JPWO2004011652A1 - トリペプチド以上のペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、トリペプチド以上のペプチドを製造することができる方法を提供することを課題とする。本発明者らは、エンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属に属する細菌からペプチドを効率良く生成する新規酵素を見出した。本発明では、当該酵素を、カルボキシ成分およびアミン成分に作用させて、トリペプチド以上のペプチドを生成する。
Description
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にペプチドを製造できるペプチドの製造方法に関する。より詳細には、カルボキシ成分とアミン成分とからのペプチド生成反応を触媒する酵素を用いてトリペプチド以上のペプチドを製造する方法に関する。
ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンはＬ−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは光学活性中間体の使用が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
一方、酵素を用いたペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、および、Ｎ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が広く知られている。反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、反応２の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，１６３，５３１（１９７７））が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の報告研究例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許ＷＯ ９０／０１５５５があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１とＥＰ ３５９３９９Ｂ１があり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは光学活性中間体の使用が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
一方、酵素を用いたペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、および、Ｎ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が広く知られている。反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、反応２の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，１６３，５３１（１９７７））が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の報告研究例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許ＷＯ ９０／０１５５５があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１とＥＰ ３５９３９９Ｂ１があり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。
上記の反応１から反応４の方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範疇に入る反応である。
しかしながら、反応４の先行例（特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１）には以下の大きな問題点があった。（１）ペプチド生成速度が極めて遅い、（２）ペプチド生成収率が低い、（３）生産できるペプチドが比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものに限られる、（４）添加酵素量が極めて大量、（５）カビ、酵母、植物に由来する比較的高価なカルボキシペプチダーゼ標品が必要。反応４において、細菌およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属以外の酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミン等のペプチドの製造方法についても全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
また、酵素を用いた上記反応４のペプチドの製造方法は、ジペプチドの生成に限られており、工業的に十分利用可能なように、トリペプチド以上のペプチドを簡便に製造する方法の開発が望まれていた。
以上の様な状況の下、本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、トリペプチド以上のペプチドを製造することができる方法を提供することを課題とする。
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出したエンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌、およびスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌からトリペプチド以上のペプチドを効率良く生成する酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、トリペプチド以上のペプチドを生成することを特徴とする、トリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔２〕 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔３〕 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕または〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔４〕 前記酵素または酵素含有物が、アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔５〕 前記酵素が、下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔６〕 前記酵素が、下記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔７〕 前記酵素が、下記（Ｅ）または（Ｆ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔８〕 前記酵素が、下記（Ｇ）または（Ｈ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｇ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔９〕 前記微生物が、エンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔１０〕 前記微生物が、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１１〕 前記微生物が、下記（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１２〕 前記微生物が、下記（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｅ）配列表の配列番号５に記載の塩基番号のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１３〕 前記微生物が、下記（ｇ）または（ｈ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｇ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１４〕 前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステルおよびＬ−トレオニンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｄ−アラニンエステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕から〔１３〕のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
しかしながら、反応４の先行例（特許ＥＰ ２７８７８７Ａ１）には以下の大きな問題点があった。（１）ペプチド生成速度が極めて遅い、（２）ペプチド生成収率が低い、（３）生産できるペプチドが比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものに限られる、（４）添加酵素量が極めて大量、（５）カビ、酵母、植物に由来する比較的高価なカルボキシペプチダーゼ標品が必要。反応４において、細菌およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属以外の酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミン等のペプチドの製造方法についても全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
また、酵素を用いた上記反応４のペプチドの製造方法は、ジペプチドの生成に限られており、工業的に十分利用可能なように、トリペプチド以上のペプチドを簡便に製造する方法の開発が望まれていた。
以上の様な状況の下、本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、トリペプチド以上のペプチドを製造することができる方法を提供することを課題とする。
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出したエンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌、およびスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌からトリペプチド以上のペプチドを効率良く生成する酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、トリペプチド以上のペプチドを生成することを特徴とする、トリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔２〕 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔３〕 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕または〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔４〕 前記酵素または酵素含有物が、アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔５〕 前記酵素が、下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔６〕 前記酵素が、下記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔７〕 前記酵素が、下記（Ｅ）または（Ｆ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔８〕 前記酵素が、下記（Ｇ）または（Ｈ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｇ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔９〕 前記微生物が、エンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
〔１０〕 前記微生物が、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１１〕 前記微生物が、下記（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１２〕 前記微生物が、下記（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｅ）配列表の配列番号５に記載の塩基番号のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１３〕 前記微生物が、下記（ｇ）または（ｈ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｇ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
〔１４〕 前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステルおよびＬ−トレオニンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｄ−アラニンエステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕から〔１３〕のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
第１図は、エンペドバクターの酵素の至適ｐＨを示す図である。
第２図は、エンペドバクターの酵素の至適温度を示す図である。
第３図は、Ｌ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成の経時変化を示す図である。
第４図は、サイトプラズム画分（Ｃｙ）とペリプラズム画分（Ｐｅ）に存在する酵素量を示す図である。
第２図は、エンペドバクターの酵素の至適温度を示す図である。
第３図は、Ｌ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成の経時変化を示す図である。
第４図は、サイトプラズム画分（Ｃｙ）とペリプラズム画分（Ｐｅ）に存在する酵素量を示す図である。
以下、本発明のトリペプチド以上のペプチドを製造する方法について、
１．トリペプチド以上のペプチドの製造方法、
２．本発明で用いられる酵素、
の順に詳細に説明する。
本明細書において、カルボキシ成分とは、ペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）におけるカルボニル部位（ＣＯ）を供給する成分のことをいい、アミン成分とは、ペプチド結合におけるアミノ部位（ＮＨ）を供給する成分のことをいう。また、本明細書において、単に「ペプチド」というときは、特に断らない限り、少なくとも１つ以上のペプチド結合を有するポリマーのことをいう。また、「ジペプチド」とは１つのペプチド結合を有するペプチドのことをいう。また、「トリペプチド以上のペプチド」とはペプチド結合を少なくとも２つ以上有するペプチドのことをいう。
１．トリペプチド以上のペプチドの製造方法
本発明のトリペプチド以上のペプチドを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定の酵素の存在下でカルボキシ成分とアミン成分とを反応させる。すなわち、本発明のペプチドを製造する方法は、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素または当該酵素の含有物を、カルボキシ成分とアミン成分とに作用させ、トリペプチド以上のペプチドを生成せしめるものである。
酵素または酵素含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、酵素または酵素含有物をカルボキシ成分およびアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を精製・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたトリペプチド以上のペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
