まり、それがきっかけとなり受容体とアダプタータンパク質の周りに重鎖（Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ｃ）三量体と軽鎖（Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ａ）三量体からなるクラスリンが集まって来る。クラスリンがたくさん集まることによってクラスリン被覆ピット（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔ）が出来上がり、エンドゾームが形成される。
本実施例では、上記エンドサイトーシス関連分子としてＣＬＴＣ，ＣＬＴＡ及びＡＰ２Ｍ１の３分子を測定した。
なお、感染に伴い起こるシグナル伝達の１つであるＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ関連のシグナル分子（ＴＬＲ３，ＴＩＣＡＭ１，ＤＤＸ５８）も測定した。
表１６に各遺伝子のプライマー配列を示す。リアルタイムＰＣＲにて定量した結果を表１７に示す。
表１７の癌部（Ｔｕｍｏｒ）の「２群間比較」の欄において、網掛けをした部分の結果を図１８及び図１９に示す。図１８及び図１９は、有意差のでた受容体関連遺伝子の結果である。
なお、表１７におけるＣＬＥＣ４Ｍは、Ｌ−ＳＩＧＮと同義である。
非癌部のウイルス量から、低ウイルス群（ＮＬ）１１例、高ウイルス群（ＮＨ）１４例に分け、ＮＨについては、さらに癌部で依然として高ウイルスである（ＮＨＴＨ）７例と低ウイルスとなる（ＮＨＴＬ）７例とに分けて、比較した。
なお、２群間比較における背景因子の比較を、表１８に示す。
以上の結果より、次のことが分かった。
（１）非癌部でウイルス量に相関する受容体関連遺伝子はなかった。
（２）癌部ではウイルス量に相関する受容体遺伝子（Ｌ−ＳＩＧＮ）が１つみつかった。ウイルス量が多い癌ではＬ−ＳＩＧＮが高発現していた。
（３）癌部でウイルス量に逆相関する遺伝子が３つ（エンドサイトーシス関連遺伝子の３つ）がみつかった。ウイルスが少ない癌ではエンドサイトーシス関連分子が高発現していた。
（４）非癌部が高ウイルスであるにも拘わらず、癌部ではウイルス低下が見られる症例には上記の変化に加え、ＳＣＡＲＢ１，ＡＳＧＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮの低下が顕著であった。
以上より、これら受容体関連遺伝子において、非癌部のウイルス量には関連ないが、癌部ウイルス量には関連する分子が存在した。非癌部のウイルス量はこれら受容体関連遺伝子の発現量とは無関係なところで制御されている。しかし癌細胞のウイルス量はこれら受容体および関連分子の発現量に依存しており、１つにウイルスエントリーステップでウイルス量が制御されていると考えられた。
また癌細胞におけるウイルス低下がエンドサイトーシス亢進と関連する可能性が示唆された。特にＬ−ＳＩＧＮの発現抑制、ＣＬＴＣの発現促進は、癌部低ウイルス群に顕著であり、非癌部レベルと比べても明らかな特徴である。従って、Ｌ−ＳＩＧＮの発現抑制、ＣＬＴＣの発現促進をすることが、ＨＣＶ感染防御に有効な戦略を示すものと思われる。
ＨＣＶは肝細胞に受容体を介して吸着し、細胞質にエンドサイトーシスで侵入したあと脱殻してＲＮＡを放出する。このＲＮＡはすぐにｍＲＮＡとしてリボゾームと結合し約３０００アミノ酸からなる前駆体蛋白質が翻訳される。小胞体膜上で翻訳された前駆体タンパク質は、細胞のシグナラーゼとウイルス自身がコードする２種類のプロテアーゼによって３種の構造蛋白質と７種の非構造蛋白質として産生される。合成されたウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、ウイルスＲＮＡは＋鎖から−鎖が複製され、さらに＋鎖が複製される。＋鎖ＲＮＡはコアタンパク質に取り込まれ、小胞体内に向かってエンベロープをかぶりながら粒子形成が起こる。ウイルス粒子はゴルジ装置を通って細胞膜に達し、肝細胞の外へ放出されると考えられている。
これらの過程で、ウイルス量を制御する第一ステップとして細胞への吸着と侵入過程が考えられる。そこで、本実施例では、ウイルス量の違いがウイルス受容体発現およびエンドサイトーシス関連遺伝子発現と関連するかどうか、検討した。
方法は、以下の通り行った。まず肝臓ウイルス量を定量し、症例の選別を行った。方法を以下に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は、実施例１と同様である。
ウイルス量は、ウイルス遺伝子の定量で求めた。材料は、肝細胞癌症例５０例の癌部および非癌部組織を用い、なるべく肝細胞癌ステージの低いＩ，およびＩＩを選択した。
組織からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡの混在を除くためＤＮａｓｅＩ処理をおこなった。その後、ランダムプライマーによりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲにて遺伝子定量をおこなった。ＨＣＶ ＲＮＡの定量は、ＨＣＶの遺伝子配列が保存されていて、効率よくＰＣＲ増幅ができた、３’端に近い領域を用いた。また肝臓ｍＲＮＡの定量も同様の方法で行った。ＨＣＶ ＲＮＡ量やｍＲＮＡ量は、細胞あたりの量に標準化するために１８Ｓ ｒＲＮＡの定量も行い、この値で除した値を各ＲＮＡ量とした。
