JPWO2004078979A1 - 配糖化酵素遺伝子ＳａＧＴ４およびその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、新規な配糖化酵素遺伝子を提供することである。本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が提供される。（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
Description
本発明は、ナス科などの植物から得ることのできる配糖化酵素遺伝子、及びその利用に関する。
ＵＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−ラムノースなどの活性化された単糖あるいはオリゴ糖を、特定の化合物に結合する能力を有する酵素は配糖化酵素と呼ばれ、配糖化反応における基質特異性が高いことが知られている（Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ Ｄ ａｎｄ Ｙｕ ＲＫ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：９６１−９７８（１９９９））。配糖化反応によって、化合物の物性は大きく変わるため、配糖化酵素によって配糖化された化合物、あるいは逆に、配糖化反応を抑制した化合物は、医薬、食品添加物、工業原料などに利用されている。
ナス科植物の多くは、医薬品として利用価値の高いステロイドサポニンを含有しており、その生合成過程の最終段階である配糖化反応がサポニン生産において重要であると考えられる。またサポニンは二次代謝産物として植物の防御機構に関わっており、サポニン配糖化の度合いと抵抗性との相関やその制御機構にも興味が持たれる。しかし、この反応を触媒する酵素の遺伝子は未だクローニングされておらず、その機能に関する知見はほとんどない。
ナス科植物の多くは、医薬品として利用価値の高いステロイドサポニンを含有しており、その生合成過程の最終段階である配糖化反応がサポニン生産において重要であると考えられる。またサポニンは二次代謝産物として植物の防御機構に関わっており、サポニン配糖化の度合いと抵抗性との相関やその制御機構にも興味が持たれる。しかし、この反応を触媒する酵素の遺伝子は未だクローニングされておらず、その機能に関する知見はほとんどない。
植物には配糖化化合物が多く含まれている。配糖化酵素反応は基質特性が高いことから、植物由来の配糖化酵素を利用した医薬、食品添加物、工業原料の生産のための技術開発が切望されている。ところが、このような技術に利用できる既知の配糖化酵素遺伝子はその種類が十分ではなく、新規な配糖化遺伝子をクローニングする必要があった。即ち、本発明は、新規な配糖化酵素遺伝子を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ナス科植物から新規な配糖化酵素をコードするＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
好ましくは、本発明の遺伝子は下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子である。
（１）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
好ましくは、本発明の遺伝子は植物に由来する遺伝子であり、さらに好ましくは、植物はナス科植物である。
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の形質転換体を培養し、培養物から本発明のタンパク質を採取することを含む、当該タンパク質の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることを含む、糖を基質に結合させる方法が提供される。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ナス科植物から新規な配糖化酵素をコードするＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
好ましくは、本発明の遺伝子は下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子である。
（１）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
好ましくは、本発明の遺伝子は植物に由来する遺伝子であり、さらに好ましくは、植物はナス科植物である。
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の形質転換体を培養し、培養物から本発明のタンパク質を採取することを含む、当該タンパク質の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることを含む、糖を基質に結合させる方法が提供される。
図１は、ゲノムサザン分析の結果を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の遺伝子
キンギンナスビは、根から２種類のステロイドサポニンが同定されており、毛状根培養および形質転換体の作成が可能である。本発明者らは、ステロイドサポゲニン配糖化機構を解明する手がかりとして、キンギンナスビより配糖化酵素遺伝子の単離を試み、デジェネレートＰＣＲおよびＲＡＣＥ法により、２種類の候補遺伝子であるＳａＧＴ４ＡおよびＳａＧＴ４Ｒを取得した。ＳａＧＴ４Ａのアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示し、ＳａＧＴ４Ｒのアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
また、上記のデジェネレートＰＣＲにより、ソラナム・カシアナムからは、配列番号８で示される塩基配列（Ｓｋ＃７−５）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号７に示す）が取得された。同様に、ナスビからは、配列番号１０で示される塩基配列（ｅｇｐ＃１−１）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号９に示す）、並びに配列番号１２で示される塩基配列（ｅｇｐ＃１−４）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１１に示す）が得られた。上記のＳａＧＴ４ＡおよびＳａＧＴ４Ｒを取得した手法と同様の手法により、これらの遺伝子断片（Ｓｋ＃７−５、ｅｇｐ＃１−１、及びｅｇｐ＃１−４）を用いてＲＡＣＥ法を用いることにより、ソラナム・カシアナム又はナスビからこれらの遺伝子断片を含む全長の遺伝子（即ち、配糖化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を取得することが可能である。
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
本発明において、「配糖化酵素」とは、ＵＤＰ−グルコース又はＴＤＰ−ラムノースなどの活性化された単糖あるいはオリゴ糖を特定の化合物に結合する能力を有する酵素である。また、「配糖化酵素活性」とは、上記のような単糖あるいはオリゴ糖を特定の化合物に結合することができる酵素活性を意味する。
本発明の遺伝子は、例えば、ナス科などの植物、具体的には、キンギンナスビ、ソラナム・カシアナム、ナスビ、ジャガイモ、タバコなどから単離できる。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１から１２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてナス科などの植物（より具体的には、キンギンナスビ、ソラナム・カシアナム、ナスビ、ジャガイモ、タバコなど）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した植物由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
また、配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１〜１２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
