JPWO2002064165A1 - Ets転写因子又はそれをコードする遺伝子からなる細胞増殖抑制剤 - Google Patents
Ets転写因子又はそれをコードする遺伝子からなる細胞増殖抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002064165A1 JPWO2002064165A1 JP2002563957A JP2002563957A JPWO2002064165A1 JP WO2002064165 A1 JPWO2002064165 A1 JP WO2002064165A1 JP 2002563957 A JP2002563957 A JP 2002563957A JP 2002563957 A JP2002563957 A JP 2002563957A JP WO2002064165 A1 JPWO2002064165 A1 JP WO2002064165A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- mef
- transcription factor
- gene encoding
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
本発明は、ETS転写因子、より詳細にはETS転写因子MEFが強い抗細胞増殖作用、及びMMP産生抑制作用を有することを見出し、ETS転写因子MEF又はそれをコードする遺伝子を用いた新規な細胞増殖抑制剤、より詳細には新規抗腫瘍治療薬ならびに新規抗リュウマチ治療薬を提供する。本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤に関する。また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease、MMP)、より詳細にはMMP−9産生抑制剤、又はIL−8産生抑制剤に関する。
Description
技術分野
本発明者らは、遺伝子転写調節活性を有するETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細には、転写調節タンパク質Myeloid Elf−1 like Factor(以下、MEFまたはMEFタンパク質という)、およびそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質がガン細胞増殖抑制作用、滑膜線維芽細胞増殖抑制作用などの細胞増殖抑制作用を有することを見出した。したがって、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細にはETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子、からなる細胞増殖抑制剤に関する。また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はそれらの作用を調節する物質、より詳細にはETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子又はそれらの作用を調節する物質、からなるマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease、MMP)、より詳細にはMMP−9産生抑制剤、及びIL−8産生抑制剤に関する。また本発明は、これらの作用に基づく細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、及び、これらの有効成分となり得る物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞は秩序ある増殖の後、その増殖は停止する機構を持っている。しかし、ガン細胞は秩序を逸脱し、無限増殖を遂げ、正常組織にまで浸潤し、正常組織の機能を破壊する。従ってこれら逸脱した無限増殖に秩序を提供する、もしくは正常組織への浸潤を抑制することによってその増殖を停止させる−すなわち死滅させることがガンの治療には必要である。
今日までに、シスプラチン、5−フルオロウラシルに代表される抗腫瘍治療薬および放射線療法や外科的切除による抗腫瘍治療法が開発されてきたが、その効果および副作用の面における問題が指摘されている。前者は腫瘍細胞と正常細胞に及ぼす質的な差異が少ないことから、抗腫瘍効果の高いものほど副作用が重篤である。さらに、癌の種類によっては薬剤に対して感受性が異なることから、抗腫瘍治療薬の使用には十分な注意が必要である。また後者は、一時的に腫瘍細胞を選択的に切除または死滅させるため非常に効果が高い治療法である一方、目に見えない腫瘍細胞を標的とする治療が不可能であるため、常に再発の危険性を秘めている。そこで、上記治療法および治療薬に代わり、サイトカイン、細胞周期調節因子、転写因子等をコードする遺伝子を用いた抗腫瘍治療の試みが行われている。
ところで、転写因子は細胞における遺伝子発現を調節するのみならず、分化・増殖を含めた細胞の機能をも調節する。従って、細胞の機能−すなわち無限増殖、正常細胞への浸潤および正常組織の破壊などガン細胞の機能を調節する転写因子を用い遺伝子治療に用いることが可能である。ETS(E26 transforming specific)転写因子群は、ショウジョウバエからヒトまで約50種が報告され、相同性が高い85アミノ酸からなるDNA結合領域を持ち、ETS転写因子群が結合する塩基配列(以下、ETS結合部位という)を共通して認識し、血球系細胞に特異的に発現する遺伝子の発現調節を行うことが知られている。また、ETS転写因子群は遺伝子の発現調節活性を持つのみならず、血球系細胞をはじめ多くの細胞の分化・増殖・機能発現に対する関与が報告されている。癌細胞においても癌細胞の増殖や抑制にETS転写因子が関与しているかもしれない。