その結果、ウイルス量の違いは、非癌部肝組織だけでなく、癌部でも多様であることが分かった（図１７）。図１７は、肝臓ＨＣＶ ＲＮＡ定量の結果について、縦軸に癌部のＨＣＶ量、横軸に非癌部のＨＣＶ量をとってあらわしたグラフである。
実線は非癌部（ＮＴ）に対し癌部（Ｔ）の量が１の場合を示し、点線は１／４（Ｔ／ＮＴ、実線の下側）と４倍（実線の上側）を表す。非癌部ＨＣＶは数十から数十万単位まで幅広く分布している。これに対し、癌部ＨＣＶは同量かもしくは低下が見られ、１／４以下になる症例が５０症例中２９例（５８％）存在することが分かった。癌部では半分以上の症例で、ＨＣＶが感染しにくいか増えにくいと言える。そこで、ウイルス量の違いについて、非癌部同志の違いだけでなく、癌部同志での違いについても検討した。非癌部・癌部ともにウイルス量が多い症例が７例（領域１の症例）、癌部のウイルス量が非癌部の１００分の１以下になる症例が７例（領域２の症例）、非癌部・癌部ともにウイルス量が少ない症例が１１例（領域３）について、ウイルス受容体およびその関連遺伝子について発現量を比較した。
なお、図１７において、ＨＣＶ遺伝子型別については、「●」は１ｂ、「○」は２ａ、「◇」は２ｂ、「■」は１ｂと２ａの重感染を示す。
受容体のリガンド別に分類すると、ＨＣＶエンベロープタンパク質を認識する受容体としてＣＤ８１、ヘパラン硫酸が知られている。ヘパラン硫酸については、ヘパラン硫酸合成に関わる糖転移酵素の３分子を測定した。ＨＣＶエンベロープタンパク質の糖鎖を認識する受容体として、Ｃ型レクチンのＤＣ−ＳＩＧＮ，Ｌ−ＳＩＧＮ，ＡＳＧＲ及びＭＢＬ２があり、それぞれマンノースやガラクトースなどが認識分子となっている。ＨＣＶ粒子が血中のＬＤＬ、ＨＤＬと結合し複合体形成をしているため、これらの受容体であるＬＤＬＲ及びＳＣＡＲＢ１がＨＣＶ受容体として働くことも示唆されている。また、ＳＣＡＲＢ１はＥ２蛋白を直接認識しているとも考えられている。
そこで、発現量については、８個の受容体候補に関連して１１分子のｍＲＮＡを測定した。
エンドサイトーシス関連分子には、クラスリンタンパク質とアダプタータンパク質がある。リガンドが受容体に結合すると、細胞膜内で受容体の近くに存在しているアダプタータンパク質であるＡＰ２が受容体の周りに集まり、それがきっかけとなり受容体とアダプタータンパク質の周りに重鎖（Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ｃ）三量体と軽鎖（Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ａ）三量体からなるクラスリンが集まって来る。クラスリンがたくさん集まることによってクラスリン被覆ピット（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔ）が出来上がり、エンドゾームが形成される。
本実施例では、上記エンドサイトーシス関連分子としてＣＬＴＣ，ＣＬＴＡ及びＡＰ２Ｍ１の３分子を測定した。
なお、感染に伴い起こるシグナル伝達の１つであるＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ関連のシグナル分子（ＴＬＲ３，ＴＩＣＡＭ１，ＤＤＸ５８）も測定した。
表１６に各遺伝子のプライマー配列を示す。リアルタイムＰＣＲにて定量した結果を表１７に示す。
なお、表１７におけるＣＬＥＣ４Ｍは、Ｌ−ＳＩＧＮと同義である。
非癌部のウイルス量から、低ウイルス群（ＮＬ）１１例、高ウイルス群（ＮＨ）１４例に分け、ＮＨについては、さらに癌部で依然として高ウイルスである（ＮＨＴＨ）７例と低ウイルスとなる（ＮＨＴＬ）７例とに分けて、比較した。
なお、２群間比較における背景因子の比較を、表１８に示す。
（１）非癌部でウイルス量に相関する受容体関連遺伝子はなかった。
（２）癌部ではウイルス量に相関する受容体遺伝子（Ｌ−ＳＩＧＮ）が１つみつかった。ウイルス量が多い癌ではＬ−ＳＩＧＮが高発現していた。
（３）癌部でウイルス量に逆相関する遺伝子が３つ（エンドサイトーシス関連遺伝子の３つ）がみつかった。ウイルスが少ない癌ではエンドサイトーシス関連分子が高発現していた。
（４）非癌部が高ウイルスであるにも拘わらず、癌部ではウイルス低下が見られる症例には上記の変化に加え、ＳＣＡＲＢ１，ＡＳＧＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮの低下が顕著であった。
以上より、これら受容体関連遺伝子において、非癌部のウイルス量には関連ないが、癌部ウイルス量には関連する分子が存在した。非癌部のウイルス量はこれら受容体関連遺伝子の発現量とは無関係なところで制御されている。しかし癌細胞のウイルス量はこれら受容体および関連分子の発現量に依存しており、１つにウイルスエントリーステップでウイルス量が制御されていると考えられた。
また癌細胞におけるウイルス低下がエンドサイトーシス亢進と関連する可能性が示唆された。特にＬ−ＳＩＧＮの発現抑制、ＣＬＴＣの発現促進は、癌部低ウイルス群に顕著であり、非癌部レベルと比べても明らかな特徴である。従って、Ｌ−ＳＩＧＮの発現抑制、ＣＬＴＣの発現促進をすることが、ＨＣＶ感染防御に有効な戦略を示すものと思われる。