例えば、配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明のタンパク質は配糖化酵素活性を有するタンパク質であり、このタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることにより糖を基質に結合させることができる。上記方法による糖の基質への結合方法も本発明の範囲内に含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミス α アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＡＮ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）糖を基質に結合させる方法
本発明の配糖化酵素活性を有するタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることによって糖を基質へ結合させる方法も本発明の範囲内に含まれる。本発明で用いる基質は限定されるものではないが、ステロイドアルカロイド、ステロイド、あるいはそれらの誘導体が例示される。ステロイドアルカロイドとして、例えば、ソラソジン、トマチジンを、またステロイドとして、例えば、ジオスゲニン、ヌアチゲニン、チゴゲニンを例示できる。
本発明では、上記（４）に記載したように培養して得られた形質転換体をそのまま、あるいは洗浄して、配糖化反応に使用することができる。培養して得られた形質転換体をさらに処理して得られる処理物もまた、配糖化反応に使用することができる。ここで言う処理物としては、（ａ）形質転換体を当業者に公知の方法で固定化したもの、（ｂ）形質転換体を、例えば、ガラスビーズなどを使用して機械的に、又は酵素的に処理するか、又は界面活性剤や有機溶剤（例えば、トルエンなど）などで処理したもの、又はそれらを固定化したもの、（ｃ）形質転換体を破砕して破砕残渣を除去したもの、又はそれを固定化したもの、（ｄ）上記（ｂ）または（ｃ）からさらに精製した得られた酵素、又はそれを固定化したもの、などが挙げられる。
上記の通り本発明では、酵素を固定化して用いることもできる。酵素を固定化する方法は、特に限定されないが、例えば、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、セライトなどを用いて酵素を固定化する方法を使用することができる。また、本発明の配糖化反応は、膜リアクターを利用して行うこともできる。膜リアクターを構成することができる膜としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフィルトレーション膜（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８３，５４−５８（１９９７））等を挙げることができる。
上記したような形質転換体又はその処理物（精製酵素、粗精製酵素などを含む）は、基質と糖を含む反応液と混合して、配糖化反応を行う。本発明の酵素を用いた配糖化反応は、水、又は水と有機溶媒との混合液中で行うことができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、あるいはアセトニトリルなどを挙げることができる。
反応液中における基質と糖の割合は配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは約１００：１〜１：１００であり、さらに好ましくは約１０：１〜１：１０である。反応液のｐＨは、配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは約３．０〜１１．０であり、さらに好ましくはｐＨ約６．０〜８．０である。反応温度も配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、通常は約４〜７０℃であり、好ましくは約１０〜５０℃である。また、基質および糖は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の濃度が高くなりすぎないように連続的もしくは非連続的に添加することもできる。
上記の反応により、糖が付加された生成物（例えば、糖が付加されたステロイドアルカロイド、ステロイド、あるいはそれらの誘導体など）が得られるが、得られた生成物は、遠心分離、溶媒抽出、蒸留、晶析、クロマトグラフィーなどを単独又は適宜組み合わせることによって分離することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）本発明の遺伝子
キンギンナスビは、根から２種類のステロイドサポニンが同定されており、毛状根培養および形質転換体の作成が可能である。本発明者らは、ステロイドサポゲニン配糖化機構を解明する手がかりとして、キンギンナスビより配糖化酵素遺伝子の単離を試み、デジェネレートＰＣＲおよびＲＡＣＥ法により、２種類の候補遺伝子であるＳａＧＴ４ＡおよびＳａＧＴ４Ｒを取得した。ＳａＧＴ４Ａのアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示し、ＳａＧＴ４Ｒのアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
また、上記のデジェネレートＰＣＲにより、ソラナム・カシアナムからは、配列番号８で示される塩基配列（Ｓｋ＃７−５）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号７に示す）が取得された。同様に、ナスビからは、配列番号１０で示される塩基配列（ｅｇｐ＃１−１）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号９に示す）、並びに配列番号１２で示される塩基配列（ｅｇｐ＃１−４）（この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１１に示す）が得られた。上記のＳａＧＴ４ＡおよびＳａＧＴ４Ｒを取得した手法と同様の手法により、これらの遺伝子断片（Ｓｋ＃７−５、ｅｇｐ＃１−１、及びｅｇｐ＃１−４）を用いてＲＡＣＥ法を用いることにより、ソラナム・カシアナム又はナスビからこれらの遺伝子断片を含む全長の遺伝子（即ち、配糖化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を取得することが可能である。
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
本発明において、「配糖化酵素」とは、ＵＤＰ−グルコース又はＴＤＰ−ラムノースなどの活性化された単糖あるいはオリゴ糖を特定の化合物に結合する能力を有する酵素である。また、「配糖化酵素活性」とは、上記のような単糖あるいはオリゴ糖を特定の化合物に結合することができる酵素活性を意味する。
本発明の遺伝子は、例えば、ナス科などの植物、具体的には、キンギンナスビ、ソラナム・カシアナム、ナスビ、ジャガイモ、タバコなどから単離できる。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１から１２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてナス科などの植物（より具体的には、キンギンナスビ、ソラナム・カシアナム、ナスビ、ジャガイモ、タバコなど）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した植物由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
また、配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１〜１２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
例えば、配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
本発明のタンパク質は配糖化酵素活性を有するタンパク質であり、このタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることにより糖を基質に結合させることができる。上記方法による糖の基質への結合方法も本発明の範囲内に含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミス α アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＡＮ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）糖を基質に結合させる方法