単球・マクロファージやリンパ球にのみ発現するETS転写因子PU.1は、DMSO刺激における分化において、白血病細胞に高発現させることによってアポトーシスによる細胞死を誘導することが報告された(Kihara−Negishi et.al.,Int.J.Cancer,76(4),523−530,1998)。さらに、ガン細胞の無限増殖の阻害は、ガン細胞の浸潤転移および血管新生への関与が報告されているマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease、以下MMPという)類の産生分泌、またはその活性を抑制することにより可能である。そして、上記ETS転写因子PU.1が、MMP−1のプロモーター活性を他の転写因子に比べ劇的に抑制することが報告された(Kahari et.al.,Oncogene,14(22),2651−2660,1997)。
発明の開示
本発明は、ETS転写因子、より詳細にはETS転写因子MEFが強い抗細胞増殖作用、MMP産生抑制作用、及びIL−8産生抑制作用を有することを見出し、ETS転写因子MEF又はそれをコードする遺伝子を用いた新規な細胞増殖抑制剤、より詳細には新規抗腫瘍治療薬ならびに新規抗リウマチ治療薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記ETS転写因子に関して鋭意検討した結果、ETS転写因子MEFを安定高発現させたガン細胞は親細胞に対し著明にMMP−9活性が低く、ヌードマウスに移植した際、顕著に腫瘍の増殖を抑制することを見いだした。更に滑膜線維芽細胞の増殖に対して顕著な抑制作用を示した。
すなわち、本発明は以下1〜21に記載の事項を提供する。
1.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤。
2.ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子が、ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子である前記1に記載の細胞増殖抑制剤。
3.ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記1又は2に記載の発現調節剤。
4.ETS転写因子MEFタンパク質が、配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列、又はその1個若しくは2個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記2又は3に記載の細胞増殖抑制剤。
5.ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号2に記載のヌクレオチド配列、若しくはその1又は2以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である前記2又は3に記載の細胞増殖抑制剤。
6.細胞が、上皮細胞である前記1〜5のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
7.細胞が、ガン細胞である前記1〜6のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
8.細胞が、滑膜細胞である前記1〜6のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
9.細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である前記1〜7のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
10.細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である前記1〜6又は前記8のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
11.ETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤、又はIL−8産生抑制剤。
12.MMPが、MMP−9である前記11に記載のMMP産生抑制剤。
13.ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
14.ETS転写因子をコードする遺伝子が、MEFタンパク質をコードする遺伝子である前記13に記載の方法。
15.抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である前記13又は14に記載の方法。
16.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
17.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記16に記載の抗腫瘍剤。
18.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記13〜15のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記16又は17に記載の抗腫瘍剤。
19.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
