JPWO2003070934A1 - 植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法、および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法に関する。
背景技術
半わい性はイネをはじめとする穀類の最も重要な形質の一つである。イネの半わい性遺伝子sd−1は、「緑の革命」遺伝子としてよく知られており、1960〜1970年代の、とくにアジア地域における穀物の著しい増収に貢献したものである(Futsuhara,Y.and Kikuchi,F.1997,Science of the Rice Plant,vol.3.Matsuo,T.,Futsuhara,Y.,Kikuchi,F.& Yamaguchi,H.(eds.),pp.300−318.Food and Agriculture Policy Research Center,Tokyo.)。元来、中国の品種である低脚烏尖Dee−Geo−Woo−Gen(DGWG)に由来するこの遺伝子は、イネ品種に短く、太い茎をもたらし、収穫量指数を増加させ、冠水への抵抗性と窒素肥料応答性を増し、穂あるいは穀粒に負の影響を与えることなく収量を増加させることができる(Futsuhara,Y.and Kikuchi,F.1997,Science of the Rice Plant,vol.3.Matsuo,T.,Futsuhara,Y.,Kikuchi,F.& Yamaguchi,H.(eds.),pp.300−318.Food and Agriculture Policy Research Center,Tokyo.)。
sd−1遺伝子の導入は従来の育種法により行われてきたが、この遺伝子が非常に重要であることから、遺伝子工学を介した多収品種の育成のためにも該遺伝子の同定が強く望まれてきた。sd−1遺伝子については、第1染色体のいくつかのタンパク質遺伝子座(Cho,Y.G.,Eun,M.Y.,Kim,Y.K.,Chung,T.Y.and Chae,Y.A.1994,The semidwarf gene,sd−1,of rice(Oryza sativa L.).I.Linkage with the esterase locus,Estl−2,Theor.Appl.Genet.,89,49−53.,Nakamura,A.,Hirano,H.and Kikuchi,F.1991,A protein gene Srp(t) linked with a semidwarfing gene sd−1 in rice,Japan.J.Breed.,41,517−521.,Nakamura,A.,Komatsu S.,Xia,B.−S.and Hirano,H.1995,Linkage analysis of the gene Ioci for seed glutelin(Glu−1),semidwarfism(sd−1)and shattering habit(sh−2)in rice(Oryza sativa L.),Breeding Sci.,45,185−188.,Yokoo,M.and Saito,S.1986,Association between grain shattering and semidwarfness in rice,Rice Genetics Newsletter,3,63−65.)およびいくつかの分子マーカー(Cho,Y.G.,Eun,M.Y.,McCouch,S.R.and Chae,Y.A.1994b,The semidwarf gene,sd−1,of rice(Oryza sativa L.).II.Molecular mapping and marker assisted selection,Theor.Appl.Genet.,89,54−59.,Maeda,H.,Ishii,T.,Mori,H.,Kuroda,J.et al.1997,High density molecular map of semidwarfing gene,sd−1,in rice,Breeding Sci.,47,317−320.,Ogi,Y.,Kato,H.,Maruyama,K.,Saito,A.and Kikuchi,F.1993,Identification of RFLP markers closely linked to the semidwarfing gene at the sd−1 locus in rice,Japan.J.Breed.,43,141−146.)に連鎖することが報告されている。しかしながら、これらの研究における遺伝解析の精度は不十分であり、本遺伝子の同定には到っていない。
ポジショナルクローニングは、自然に起こる遺伝的組換えを利用して遺伝子の単離・同定を行う戦略である。有性生殖を行う生物種の染色体上にコードされている観察可能な形質であれば、理論上全てポジショナルクローニングの対象とすることができる。形質遺伝子のポジショナルクローニングを行った例は、アラビドプシス(Lukowitz,W.,Gillmor,C.S.and Scheible,W.R.2000,Positional cloning in Arabidopsis.Why it feels good to have a genome initiative working for you,Plant Physiol.,123,795−805.)、トマト(Alpert,K.B.and Tanksley S.D.1996,High−resolution mapping and isolation of a yeast artificial chromosome contig containing fw2.2:A major fruit weight quantitative trait locus in tomato,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,24,15503−15507.)、およびイネ(Takahashi Y.,Shomura A.,Sasaki T.and Yano M.2001,Hd6,a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensitivity,encodes the alpha subunit of protein kinase CK2,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(14),7922−7927.,Yano,M.,Katayose,Y.,Ashikari,M.2000,Hd1,a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice,is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS,Plant Cell,12,2473−2483.)などの高等植物で報告がある。
ポジショナルクローニングには、大規模な分離集団の解析が必須である。近年、cleaved amplified polymorphic sequence(CAPS)(Konieczny A.and Ausubel F.1993,A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co−dominant ecotype−specific PCR−based markers,Plant J.,4:403−410.)あるいはderived−CAPS(dCAPS)(Neff M.M.,Neff J.D.,Chory J.and Pepper A.E.1998,dCAPS,a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms:experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics,Plant J.,14:387−392.)といったPCRを基盤としたマーカー技術の進展により、多数の植物個体を生育初期のうちに短期間で解析することが可能となった。
また、イネに関して以下のような関連特許が知られている。
・「イネ雑種不稔座S−5座近傍に位置するDNAマーカーおよびこれを用いたS−5座の遺伝子型の判別方法」(特開2000−342267)
・「イネ雑種不稔座近傍に位置するDNAマーカー及びこれを用いた雑種不稔座の遺伝子型の判別方法」(特開2000−342266)
・「イネの穂いもち抵抗性を間接的に識別できる分子マーカー」(特開2000−279170)
・「イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するDNAマーカーおよびこれを用いた細胞質雄性不稔回復遺伝子の判別方法」(特開2000−139465)
・「半矮性遺伝子の近傍に位置するマイクロサテライトマーカーおよびこれを用いた半矮性遺伝子の検定方法」(特開平11−253167)
・「イネのトビイロウンカ抵抗性の検定方法、DNA断片及びPCRマーカー」(特開平11−206376)
・「イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するDNAマーカーおよびDNA診断法」(特開平09−313187)
・「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マーカーと、このマーカーによって得られるイネいもち病抵抗性遺伝子」(特開平07−163371)
・「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マーカーと、このマーカーによって得られるイネいもち病抵抗性遺伝子」(特開平07−163357)
・「イネの開頴角度に関与する染色体領域、該領域を含む栽培イネ及び該領域の識別法」(特開2000−270864)
・「イネのツマグロヨコバイ耐虫性を識別するための方法」(特開平11−103893)
・「イネ縞葉枯病抵抗性を間接的に識別できる分子マーカー」(特開平11−089583)
・「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」(特開平06−113852)