トリペプチド以上のペプチドを生成する活性のあるペプチド生成酵素を生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、トリペプチド以上のペプチドを生成する活性のあるペプチド生成酵素を発現可能なように形質転換した遺伝子組み換え株はペプチド生成酵素をより大量生成するように改変することが可能であるため、トリペプチド以上のペプチドの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。野生株または遺伝子組み換え株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該ペプチド生成酵素を蓄積させて、アミノ酸エステルおよびジペプチド以上のアミン成分に混合して、トリペプチド以上のペプチドを生成することができる。
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は１〜５００ｇ／Ｌ程度である。
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド等が挙げられる。また、アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドなども例示される。また、アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドとしては、α−アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が例示される。
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるペプチドであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としての最小単位はジペプチドであり、上限は特に限定されない。また、アミン成分となるペプチドのアミノ酸配列も特に限定されない。また、アミン成分となるペプチドは側鎖が修飾されたものであってもよいし、アミノ酸ではなくアミンが含まれたものでもよい。具体的には、前記アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチド等が挙げられる。Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドとは、トリペプチドを例にした場合、Ｎ末端アミノ酸−アミノ酸−アミンの構造となるペプチドである。
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
反応温度は０〜６０℃でペプチド生成可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５でペプチド生成可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。
所望のアミノ酸配列を有するようにトリペプチド以上のペプチドを生成するには、所望のアミノ酸配列になるように、カルボキシ成分となるアミノ酸エステルを１種ずつ選択して、逐次的にアミノ酸を伸長させていけばよい。例えば、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するトリペプチドを生成するには、アラニンメチルエステルをカルボキシ成分とし、Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するジペプチドをアミン成分として合成すればよい。トリペプチド生成後、さらに、グリシンメチルエステルをカルボキシ成分として添加し、反応させることにより、Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するペプチドを得ることができる。
２．本発明で用いられる酵素
上記本発明のペプチド製造方法では、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素が用いられる。本発明のペプチド製造方法では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などに限定されるものではない。以下に、本発明で用いられる酵素を有する微生物、微生物の培養、酵素の精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
（２−１）本発明の製法に用いることができる酵素を有する微生物
本発明の酵素を生産する微生物としては、例えばエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはエンペドバクター ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）、スフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株が挙げられる。エンペドバクター ブレビス ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）およびスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株は、本発明者らが、カルボキシ成分とアミン成分からペプチドを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。
エンペドバクター ブレビス ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）は、２００１年１０月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５の受託番号が付与され、さらに平成１４年７月８日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３が付与された微生物である（微生物の表示：Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＡＪ １３９３３株）。
スフィンゴバクテリウム エスピーＡＪ １１０００３株は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４の受託番号が付与されている。尚、ＡＪ １１０００３（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４）は、以下の分類実験により、上述のスフィンゴバクテリウム エスピーであることが同定された。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの産生陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陰性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陰性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、ｎ−カプリン酸陰性、アジピン酸資化陰性、ｄｌ−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム マルチボーラムあるいはスフィンゴバクテリウム スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。更に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム マルチボーラムと最も高いホモロジー（９８．８％）を示したが、完全に一致する株はなかったことより、本菌株をスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
（２−２）微生物の培養
本発明で用いられる酵素を有する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
（２−３）酵素の精製
上記のように、本発明で用いられるペプチド生成酵素は、例えばエンペドバクター属に属する細菌から精製することができる。当該酵素を精製する例として、エンペドバクター ブレビスからペプチド生成酵素を単離・精製する方法を説明する。
まず、エンペドバクター ブレビス、例えばＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ ＨＲ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャム社製）が挙げられる。
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸エステルの少なくとも１種以上、アミノ酸アミドの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る」というのは、ジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上、および、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。カルボキシ成分またはアミノ成分について幅広い基質特異性を有することは、工業生産の場におけるコスト、生産設備などの点で都合のよい原料の選択性が広がるという点で好ましい。
（２−４）ＤＮＡの単離、形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の精製
（２−４−１）ＤＮＡの単離
本発明者らは、まずエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素のＤＮＡの１種を単離することに成功した。本発明のＤＮＡである配列番号５に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）より単離されたものである。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９０８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号５に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９０８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示す。
本発明のＤＮＡである配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）より単離されたものである。配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９１７の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２０の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２１〜１９１７の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号５に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２１〜１９１７でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示す。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
本発明で用いることができる酵素をコードするＤＮＡは、エンペドバクター ブレビス、もしくはスフィンゴバクテリウム エスピーの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたペプチド生成酵素に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりペプチド生成酵素遺伝子（配列番号５および配列番号１１）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５′非翻訳領域及び３′非翻訳領域に対応する配列を有するプフィマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。配列番号５に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５′側プライマーとしては配列番号５において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３′側プライマーとしては塩基番号１９０８よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするＤＮＡとしては、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
すなわち、本発明においては、下記（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡを利用することができる。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列表の配列番号５に記載の塩基番号のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
プローブは、例えば配列番号５に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするＤＮＡをつり上げ、目的とするＤＮＡを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、配列番号５に記載の塩基配列のうち塩基番号１２７〜１９０８にの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
配列表の配列番号５に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示される。また、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示される。配列番号６に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２２までがリーダーペプチドにあたり、２３〜６１６までが成熟タンパク質領域である。また、配列番号１１に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２０までがリーダーペプチドにあたり、２１〜６１９までが成熟タンパク質領域である。
本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、その成熟タンパク質はペプチド生成活性を有するタンパク質であり、リーダーペプチドを含むか含まないかに関わらず、配列表の配列番号６もしくは配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。（なお、ユニバーサルコドンのコードに従ってアミノ酸配列から塩基配列は特定される）。すなわち、本発明により、以下の（Ａ）から（Ｈ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
本発明のペプチドの製造方法においては、上記（ａ）から（ｈ）に示されるＤＮＡでコードされるタンパク質群および上記（Ａ）から（Ｈ）に示されるタンパク質群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質を用いることができる。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜１００個、より好ましくは、２〜５０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号６または１２に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
（２−４−２）形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の生成
上記（２−４−１）で説明したＤＮＡを適当な宿主に導入し、発現させることによって、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素を生成することができる。
ＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、エンペドバクター属細菌、スフィンゴバクテリウム属細菌、フラボバクテリウム細菌及びバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