20.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記19に記載の抗リウマチ剤。
21.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記13〜15のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記19又は20に記載の抗リウマチ剤。
即ち、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物、より詳細には上皮細胞における細胞増殖抑制剤として有用な医薬組成物、当該医薬組成物の有効量を良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を有する患者に投与することからなる細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を治療、予防又は処置する方法、及び、当該医薬組成物を製造するためのETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質の使用に関する。
また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、より詳細には上皮細胞における抗腫瘍剤、又は抗リウマチ剤に関する。
また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤、及びIL−8産生抑制剤に関する。
さらに本発明は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を抑制、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質に関する。
本発明の好ましいETS転写因子又はそれをコードする遺伝子としては、ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が挙げられる。
以下に、本発明について詳細に説明する。
(MEFタンパク質およびMEF遺伝子)
MEFは1996年、Miyazakiらによってヒト巨核球細胞株であるCMKのmRNAから単離されたETS転写因子群に属する663アミノ酸、分子量約100kDaの転写因子である。(Miyazaki,Y.et.al.,Oncogene,13,1721−1729,1996)。本発明者らはすでに、血球系細胞におけるETS転写因子PU.1の機能、すなわち該細胞におけるリゾチームの発現調節を行うごとく、MEFが上皮細胞におけるリゾチームの発現調節を行うことを明らかにした(Kai,H.et.al.,J.Biol.Chem.,274(29),20098−20102,1999)。すなわち、血球系細胞においてPU.1により調節される機能は、上皮細胞においてはETS転写因子MEFにより調節される可能性が示唆される。そこで、上皮細胞系ガン細胞にMEFを安定高発現させ、ヌードマウスに移植した該細胞株におけるアポトーシスの有無、MMP活性、血管新生ならびに腫瘍増殖性について検討した。
まず、細胞増殖抑制活性について検討した。
肺上皮ガン由来細胞株A549、およびMEF高発現細胞株について血清存在下、及び非存在下での細胞増殖活性を試験した結果を第1図に示す。第1図の左側は10%血清(仔ウシ血清)を含有した条件のものを示し、第1図の右側は血清非存在下のものを示す。第1図の白四角印(□)は親細胞のA549株の場合を示し、白菱形印(◇)はMEF高発現細胞株を示す。グラフの縦軸はABSを示し、横軸は培養日数(日)を示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではMEF高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
さらに、正常細胞と癌細胞系におけるMEF発現の制御について検討した。RT−PCR法によりヒト癌細胞と正常細胞のMEFの発現を分析した。結果を第2図に図面に代わる写真で示す。第2図のGAPDHはコントロールとして示したものである。第2図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、NCIH292細胞、およびHela細胞を示す。
この結果、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞において、MEFは非常に多く発現されていた。しかしながら、他の癌細胞においては、GAPDH mRNAの発現量により標準化されたデータに基づけば、MEFの発現量は正常細胞のHEK293細胞と比べて非常に低いか又はほとんど検出できない量であった。
また、エキソン1とプロモータ領域の周辺でCpGリッチ領域が見出されたことから、本発明者らは癌細胞における低い発現量がMEF遺伝子のメチル化によるものであるかどうかを検討した。この領域のメチル化されたCpGを調べるために、A549、Caco−2、NCIH292、およびHela細胞からのゲノムDNAをメチルシトシンに感受性があり、かつそのアイソシゾマー酵素(イソ制限酵素)に抵抗力があるHpaIIおよびMsp Iによって消化した。そして、CpG領域(アイランド)を含有するエキソン1を増幅することができるプライマーを用いてPCRで増幅した。+500から+1500までの領域でメチル化されていたのは、MEFの発現量が少ないA549細胞でのみであり、他の細胞では無かった。DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT−1)がA549細胞で高発現し、DNMT−1のmRNAのアンチセンスがA549細胞の中でのp21の転写活性および細胞の成長を抑制することは既に報告されている[Knoxら,2000年;Milutinovicら,2000年]。