・「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」(特開平06−113851)
発明の開示
本発明の目的は、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法を提供することにある。
本発明者らは、ササニシキ(正常な草丈をもつ日本型イネ品種)・ハバタキ(sd−1に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種)の交配後代集団を用いたポジショナルクローニングにより、イネの半わい性遺伝子sd−1を単離・同定した(Monna et al.,DNA Research(2002)9:11−17)。その過程で、イネ第1染色体上のsd−1周辺部分に、ササニシキ・ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見出した。得られた多型のいくつかについて、CAPSまたはdCAPS法でジェノタイピングが可能となるようマーカー化を行った。次いで、コシヒカリに半わい性形質を導入するモデル実験を行った。その結果、該マーカーを用いることで、イネの半わい性形質を検査できることが明らかになった。
即ち、本発明は、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法に関し、より具体的には、
〔1〕 植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、以下の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法、
(A)配列番号:1に記載の塩基配列の103位、144位、199位、203位、204位、または、347位、
(B)配列番号:2に記載の塩基配列の2位、59位、105/106位、110位、151位、304位、375位、439位、568/569位、577位、604位、614位、616位、1562位、1675〜1676位、1732位、1852位、1878位、1935位、2121位、2125/2126位、2503〜2885位、または、3104位、
(C)配列番号:3に記載の塩基配列の58位、
(D)配列番号:4に記載の塩基配列の86位、または、277〜306位、
(E)配列番号:5に記載の塩基配列の78位、331位、337位、364位、373位、405位、423位、481位、539〜551位、583位、593位、661位、685位、または、701位、
(F)配列番号:6に記載の塩基配列の201〜213位、351位、547位、または、840位、
(G)配列番号:7に記載の塩基配列の103位、221位、または、264位、
(H)配列番号:8に記載の塩基配列の59位、
(I)配列番号:9に記載の塩基配列の288位、301位、または、525〜560位、
(J)配列番号:10に記載の塩基配列の124〜342位、
(K)配列番号:11に記載の塩基配列の223位、または、224/225位、
(L)配列番号:12に記載の塩基配列の314位、
(M)配列番号:13に記載の塩基配列の320位、
(N)配列番号:14に記載の塩基配列の70位、137位、170位、または、691位、
(O)配列番号:15に記載の塩基配列の210位、
(P)配列番号:16に記載の塩基配列の380位、または、405位、
(Q)配列番号:17に記載の塩基配列の43位、84位、139位、143位、144位、または、287位、
(R)配列番号:18に記載の塩基配列の101位、161位、196位、または、653位、
(S)配列番号:19に記載の塩基配列の319/320位、
(T)配列番号:20に記載の塩基配列の214位、670位、または、926位、
(U)配列番号:21に記載の塩基配列の194位、
(V)配列番号:22に記載の塩基配列の170位、
〔2〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)増幅したDNAの塩基配列を決定する工程、
〔3〕 以下の(a)〜(d)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)調製したDNAを制限酵素により切断する工程、
(c)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、
(d)検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する工程、
〔4〕 以下の(a)〜(e)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)増幅したDNAを制限酵素により切断する工程、
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、
(e)検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する工程、
〔5〕 以下の(a)〜(e)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)増幅したDNAを一本鎖に解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程、
〔6〕 以下の(a)〜(f)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の2つを標識したプローブを2種類合成する工程、
(c)工程(a)で調製したDNAに、工程(b)で合成したプローブをハイブリダイズさせる工程、
(d)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(e)レポーター蛍光の発光を検出する工程、
(f)工程(e)で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程、
〔7〕 以下の(a)〜(h)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む3’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程、
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から5’末端側が相補的なプローブを合成する工程、(d)工程(c)で合成したプローブと工程(a)で調製したDNAとハイブリダイズさせる工程、
(e)工程(d)でハイブリダイズしたDNAを一本鎖DNA切断酵素で切断し、工程(b)で合成したプローブの一部を遊離させる工程、
(f)工程(e)で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる工程、
(g)工程(f)でハイブリダイズしたDNAを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する工程、
(h)工程(g)で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、
〔8〕 以下の(a)〜(f)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)増幅したDNAを一本鎖に解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖DNAのうち、片鎖のみを分離する工程、
(e)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より1塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程、
(f)工程(e)で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、
〔9〕 以下の(a)〜(f)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
(d)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、(e)蛍光の偏光度を測定する工程、
(f)工程(e)で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程、
〔10〕 以下の(a)〜(f)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
(d)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、
(e)シーケンサーを利用して、工程(d)で反応に使われた塩基種を判定する工程、
(f)工程(e)で判定された塩基種を対照と比較する工程、
〔11〕 以下の(a)〜(d)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)工程(b)で増幅したDNAを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程、
(d)工程(c)で測定した分子量を対照と比較する工程、
〔12〕 以下の(a)〜(f)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程、
(d)工程(b)のDNAと工程(c)の基板を接触させる工程、
(e)該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程、
(f)工程(e)で検出された強度を対照と比較する工程、
〔13〕 以下の(a)〜(g)の工程を含む、〔1〕に記載の判定方法、
(a)被検植物体からDNAを調製する工程、
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程、
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
(d)工程(c)で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程、