ＤＮＡを宿主に導入するのに用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするＤＮＡを、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモータとしては、エンペドバクター ブレビスなどのペプチド生成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のＤＮＡに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてペプチド生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にペプチド生成酵素を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするＤＮＡを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のＤＮＡのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムのニンヒドリン発色での確認（定性）に加え、定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ−２（ＧＬサイエンス社製）、溶離液：５．０ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：メタノール＝１００：１５〜５０、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出 ２１０ｎｍ。
１．トリペプチド以上のペプチドの製造方法、
２．本発明で用いられる酵素、
の順に詳細に説明する。
本明細書において、カルボキシ成分とは、ペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）におけるカルボニル部位（ＣＯ）を供給する成分のことをいい、アミン成分とは、ペプチド結合におけるアミノ部位（ＮＨ）を供給する成分のことをいう。また、本明細書において、単に「ペプチド」というときは、特に断らない限り、少なくとも１つ以上のペプチド結合を有するポリマーのことをいう。また、「ジペプチド」とは１つのペプチド結合を有するペプチドのことをいう。また、「トリペプチド以上のペプチド」とはペプチド結合を少なくとも２つ以上有するペプチドのことをいう。
１．トリペプチド以上のペプチドの製造方法
本発明のトリペプチド以上のペプチドを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定の酵素の存在下でカルボキシ成分とアミン成分とを反応させる。すなわち、本発明のペプチドを製造する方法は、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素または当該酵素の含有物を、カルボキシ成分とアミン成分とに作用させ、トリペプチド以上のペプチドを生成せしめるものである。
酵素または酵素含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、酵素または酵素含有物をカルボキシ成分およびアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を精製・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたトリペプチド以上のペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
トリペプチド以上のペプチドを生成する活性のあるペプチド生成酵素を生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、トリペプチド以上のペプチドを生成する活性のあるペプチド生成酵素を発現可能なように形質転換した遺伝子組み換え株はペプチド生成酵素をより大量生成するように改変することが可能であるため、トリペプチド以上のペプチドの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。野生株または遺伝子組み換え株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該ペプチド生成酵素を蓄積させて、アミノ酸エステルおよびジペプチド以上のアミン成分に混合して、トリペプチド以上のペプチドを生成することができる。
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は１〜５００ｇ／Ｌ程度である。
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド等が挙げられる。また、アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドなども例示される。また、アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドとしては、α−アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が例示される。
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるペプチドであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としての最小単位はジペプチドであり、上限は特に限定されない。また、アミン成分となるペプチドのアミノ酸配列も特に限定されない。また、アミン成分となるペプチドは側鎖が修飾されたものであってもよいし、アミノ酸ではなくアミンが含まれたものでもよい。具体的には、前記アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチド等が挙げられる。Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドとは、トリペプチドを例にした場合、Ｎ末端アミノ酸−アミノ酸−アミンの構造となるペプチドである。
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
反応温度は０〜６０℃でペプチド生成可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５でペプチド生成可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。
所望のアミノ酸配列を有するようにトリペプチド以上のペプチドを生成するには、所望のアミノ酸配列になるように、カルボキシ成分となるアミノ酸エステルを１種ずつ選択して、逐次的にアミノ酸を伸長させていけばよい。例えば、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するトリペプチドを生成するには、アラニンメチルエステルをカルボキシ成分とし、Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するジペプチドをアミン成分として合成すればよい。トリペプチド生成後、さらに、グリシンメチルエステルをカルボキシ成分として添加し、反応させることにより、Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａの配列を有するペプチドを得ることができる。
２．本発明で用いられる酵素
上記本発明のペプチド製造方法では、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素が用いられる。本発明のペプチド製造方法では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などに限定されるものではない。以下に、本発明で用いられる酵素を有する微生物、微生物の培養、酵素の精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
（２−１）本発明の製法に用いることができる酵素を有する微生物
本発明の酵素を生産する微生物としては、例えばエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはエンペドバクター ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）、スフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株が挙げられる。エンペドバクター ブレビス ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）およびスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株は、本発明者らが、カルボキシ成分とアミン成分からペプチドを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。
エンペドバクター ブレビス ＡＴＣＣ １４２３４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株）は、２００１年１０月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１８５４５の受託番号が付与され、さらに平成１４年７月８日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３が付与された微生物である（微生物の表示：Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＡＪ １３９３３株）。
スフィンゴバクテリウム エスピーＡＪ １１０００３株は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４の受託番号が付与されている。尚、ＡＪ １１０００３（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４）は、以下の分類実験により、上述のスフィンゴバクテリウム エスピーであることが同定された。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの産生陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陰性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陰性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、ｎ−カプリン酸陰性、アジピン酸資化陰性、ｄｌ−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム マルチボーラムあるいはスフィンゴバクテリウム スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。更に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム マルチボーラムと最も高いホモロジー（９８．８％）を示したが、完全に一致する株はなかったことより、本菌株をスフィンゴバクテリウム エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
（２−２）微生物の培養
本発明で用いられる酵素を有する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
（２−３）酵素の精製
上記のように、本発明で用いられるペプチド生成酵素は、例えばエンペドバクター属に属する細菌から精製することができる。当該酵素を精製する例として、エンペドバクター ブレビスからペプチド生成酵素を単離・精製する方法を説明する。
まず、エンペドバクター ブレビス、例えばＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ ＨＲ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャム社製）が挙げられる。
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。「アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る」というのは、アミノ酸エステルの少なくとも１種以上、アミノ酸アミドの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。また、本発明の酵素として好ましいものの一形態には、アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る」というのは、ジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上、および、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドの少なくとも１種以上を基質とし得ることを意味する。カルボキシ成分またはアミノ成分について幅広い基質特異性を有することは、工業生産の場におけるコスト、生産設備などの点で都合のよい原料の選択性が広がるという点で好ましい。
（２−４）ＤＮＡの単離、形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の精製
（２−４−１）ＤＮＡの単離
本発明者らは、まずエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素のＤＮＡの１種を単離することに成功した。本発明のＤＮＡである配列番号５に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）より単離されたものである。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９０８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号５に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９０８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示す。
本発明のＤＮＡである配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）より単離されたものである。配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９１７の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２０の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２１〜１９１７の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号５に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２１〜１９１７でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示す。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
本発明で用いることができる酵素をコードするＤＮＡは、エンペドバクター ブレビス、もしくはスフィンゴバクテリウム エスピーの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたペプチド生成酵素に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりペプチド生成酵素遺伝子（配列番号５および配列番号１１）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５′非翻訳領域及び３′非翻訳領域に対応する配列を有するプフィマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。配列番号５に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５′側プライマーとしては配列番号５において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３′側プライマーとしては塩基番号１９０８よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするＤＮＡとしては、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
すなわち、本発明においては、下記（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡを利用することができる。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列表の配列番号５に記載の塩基番号のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