本発明の配糖化酵素活性を有するタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることによって糖を基質へ結合させる方法も本発明の範囲内に含まれる。本発明で用いる基質は限定されるものではないが、ステロイドアルカロイド、ステロイド、あるいはそれらの誘導体が例示される。ステロイドアルカロイドとして、例えば、ソラソジン、トマチジンを、またステロイドとして、例えば、ジオスゲニン、ヌアチゲニン、チゴゲニンを例示できる。
本発明では、上記（４）に記載したように培養して得られた形質転換体をそのまま、あるいは洗浄して、配糖化反応に使用することができる。培養して得られた形質転換体をさらに処理して得られる処理物もまた、配糖化反応に使用することができる。ここで言う処理物としては、（ａ）形質転換体を当業者に公知の方法で固定化したもの、（ｂ）形質転換体を、例えば、ガラスビーズなどを使用して機械的に、又は酵素的に処理するか、又は界面活性剤や有機溶剤（例えば、トルエンなど）などで処理したもの、又はそれらを固定化したもの、（ｃ）形質転換体を破砕して破砕残渣を除去したもの、又はそれを固定化したもの、（ｄ）上記（ｂ）または（ｃ）からさらに精製した得られた酵素、又はそれを固定化したもの、などが挙げられる。
上記の通り本発明では、酵素を固定化して用いることもできる。酵素を固定化する方法は、特に限定されないが、例えば、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、セライトなどを用いて酵素を固定化する方法を使用することができる。また、本発明の配糖化反応は、膜リアクターを利用して行うこともできる。膜リアクターを構成することができる膜としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフィルトレーション膜（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８３，５４−５８（１９９７））等を挙げることができる。
上記したような形質転換体又はその処理物（精製酵素、粗精製酵素などを含む）は、基質と糖を含む反応液と混合して、配糖化反応を行う。本発明の酵素を用いた配糖化反応は、水、又は水と有機溶媒との混合液中で行うことができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、あるいはアセトニトリルなどを挙げることができる。
反応液中における基質と糖の割合は配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは約１００：１〜１：１００であり、さらに好ましくは約１０：１〜１：１０である。反応液のｐＨは、配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは約３．０〜１１．０であり、さらに好ましくはｐＨ約６．０〜８．０である。反応温度も配糖化反応が進行する限り特に限定されないが、通常は約４〜７０℃であり、好ましくは約１０〜５０℃である。また、基質および糖は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の濃度が高くなりすぎないように連続的もしくは非連続的に添加することもできる。
上記の反応により、糖が付加された生成物（例えば、糖が付加されたステロイドアルカロイド、ステロイド、あるいはそれらの誘導体など）が得られるが、得られた生成物は、遠心分離、溶媒抽出、蒸留、晶析、クロマトグラフィーなどを単独又は適宜組み合わせることによって分離することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１（ナス科植物からのゲノムＤＮＡの調製および部分ＤＮＡの単離）
キンギンナスビ（Ｓｏｌａｎｕｍ ａｃｕｌｅａｔｉｓｉｍｕｍ）無菌培養苗地上部およびソラナム・カシアナム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｋｈａｓｉａｎｕｍ）無菌培養苗葉、ナスビ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）野外育成植物葉各０．１ｇよりゲノムＤＮＡを抽出した。抽出はＮｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ，ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、手順は添付のプロトコールに従った。各々につき数１００ｎｇのＤＮＡが回収され、その一部を以下の実験に用いた。
ゲノムＤＮＡ数ｎｇをテンプレートとし、反応液２０μｌ中（プライマー各１μｌ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ０．５ｕｎｉｔｓおよび添付バッファー）にてサイクルパラメーター［最初に９４℃（３分）、次いで９４℃（３０秒）／５５℃（１分）／７２℃（１分）を３０サイクル、最後に７２℃（２分）］で増幅反応を行った。使用したプライマーＧＴ５（配列番号１３）は１００μＭ，ＧＴ８（配列番号１４）は５０μＭに調製した。
以下、ＰＣＲは全て同様の酵素量、ｄＮＴＰ濃度、バッファー組成で行った。各プライマー濃度は特記のない限り、終濃度０．５μＭとした。
プライマーＧＴ５／ＧＴ８によりキンギンナスビからは約７５０ｂｐ、ソラナム・カシアナムからは約７５０ｂｐ、ナスビからは約６００ｂｐ，および８００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
実施例２（部分配列の決定）
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い抽出した。抽出した断片をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。
その結果、キンギンナスビからは、配列番号６で示される塩基配列（Ｓａ＃４−５）、ソラナム・カシアナムからは、配列番号８で示される塩基配列（Ｓｋ＃７−５）、ナスビからは、配列番号１０および１２で示される塩基配列（それぞれ、ｅｇｐ＃１−１，ｅｇｐ＃１−４）が得られた。
実施例３（キンギンナスビのゲノムサザン解析）
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド法により、キンギンナスビ無菌培養苗葉０．５ｇより約１ｍｇのゲノムＤＮＡを得た。このうち１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）で各々切断後（ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ １０ｕｎｉｔｓ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ ５ｕｎｉｔｓ、３７°Ｃ １６時間）、１％アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲルからＤＮＡをナイロン膜（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ，ＮＥＮ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）へ１０ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中でのキャピラリー法により、室温１６時間で転写した。転写後の膜を風乾後８０°Ｃにて２時間ベーキングし、ハイブリダイゼーションに用いた。
ハイブリダイゼーション用のプローブＤＮＡは、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングしたゲノム部分配列ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ（サイクルパラメーター［９６℃（２０秒）、次いで、９６℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒）を３０サイクル］）により調製した。プライマーとして、Ｓａ＃４−５検出用プローブにはＧＴ２２（配列番号１５）およびＧＴ２３（配列番号１６）を用いた。