次に、メチルシトシンがHDACと相互作用しているタンパク質MeCP2に結合しているメチル化DNAによって認識されるので[Ngら,1999年]、本発明者らは、A549細胞のMEFの発現における、脱メチル化剤5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−aza−2’deoxycytidine)(5−アザシチジン)及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンA(tricostatin A)の併用効果を検討した。結果を第3図の図面に代わる写真で示す。第3図は第2図と同様に各条件におけるMEFの発現量をRT−PCR法により検定した結果を示している。GAPDHはコントロールとして示したものであり、第3図の上段の左側から、HEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、下段の左側からA549細胞、Caco−2細胞を示す。第3図のDMSOはジメチルスルホキサイドを示し、5−ACは5−アザシチジンを示し、TSAはトリコスタチンAをそれぞれ示す。第3図に示されるように、5−アザシチジン(1μM)およびトリコスタチンA(300nM)の併用(第3図の下段の各細胞の右端)は、A549細胞の中でMEFの発現を明らかに増加させた。しかし、これらの試薬の単独での使用はMEFの発現を僅かに増加させただけである。これらの結果は、メチル化のパターンは、メチル化と脱メチル化の力学的なバランス及びヒストンアセチル化の局在化状態によって維持されるという最近の発見によっても支持されるものである[Cervoniら,2001年]。同様の効果は、Caco−2で観測されるが、HEK293とHela細胞では観測されなかった。HeLa細胞でのMEFの低い発現は、他の未知のメカニズムによるものと考えられる。これは、公知のメチル化依存性の抑制剤MeCP2を欠くHeLa細胞は、MBD2を含む別の経路を使用してサイレンスメチル化遺伝子になると報告されている[Ngら,1999年]ことからも支持される。したがって、これらの知見から、MEF遺伝子のメチル化が少なくともA549細胞とCaco−2細胞におけるMEFの低い発現に関係していることが示されたことになる。
また、MEFが癌抑制遺伝子であるならば、MEF遺伝子高発現はMEFが少ししか発現していないA549細胞の腫瘍形成を抑制することができる。そこで、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の生体外(in vitro)における特性を検討するためにA549細胞の安定なトランスフェクタント(これをクローン71と呼ぶ。)を調製した。このA549細胞の安定なトランスフェクタントはMEFを発現する。
第4図はMEF遺伝子高発現セルラインの生体外(in vitro)における特性を示すもので、第4図の上段は形態学的な状況を図面に代わる写真示したものである。第4図の下段はF−アクチン(F−actin)染色を示す。第4図の左側からA549細胞、MEF遺伝子高発現A549細胞、BB94(10μM)で処理したA549細胞をそれぞれ示す。
この結果、細胞の外観を観察すると、MEF遺伝子高発現細胞は強い細胞−細胞接触を失って形態的変化を誘導した。また、第4図に示されるように、F−アクチンがMEF遺伝子高発現細胞の細胞間の境界に局在化しているのが観察され、これはMEF遺伝子高発現によって機能的な接触点の形成が促進され、細胞の運動性が抑制されたことを示している。また、A549細胞を5−アザシチジン(10μM)を含有する培地で培養したところ、MEF遺伝子高発現細胞と同様の形態学的変化が引き起こされた。さらに、上皮から間葉への転移がE−カドヘリンの欠乏あるいはMMP類の活性化によって引き起こされるとの報告があることから[Llorensら,1998年]、次にMMP類とE−カドヘリンの発現を検討した。第5図の右側はA549細胞及びMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清(conditioned media)におけるMMP−9蛋白質の含有量を抗MMP−9抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果を示し、第5図の左側はMMP−9のゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−zymogrphy)をそれぞれ示す図面に代わる写真である。第5図のウエスタンブロット分析とゼラチンザイモグラフィーに示されるように、MMP−9の発現はMEF遺伝子高発現細胞で減少したが、E−カドヘリンのmRNAレベルは変化しなかった。MEF遺伝子高発現細胞におけるMMP−9の活性の低下を検討するために、A549細胞をMMP阻害剤であるBB94で処理した。第4図に示されるように、BB94(10μM)は典型的な形態学的変化を誘発し、MEF遺伝子高発現細胞のようにな細胞と細胞の境界にF−アクチンの局在を引き起こした。一般に、これらの形態学的変化は浸潤活性の軽減を示している。したがって、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためにマトリゲル浸潤アッセイを行った。実験の概要を第6図に示す。