本発明により、高ウイルス群で発現亢進している遺伝子をスクリーニングすることが可能となる。そして、この高ウイルス遺伝子の中には、ＨＣＶが増殖するのに有利に働くと予想される因子が存在する可能性があるため、高ウイルス遺伝子の発現を抑制することによってＨＣＶの増殖を抑制することができる。
また、本発明により、低ウイルス群で発現亢進している遺伝子をスクリーニングすることが可能となる。そして、この低ウイルス遺伝子には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。すなわち、低ウイルス遺伝子の発現を亢進することによってＨＣＶの増殖を抑制することができる。
すなわち、本発明の方法を用いて見出された遺伝子の発現を調節することによって、ＨＣＶの発現量の調節を行うことができるため、本発明によってＨＣＶの治療剤、治療方法の開発を行うことができる。
また、本発明により、低ウイルス群で発現亢進している遺伝子をスクリーニングすることが可能となる。そして、この低ウイルス遺伝子には、ＨＣＶが増殖しにくい環境作りに関与する遺伝子が存在する可能性がある。すなわち、低ウイルス遺伝子の発現を亢進することによってＨＣＶの増殖を抑制することができる。
すなわち、本発明の方法を用いて見出された遺伝子の発現を調節することによって、ＨＣＶの発現量の調節を行うことができるため、本発明によってＨＣＶの治療剤、治療方法の開発を行うことができる。
配列番号１〜５３：プライマー
配列番号３０３〜４０４：プライマー
配列番号３０３〜４０４：プライマー
Claims (9)
- 多量のＨＣＶを含む高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記低ウイルス群組織よりも高ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。 - 少量のＨＣＶを含む低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝組織由来ｃＤＮＡ５０ｎｇ当りのＨＣＶのコピー数を１８Ｓ ｒＲＮＡ定量値で割った値が３００ｕｎｉｔ以下の肝組織を低ウイルス群組織として選択し、当該値が３００００ｕｎｉｔ以上の肝組織を高ウイルス群組織として選択するステップ、
（ｂ）前記低ウイルス群組織および高ウイルス群組織における遺伝子の発現量を測定するステップ、並びに、
（ｃ）前記高ウイルス群組織よりも低ウイルス群組織において発現が亢進する遺伝子を選択するステップ
を含む前記方法。 - 遺伝子の発現量の測定がマイクロアレイおよび／またはリアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
- 高ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、低ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 低ウイルス群組織における遺伝子の発現量が、高ウイルス群における遺伝子の発現量に対して２倍以上発現亢進することを特徴とする、請求項２記載の方法。
- 低ウイルス群組織又は高ウイルス群組織を、さらに慢性肝炎由来のもの及び肝硬変由来のものに分類することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号５４〜１３１で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号１３２〜１７０で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子 - 以下の（ａ）〜（ｈ）の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含有する、ウイルス量に関連する病態の検査薬。
（ａ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｂ）配列番号１７１〜２３７で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｃ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｄ）配列番号２３８〜２５８で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、慢性肝炎の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｅ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｆ）配列番号２５９〜２８５で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の高ウイルス群において発現が亢進する遺伝子
（ｇ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列を含む遺伝子
（ｈ）配列番号２８６〜３０２で表されるいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、肝硬変の低ウイルス群において発現が亢進する遺伝子 - マイクロアレイの形態である、請求項７又は８に記載の検査薬。
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