プローブの標識はＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。ハイブリダイゼーション・バッファー（５ｘＳＳＰＥ ｐＨ７．４，５ｘデンハルト溶液，０．５％ＳＤＳ，１０％硫酸デキストラン，０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡ）中６５℃，１８時間でハイブリダイズし、洗浄バッファーでナイロン膜を洗浄後（２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ ６５℃，３０分、１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ ６５℃，３０分）、オートラジオグラフィーにかけた。その結果、部分配列Ｓａ＃４−５に相当な遺伝子はキンギンナスビゲノム中に複数コピー存在することが示された（図１）。
実施例４（キンギンナスビ由来の遺伝子の３’−ＲＡＣＥ）
キンギンナスビ無菌培養苗（１／２ＭＳ液体培地、振盪培養）地上部あるいは地下部約５０ｍｇよりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、トータルＲＮＡを抽出した。そのうち２．５μｇを最初の相補鎖の合成に用いた。合成反応はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により、添付のプロトコールの反応液組成に従い２０μｌ中、４２℃５０分で行った。アダプター配列を含むオリゴ（ｄＴ）プライマー３Ｒ１（配列番号１７）は終濃度０．５μＭとなるよう加えた。反応終了後、反応混合液をＲＮａｓｅＨ（ＴａＫａＲａ）で処理し（２ｕｎｉｔｓ，３７℃２０分）、このうち１μｌをテンプレートとして次のＰＣＲに用いた。アダプタープライマー３Ｒ２と遺伝子特異的プライマーＧＴ２８（配列番号１９）による増幅反応を行い（９６℃２分、次いで９４℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒）、２０μｌ、３０サイクル）、この反応混合液０．０１μｌ相当をテンプレートとして、３Ｒ２（配列番号１８）と遺伝子特異的プライマーＧＴ２９（配列番号２０）によるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを同様の条件で行った。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより増幅された３’領域のＤＮＡ断片を１．２％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出した断片をベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、ポリＡ領域を含む２種の約６００ｂｐの異なるＤＮＡ配列を得た。
実施例５（キンギンナスビ由来の遺伝子の５’−ＲＡＣＥ）
キンギンナスビ無菌培養苗（１／２ＭＳ液体培地、振盪培養）地上部あるいは地下部より実施例４の方法と同様にトータルＲＮＡを抽出、そのうち１．５μｇを５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットにより５’領域のＤＮＡ配列を増幅した。最初の相補鎖の合成には遺伝子特異的アンチセンスプライマーＧＴ３２（配列番号２１）を用いた。３’末端へのアンカー配列ｄＣポリマー付加反応後、キット添付のＡＡＰと遺伝子特異的プライマーＧＴ３４（配列番号２２）によりＰＣＲを行い、さらにこの反応混合液をテンプレートとして、キット添付のＡＵＡＰと遺伝子特異的プライマーＧＴ３５（配列番号２３）によりｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、地上部、地下部より開始コドンを含む各々約４５０ｂｐ，４００ｂｐの異なるＤＮＡ配列を得た。
実施例６（キンギンナスビ由来全長ｃＤＮＡの単離）
実施例４および実施例５によるＲＡＣＥ法により非翻訳領域を含む２種のキンギンナスビｃＤＮＡ全長配列を同定した。得られた塩基配列を、配列番号２（ＳａＧＴ４Ａ）および配列番号４（ＳａＧＴ４Ｒ）に示す。ＳａＧＴ４Ａは１６７３塩基対で、４９１アミノ酸をコードしていた。一方ＳａＧＴ−４Ｒは１６１３塩基対で、４２７アミノ酸をコードしていた。ＳａＧＴ４Ａ、ＳａＧＴ４Ｒのいずれもが、植物二次代謝産物の生産に関わる配糖化酵素においてアミノ酸同一性８０％以上のコンセンサス配列（ＴＨＣＧＷＮＳ）と完全に一致する配列を有していた。ＳａＧＴ−４ＡとＳａＧＴ４Ｒのアミノ酸同一性は約８９％であった。またＳａＧＴ４Ａの全アミノ酸配列をもとにＴＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によるホモロジーサーチを行った結果、ジャガイモ由来の配糖化酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＴＵ８２３６７）との相同性が最も高く、アミノ酸同一性は約６３％であった。
実施例７（ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析）
ＲＴ−ＰＣＲ法により、キンギンナスビ由来の２つの遺伝子ＳａＧＴ４Ａ、ＳａＧＴ４Ｒの発現解析を行った。
無菌培養キンギンナスビ各器官より前述の方法で抽出したトータルＲＮＡ２．５μｇを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により逆転写反応を行った。反応条件は添付のプロトコールに従った。反応終了後、反応混合液をＲＮａｓｅＨ（ＴａＫａＲａ）で処理し（２ｕｎｉｔｓ，３７℃２０分）、このうち０．５μｌ相当をテンプレートとして次のＰＣＲに用いた。
増幅反応はサイクルパラメーター［９６℃２分、９６℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒），３０サイクル］で行った。ＰＣＲ混合液２０μｌのうち８μｌを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＰＣＲ産物を検出した。
植物体の傷処理は、地上部については葉脈に垂直にハサミで切り込みを入れ、１／２ＭＳ固体培地培養と同じ条件下（２６℃）に置き、経時的に処理葉またはその上位葉を回収した。地下部については１／２ＭＳ液体培地静置苗より切り取った根の表面にカミソリで傷をつけ、水で湿らせたキムワイプの上に並べシャーレ中に静置し（２６℃）、経時的に回収した。
キンギンナスビ遺伝子の器官局在は、ＳａＧＴ４Ａは植物体全体で発現していたのに対し、ＳａＧＴ４Ｒは根特異的に発現していた。
傷処理に対しＳａＧＴ４Ａは葉でも根でも発現が迅速に抑制された。この抑制は一過的なもので、傷処理後６時間後には遺伝子の発現は元のレベルにまで回復した。また地上部において、傷処理を与えた葉の上位の葉でも同様の応答がみられたことから、全身応答性であることが示された。ＳａＧＴ４Ｒの根における発現レベルは傷処理により変動したが、ＳａＧＴ４Ａとは異なる応答を示し、葉での発現誘導はみられなかった。
実施例８ （大腸菌によるタンパク質生産）
ＧＳＴ融合型タンパク質として大腸菌でＳａＧＴ４Ａ，ＳａＧＴ４Ｒの遺伝子産物を生産させるために、発現用ベクターを構築した。各遺伝子の翻訳領域をＰＣＲにより調製し、ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のクローンニングサイトに挿入した。ＰＣＲのテンプレートとして、無菌液体培養苗地上部および地下部から逆転写反応で合成したｃＤＮＡを用いた。プライマーにはベクター構築に必要な制限酵素サイトを導入したものもある。プライマーの配列を配列番号１５、１６および２４から２７に示す。