プローブは、例えば配列番号５に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするＤＮＡをつり上げ、目的とするＤＮＡを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、配列番号５に記載の塩基配列のうち塩基番号１２７〜１９０８にの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
配列表の配列番号５に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示される。また、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示される。配列番号６に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２２までがリーダーペプチドにあたり、２３〜６１６までが成熟タンパク質領域である。また、配列番号１１に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２０までがリーダーペプチドにあたり、２１〜６１９までが成熟タンパク質領域である。
本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、その成熟タンパク質はペプチド生成活性を有するタンパク質であり、リーダーペプチドを含むか含まないかに関わらず、配列表の配列番号６もしくは配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。（なお、ユニバーサルコドンのコードに従ってアミノ酸配列から塩基配列は特定される）。すなわち、本発明により、以下の（Ａ）から（Ｈ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
本発明のペプチドの製造方法においては、上記（ａ）から（ｈ）に示されるＤＮＡでコードされるタンパク質群および上記（Ａ）から（Ｈ）に示されるタンパク質群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質を用いることができる。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜１００個、より好ましくは、２〜５０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号６または１２に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
（２−４−２）形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の生成
上記（２−４−１）で説明したＤＮＡを適当な宿主に導入し、発現させることによって、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素を生成することができる。
ＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、エンペドバクター属細菌、スフィンゴバクテリウム属細菌、フラボバクテリウム細菌及びバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
ＤＮＡを宿主に導入するのに用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするＤＮＡを、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモータとしては、エンペドバクター ブレビスなどのペプチド生成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のＤＮＡに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてペプチド生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にペプチド生成酵素を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするＤＮＡを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のＤＮＡのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムのニンヒドリン発色での確認（定性）に加え、定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ−２（ＧＬサイエンス社製）、溶離液：５．０ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：メタノール＝１００：１５〜５０、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出 ２１０ｎｍ。
（実施例１）微生物の培養（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３）
１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した。これに同培地で３０℃、１６時間培養したエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
（実施例２）微生物菌体を用いるペプチドの生産
実施例１で得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し菌体を集め、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に１００ｇ／Ｌになるように懸濁した。懸濁液１ｍＬを、ＥＤＴＡ１０ｍＭと下記のカルボキシ成分 ２００ｍＭと、下記のアミノ酸４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、１８℃にて２時間反応をおこなった。この結果、生成したペプチドを表１に示した。
（実施例３）酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例１と同様に、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＭｏｎｏ Ｓカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、活性画分溶液を得た。これらの操作により、本発明に使用されるペプチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は１２．２％、精製度は７０７倍であった。
（実施例４）酵素の分子量測定
（ＳＤＳ−ゲル電気泳動）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分０．３μｇ相当をポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動緩衝液には０．３％（ｗ／ｖ）トリス、１．４４％（ｗ／ｖ）グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを、ポリアクリルアミドゲルはゲル濃度１０〜２０％の濃度勾配ゲル（マルチゲル１０−２０、第一化学薬品製）、分子量マーカーはファルマシア製分子量マーカーを用いた。電気泳動終了後、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によってゲルを染色し、分子量約７５ｋＤａ位置に均一なバンドが検出された。
（ゲル濾過）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、分子量を測定した。検量線を作成するための分子量既知の標準タンパクとしてはファルマシア製分子量マーカーを用いた。この結果、得られた酵素の分子量は約１５０ｋＤａであった。
ＳＤＳ−ゲル電気泳動とゲル濾過の結果より、本酵素は分子量約７５ｋＤａのホモダイマーであることが示唆された。
（実施例５）酵素の至適ｐＨ
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応におけるｐＨの影響を検討した。緩衝液としては、酢酸緩衝液（ｐＨ３．９〜５．４）ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．４〜６．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．９）ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．８〜９．３）、ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３〜１０．７）、およびＫ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．８〜１１．６）を用いた。１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのそれぞれの緩衝液１００μｌに実施例３で得られたＭｏｎｏＳ画分酵素（約１８０Ｕ／ｍｌ）を１μｌ加え、１８℃、５分間反応させ、反応に対するｐＨの影響を測定した。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）を用いた場合の活性を１００％とした結果を第１図に示した。この結果、本酵素の至適ｐＨは８〜９．５であった。
（実施例６）酵素の至適温度
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応における温度の影響を検討した。１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分を１μｌ加え、各温度にて５分間反応させ、反応に対する温度の影響を測定した。３４℃での活性を１００％とした結果を第２図に示した。この結果、本酵素の至適温度は３０〜４０℃であった。
（実施例７）酵素の阻害剤
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質に用い、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成に与える阻害剤の影響を検討した。表２に示す１０ｍＭの各種酵素阻害剤を含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを加え、２５℃にて５分間反応させた。尚、ｏ−フェナンスロリン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、ｐ−ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノベンゾエートについては５０ｍＭになるようにメタノールに溶解したものを使用した。各条件での酵素活性は酵素阻害剤を加えない条件でのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成を１００とした場合の相対活性で示した。結果を表２に示す。この結果、本酵素は、セリン酵素阻害剤の内、フェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されないが、ｐ−ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノベンゾエートで阻害される性質を示した。
（実施例８）Ｌ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例５で用いたものと同じ酵素画分３μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて反応した。この結果、第３図に示すように、酵素添加区では、反応６０分で８３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成し、副成するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎは１．３ｍＭであった。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例９）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産に与えるＬ−グルタミン濃度の影響
実施例５で用いたものと同じ酵素画分１μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、表３に示す濃度のＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて２時間反応した。この結果を表３に示した。
（実施例１０）酵素の基質特異性（１）
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステルを用いた場合のエステル特異性を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表４に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて２時間反応した。この反応で生成したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量を表４に示した（表４中、ＨＣｌは塩酸塩を示す）。
（実施例１１）酵素の基質特異性（２）
カルボキシ成分にＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭの表５に示すＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表５に示した（＋印は、ペプチドの生成は確認されているが、標準品がなく定量できなかったもの、ｔｒは微量を示す）。
（実施例１２）酵素の基質特異性（３）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にＬ−グルタミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表６に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１５０ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表６に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。
（実施例１３）酵素の基質特異性（４）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表７に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表７に示す１５０ｍＭの各種Ｌ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表７に示した（ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成が確認されているものを示す）。
（実施例１４）酵素の基質特異性（５）
カルボキシ成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表８に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表８に示す１５０ｍＭの各種アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表８に示した（ｔｒは微量を示す）。
（実施例１５）酵素の基質特異性（６）
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸アミド、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表９に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸アミド（ＡＡ−ＮＨ２・ＨＣｌ）、表９に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表９に示した。
（実施例１６）酵素の基質特異性（７）
カルボキシ成分に各種のＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分にＣ保護Ｌ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１０に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１０に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸アミド、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１０に示した。
（実施例１７）酵素の基質特異性（８）