第6図の上の房(chamber)に2.5X105個のA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、およびBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ播種し、24時間後に、8μmのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。細胞の数をコントロール(A549細胞)に対する百分率(%)として第7図に示した。また、各細胞の状況を第8図に図面に代わる写真で示す。第8図の左側からA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、及びBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ示す。第7図及び第8図に示されるように、A549細胞は強力な浸潤作用を示したが、MEF遺伝子高発現細胞はBB94の抑制効果と同程度に低い浸潤作用を示した。
さらに、BB94がMMP類によって誘導される様々な成長因子のプロセッシングの阻止及び/又は抑制による、癌細胞の細胞成長を抑制することが報告されていることから[Bergersら,2000年;Miraら,1999年]、BB94(10μM)によるA549細胞の生体外の細胞成長への影響を検討した。無血清条件におけるMEF遺伝子高発現細胞の細胞成長速度はA549細胞に比べて遅かった。これは、おそらくMMPの阻害による影響である。
以上のことから、MMP−9あるいは他のMMP類の発現の抑制により、MEFが形態学的変化、浸潤作用、および細胞の成長に影響することが示された。
次に、MEFが生体外又は生体内でA549細胞の細胞形質転換と腫瘍発生の活性を抑制するかどうかを検討した。寒天培地におけるコロニーの形成評価により、MEF遺伝子高発現細胞はコロニーを形成しなかったが、A549細胞を形成した。このことは、MEFが悪性腫瘍のマーカーとして知られている足場非依存性増殖を抑制することを示している。
次に、腫瘍形成に対する生体内での影響を検討した。前記のA549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。2ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した結果を第9図に図面に代わる写真で示す。第9図の左側のマウスはA549株を接種したものであり、右側はMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したものである。第9図の矢印部分が腫瘍を示している。投与から2カ月経過して、A549細胞の腫瘍は直径約2cmまで成長したが、MEF遺伝子高発現細胞の腫瘍は0.4cm以上成長しなかった。各腫瘍の大きさをグラフにして第10図に示す。第10図の縦軸は腫瘍の体積(mm3)を示し、左側はA549細胞を示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞を示す。この結果、A549を接種したヌードマウスに比べ、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制されることがわかった。
さらにこれらの株についてMMP産生および活性に対する影響を調べた。A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これらの組織におけるMMPの産生をゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法により検討した。結果を第11図に図面に代わる写真で示す。第11図の上段はゼラチンザイモグラフィーの結果を示し、下段はMMP−9に対する抗体を用いて常法に従いウェスタンブロッティングを行った結果を示す。第11図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子安定高発現細胞株のものであり、各3例ずつ示す。
その結果、MMP−9の活性がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。また、MMP−9の発現がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。
さらに、これらの細胞に対してヘマトキシリン−エオシン(Haematoxilin−eosin(HE))染色を行った。結果を第12図に図面に代わる写真で示す。第12図の上段はHE染色の結果を示し、下段はリゾチームによるものを示す。この結果、A549細胞の腫瘍は不完全に分化していたが、MEF遺伝子高発現細胞の腫瘍は多数の中央内腔を有する腺に十分に分化していた(第12図)。以前に、本発明者らは腺漿液細胞分化のマーカーとしてA549細胞のリゾチームの発現によりMEFがアップレギュレーションされることを示してきた[Kai,1999年]。これによれば、リゾチームの高発現はMEF遺伝子高発現腫瘍の中央内腔のみに見られた(第12図下段)。してみれば、MEFによる上皮細胞の分化の誘導は生体内におけるA549細胞の腫瘍の発生の抑制と関係している。
次に、A549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響を検討した。
即ち、A549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、これを凍結保存し、保存した組織を10μmの薄さの切片を作り、組織標本を作製した。これをHE染色法を用いて染色した結果を、第13図に図面に代わる写真で示す。第13図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)のものである。