ＳａＧＴ４Ａについては、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２４および配列番号２５のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ａの翻訳領域を含むＤＮＡを増幅した。増幅した翻訳領域を含むＤＮＡをベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩで切り出した約１．５ｋｂの断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに挿入し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク発現ベクターとした。一方、ＳａＧＴ４Ｒについては、まず、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２６および配列番号１６のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域のＮ末領域を含むＤＮＡを増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶで切り出した約３５０ｂｐの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶサイトに挿入した。このプラスミドをｐ４Ｒ５ＢＥとする。続いて、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１５および配列番号２７のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域のＣ末領域を含むＤＮＡを増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩで切り出した約１ｋｂの断片を、プラスミドｐ４Ｒ５ＢＥのＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩサイトに挿入することにより、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域全体を有するプラスミドを構築した。このプラスミドＤＮＡよりＢａｍＨＩ，ＳａｌＩで切り出した約１．３ｋｂの断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに挿入し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク発現ベクターとした。
このようにして得られたベクタープラスミドで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した形質転換大腸菌をＬＢ培地（アンピシリン５０μＭ）で、６００ｎｍにおける培養液の吸光度が０．６から０．８になるまで３７℃で振盪培養し、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（終濃度０．１ｍＭ）を加えてタンパク質生産を誘導し、１８℃で１８時間振盪培養を続けた。集菌後の菌体を培養液の１／２５量のバッファー（２０ｍＭトリスｐＨ８，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．７μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に懸濁し、超音波破砕装置（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ）でトータル３分間超音波処理後、８０００ｘｇ，４℃で２０分間遠心し、上清を回収した。融合タンパク質の精製はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、添付のプロトコールに従い行った。バッファーは菌体を懸濁した際と同じ組成のものを用いた。溶出は２０ｍＭ還元型グルタチオン，０．１ＭトリスｐＨ８，０．１２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．７μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎで行った。溶出液を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離解析したところ、目的タンパク質の回収量は、大腸菌培養液５０ｍｌあたり約数１０μｇであると見積もられた。
実施例９（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質によるステロイドアルカロイドの配糖化）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質１〜５μｇを一回の反応に用いて、各種ステロイドアルカロイドに対するグルコース付加活性を調べた。タンパク質溶液２０μｌ、ＵＤＰグルコース（シグマ）１５μｇ、各種ステロイドアルカロイド（市販のものはすべてシグマ）１０μｇを５ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌ中３０℃で３時間反応させた。９５℃、５分間の熱処理後、５Ｍ相当のＮａＣｌを加え、ブタノール２５０μｌによる抽出を３度繰り返し、有機溶媒層を凍結乾燥した。乾燥試料をメタノールあるいはエタノール１５μｌに溶解し、そのうち５μｌを薄層クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィーは、５ｃｍｘ５ｃｍ ＲＰ−１８ Ｆ２５４ｓプレート（メルク社）、展開溶媒テトラヒドロフラン：メタノール：アンモニア（１．５：１：１）を用い、アニス溶液（パラ・アニスアルデヒド２．５ｍｌ、酢酸１ｍｌ、硫酸３．５ｍｌ、エタノール１０４ｍｌ）により基質およびそれらの配糖化体を検出した。その結果、ソラソジンおよびトマチジンを基質とした時に、配糖化活性が認められた。ソラソジン配糖化産物のＲｆ値は０．５７、トマチジン配糖化産物のＲｆ値は０．５３であった。また、ＵＤＰガラクストースを糖供与体としてこれらの基質に対して反応させたが、配糖体は検出されなかった。
実施例１０（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質によるステロイドの配糖化）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質１〜５μｇを一回の反応に用いて、各種ステロイドに対するグルコース付加活性を調べた。タンパク質溶液２０μｌ、ＵＤＰグルコース（シグマ）１５μｇ、各種ステロイド（市販のものはすべてシグマ）１０μｇを５ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌ中３０℃で３時間反応させた。９５℃、５分間の熱処理後、５Ｍ相当のＮａＣｌを加え、ブタノール２５０μｌによる抽出を３度繰り返し、有機溶媒層を凍結乾燥した。乾燥試料をメタノールあるいはエタノール１５μｌに溶解し、そのうち５μｌを薄層クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィーは、６ｃｍｘ５ｃｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４プレート（メルク社）を用い、展開溶媒にはクロロホルム：メタノール（１７：３）を使用し、アニス溶液（パラ・アニスアルデヒド２．５ｍｌ、酢酸１ｍｌ、硫酸３．５ｍｌ、エタノール１０４ｍｌ）により基質およびそれらの配糖化体を検出した。その結果、ジオスゲニン、ヌアチゲニン、チゴゲニンを基質とした時に、配糖化活性が認められた。ジオスゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．４２、ヌアチゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．３６、チゴゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．４３であった。また、ＵＤＰガラクストースを糖供与体としてこれらの基質に対して反応させたが、配糖体は検出されなかった。
実施例１１（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質の酵素活性測定）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質、ＵＤＰ−グルコースを用いて、各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドに対する比活性を調べた。すなわち、大腸菌で発現させ精製した１〜１．５μｇのＳａＧＴ４Ａタンパク質、５００μｇのＵＤＰ−グルコース、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１．６ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．１２ｍＭ ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、０．６ｕｎｉｔピルビン酸キナーゼ、０．８ｕｎｉｔ乳酸デヒドロゲナーゼ、１０μｇの各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドを５０ｍＭトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌとなるように混合し、３０℃で１時間反応後、８０℃で２分間の熱処理により反応を停止し、その後、氷上に保存した。反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の減少量から、各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドに対する比活性を求めた。その結果、ＳａＧＴ４Ａタンパク質１ｍｇ当たりの比活性は、ジオスゲニンが３．５ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ヌアチゲニンが１．６ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、チゴゲニンが０．３ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、トマチジンが３．４ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ソラソジンが３．３ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ソラニジンが０．４ｍｍｏｌ／ｍｉｎとなった。