カルボキシ成分に各種のアミノ酸メチルエステル、アミン成分にメチルアミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１１に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１１に示す１５０ｍＭのメチルアミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１１に示した。
（実施例１８）酵素の基質特異性（９）
カルボキシ成分としてβ−アミノ酸エステル、あるいはアミン成分としてβ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１２に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１２に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１２に示した（ｔｒは微量を示す）。
（実施例１９）酵素の基質特異性（１０）
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステル、アミン成分としてペプチドを用いた場合のオリゴペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１３に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１３に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１３に示した。この結果、本酵素はジペプチド生産のみならず、アミン成分としてペプチドを用いることにより、鎖長の長いペプチドも生産できることが明らかとなった。
以上実施例９〜２０に示されるように、エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭＰ−１８５４５株から得られた本酵素が、極めて基質特異性の広い酵素であることが判明した。
（実施例２０）既存酵素とのペプチド生成触媒能力の比較
本酵素のペプチド生成能力を既存酵素と比較した。既存酵素としては、ＥＰ ２７８７８７Ａ１記載のカルボキシペプチダーゼＹ、ＥＰ ３５９３９９Ｂ１記載のチオールエンドペプチダーゼ（フィシン、パパイン、ブロメライン、キモパパイン）を用い、これらについては、シグマ社製の精製酵素を使用した。本酵素源としては実施例３で均一に精製した酵素を使用した。これら酵素は、タンパク量として表１４に示す量を反応系に添加した。反応は、１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステルと２００ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む１００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２５℃にて反応した。尚、カルボキシペプチダーゼは、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素、チオールエンドペプチダーゼは、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ジチオスレイトールを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素を用いた。これら酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度比を表１４に示した。
この結果、酵素無添加でも、ごく微量のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成が観察され、カルボキシペプチダーゼあるいはチオールエンドペプチダーゼ添加区では、酵素無添加区に比し若干生成速度速まることが観察された。これに対して、本酵素の添加区では圧倒的に速いＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度が観察され、その速度は、カルボキシペプチダーゼＹ、チオールエンドペプチダーゼに対して、約５，０００倍〜１００，０００倍であった。以上のように、本酵素は、今までに例のない極めて速いペプチド生成速度を有していることが判明した。尚、本酵素の分子量は７５０００のダイマーであるのに対し、カルボキシペプチダーゼＹの分子量は約６１０００、上記チオールエンドペプチダーゼの分子量は約２３０００〜３６０００と報告されているので、分子量当たりのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度は、実施例に示した単位重量当たりよりも更に本酵素の方が速くなる。
（実施例２１）エンペドバクター ブレビス由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
（１）決定内部アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素のリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号１及び２）をもとに、配列番号３及び４にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
（２）菌体の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
（４）ＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
（５）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
本実施例２１（３）で取得したエンペドバクター ブレビスの染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約４ｋｂのバンドが検出できた。
本実施例２１（３）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを２株確認できた。
（６）エンペドバクター ブレビス由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
その結果、ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列（配列番号１及び２）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子であることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号５に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、二つの酵素に相同性が見出され、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓのａ−アミノ酸エステルハイドロラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８（１），２１１−２１８（２００２）とは、アミノ酸配列で３４％、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３（２４），７８４８−７８５５（１９９１）のグルタリル−７ＡＣＡアシラーゼとは、アミノ酸配列で２６％の相同性を示した。
（実施例２２）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を配列番号７，８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴと命名した。
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号９、１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２と命名した。
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌ アンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．４４ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号６番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ１２，ｎｏ．１，ｐｐ．３−９，１９９９）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２２番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２３番目より下流であると推定された。
（分泌の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行い培養菌体を得た。
上記培養菌体を２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液を用いた浸透圧ショック法により、ペリプラズム画分とサイトプラズム画分に分画した。２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液に浸した菌体を５ｍＭ ＭｇＳＯ４水溶液に浸し、この遠心上清をペリプラズム画分（Ｐｅ）とした。また、その遠心沈殿を再懸濁し、超音波破砕したものをサイトプラズム画分（Ｃｙ）とした。サイトプラズムを分離したことを確認するために、サイトプラズムに存在することが知られているグルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼの活性を指標とした。測定法は１ｍＭ グルコース６燐酸、０．４ｍＭ ＮＡＤＰ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、３０℃の反応溶液の中に適当量の酵素を添加し、３４０ｎｍの吸光度の測定によりＮＡＤＰＨの生成を測定することにより行った。
別途調整した無細胞抽出液の活性を１００％としたときの、サイトプラズム画分、ペリプラズム画分の酵素量を第４図に示す。グルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼ活性がペリプラズム画分に混入していないことは、サイトプラズム画分にペリプラズム画分が混入していないことを示す。Ａｌａ−Ｇｌｎ生成活性のうち約６０％がペリプラズム画分に回収され、上記ＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラムを用いてアミノ酸配列から予測されたように、Ａｌａ−Ｇｌｎ生成酵素がペリプラズムに分泌していることが確認された。
（実施例２３）酵素の基質特異性（１１）
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から調製したＡｌａ−Ｇｌｎ生成活性を有する酵素画分を用いて、さらにその基質特異性を検討した。表１５に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中０．１ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて表１５に示した反応時間で反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１５に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。
略号の説明；
Ｈ−Ａｌａ−ＯＭｅ：Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｃｌ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−クロロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−ＮＯ２−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ：ｔｅｒｔ−Ｌ−ロイシンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−２−Ｎａｌ−ＯＭｅ：３−（２−ナフチル）−Ｌアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ａｉｂ−ＯＭｅ：α−アミノイソブチリックアシッドメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ−ＯＭｅ：Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ＣＨＡ−ＯＭｅ：β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＭｅ：Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＭｅ：Ｌ−アスパルチックアシッド β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル α−メチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ：Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−Ｃｌ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−ｐ−ＮＯ２−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−ｔ−Ｌｅｕ−ＯＨ：ｔｅｒｔ−Ｌ−ロイシン
Ｈ−２−Ｎａｌ−ＯＨ：３−（２−ナフチル）−Ｌアラニン
Ｈ−Ｇｌｎ−ＯＨ：Ｌ−グルタミン
Ｈ−Ｐｈｅ−ＯＨ：Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｌ−アスパルチックアシッド β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン
（実施例２４）酵素の基質特異性（１２）
実施例２３と同じ酵素画分を用い、オリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１６に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中に添加したユニット数は表１８に記載）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１８に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
（実施例２５）スフィンゴバクテリウム エスピーの菌体を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養したスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２０時間振とう培養を行った。この培養液１ｍｌを上記培地（５０ｍｌ／５００ｍＬ坂口フラスコ）に添加し、３０℃、１８時間培養した。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。この菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬを添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて１２０分反応をおこなった。このときのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）の生成量は６２ｍＭであった。
（実施例２６）スフィンゴバクテリウム エスピーからの酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例２５と同様に、スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体２ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて洗浄後、同緩衝液８ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
（実施例２７）酵素画分を用いたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例２６で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分（約２７Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、１１１ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２２２ｍＭのＬ−グルタミン、１１ｍＭのＥＤＴＡを含む１１１ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９０μｌに加え、２５℃にて１２０分反応した。はこの結果、酵素添加区では、７３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが生成した。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例２８）酵素の基質特異性（１３）