この結果、MEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスでは血管新生が顕著に抑制されていることがわかった。
次に、アポトーシスの誘導について検討した。
アポトーシス検出キットを用いて前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。結果を第14図に図面に代わる写真で示す。第14図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)のものである。
その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
さらに、ウサギを用いて膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響を調べた。
日本白色種ウサギ(体重約3kg)から摘出した膝関節滑膜組織よりWerb and Burleigh(1974)の方法に準じてアウトグロース(outgrowth)法により調製した滑膜線維芽細胞を使用して、滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてMTT法により検討した。結果を次の表1に示す。
その結果MEFを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用があることがわかった。
これらの結果から、MEFを遺伝子導入した細胞株はアポトーシスの誘導が観察され、親細胞株と比較し、顕著なMMP産生並びに活性の低下、血管新生の抑制、腫瘍増殖性の抑制が観察された。従って、本発明により、ETS転写因子MEFを疾患に起因する細胞に導入、発現させることにより、優れた細胞増殖抑制効果を発揮することがわかった。
さらに、MEFが腫瘍の脈管形成に影響しているかどうかを検討するために、脈管上皮細胞のマーカーであるCD31の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した。MEF遺伝子高発現腫瘍における中程度及び大きな脈管の数はコントロールに対してそれぞれ75%及び31%も明らかに減少していた。結果を第15図に示す。第15図の縦軸はA549細胞の脈管数に対する相対的な(%)値を示し、横軸は脈管サイズが50mm以上のものと50mm以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はA549細胞のものを示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)のものを示す。
続いて、A549細胞のMEF遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響するかどうかをさらに調べた。実験の概要を第16図に示す。第16図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を播種し、8μmのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
結果を第17図に図面に代わる写真で示す。第17図の左上は無処理の場合を示し、右上はbFGFを添加した場合を示し、左下はA549細胞の培地(media)の場合を示し、右下はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)を示す。この結果をグラフ化したものを第18図に示す。第18図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な(%)移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、bFGFの場合、A549細胞の場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。A549細胞の無血清培養上清(conditioned media)ではヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)の移行が促進され、これに対してMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清では同じ効果はなかった。陽性のコントロールにおいて、塩基性FGF(bFGF)はHUVECsの移行を増加させた(第17図、第18図)。
IGF−1のシグナル系の封鎖によりA549腫瘍における腺分化が誘導されることが報告されている[Jiang,1999年]。様々な成長因子が基質のマトリックス中に見出されており、様々な結合性蛋白質及び細胞外マトリックスに結合している[Bergers,2000年]。MMP類が腫瘍の浸潤だけではなく、VEGFやIGF−1などの様々な成長因子の処理と放出にかかわると報告されている[Bergers,2000年;Mira,1999年]。したがって、MMP類はこれらの成長因子を統合するのに必要であって、そして間接的に腫瘍の成長と脈管形成に関係している。これらの因子がMEFの腫瘍抑制作用に関係していることを確認するために、本発明者らは最初にMMP類の発現と活性に着目した。その理由は、特にA549細胞におけるVEGFとIGF−1の発現がMEF遺伝子高発現によるものでないからである。ゼラチンザイモグラフィーによれば、MEF遺伝子高発現腫瘍ではMMP−9とMMP−2の発現はかなり減少していた。MMP−9のこの結果はウエスタンブロッティング分析と免疫組織化学によっても確認された。MEFはMMP−2の発現を阻害した。etsコンセンサスモチーフを含んでいないと推定されるMMP−2のプロモーターがETS転写因子によって直接制御されていないにもかかわらず、MMP−2の阻害が悪性腫瘍の抑制に大きな寄与をしている。この理由のひとつはMMP−2単独の抑制が腫瘍発生における脈管前の状態(prevascular)から脈管への転移を阻害し、次いで腫瘍の成長を阻害するという知見に基づくものである。