キンギンナスビ（Ｓｏｌａｎｕｍ ａｃｕｌｅａｔｉｓｉｍｕｍ）無菌培養苗地上部およびソラナム・カシアナム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｋｈａｓｉａｎｕｍ）無菌培養苗葉、ナスビ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）野外育成植物葉各０．１ｇよりゲノムＤＮＡを抽出した。抽出はＮｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ，ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、手順は添付のプロトコールに従った。各々につき数１００ｎｇのＤＮＡが回収され、その一部を以下の実験に用いた。
ゲノムＤＮＡ数ｎｇをテンプレートとし、反応液２０μｌ中（プライマー各１μｌ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ０．５ｕｎｉｔｓおよび添付バッファー）にてサイクルパラメーター［最初に９４℃（３分）、次いで９４℃（３０秒）／５５℃（１分）／７２℃（１分）を３０サイクル、最後に７２℃（２分）］で増幅反応を行った。使用したプライマーＧＴ５（配列番号１３）は１００μＭ，ＧＴ８（配列番号１４）は５０μＭに調製した。
以下、ＰＣＲは全て同様の酵素量、ｄＮＴＰ濃度、バッファー組成で行った。各プライマー濃度は特記のない限り、終濃度０．５μＭとした。
プライマーＧＴ５／ＧＴ８によりキンギンナスビからは約７５０ｂｐ、ソラナム・カシアナムからは約７５０ｂｐ、ナスビからは約６００ｂｐ，および８００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
実施例２（部分配列の決定）
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い抽出した。抽出した断片をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。
その結果、キンギンナスビからは、配列番号６で示される塩基配列（Ｓａ＃４−５）、ソラナム・カシアナムからは、配列番号８で示される塩基配列（Ｓｋ＃７−５）、ナスビからは、配列番号１０および１２で示される塩基配列（それぞれ、ｅｇｐ＃１−１，ｅｇｐ＃１−４）が得られた。
実施例３（キンギンナスビのゲノムサザン解析）
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド法により、キンギンナスビ無菌培養苗葉０．５ｇより約１ｍｇのゲノムＤＮＡを得た。このうち１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）で各々切断後（ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ １０ｕｎｉｔｓ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ ５ｕｎｉｔｓ、３７°Ｃ １６時間）、１％アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲルからＤＮＡをナイロン膜（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ，ＮＥＮ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）へ１０ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中でのキャピラリー法により、室温１６時間で転写した。転写後の膜を風乾後８０°Ｃにて２時間ベーキングし、ハイブリダイゼーションに用いた。
ハイブリダイゼーション用のプローブＤＮＡは、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングしたゲノム部分配列ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ（サイクルパラメーター［９６℃（２０秒）、次いで、９６℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒）を３０サイクル］）により調製した。プライマーとして、Ｓａ＃４−５検出用プローブにはＧＴ２２（配列番号１５）およびＧＴ２３（配列番号１６）を用いた。
プローブの標識はＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。ハイブリダイゼーション・バッファー（５ｘＳＳＰＥ ｐＨ７．４，５ｘデンハルト溶液，０．５％ＳＤＳ，１０％硫酸デキストラン，０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡ）中６５℃，１８時間でハイブリダイズし、洗浄バッファーでナイロン膜を洗浄後（２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ ６５℃，３０分、１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ ６５℃，３０分）、オートラジオグラフィーにかけた。その結果、部分配列Ｓａ＃４−５に相当な遺伝子はキンギンナスビゲノム中に複数コピー存在することが示された（図１）。
実施例４（キンギンナスビ由来の遺伝子の３’−ＲＡＣＥ）
キンギンナスビ無菌培養苗（１／２ＭＳ液体培地、振盪培養）地上部あるいは地下部約５０ｍｇよりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、トータルＲＮＡを抽出した。そのうち２．５μｇを最初の相補鎖の合成に用いた。合成反応はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により、添付のプロトコールの反応液組成に従い２０μｌ中、４２℃５０分で行った。アダプター配列を含むオリゴ（ｄＴ）プライマー３Ｒ１（配列番号１７）は終濃度０．５μＭとなるよう加えた。反応終了後、反応混合液をＲＮａｓｅＨ（ＴａＫａＲａ）で処理し（２ｕｎｉｔｓ，３７℃２０分）、このうち１μｌをテンプレートとして次のＰＣＲに用いた。アダプタープライマー３Ｒ２と遺伝子特異的プライマーＧＴ２８（配列番号１９）による増幅反応を行い（９６℃２分、次いで９４℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒）、２０μｌ、３０サイクル）、この反応混合液０．０１μｌ相当をテンプレートとして、３Ｒ２（配列番号１８）と遺伝子特異的プライマーＧＴ２９（配列番号２０）によるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを同様の条件で行った。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより増幅された３’領域のＤＮＡ断片を１．２％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出した断片をベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、ポリＡ領域を含む２種の約６００ｂｐの異なるＤＮＡ配列を得た。
実施例５（キンギンナスビ由来の遺伝子の５’−ＲＡＣＥ）