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素の基質特異性を検討した。表１７−１から表１７−４に示した終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２６で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１７に示した。（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。また、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
（実施例２９）酵素の基質特異性（１４）
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素のオリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１８に示した、終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２２で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１８に示した。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
（実施例３０）スフィンゴバクテリウム エスピー由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
（１）菌体の取得
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天，ｐＨ７．０））上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
本実施例３０（２）で取得したスフィンゴバクテリウム エスピーの染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約３ｋｂのバンドが検出できた。
本実施例３０（２）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＳａｃＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約３ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ＳａｃＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）で３７℃、３０分、５０℃、３０分処理したｐＵＣ１１８とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αのコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを６株確認できた。
（５）スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記６菌株から、エシェリヒア コリ ＤＨ５αが保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した。スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素は、エンペドバクターブレビス由来ペプチド生成酵素とアミノ酸配列で６３．５％の相同性を示した（ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用）。
（実施例３１）スフィンゴバクテリウム属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１３、１４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔと命名した。
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を３ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり２．１ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がエシェリヒア コリで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号１２番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ１２，ｎｏ．１，ｐｐ．３−９，１９９９）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２０番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２１番目より下流であると推定された。
（シグナル配列の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液に懸濁した。１９５Ｗにて２０分間超音波破砕処理を行い、超音波破砕処理液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分）し、破砕菌体片を除去することにより可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて予め平衡化したＣＨＴ−ＩＩカラム（バイオラッド製）に供し、５００ｍＭリン酸緩衝液による直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分と５倍量の２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液とを混合した溶液を、２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液にて予め平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ−ＰＨＥカラム（アマシャム社製）に供し、２〜０Ｍ硫酸アンモニウムによる直線的な濃度勾配で酵素を溶出させ、活性画分溶液を得た。これらの操作により、ペプチド生成酵素は電気泳動的に単一に精製されたことが確認された。
上記ペプチド生成酵素をエドマン分解法によりアミノ酸配列を決定したところ、配列番号１５のアミノ酸配列を取得し、ＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラムで予測されたとおり成熟タンパクは２１番目より下流であることが確認された。
１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した。これに同培地で３０℃、１６時間培養したエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
（実施例２）微生物菌体を用いるペプチドの生産
実施例１で得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し菌体を集め、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に１００ｇ／Ｌになるように懸濁した。懸濁液１ｍＬを、ＥＤＴＡ１０ｍＭと下記のカルボキシ成分 ２００ｍＭと、下記のアミノ酸４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、１８℃にて２時間反応をおこなった。この結果、生成したペプチドを表１に示した。
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例１と同様に、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＭｏｎｏ Ｓカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、活性画分溶液を得た。これらの操作により、本発明に使用されるペプチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は１２．２％、精製度は７０７倍であった。
（実施例４）酵素の分子量測定
（ＳＤＳ−ゲル電気泳動）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分０．３μｇ相当をポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動緩衝液には０．３％（ｗ／ｖ）トリス、１．４４％（ｗ／ｖ）グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを、ポリアクリルアミドゲルはゲル濃度１０〜２０％の濃度勾配ゲル（マルチゲル１０−２０、第一化学薬品製）、分子量マーカーはファルマシア製分子量マーカーを用いた。電気泳動終了後、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によってゲルを染色し、分子量約７５ｋＤａ位置に均一なバンドが検出された。
（ゲル濾過）
実施例３の方法により得られた精製酵素画分を１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、分子量を測定した。検量線を作成するための分子量既知の標準タンパクとしてはファルマシア製分子量マーカーを用いた。この結果、得られた酵素の分子量は約１５０ｋＤａであった。
ＳＤＳ−ゲル電気泳動とゲル濾過の結果より、本酵素は分子量約７５ｋＤａのホモダイマーであることが示唆された。
（実施例５）酵素の至適ｐＨ
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応におけるｐＨの影響を検討した。緩衝液としては、酢酸緩衝液（ｐＨ３．９〜５．４）ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．４〜６．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．９）ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．８〜９．３）、ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３〜１０．７）、およびＫ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．８〜１１．６）を用いた。１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのそれぞれの緩衝液１００μｌに実施例３で得られたＭｏｎｏＳ画分酵素（約１８０Ｕ／ｍｌ）を１μｌ加え、１８℃、５分間反応させ、反応に対するｐＨの影響を測定した。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）を用いた場合の活性を１００％とした結果を第１図に示した。この結果、本酵素の至適ｐＨは８〜９．５であった。
（実施例６）酵素の至適温度
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する反応における温度の影響を検討した。１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分を１μｌ加え、各温度にて５分間反応させ、反応に対する温度の影響を測定した。３４℃での活性を１００％とした結果を第２図に示した。この結果、本酵素の至適温度は３０〜４０℃であった。
（実施例７）酵素の阻害剤
Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質に用い、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成に与える阻害剤の影響を検討した。表２に示す１０ｍＭの各種酵素阻害剤を含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌに実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを加え、２５℃にて５分間反応させた。尚、ｏ−フェナンスロリン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、ｐ−ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノベンゾエートについては５０ｍＭになるようにメタノールに溶解したものを使用した。各条件での酵素活性は酵素阻害剤を加えない条件でのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成を１００とした場合の相対活性で示した。結果を表２に示す。この結果、本酵素は、セリン酵素阻害剤の内、フェニルメチルスルフォニルフルオリドでは阻害されないが、ｐ−ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノベンゾエートで阻害される性質を示した。
実施例５で用いたものと同じ酵素画分３μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて反応した。この結果、第３図に示すように、酵素添加区では、反応６０分で８３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成し、副成するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎは１．３ｍＭであった。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例９）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産に与えるＬ−グルタミン濃度の影響
実施例５で用いたものと同じ酵素画分１μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、表３に示す濃度のＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、１８℃にて２時間反応した。この結果を表３に示した。
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステルを用いた場合のエステル特異性を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表４に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて２時間反応した。この反応で生成したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量を表４に示した（表４中、ＨＣｌは塩酸塩を示す）。
カルボキシ成分にＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、１００ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭの表５に示すＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表５に示した（＋印は、ペプチドの生成は確認されているが、標準品がなく定量できなかったもの、ｔｒは微量を示す）。
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にＬ−グルタミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表６に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１５０ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表６に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表７に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表７に示す１５０ｍＭの各種Ｌ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表７に示した（ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成が確認されているものを示す）。