(e)工程(b)のDNAと工程(d)の基板を接触させる工程、
(f)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(d)で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、
(g)スキャナーを用いて、工程(f)で反応に使われた塩基種を判定する工程、
〔14〕 植物がイネである、〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載の判定方法、
〔15〕 植物の半わい性形質の検査方法であって、〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される方法、
〔16〕 植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのPCRプライマーであって、該領域に存在する、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、
〔17〕 植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する、〔1〕に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有する、sd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチド、
〔18〕 植物がイネである、〔16〕または〔17〕に記載のオリゴヌクレオチド、
〔19〕 〔16〕または〔17〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬、
〔20〕 〔16〕または〔17〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の半わい性形質検査用試薬、
〔21〕 植物がイネである、〔19〕または〔20〕に記載の試薬、を提供するものである。
本発明者らは、植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、下記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位の多型を見出した。さらに、これらの多型を検出することにより、植物について半わい性形質の有無を検査することが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいたものである。
(A)配列番号:1に記載の塩基配列の103位、144位、199位、203位、204位、または、347位。
(B)配列番号:2に記載の塩基配列の2位、59位、105/106位、110位、151位、304位、375位、439位、568/569位、577位、604位、614位、616位、1562位、1675〜1676位、1732位、1852位、1878位、1935位、2121位、2125/2126位、2503〜2885位、または、3104位。
(C)配列番号:3に記載の塩基配列の58位。
(D)配列番号:4に記載の塩基配列の86位、または、277〜306位。
(E)配列番号:5に記載の塩基配列の78位、331位、337位、364位、373位、405位、423位、481位、539〜551位、583位、593位、661位、685位、または、701位。
(F)配列番号:6に記載の塩基配列の201〜213位、351位、547位、または、840位。
(G)配列番号:7に記載の塩基配列の103位、221位、または、264位。
(H)配列番号:8に記載の塩基配列の59位。
(I)配列番号:9に記載の塩基配列の288位、301位、または、525〜560位。
(J)配列番号:10に記載の塩基配列の124〜342位。
(K)配列番号:11に記載の塩基配列の223位、または、224/225位。
(L)配列番号:12に記載の塩基配列の314位。
(M)配列番号:13に記載の塩基配列の320位。
(N)配列番号:14に記載の塩基配列の70位、137位、170位、または、691位。
(O)配列番号:15に記載の塩基配列の210位。
(P)配列番号:16に記載の塩基配列の380位、または、405位。
(Q)配列番号:17に記載の塩基配列の43位、84位、139位、143位、144位、または、287位。
(R)配列番号:18に記載の塩基配列の101位、161位、196位、または、653位。
(S)配列番号:19に記載の塩基配列の319/320位。
(T)配列番号:20に記載の塩基配列の214位、670位、または、926位。
(U)配列番号:21に記載の塩基配列の194位。
(V)配列番号:22に記載の塩基配列の170位。
本発明において、「/」は、塩基部位と塩基部位との間を意味する。例えば、上記において「105/106位」とは、105番目の塩基と106番目の塩基との間に塩基が挿入されるような変異(挿入変異)を特徴とする多型部位を表す。
本発明の好ましい態様として、上記の(A)〜(V)に記載の部位の多型は、具体的には、下記(A’)〜(V’)のような変異を示すことができる。
(A’)配列番号:1に記載の塩基配列において、103位の多型はcからt、144位の多型はcからt、199位の多型はgからa、203位の多型はtからc、204位の多型はcからt、347位の多型はcからaへの変異である。(B’)配列番号:2に記載の塩基配列において、2位の多型はaからt、59位の多型はcからg、110位の多型はgからt、151位の多型はtからg、304位の多型はaからt、375位の多型はaからt、439位の多型はgからa、577位の多型はcからt、604位の多型はgからt、614位の多型はcからa、616位の多型はgからa、1562位の多型はtからa、1675〜1676位の多型はggからta、1732位の多型はcからt、1852位の多型はaからg、1878位の多型はgからa、1935位の多型はtからc、2121位の多型はcからg、3104位の多型はcからtへの変異である。なお、3104位のcからtへの変異は、calrose76において検出される変異である。また、105/106位の多型は105位と106位の間のaggの挿入、568/569位の多型は568位と569位の間のatcagggcagagggtttacataaccacacggttatcgtac(配列番号:25)の挿入、2125/2126位の多型は2125位と2126位の間のcaの挿入変異である。さらに、2503〜2885位の多型は2503位から2885位までの383bpの欠失変異である。
(C’)配列番号:3に記載の塩基配列において、58位の多型はaからgへの変異である。
(D’)配列番号:4に記載の塩基配列において、86位の多型はcからt、277〜306位の多型はcttttttctttttttttctttttttttttt(配列番号:26)からcctttttcttttctttctttctttttttt(配列番号:27)への変異である。
(E’)配列番号:5に記載の塩基配列において、78位の多型はaからg、331位の多型はtからc、337位の多型はaからg、364位の多型はcからt、373位の多型はaからg、405位の多型はtからc、423位の多型はgからa、481位の多型はaからg、583位の多型はgからt、593位の多型はtからc、661位の多型はcからg、685位の多型はgからa、701位の多型はaからgへの変異である。また、539〜551位の多型は539位から551位までのcacctgtgatgat(配列番号:28)の欠失変異である。
(F’)配列番号:6に記載の塩基配列において、351位の多型はaからg、547位の多型はaからc、840位の多型はtからaへの変異である。201〜213位の多型は201位から213位までのtgtgaaaattcac(配列番号:29)の欠失変異である。
(G’)配列番号:7に記載の塩基配列において、103位の多型はaからt、221位の多型はtからg、264位の多型はaからgへの変異である。
(H’)配列番号:8に記載の塩基配列において、59位の多型はcからtへの変異である。
(I’)配列番号:9に記載の塩基配列において、288位の多型はaからg、301位の多型はtからc、525〜560位の多型はatgaatからttcattttaccaatatgacacctacatgaaaa(配列番号:30)への変異である。
(J’)配列番号:10に記載の塩基配列において、124〜342位の多型は124位から342位までの219bpの欠失変異である。
(K’)配列番号:11に記載の塩基配列において、223位の多型はcからgへの変異である。また、224/225位の多型は224位と225位の間のatcgの挿入変異である。
(L’)配列番号:12に記載の塩基配列において、314位の多型はtからgへの変異である。
(M’)配列番号:13に記載の塩基配列において、320位の多型はtからgへの変異である。
(N’)配列番号:14に記載の塩基配列において、70位の多型はcからt、137位の多型はgからt、170位の多型はgからt、691位の多型はtからcへの変異である。
(O’)配列番号:15に記載の塩基配列において、210位の多型はaからcへの変異である。
(P’)配列番号:16に記載の塩基配列において、380位の多型はaからg、405位の多型はaからcへの変異である。
(Q’)配列番号:17に記載の塩基配列において、43位の多型はcからt、84位の多型はcからt、139位の多型はgからa、143位の多型はtからc、144位の多型はcからt、287位の多型はcからaへの変異である。
(R’)配列番号:18に記載の塩基配列において、101位の多型はtからc、161位の多型はtからg、196位の多型はtからc、653位の多型はaからgへの変異である。
(S’)配列番号:19に記載の塩基配列において、319/320位の多型は319位と320位の間のgの挿入変異である。
(T’)配列番号:20に記載の塩基配列において、214位の多型はtからc、670位の多型はgからc、926位の多型はtからaへの変異である。
(U’)配列番号:21に記載の塩基配列において、194位の多型はgからaへの変異である。