キンギンナスビ無菌培養苗（１／２ＭＳ液体培地、振盪培養）地上部あるいは地下部より実施例４の方法と同様にトータルＲＮＡを抽出、そのうち１．５μｇを５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットにより５’領域のＤＮＡ配列を増幅した。最初の相補鎖の合成には遺伝子特異的アンチセンスプライマーＧＴ３２（配列番号２１）を用いた。３’末端へのアンカー配列ｄＣポリマー付加反応後、キット添付のＡＡＰと遺伝子特異的プライマーＧＴ３４（配列番号２２）によりＰＣＲを行い、さらにこの反応混合液をテンプレートとして、キット添付のＡＵＡＰと遺伝子特異的プライマーＧＴ３５（配列番号２３）によりｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、地上部、地下部より開始コドンを含む各々約４５０ｂｐ，４００ｂｐの異なるＤＮＡ配列を得た。
実施例６（キンギンナスビ由来全長ｃＤＮＡの単離）
実施例４および実施例５によるＲＡＣＥ法により非翻訳領域を含む２種のキンギンナスビｃＤＮＡ全長配列を同定した。得られた塩基配列を、配列番号２（ＳａＧＴ４Ａ）および配列番号４（ＳａＧＴ４Ｒ）に示す。ＳａＧＴ４Ａは１６７３塩基対で、４９１アミノ酸をコードしていた。一方ＳａＧＴ−４Ｒは１６１３塩基対で、４２７アミノ酸をコードしていた。ＳａＧＴ４Ａ、ＳａＧＴ４Ｒのいずれもが、植物二次代謝産物の生産に関わる配糖化酵素においてアミノ酸同一性８０％以上のコンセンサス配列（ＴＨＣＧＷＮＳ）と完全に一致する配列を有していた。ＳａＧＴ−４ＡとＳａＧＴ４Ｒのアミノ酸同一性は約８９％であった。またＳａＧＴ４Ａの全アミノ酸配列をもとにＴＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によるホモロジーサーチを行った結果、ジャガイモ由来の配糖化酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＳＴＵ８２３６７）との相同性が最も高く、アミノ酸同一性は約６３％であった。
実施例７（ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析）
ＲＴ−ＰＣＲ法により、キンギンナスビ由来の２つの遺伝子ＳａＧＴ４Ａ、ＳａＧＴ４Ｒの発現解析を行った。
無菌培養キンギンナスビ各器官より前述の方法で抽出したトータルＲＮＡ２．５μｇを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により逆転写反応を行った。反応条件は添付のプロトコールに従った。反応終了後、反応混合液をＲＮａｓｅＨ（ＴａＫａＲａ）で処理し（２ｕｎｉｔｓ，３７℃２０分）、このうち０．５μｌ相当をテンプレートとして次のＰＣＲに用いた。
増幅反応はサイクルパラメーター［９６℃２分、９６℃（２０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１分３０秒），３０サイクル］で行った。ＰＣＲ混合液２０μｌのうち８μｌを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＰＣＲ産物を検出した。
植物体の傷処理は、地上部については葉脈に垂直にハサミで切り込みを入れ、１／２ＭＳ固体培地培養と同じ条件下（２６℃）に置き、経時的に処理葉またはその上位葉を回収した。地下部については１／２ＭＳ液体培地静置苗より切り取った根の表面にカミソリで傷をつけ、水で湿らせたキムワイプの上に並べシャーレ中に静置し（２６℃）、経時的に回収した。
キンギンナスビ遺伝子の器官局在は、ＳａＧＴ４Ａは植物体全体で発現していたのに対し、ＳａＧＴ４Ｒは根特異的に発現していた。
傷処理に対しＳａＧＴ４Ａは葉でも根でも発現が迅速に抑制された。この抑制は一過的なもので、傷処理後６時間後には遺伝子の発現は元のレベルにまで回復した。また地上部において、傷処理を与えた葉の上位の葉でも同様の応答がみられたことから、全身応答性であることが示された。ＳａＧＴ４Ｒの根における発現レベルは傷処理により変動したが、ＳａＧＴ４Ａとは異なる応答を示し、葉での発現誘導はみられなかった。
実施例８ （大腸菌によるタンパク質生産）
ＧＳＴ融合型タンパク質として大腸菌でＳａＧＴ４Ａ，ＳａＧＴ４Ｒの遺伝子産物を生産させるために、発現用ベクターを構築した。各遺伝子の翻訳領域をＰＣＲにより調製し、ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のクローンニングサイトに挿入した。ＰＣＲのテンプレートとして、無菌液体培養苗地上部および地下部から逆転写反応で合成したｃＤＮＡを用いた。プライマーにはベクター構築に必要な制限酵素サイトを導入したものもある。プライマーの配列を配列番号１５、１６および２４から２７に示す。
ＳａＧＴ４Ａについては、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２４および配列番号２５のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ａの翻訳領域を含むＤＮＡを増幅した。増幅した翻訳領域を含むＤＮＡをベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩで切り出した約１．５ｋｂの断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに挿入し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク発現ベクターとした。一方、ＳａＧＴ４Ｒについては、まず、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２６および配列番号１６のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域のＮ末領域を含むＤＮＡを増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶで切り出した約３５０ｂｐの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶサイトに挿入した。このプラスミドをｐ４Ｒ５ＢＥとする。続いて、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１５および配列番号２７のプライマーを用いて、実施例７記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域のＣ末領域を含むＤＮＡを増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、塩基配列を確認後、ＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩで切り出した約１ｋｂの断片を、プラスミドｐ４Ｒ５ＢＥのＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩサイトに挿入することにより、ＳａＧＴ４Ｒの翻訳領域全体を有するプラスミドを構築した。このプラスミドＤＮＡよりＢａｍＨＩ，ＳａｌＩで切り出した約１．３ｋｂの断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに挿入し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク発現ベクターとした。
このようにして得られたベクタープラスミドで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した形質転換大腸菌をＬＢ培地（アンピシリン５０μＭ）で、６００ｎｍにおける培養液の吸光度が０．６から０．８になるまで３７℃で振盪培養し、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（終濃度０．１ｍＭ）を加えてタンパク質生産を誘導し、１８℃で１８時間振盪培養を続けた。集菌後の菌体を培養液の１／２５量のバッファー（２０ｍＭトリスｐＨ８，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．７μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に懸濁し、超音波破砕装置（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ）でトータル３分間超音波処理後、８０００ｘｇ，４℃で２０分間遠心し、上清を回収した。融合タンパク質の精製はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、添付のプロトコールに従い行った。バッファーは菌体を懸濁した際と同じ組成のものを用いた。溶出は２０ｍＭ還元型グルタチオン，０．１ＭトリスｐＨ８，０．１２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．７μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎで行った。溶出液を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離解析したところ、目的タンパク質の回収量は、大腸菌培養液５０ｍｌあたり約数１０μｇであると見積もられた。