脈管形成は血管内皮細胞の増殖と移動で引き起こされ、そしてA549細胞の場合には脈管形成因子により促進される。IL−8は強力な脈管形成因子である[Arenberg,1996年]。最近、PEA3がIL−8の誘発により腫瘍の脈管形成に関係していることが報告された[Arenberg,1996年]。そこで、MEFがIL−8の発現を阻害することにより腫瘍の脈管形成を抑制するのかもしれないと考察した。ヌードマウスの腫瘍における免疫組織化学的分析は、IL−8の発現がMEF遺伝子高発現腫瘍の中で減少していることが示された(第19図)。生体外の培養において、IL−8のmRNAの発現はA549細胞との比較においてMEF遺伝子高発現細胞ではかなり減少した(第19図)。第19図はIL−8のmRNAの発現のRT−PCRによる結果を示す図面に代わる写真である。第19図のGAPDHは確認のためのコントロールである。
これらの結果は、MEFがIL−8の転写を抑制することにより、少なくとも一部分において、腫瘍の脈管形成を阻害することを示唆した。
そこで、本発明者らは、MMP−9およびIL−8の転写へのMEFの作用をさらに調べた。MEFがMMP−9とIL−8の転写を直接抑制するかどうか調べるために、本発明者らはMMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った。結果を第20図に示す。第20図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、MEFを1.0μM添加した場合、MEFを3.0μM添加した場合、MEFを5.0μM添加した場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。A549細胞中では、MMP−9とIL−8のプロモーターの高いルシフェラーゼ活性が観察された(第20図)。MEFはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を濃度依存的に減少させた。これに対して、ETS転写因子(ELF−1、ETS−1、PEA3、ESE−1)中のETS−2のみがMMP−9及びIL−8プロモーターのルシフェラーゼ活性を増加させ、そいてETS−2のmRNAのアンチセンスはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を減少させた(第21図)。第21図はMMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第21図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を添加した場合、及びアンチEst−2を添加した場合をそれぞれ示す。
ETS−2によるMMP−9の活性化の発見は、マウスを用いたEts−2のターゲットされた欠失に関する研究によっても支持される[Yamamoto,1998年]。MEFはPU−1と異なって[Kihara−Negishi,2001年]リプレッサー領域を持たないで、かつデアセチラーゼ活性を有するHDACやSin3Aと相互作用をすることから、本発明者らは次にMEFがこれらのプロモーターのets結合部位におけるETS−2とのコンペティターであると仮定した。第22図はEst−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第22図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。また、これらの各々の場合におけるEst−2の発現のウエスタンブロットの結果を第23図に図面に代わる写真で示す。
第22図に示したように、ETS2はMEFの共導入でこれらのプロモーターを活性化しかった。MEFのETSドメインのみが発現する発現ベクターの共導入によってさえもETS2誘発活性は抑制された。プロモーターのets結合部位に結合するETS−2をブロックすることによりプロモータの活性が抑制されるかどうかをさらに検討するために、MMP−9及びIL−2のプロモーターの3つのets結合モチーフ並びに腫瘍発生に重要なサイトカインであるマクロファージコロニー誘起因子(GM−CSF)からなる二本鎖の合成オリゴヌクレオチドによる「おとり型核酸」を作成した。ets結合モチーフを有するこの「おとり型核酸」は、ETS2過発現によって誘発されるプロモータ活性を抑制したが、5’−GGAA−3’が5’−TCAA−3’に変異したets結合モチーフの変異体の「おとり型核酸」は抑制しなかった。前述した知見に基づき、MEF遺伝子の脱メチル化がMMP−9及びIL−8のプロモータ活性を制御するかどうかを確認するために、これらのプロモータ活性における5−アザシチジン(1μM)とトリコサミンA(1μM)の効果を検討した。MMP−9およびIL−8のプロモータ活性は、A549細胞の中で5−アザシチジンとトリコサミン Aによって抑制された。
以上のことから、MEFが癌抑制遺伝子であり、また、これは癌細胞中のメチル化によって下流側で制御されているものであることが示された。