(V’)配列番号:22に記載の塩基配列において、170位の多型はcからaへの変異である。
本発明は、植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、上記(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法を提供する。
本発明において、上記判定方法を実施することができる植物としては、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ、ジャガイモ、レタス、トマト等を例示することができるが、これらの植物に特に制限されない。
本発明のsd−1遺伝子としては、例えば、イネsd−1遺伝子を挙げることができる。該遺伝子の塩基配列を配列番号:23に、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号:24に記載する。
また、本発明におけるsd−1遺伝子には、上記遺伝子のホモログも含まれる。このような遺伝子は、当業者においては公知の方法、例えば、ハイブリダイゼーション技術(Southern,E.M.et.al.,Journal of Molecular Biology 98:503,1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki,R.K.et.al.,Science 230:1350−1354,1985、Saiki,R.K.et.al.,Science 239:487−491,1988)を利用して、同定することが可能である。例えば、配列番号:23に記載の塩基配列、もしくはその一部をプローブとして用いるハイブリダイゼーション技術、または配列番号:23に記載の塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR技術により、所望の植物から上記の遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することが可能である。
このようなDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示することができる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離したDNAの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。
単離されたDNAが、sd−1遺伝子であるかは、通常、配列の相同性から判定する。配列の相同性は、BLASTn(核酸レベル)やBLASTx(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul,S.F.et.al.,J.Mol.Biol.215:403−410,1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87:2264−2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877,1993)に基づいている。BLASTnによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTxによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic.Acids.Res.25:3389−3402,1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本発明において、sd−1遺伝子周辺領域とは、上記sd−1遺伝子の5’側および3’側の、通常3cM、好ましくは2cM、より好ましくは1cM、最も好ましくは150kbのDNA領域を意味する。
本発明において、多型とは、遺伝学的には、母集団中1%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、1%未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基(時には数千塩基)が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに特に制限はされない。
本発明の遺伝子型判定方法の好ましい態様においては、まず、被検植物体からDNAを調製する。本発明において、被検植物体としては、例えば、上記植物の葉、根、種子、カルス、葉鞘、培養細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、当業者であれば、DNAを上記被検植物体から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。
本方法においては、次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する。本発明において、DNAの増幅方法としては、PCR法が挙げられるが、DNAを増幅できる方法であれば特に制限されない。
本方法においては、次いで、増幅したDNAの塩基配列を決定する。DNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、通常、野生型sd−1遺伝子であり、当業者においては、各種遺伝子データベースまたは文献等から野生型sd−1遺伝子の塩基配列情報を取得することができる。
本発明の遺伝子型判定方法は、上記の如く直接被検植物体由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。例えば、本発明の遺伝子型判定方法は、以下のような方法によって行うことも可能である。
まず、被検植物体からDNAを調製する。次いで、調製したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検植物体からDNAを調製する。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または、該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法やPCR−RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて当業者においては適宜選択することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
該方法としては、例えばPCR−SSCP(single−strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction−single−strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11.Genomics.1992 Jan 1;12(1):139−146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single−strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene.1991 Aug 1;6(8):1313−1318.、Multiple fluorescence−based PCR−SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl.1995 Apr 1;4(5):275−282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量(5から10%程度)のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温(20から25℃)で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の2つを標識したプローブを2種類合成する(工程(b))。次いで、工程(a)で調製したDNAに、工程(b)で合成したプローブをハイブリダイズさせる(工程(c))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(d))。次いで、レポーター蛍光の発光を検出する(工程(e))。次いで、工程(e)で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する(工程(f))。
上記方法としては、TaqMan PCR法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p94−105、Genet Anal.(1999)14:143−149)等を挙げることができる。具体的には、まず、プローブの5’末端にレポーター蛍光を標識する。本発明において、レポーター蛍光としては、FAMやVICなどが例示できるが、これらに限定されない。さらに、上記プローブの3’末端にクエンチャー蛍光を標識する。本発明において、クエンチャー蛍光としては、レポーター蛍光を消光できる物質であれば特に制限されない。次いで、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したプローブを、調製したDNAにハイブリダイズさせる。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを、5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて増幅する。その結果、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したプローブのレポーター蛍光標識部分が切断され、レポーター蛍光が遊離する。本発明において、5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとしては、好適にはTaqDNAポリメラーゼが例示できるが、これに限定されるものではない。本方法においては、次いで、遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む3’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する(工程(b))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から5’末端側が相補的なプローブを合成する(工程(c))。次いで、工程(c)で合成したプローブと工程(a)で調製したDNAとハイブリダイズさせる(工程(d))。次いで、工程(d)でハイブリダイズしたDNAを一本鎖DNA切断酵素で切断し、工程(b)で合成したプローブの一部を遊離させる(工程(e))。本発明において、一本鎖DNA切断酵素としては、特に制限はなく、例えば下記のcleavaseが例示できる。本方法においては、次いで、工程(e)で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる(工程(f))。次いで、工程(f)でハイブリダイズしたDNAを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する(工程(g))。次いで、工程(g)で測定した蛍光の強度を対照と比較する(工程(h))。