実施例９（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質によるステロイドアルカロイドの配糖化）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質１〜５μｇを一回の反応に用いて、各種ステロイドアルカロイドに対するグルコース付加活性を調べた。タンパク質溶液２０μｌ、ＵＤＰグルコース（シグマ）１５μｇ、各種ステロイドアルカロイド（市販のものはすべてシグマ）１０μｇを５ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌ中３０℃で３時間反応させた。９５℃、５分間の熱処理後、５Ｍ相当のＮａＣｌを加え、ブタノール２５０μｌによる抽出を３度繰り返し、有機溶媒層を凍結乾燥した。乾燥試料をメタノールあるいはエタノール１５μｌに溶解し、そのうち５μｌを薄層クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィーは、５ｃｍｘ５ｃｍ ＲＰ−１８ Ｆ２５４ｓプレート（メルク社）、展開溶媒テトラヒドロフラン：メタノール：アンモニア（１．５：１：１）を用い、アニス溶液（パラ・アニスアルデヒド２．５ｍｌ、酢酸１ｍｌ、硫酸３．５ｍｌ、エタノール１０４ｍｌ）により基質およびそれらの配糖化体を検出した。その結果、ソラソジンおよびトマチジンを基質とした時に、配糖化活性が認められた。ソラソジン配糖化産物のＲｆ値は０．５７、トマチジン配糖化産物のＲｆ値は０．５３であった。また、ＵＤＰガラクストースを糖供与体としてこれらの基質に対して反応させたが、配糖体は検出されなかった。
実施例１０（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質によるステロイドの配糖化）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質１〜５μｇを一回の反応に用いて、各種ステロイドに対するグルコース付加活性を調べた。タンパク質溶液２０μｌ、ＵＤＰグルコース（シグマ）１５μｇ、各種ステロイド（市販のものはすべてシグマ）１０μｇを５ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌ中３０℃で３時間反応させた。９５℃、５分間の熱処理後、５Ｍ相当のＮａＣｌを加え、ブタノール２５０μｌによる抽出を３度繰り返し、有機溶媒層を凍結乾燥した。乾燥試料をメタノールあるいはエタノール１５μｌに溶解し、そのうち５μｌを薄層クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィーは、６ｃｍｘ５ｃｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４プレート（メルク社）を用い、展開溶媒にはクロロホルム：メタノール（１７：３）を使用し、アニス溶液（パラ・アニスアルデヒド２．５ｍｌ、酢酸１ｍｌ、硫酸３．５ｍｌ、エタノール１０４ｍｌ）により基質およびそれらの配糖化体を検出した。その結果、ジオスゲニン、ヌアチゲニン、チゴゲニンを基質とした時に、配糖化活性が認められた。ジオスゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．４２、ヌアチゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．３６、チゴゲニン配糖化産物のＲｆ値は０．４３であった。また、ＵＤＰガラクストースを糖供与体としてこれらの基質に対して反応させたが、配糖体は検出されなかった。
実施例１１（大腸菌で発現させたＳａＧＴ４Ａタンパク質の酵素活性測定）
実施例８により大腸菌で発現させ精製したＳａＧＴ４Ａタンパク質、ＵＤＰ−グルコースを用いて、各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドに対する比活性を調べた。すなわち、大腸菌で発現させ精製した１〜１．５μｇのＳａＧＴ４Ａタンパク質、５００μｇのＵＤＰ−グルコース、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１．６ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．１２ｍＭ ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、０．６ｕｎｉｔピルビン酸キナーゼ、０．８ｕｎｉｔ乳酸デヒドロゲナーゼ、１０μｇの各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドを５０ｍＭトリス（ｐＨ８）反応液２５０μｌとなるように混合し、３０℃で１時間反応後、８０℃で２分間の熱処理により反応を停止し、その後、氷上に保存した。反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の減少量から、各種ステロイドおよびステロイドアルカロイドに対する比活性を求めた。その結果、ＳａＧＴ４Ａタンパク質１ｍｇ当たりの比活性は、ジオスゲニンが３．５ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ヌアチゲニンが１．６ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、チゴゲニンが０．３ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、トマチジンが３．４ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ソラソジンが３．３ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、ソラニジンが０．４ｍｍｏｌ／ｍｉｎとなった。
本発明により新規な配糖化酵素遺伝子が提供される。本発明の配糖化酵素を利用して配糖化酵素反応を行うことにより、医薬、食品添加物又は工業原料などの新規な製造方法を提供することが可能になる。
【配列表】
Claims (9)
- 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列； - 下記の何れかの塩基配列を有する請求項１に記載の遺伝子。
（１）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２、４、８、１０または１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列； - 植物に由来する遺伝子である、請求項１又は２に記載の遺伝子。
- 植物がナス科植物である、請求項３に記載の遺伝子。
- 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、７、９または１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するアミノ酸配列； - 請求項１から４の何れかに記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
- 請求項１から４の何れかに記載の遺伝子又は請求項６に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項７に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項５に記載のタンパク質を採取することを含む、請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項５に記載のタンパク質の存在下で糖と基質を反応させることを含む、糖を基質に結合させる方法。
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