カルボキシ成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸メチルエステル、アミン成分に各種のＬ−またはＤ−体のアミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表８に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル塩酸塩（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表８に示す１５０ｍＭの各種アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表８に示した（ｔｒは微量を示す）。
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸アミド、アミン成分に各種のＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表９に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸アミド（ＡＡ−ＮＨ２・ＨＣｌ）、表９に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表９に示した。
カルボキシ成分に各種のＬ−アラニンメチルエステル、アミン成分にＣ保護Ｌ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１０に示す１００ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１０に示す１５０ｍＭのＬ−アミノ酸アミド、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１０に示した。
カルボキシ成分に各種のアミノ酸メチルエステル、アミン成分にメチルアミンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１１に示す１００ｍＭのアミノ酸メチルエステル（ＡＡ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、表１１に示す１５０ｍＭのメチルアミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１１に示した。
カルボキシ成分としてβ−アミノ酸エステル、あるいはアミン成分としてβ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１２に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１２に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１２に示した（ｔｒは微量を示す）。
カルボキシ成分としてＬ−アミノ酸エステル、アミン成分としてペプチドを用いた場合のオリゴペプチド生産を検討した。実施例５で用いたものと同じ酵素画分２μｌを、表１３に示す１００ｍＭのカルボキシ成分、表１３に示す１５０ｍＭのアミン成分、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに加え、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１３に示した。この結果、本酵素はジペプチド生産のみならず、アミン成分としてペプチドを用いることにより、鎖長の長いペプチドも生産できることが明らかとなった。
以上実施例９〜２０に示されるように、エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭＰ−１８５４５株から得られた本酵素が、極めて基質特異性の広い酵素であることが判明した。
本酵素のペプチド生成能力を既存酵素と比較した。既存酵素としては、ＥＰ ２７８７８７Ａ１記載のカルボキシペプチダーゼＹ、ＥＰ ３５９３９９Ｂ１記載のチオールエンドペプチダーゼ（フィシン、パパイン、ブロメライン、キモパパイン）を用い、これらについては、シグマ社製の精製酵素を使用した。本酵素源としては実施例３で均一に精製した酵素を使用した。これら酵素は、タンパク量として表１４に示す量を反応系に添加した。反応は、１００ｍＭ Ｌ−アラニンメチルエステルと２００ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む１００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２５℃にて反応した。尚、カルボキシペプチダーゼは、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素、チオールエンドペプチダーゼは、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ジチオスレイトールを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した酵素を用いた。これら酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成速度比を表１４に示した。
この結果、酵素無添加でも、ごく微量のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成が観察され、カルボキシペプチダーゼあるいはチオールエンドペプチダーゼ添加区では、酵素無添加区に比し若干生成速度速まることが観察された。これに対して、本酵素の添加区では圧倒的に速いＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度が観察され、その速度は、カルボキシペプチダーゼＹ、チオールエンドペプチダーゼに対して、約５，０００倍〜１００，０００倍であった。以上のように、本酵素は、今までに例のない極めて速いペプチド生成速度を有していることが判明した。尚、本酵素の分子量は７５０００のダイマーであるのに対し、カルボキシペプチダーゼＹの分子量は約６１０００、上記チオールエンドペプチダーゼの分子量は約２３０００〜３６０００と報告されているので、分子量当たりのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成速度は、実施例に示した単位重量当たりよりも更に本酵素の方が速くなる。
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
（１）決定内部アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のエンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素のリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号１及び２）をもとに、配列番号３及び４にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
（２）菌体の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
（４）ＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
（５）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
本実施例２１（３）で取得したエンペドバクター ブレビスの染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約４ｋｂのバンドが検出できた。
本実施例２１（３）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを２株確認できた。
（６）エンペドバクター ブレビス由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
その結果、ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列（配列番号１及び２）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子であることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号５に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、二つの酵素に相同性が見出され、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓのａ−アミノ酸エステルハイドロラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８（１），２１１−２１８（２００２）とは、アミノ酸配列で３４％、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３（２４），７８４８−７８５５（１９９１）のグルタリル−７ＡＣＡアシラーゼとは、アミノ酸配列で２６％の相同性を示した。
（実施例２２）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を配列番号７，８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴと命名した。
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号９、１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２と命名した。
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌ アンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．４４ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号６番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ１２，ｎｏ．１，ｐｐ．３−９，１９９９）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２２番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２３番目より下流であると推定された。
（分泌の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行い培養菌体を得た。
上記培養菌体を２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液を用いた浸透圧ショック法により、ペリプラズム画分とサイトプラズム画分に分画した。２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液に浸した菌体を５ｍＭ ＭｇＳＯ４水溶液に浸し、この遠心上清をペリプラズム画分（Ｐｅ）とした。また、その遠心沈殿を再懸濁し、超音波破砕したものをサイトプラズム画分（Ｃｙ）とした。サイトプラズムを分離したことを確認するために、サイトプラズムに存在することが知られているグルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼの活性を指標とした。測定法は１ｍＭ グルコース６燐酸、０．４ｍＭ ＮＡＤＰ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、３０℃の反応溶液の中に適当量の酵素を添加し、３４０ｎｍの吸光度の測定によりＮＡＤＰＨの生成を測定することにより行った。
別途調整した無細胞抽出液の活性を１００％としたときの、サイトプラズム画分、ペリプラズム画分の酵素量を第４図に示す。グルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼ活性がペリプラズム画分に混入していないことは、サイトプラズム画分にペリプラズム画分が混入していないことを示す。Ａｌａ−Ｇｌｎ生成活性のうち約６０％がペリプラズム画分に回収され、上記ＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラムを用いてアミノ酸配列から予測されたように、Ａｌａ−Ｇｌｎ生成酵素がペリプラズムに分泌していることが確認された。
（実施例２３）酵素の基質特異性（１１）
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から調製したＡｌａ−Ｇｌｎ生成活性を有する酵素画分を用いて、さらにその基質特異性を検討した。表１５に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中０．１ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて表１５に示した反応時間で反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１５に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。
Ｈ−Ａｌａ−ＯＭｅ：Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｃｌ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−クロロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−ＮＯ２−Ｐｈｅ−ＯＭｅ：ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ：ｔｅｒｔ−Ｌ−ロイシンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−２−Ｎａｌ−ＯＭｅ：３−（２−ナフチル）−Ｌアラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ａｉｂ−ＯＭｅ：α−アミノイソブチリックアシッドメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ−ＯＭｅ：Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ＣＨＡ−ＯＭｅ：β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＭｅ：Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＭｅ：Ｌ−アスパルチックアシッド β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル α−メチルエステル塩酸塩
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ：Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩
Ｈ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−Ｃｌ−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−ｐ−ＮＯ２−Ｐｈｅ−ＯＨ：ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−ｔ−Ｌｅｕ−ＯＨ：ｔｅｒｔ−Ｌ−ロイシン
Ｈ−２−Ｎａｌ−ＯＨ：３−（２−ナフチル）−Ｌアラニン
Ｈ−Ｇｌｎ−ＯＨ：Ｌ−グルタミン
Ｈ−Ｐｈｅ−ＯＨ：Ｌ−フェニルアラニン
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｌ−アスパルチックアシッド β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン
（実施例２４）酵素の基質特異性（１２）
実施例２３と同じ酵素画分を用い、オリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１６に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素（反応液中に添加したユニット数は表１８に記載）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて３時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１８に示した（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養したスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２０時間振とう培養を行った。この培養液１ｍｌを上記培地（５０ｍｌ／５００ｍＬ坂口フラスコ）に添加し、３０℃、１８時間培養した。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。この菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬを添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて１２０分反応をおこなった。このときのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）の生成量は６２ｍＭであった。