上記方法としては、例えば、Invader法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p94−105、Genome Research(2000)10:330−343)等が挙げられる。具体的には、まず、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から3’側が鋳型と相補的な配列であり、5’側が鋳型配列と無関係な配列(フラップ)を有するプローブ(プローブA)を合成する。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から5’側が鋳型と相補的な配列を有するプローブ(プローブB)を合成する。プローブBにおいては、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応する塩基は任意でよい。次いで、これらプローブを調製した鋳型DNAにハイブリダイズさせる。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応するプローブBの塩基が侵入することで、5’末端がフラップ状になっている部分を認識して、該部位に対応するプローブAの塩基の3’側を切断するエンドヌクレアーゼ(cleavase)を用いてハイブリダイズしたDNAを切断する。これにより、フラップ部分が遊離する。次いで、遊離したフラップ部分と検出用プローブをハイブリダイズさせる。該検出用プローブは、一般的にfluorescence resonance energy transfer(FRET)プローブとよばれる。該プローブにおいて、5’側は自身で相補的に結合できる。また、3’側はフラップと相補的な配列を有している。また、自身で相補的に結合できる5’側において、5’末端にはレポーター蛍光が標識され、該5’末端の3’側にはクエンチャー蛍光が標識されている。遊離したフラップの3’末端の塩基が、FRETプローブにハイブリダイズする結果、該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵入することで、cleavaseが認識する構造が生成される。本方法においては、cleavaseによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、増幅したDNAを一本鎖に解離させる(工程(c))。次いで、解離させた一本鎖DNAのうち、片鎖のみを分離する(工程(d))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より1塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する(工程(e))。次いで、工程(e)で測定した蛍光の強度を対照と比較する(工程(f))。このような方法としては、例えば、Pyrosequencing法(Anal.Biochem.(2000)10:103−110)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する(工程(c))。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う(工程(d))。次いで、蛍光の偏光度を測定する(工程(e))。次いで、工程(e)で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する(工程(f))。このような方法としては、例えば、AcycloPrime法(Chen,X.,Levine,L.,and Kwok,P.Y.1999,Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis,Genome Res.,9,492−98.)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する(工程(c))。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う(工程(d))。次いで、シーケンサーを利用して、工程(d)で反応に使われた塩基種を判定する(工程(e))。次いで、工程(e)で判定された塩基種を対照と比較する(工程(f))。このような方法として、例えば、SNuPe法(Rapid Commun Mass Spectrom.(2000)14:950−959)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する(工程(c))。次いで、工程(c)で合成したプライマーが固定された基板を提供する(工程(d))。次いで、工程(b)のDNAと工程(d)の基板を接触させる(工程(e))。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(d)で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う(工程(f))、次いで、スキャナーを用いて、工程(f)で反応に使われた塩基種を判定する(工程(g))。このような方法としては、Arrayed Primer Extension(APEX)法(Clinical Chemistry(2002)48:2051−2054)などが挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、工程(b)で増幅したDNAを質量分析器にかけ、分子量を測定する(工程(c))。次いで、工程(c)で測定した分子量を対照と比較する(工程(d))。このような方法としては、例えば、MALDI−TOF MS法(Trends Biotechnol(2000):18:77−84)等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からDNAを調製する(工程(a))。次いで、sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する(工程(b))。次いで、ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する(工程(c))。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non−porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレンを使用することができる。
本発明において、ヌクレオチドの固定(アレイ)方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術(Affymetrix社)、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。
本方法においては、次いで、工程(b)のDNAと工程(c)の基板を接触させる(工程(d))。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNAをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本方法においては、次いで、該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する(工程(e))。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、次いで、工程(e)で検出された強度を対照と比較する(工程(f))。
このような方法としては、例えば、DNAアレイ法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128−135、Nature Genetics(1999)22:164−167)等が挙げられる。
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとDNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
本発明においては、上記の遺伝子型判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される。本発明は、このような植物の半わい性形質の検査方法も提供する。
また、本発明は、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのPCRプライマーであって、該領域に存在する、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供する。
このようなオリゴヌクレオチドとしては、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を挟むように設計されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。PCRプライマーの設計および合成については、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。また、PCRプライマーの長さは、特に制限はないが、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。
さらに本発明は、植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有する、sd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明においては、該オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。
該オリゴヌクレオチドは、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件)において、他のDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、上記の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域に対し、完全に相補的である必要はない。該オリゴヌクレオチドの長さは、15ヌクレオチド以上であれば、特に制限はない。該オリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。また、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
また、該オリゴヌクレオチドは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5’端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法(ランダムプライム法等)を例示することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬として使用することができる。さらに、植物の半わい性形質検査用試薬としても使用することができる。本発明においては、このような植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬または植物の半わい性形質検査用試薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] sd−1遺伝子周辺の多型の同定
本発明者らは、ササニシキ(正常な草丈をもつ日本型イネ品種)・ハバタキ(sd−1に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種)の交配後代集団を用いたポジショナルクローニングにより、イネの半わい性遺伝子sd−1の単離・同定を試みた。その結果、sd−1遺伝子は、ジベレリン−20−オキシダーゼ(GA20−ox)をコードしている遺伝子であることが判明した(Monna et al.,DNA Research(2002)9:11−17)。GA20−oxとは、ジベレリン(GA)の生合成経路においてC−20位の酸化とそれに続く脱離を触媒する酵素であり、活性型GA合成の最終段階を触媒するGA3β−hydroxylase(GA3ox)に基質を供給する酵素である(Hedden,P.and Phillips A.L.2000,Gibberellin metabolism:new insights revealed by the genes,Trends in Plant Science(review),5(12),523−530.)。すでに、アラビドプシス(Coles,J.P.,Phillips,A.L.,Croker,J.,Garcia−Lepe,R.,Lewis,M.J.and Hedden,P.1999,Moddification of gibberellin production and plant development in Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin 20−oxidase genes,Plant J.,17(5),547−556.)、Solanum dulcamara(Curtis,I.S.Ward,D.A.,Thomas,S.G.,Phillips,A.L.et al.2000,Induction of dwarfism in transgenic Solanum dulcamara by overexpression of a gibberellin 20−oxidase cDNA from pumpkin,Plant J.,23(3),329−338.)、ジャガイモ(Carrera,E.,Bou,J.,Garcia−Martinez,J.L.and Prat,S.2000,Changes in GA 20−oxidase gene expression strongly affect stem length,tuber induction and tuber yield of potato plants,Plant J.,22(3),247−256.)、およびレタス(Niki,T.Nishijima,T.,Nakayama,M.et al.2001,Production of dwarf lettuce by over−expressing a pumpkin gibberellin 20−oxidase gene,Plant Physiol.,42(7),694−702.)において、GA20−ox遺伝子のアンチセンス導入または過剰発現によって半わい性植物を作出することに成功したという報告がなされている。従って、イネのsd−1座に存在するGA20−ox遺伝子およびその変異型遺伝子は、収量が低いが商品価値の高い既存の品種への高収量性付与に、直接利用することができると考えられる。
本発明者らは、sd−1遺伝子を単離・同定する過程で、イネ第1染色体上のsd−1周辺部分に、ササニシキ・ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見出した。具体的には、下記のようにして行った。
イネ品種ササニシキおよびハバタキを圃場または温室で栽培し、CTAB法または簡易抽出法によりDNAを抽出した。Rice Genome Research Programのホームページ(http://rgp.dna.affrc.go.jp/)上で公開されているイネゲノムシーケンス情報、およびDDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)に登録されているシーケンスデータを利用し、プライマー設計支援サイトPrimer3(http://www−genome.wi.mit.edu/cgi−bin/primer/primer3_www.cgi)で、ゲノムDNAから適当な長さの断片を増幅するプライマーを設計した。具体的には、DDBJのアクセッションナンバーAC090974で登録されているイネゲノムDNA塩基配列(OSJNBa0029f02、139043bp)、AP003405で登録されているイネゲノム塩基配列(B1027B04、168033bp)、AU058082で登録されているイネcDNA塩基配列E30867、AU101358で登録されているイネcDNA塩基配列E11764、AU095374で登録されているイネcDNA塩基配列E61578、D25461で登録されているイネゲノムDNA塩基配列L543、D47675、AU089730で登録されているイネcDNA塩基配列S13312、D46277で登録されているイネcDNA塩基配列S10846、AU089695、AU089696で登録されているイネcDNA塩基配列C1439、AU101337で登録されているイネcDNA塩基配列E11055、D47784で登録されているイネcDNA塩基配列S13471、C22379、C22380で登録されているイネcDNA塩基配列C12740をもとに、500〜1000bpを増幅するPCRプライマーを多数設定した。設計したプライマーを用いて、ササニシキおよびハバタキのゲノムDNAを鋳型として、AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)またはHotStar Taq(QIAGEN)を用いてPCR増幅を行った。反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行い増幅断片を確認した後、残りの反応液をExoSAP−IT(USB)処理して未反応のプライマーとdNTPを取り除き、シークエンス反応の鋳型を作成した。
この鋳型に対して、最初の増幅に用いたプライマーの片方をシーケンス用プライマーとして再度添加し、DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBACE(アマシャムバイオサイエンス)を用いてサイクルシークエンス反応を行い、シークエンス用サンプルを作成した。シーケンスは、MegaBACE1000(アマシャムバイオサイエンス)を用いて行った。得られたシーケンスデータをハバタキ・ササニシキで比較し、一塩基置換多型を含む多型を検索した。同一品種、同一プライマー対に対し少なくとも4回のシーケンスを行い、確実であるもののみを多型と判定した。得られた多型のいくつかについて、CAPSまたはdCAPS法でジェノタイピングが可能となるようマーカー化を行った(図1および2)。表1に、本発明により見出されたSNP部位を利用したPCRマーカー、CAPSマーカー、dCAPSマーカー、およびSNPマーカー(AcycloPrime−FP反応(Chen,X.,Levine,L.,and Kwok,P.Y.1999,Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis,Genome Res.,9,492−98.)に使用するためのマーカー)の一覧を示す。
表1は、左から、マーカー名(図1および図2に位置を示す)、利用したSNP部位、プライマー配列、増幅断片長、制限酵素(CAPS、dCAPSの場合のみ)、および多型の出方を示す。なお、Hはハバタキ、Sはササニシキを示す。
[実施例2] 半わい性形質とsd−1遺伝子周辺の多型の関連