（実施例２６）スフィンゴバクテリウム エスピーからの酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。実施例２５と同様に、スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）によって菌体を集めた。菌体２ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて洗浄後、同緩衝液８ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
（実施例２７）酵素画分を用いたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例２６で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分（約２７Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、１１１ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２２２ｍＭのＬ−グルタミン、１１ｍＭのＥＤＴＡを含む１１１ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９０μｌに加え、２５℃にて１２０分反応した。はこの結果、酵素添加区では、７３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが生成した。一方、酵素無添加区でのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ生成はほとんど認められず、反応１２０分で０．０７ｍＭ程度であった。
（実施例２８）酵素の基質特異性（１３）
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素の基質特異性を検討した。表１７−１から表１７−４に示した終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２６で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１７に示した。（＋印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、ｔｒは微量を示す）。尚、Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを用いた場合には、反応系にＴｗｅｅｎ−８０を終末０．１％になるように添加した。また、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）由来酵素のオリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。表１８に示した、終末１００ｍＭの各種カルボキシ成分と１５０ｍＭの各種アミン成分、実施例２２で精製したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ画分酵素（反応液中０．３３ユニット添加）を含む１０ｍＭのＥＤＴＡ含有１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌの反応液を用い、２５℃にて１．５時間反応した。この反応で生成した各種オリゴペプチドの生産量を表１８に示した。尚、カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はスフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
（１）菌体の取得
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天，ｐＨ７．０））上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター ブレビス ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
本実施例３０（２）で取得したスフィンゴバクテリウム エスピーの染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約３ｋｂのバンドが検出できた。
本実施例３０（２）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＳａｃＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約３ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ＳａｃＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）で３７℃、３０分、５０℃、３０分処理したｐＵＣ１１８とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αのコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを６株確認できた。
（５）スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記６菌株から、エシェリヒア コリ ＤＨ５αが保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した。スフィンゴバクテリウム エスピー由来ペプチド生成酵素は、エンペドバクターブレビス由来ペプチド生成酵素とアミノ酸配列で６３．５％の相同性を示した（ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用）。
（実施例３１）スフィンゴバクテリウム属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
スフィンゴバクテリウム エスピー ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１３、１４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔと命名した。
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を３ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり２．１ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がエシェリヒア コリで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号１２番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ１２，ｎｏ．１，ｐｐ．３−９，１９９９）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２０番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２１番目より下流であると推定された。
（シグナル配列の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液に懸濁した。１９５Ｗにて２０分間超音波破砕処理を行い、超音波破砕処理液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分）し、破砕菌体片を除去することにより可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて予め平衡化したＣＨＴ−ＩＩカラム（バイオラッド製）に供し、５００ｍＭリン酸緩衝液による直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分と５倍量の２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液とを混合した溶液を、２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液にて予め平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ−ＰＨＥカラム（アマシャム社製）に供し、２〜０Ｍ硫酸アンモニウムによる直線的な濃度勾配で酵素を溶出させ、活性画分溶液を得た。これらの操作により、ペプチド生成酵素は電気泳動的に単一に精製されたことが確認された。
上記ペプチド生成酵素をエドマン分解法によりアミノ酸配列を決定したところ、配列番号１５のアミノ酸配列を取得し、ＳｉｇｎａｌＰ ｖ１．１プログラムで予測されたとおり成熟タンパクは２１番目より下流であることが確認された。
本発明により、酵素を用いて簡便にトリペプチドを生成することができる。本発明の方法により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法を軽減し、簡便かつ高収率で安価にペトリペプチド以上のペプチドを製造することができる。
配列番号３；合成プライマー１
配列番号４；合成プライマー２
配列番号５；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号７；ｐＴｒｐＴの調製のための合成プライマー
配列番号８；ｐＴｒｐＴの調製のための合成プライマー
配列番号９；ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２の調製のための合成プライマー
配列番号１０；ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２の調製のための合成プライマー
配列番号１１；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号１３；ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔの調製のための合成プライマー
配列番号１４；ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔの調製のための合成プライマー
配列番号４；合成プライマー２
配列番号５；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号７；ｐＴｒｐＴの調製のための合成プライマー
配列番号８；ｐＴｒｐＴの調製のための合成プライマー
配列番号９；ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２の調製のための合成プライマー
配列番号１０；ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２の調製のための合成プライマー
配列番号１１；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号１３；ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔの調製のための合成プライマー
配列番号１４；ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔの調製のための合成プライマー
【配列表】
Claims (14)
- カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、トリペプチド以上のペプチドを生成することを特徴とする、トリペプチド以上のペプチドの製造方法。
- 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、当該アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
- 前記酵素または酵素含有物が、カルボキシ成分として、アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第１項または第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
- 前記酵素または酵素含有物が、アミン成分として、ジペプチド以上のペプチド、Ｃ保護されたジペプチド以上のペプチド、Ｃ末端分子がアミノ酸ではなくアミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
- 前記酵素が、下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である、特許請求の範囲第１項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質 - 前記酵素が、下記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である、特許請求の範囲第１項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質 - 前記酵素が、下記（Ｅ）または（Ｆ）のタンパク質である、特許請求の範囲第１項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質 - 前記酵素が、下記（Ｇ）または（Ｈ）のタンパク質である、特許請求の範囲第１項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（Ｇ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルボキシ成分とジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、アミン成分よりペプチド結合が一つ多いペプチドを生成する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質 - 前記微生物が、エンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
- 前記微生物が、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２７〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記微生物が、下記（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号１２１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記微生物が、下記（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｅ）配列表の配列番号５に記載の塩基番号のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９０８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記微生物が、下記（ｇ）または（ｈ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第２項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
（ｇ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列のうちの塩基番号６１〜１９１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡ - 前記カルボキシ成分が、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステルおよびＬ−トレオニンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｄ−アラニンエステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項から第１３項のいずれか一項に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。
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