本発明によるDNAマーカー(表1)を用いて、ササニシキに半わい性形質を導入するモデル実験を行った。ササニシキは、やや高い草丈を持つ日本型イネ品種であり、正常型Sd−1遺伝子を持っている。従って、このササニシキにsd−1を導入すれば半わい性形質を付与することが可能であると予想された。
まず、ササニシキとsd−1を持つ半わい性品種IR24を交配し、F1を得た。さらに、このF1にササニシキを交配しBC1F1世代を得た。BC1F1は、理論上染色体全領域の2分の1がササニシキホモ型であり、2分の1がササニシキとIR24のヘテロ型になっている。このBC1F1個体群の中から、CAPSマーカーS10846およびdCAPSマーカーS13312を用いて、sd−1を含む両マーカー間がヘテロ型になっている個体を選抜し、さらにササニシキとの交配(戻し交配)を行い、BC2F1世代を得た(ヘテロの領域は全染色体の4分の1である)。なお、両マーカー間で起こる組換えを考慮して、sd−1遺伝子近傍に設定したマーカーbおよびiを用いて、確実にsd−1領域がヘテロであることの確認も行った。同様にしてsd−1領域がヘテロである個体を選抜し、さらにササニシキとの交配を重ねた。BC1F1からBC2F1→BC3F1→BC4F1と戻し交配を繰り返すごとに、IR24の持つ特徴的な形質は失われ、ササニシキに近い形質を持った個体群となった。これは、S10846/S13312のマーカー間の染色体領域がササニシキとIR24のヘテロ型に維持されたまま、他の染色体領域がササニシキのホモ型に徐々に置換されていっているためであると推測された。BC5F1世代ではIR24の染色体をヘテロで有する領域は理論上全体の32分の1となり、遺伝的背景はほとんどササニシキと同一で、かつ目的の染色体領域のみにIR24型の染色体が導入された準同質遺伝子系統に近い系統が得られていると推測された。実際、BC5F1の自殖種子を展開栽培したところ、草型以外ササニシキと区別のつかない個体群が得られた。
これらの個体から、幼苗期のうちにゲノムDNAを抽出し、マーカーeでsd−1(Sd−1)領域における遺伝子型を決定したところ、sd−1/sd−1ホモ、sd−1/Sd−1ヘテロ、Sd−1/Sd−1ホモの3つに分類された。そして、各個体を出穂・登熟するまで育成を続けてかん長を測定したところ、sd−1/sd−1ホモとなっている個体群ではササニシキに比べて明らかに平均かん長が短縮していることが明らかとなった。よって、上記に示したように、本発明によるマーカーを用いた選抜・交配を繰り返すことで、sd−1由来の半わい性形質を獲得した限りなくササニシキに近い品種が育成できることが確認された。
さらに、得られた個体の中で、sd−1遺伝子周辺の出来るだけ狭い領域のみがIR24ホモ型であり、その他の領域がササニシキホモ型に置換されている個体(系統)を選抜するために、本発明のマーカーを用いてsd−1周辺の遺伝子型を調査した。その結果、表2に示すような遺伝子型を有する個体が1個体得られた(この個体を仮にPGCササニシキとする)。
この結果より、本発明のマーカーを用いることにより、sd−1遺伝子のみを含む非常に限定された染色体領域のみがIR24型である個体を選抜することが可能であることが示された。これは、目的形質の非常に近傍に位置する遺伝子に起因する望ましくない形質が、強い連鎖のために戻し交配を繰り返しても取り除くことができない現象(いわゆる「連鎖のひきずり」)を防ぐために非常に有効である。
PGCササニシキの育成にあたっては、sd−1周辺の遺伝子型をモニタリングしながら世代を進めたが、染色体の他の部分についてIR24の染色体領域がどの程度残っているのかが不明である。そこで、他の染色体領域にほぼ均等に設定された100箇所のSNPマーカーを用いてPGCササニシキのグラフィカルジェノタイプを確認した結果、PGCササニシキは検査した全てのSNP位置においてササニシキホモ型の染色体を有することが確認された。すなわち、PGCササニシキは、sd−1遺伝子を含む非常に限定された染色体領域のみがIR24型であり、その他の染色体領域はササニシキ由来のものである、言い換えれば、ササニシキに半わい性遺伝子のみを導入した品種である。
ササニシキのように草丈が高く倒伏に弱い優良品種に半わい性形質を導入するためには、IR24のような半わい性の系統と交配し、戻し交配を繰り返し、得られた個体を自殖して得られた種子から莫大な数の植物体を育成し、半わい性であってかつササニシキ並の品質・食味を有するものを選抜するという、多大な労力と長い期間を要する作業が必要であった。最近の研究成果により、半わい性遺伝子sd−1が単離同定され、半わい性はジベレリン合成系の酵素であるGA20オキシダーゼの機能欠損に起因することがわかったことから、原品種のもつSd−1遺伝子をアンチセンス遺伝子の導入により機能阻害する方法も可能である。しかし、アンチセンス導入では、内性遺伝子を完全に破壊することはできないため、将来も機能阻害効果が続くことは保証できない。また遺伝子組換植物を食用に栽培することに対する農家や消費者の反発は大きく、品種として受け入れられる可能性が低いため、現在のところ現実的な方法とはいえない。
それに対して、本発明の方法を用いて半わい性品種を育成する方法は、交配・戻し交配を基盤としつつ、必要な個体のみを選抜しながら育成を進めることができるため、科学的根拠に基づいた、無駄なく迅速な半わい性品種育種の手段を提供する。さらに、遺伝子組換えの手法を用いることなく、それと同等以上の効力をもつ品種を育成できるという優位性がある。
[実施例3] 主要イネ品種でのDNAマーカーの有用性検定
実施例1において作成した各種DNAマーカーは、マーカー作成に用いたハバタキおよびササニシキ以外のイネ品種においても広く利用することが可能であると推測された。そこで、日本国での主要イネ品種に対して、本発明のDNAマーカーの有用性を確認する実験を行った。
用いた品種は以下の23品種である。日本晴、ハツシモ、むつほまれ、ゆきの精、きらら397、つがるロマン、五百万石、森のくまさん、ゆめあかり、ハナエチゼン、コシヒカリ、月の光、あきたこまち、朝の光、あいちのかおり、祭り晴、ヒノヒカリ、夢つくし、ひとめぼれ、まなむすめ、ふさおとめ、どんとこい、キヌヒカリ。
各品種の幼苗から簡易抽出法でゲノムDNAを抽出・精製し、ゲノミックPCRの鋳型に供した。具体的には、ゲノムDNA溶液を40ng/μlになるように滅菌ミリQ水で調整し、それを20μlのPCR溶液に1μl添加して、PCRを行った。各マーカーのPCRに用いた条件を表3に示す。
AmpliTaq Goldを用いた場合の条件を以下に示す。
表3中、*1は、AmpliTaq Goldがアプライドバイオシステムズ社、HotStarTaqがQIAGEN社の製品であることを示す。*2は、PCRの温度条件が上記の条件を基本とし、サイクル条件、サイクル数がマーカーにより異なることを示す。*3は、SNP primerを用いた反応が、製造業者推奨の製品プロトコールに従ったものであることを示す。上記の条件はMJリサーチ社製のPTC−225 TETRADおよびアプライドバイオシステムズ社製のGeneAmp PCR System 9700のサーマルサイクラーで至適化したものである。
PCR後のサンプルを各々5μl分取し、2%(w/v)アガロースゲルで電気泳動を行い増幅産物の有無を確認した。優性マーカーに関しては、この時点で適当な濃度のゲルを用いて電気泳動を行い、多型の検出を試みた。CAPSおよびdCAPSマーカーは、サンプル10〜13μlを表1に示した制限酵素で一晩処理した後、適当な濃度のアガロースゲルあるいはNusieve GTGアガロースゲル(BMA社)を用いて電気泳動を行って多型を検出した。SNPマーカーjについては、パーキンエルマー社のアシクロプライムFPキットを用い、添付のプロトコールに従って反応および検出を行った。
その結果、マーカーhにおける一部の品種を除き、すべてのマーカーにおいてハバタキ/ササニシキ間で得られる多型と同様なバンドパターンによる多型が検出された(表4)。ほとんどの品種はササニシキ型の遺伝子型と判定されたが、夢つくし、どんとこい、キヌヒカリにおいてはマーカーS10846以外でハバタキ型の判定結果となった。これは、夢つくし、どんとこいは親系統にキヌヒカリが使われていることから、キヌヒカリに導入されたsd−1を受け継いでいるためと考えられた。以上の結果から、本発明によるDNAマーカーはハバタキ/ササニシキを含む多くのイネ品種におけるsd−1(Sd−1)遺伝子およびその遺伝子周辺領域の遺伝子型判定においても利用可能であることが確認された。表4に主要品種で見られる多型について示す。
表4中、「H」はハバタキ型、「S」はササニシキ型の判定結果を示し、NDは増幅産物が得られなかったことを示す。
産業上の利用の可能性
一塩基置換多型(SNPs)を含む、DNA上の塩基配列の差異は、さまざまなSNPs判定法のみならず、RFLP法、CAPS法など既存の分子遺伝学的手法を用いた遺伝型判定法に利用可能である。半わい性遺伝子sd−1周辺に、正常型品種と半わい性品種との間に見出された塩基配列上の差異は、半わい性形質を有する新品種育成の過程で、交配により生じた雑種個体が半わい性形質を支配する遺伝子を含む染色体断片をどの程度の範囲で有するか、およびその染色体断片がヘテロであるのかホモであるのか、を調べる目的に有用である。通常、半わい性の検定は、イネが出穂・登熟し、穂が垂れた段階でかん長(根元から穂首までの長さ)を計測する必要があるが、SNPsを含む多型を用いたジェノタイピングでは、個体が幼苗のうちにDNAを採取して検査が可能であるため、時間が節約でき、不要な個体の栽培にかかる面積と労力を削減できる。また、かん長測定では困難であるヘテロ型の判定が、当代個体で可能であるという利点もある。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、イネ半わい性遺伝子sd−1近傍領域の遺伝地図(概略)を示す図である。縦線は第1染色体の一部を示す。横線は設定されたマーカーの位置を示す。数字は連鎖距離(単位はセンチモルガン)を示す。矢印でsd−1遺伝子の位置を示す。
図2は、イネ半わい性遺伝子sd−1近傍領域の遺伝地図(詳細)および物理地図を示す図である。横線は第1染色体の一部を示す。縦線、および矢印は設定されたマーカーの位置を示す。図aおよびcにおいて横線の下に表示される数字は、nで示される個体数の分離集団より見出された、各インターバル内で組換えを生じた個体数を示す。図dはsd−1遺伝子の同定に用いた組換え個体の遺伝子型、かん長により判定したsd−1遺伝子のジェノタイプ、およびsd−1遺伝子の候補領域内に予測された遺伝子とその位置を示す。
Claims (21)
- 植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、以下の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法。
(A)配列番号:1に記載の塩基配列の103位、144位、199位、203位、204位、または、347位。
(B)配列番号:2に記載の塩基配列の2位、59位、105/106位、110位、151位、304位、375位、439位、568/569位、577位、604位、614位、616位、1562位、1675〜1676位、1732位、1852位、1878位、1935位、2121位、2125/2126位、2503〜2885位、または、3104位。
(C)配列番号:3に記載の塩基配列の58位。
(D)配列番号:4に記載の塩基配列の86位、または、277〜306位。
(E)配列番号:5に記載の塩基配列の78位、331位、337位、364位、373位、405位、423位、481位、539〜551位、583位、593位、661位、685位、または、701位。
(F)配列番号:6に記載の塩基配列の201〜213位、351位、547位、または、840位。
(G)配列番号:7に記載の塩基配列の103位、221位、または、264位。
(H)配列番号:8に記載の塩基配列の59位。
(I)配列番号:9に記載の塩基配列の288位、301位、または、525〜560位。
(J)配列番号:10に記載の塩基配列の124〜342位。
(K)配列番号:11に記載の塩基配列の223位、または、224/225位。
(L)配列番号:12に記載の塩基配列の314位。
(M)配列番号:13に記載の塩基配列の320位。
(N)配列番号:14に記載の塩基配列の70位、137位、170位、または、691位。
(O)配列番号:15に記載の塩基配列の210位。
(P)配列番号:16に記載の塩基配列の380位、または、405位。
(Q)配列番号:17に記載の塩基配列の43位、84位、139位、143位、144位、または、287位。
(R)配列番号:18に記載の塩基配列の101位、161位、196位、または、653位。
(S)配列番号:19に記載の塩基配列の319/320位。
(T)配列番号:20に記載の塩基配列の214位、670位、または、926位。
(U)配列番号:21に記載の塩基配列の194位。
(V)配列番号:22に記載の塩基配列の170位。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)増幅したDNAの塩基配列を決定する工程 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)調製したDNAを制限酵素により切断する工程
(c)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(d)検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(e)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)増幅したDNAを制限酵素により切断する工程
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(e)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖に解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の2つを標識したプローブを2種類合成する工程
(c)工程(a)で調製したDNAに、工程(b)で合成したプローブをハイブリダイズさせる工程
(d)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(e)レポーター蛍光の発光を検出する工程
(f)工程(e)で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(h)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む3’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から5’末端側が相補的なプローブを合成する工程
(d)工程(c)で合成したプローブと工程(a)で調製したDNAとハイブリダイズさせる工程
(e)工程(d)でハイブリダイズしたDNAを一本鎖DNA切断酵素で切断し、工程(b)で合成したプローブの一部を遊離させる工程
(f)工程(e)で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる工程
(g)工程(f)でハイブリダイズしたDNAを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する工程
(h)工程(g)で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖に解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAのうち、片鎖のみを分離する工程
(e)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より1塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
(f)工程(e)で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
(d)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(e)蛍光の偏光度を測定する工程
(f)工程(e)で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
(d)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(c)で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(e)シーケンサーを利用して、工程(d)で反応に使われた塩基種を判定する工程
(f)工程(e)で判定された塩基種を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)工程(b)で増幅したDNAを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程(d)工程(c)で測定した分子量を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
(d)工程(b)のDNAと工程(c)の基板を接触させる工程
(e)該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
(f)工程(e)で検出された強度を対照と比較する工程 - 以下の(a)〜(g)の工程を含む、請求項1に記載の判定方法。
(a)被検植物体からDNAを調製する工程
(b)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNAを増幅する工程
(c)sd−1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
(d)工程(c)で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程
(e)工程(b)のDNAと工程(d)の基板を接触させる工程
(f)蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程(b)で増幅したDNAを鋳型とし、工程(d)で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
(g)スキャナーを用いて、工程(f)で反応に使われた塩基種を判定する工程 - 植物がイネである、請求項1〜13のいずれかに記載の判定方法。
- 植物の半わい性形質の検査方法であって、請求項1〜14のいずれかに記載の判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される方法。
- 植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのPCRプライマーであって、該領域に存在する、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
- 植物のsd−1遺伝子周辺領域に存在する、請求項1に記載の(A)〜(V)のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むDNA領域とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有する、sd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチド。
- 植物がイネである、請求項16または17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項16または17に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物のsd−1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬。
- 請求項16または17に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の半わい性形質検査用試薬。
- 植物がイネである、請求項19または20に記載の試薬。
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