そして、以上のことから、MEFが生体外及び生体内でヒト非小細胞肺のカルシノーマA549細胞の腫瘍形成を抑制することが明らかとなり、これはMMP類とIL−8の双方を抑制することに起因している。その抑制のメカニズムは、MMP類とIL−8のプロモーターの上のets結合部位へのETS−2の結合に競合することである。さらに、いくつかの癌細胞におけるMEFの発現は、MEF遺伝子のエキソン1領域の周囲のCpGアイランドのメチル化によりダウンレギュレーションされている。したがって、MEFがX染色体に局在している新規の癌抑制遺伝子であると考察した。このことは、LOHが卵巣癌と乳癌においてXq25−26.1で見出されるという臨床の場においてよく見られる[Choi,1997年;Choi,1998年]ことによっても強く支持される。MEFによる転写制御が細胞周期のG1ファージを制限する[Miyazaki,2001年]という最近の研究によってもさらに支持される。癌抑制遺伝子としてのMEFが腫瘍の成長を抑制するので、MEFが細胞周期のS期の間不活性にされるのは、理にかなっている。その上、腺分化による癌形成遺伝子であるESE−3[Tugores,2001年]の発現は、MEF遺伝子高発現の腫瘍におけるアップレギュレーションをかなり示した。したがって、MEFには、悪性腫瘍の抑制作用についてESE−3と相乗的な作用があるかもしれない。本発明者らは、最近、GM−CSFが、蛋白質キナーゼCのターゲットであるETS−2によりアップレギュレーションされていることを見出した。そして、このアップレギュレーションはMEFによっても阻害される。この知見もまた、GM−CSFの生産が生体外の侵入性と肺のへん平細胞癌の進行の両方にかかわると報告もあることから[Tsuruta,1998年]、本発明の癌抑制遺伝子としてMEFが作用することが支持される。また、GM−CSFはヒト非肺小細胞癌に誘起効果を持つことができ、さらに、GM−CSFが腫瘍脈管形成のための内皮前駆細胞の移行を活性化するとも報告された[Takahashi,1999年]。
腫瘍の進行には増殖、脈管形成、および転移といった段階があり、各段階は正又は負の調節のバランスによって制御されている。例えば、脈管形成は脈管形成のスイッチによって制御されている。脈管形成のスイッチは、VEGF、MMP類、IL−8、およびbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)などの正の調節のレベルが、トロンボスポンジン−1と、2とエンドスタチンなどの負の調節のレベルよりも高くなることによりスイッチが入れられる[Hanahan,1996年;Bergers,2000年]。腫瘍細胞においては、いくつかのETS転写因子がMMP類やIL−8などの正の調節の転写をアップレギュレートすることが示されている[Iguchi,2000年;Sementchenko,2000年]。さらに、オンコジーン因子群によって活性化されたETS因子群が腫瘍の進行を制御している。
多くの研究者が細胞外性要因が細胞の形質転換にどのように作用するかということに着目してきたが、転写因子などの細胞内因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということは明らかにされていない。同じファミリーにおける転写因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということを見出すために、本発明者らはETS転写因子に着目した。転写因子のETSファミリーは細胞の成長、死滅、および分化における重要な役割を担っている。多くの形質転換関連遺伝子類はETSとAP−1ファミリーの転写因子の双方に対する隣接する結合部位を含んでおり、そのようなエレメントは活性化された個体発生の広い範囲において転写の活性化を調整している[Sharrocks,1997年]。いくつかのETS転写因子がRas−Raf−MEKシグナリング経路の下流側のターゲットであることが知られている[Wasylyk,1998年]。この系路の発癌性の促進は転写活性を活性化し、そして主要な領域におけるトレオニン残基のリン酸化によるETS−1及びETS−2の局所化を変化させる[Yang,1996年;Wasylyk,1997年]。ETS−2は細胞の形質転換の重要なメディエーターとして知られている。なぜならば、ETS−2の優位なネガティブな構造はRas又はHER2による形質転換をブロックすることができるからである[Foos,1998年]。そして、乳癌細胞は、ETS−2のターゲット変異を起こした異形接合マウスとの交尾によって抑制される[Neznanov,1999年]。本発明によって支持されるように、ETS−2はA549細胞におけるMMP−9、およびIL−8のような腫瘍の悪性の因子群を活性化させる。ETS−2によるMMP−9の活性化を見出したことは、マウスのEts−2の標的化欠失に関する研究によっても支持される[Yamamoto,1998年]。したがって、ETS−2の抑制が分子癌腫療法には良い標的であるかもしれない。
最近、いくつかのETS転写因子がMMPsとHER2の転写を抑圧すると報告された[Mavrothalassitis,2000年]。したがって、腫瘍の進行が正又は負のETS因子群のバランスによって制御することが可能である。本発明において、癌細胞の中のMEFとETS−2のバランスが悪性腫瘍を決定する重要な役割を示すことが明らかとなった。いくつかのETS転写因子がRasシグナル伝達によってリン酸化され、核に入り、その結果発癌遺伝子の転写を制御すると示した。しかしながら、ESE−3(ETS転写因子の1種)は、核のタンパク質であり、Rasシグナル伝達による転写を抑制するとの最近の報告もある[Tugores,2001年]。したがって、ESE−3などの核ETS因子群が細胞質のETS因子群に対して負の調節をし、細胞の恒常性を安定化している。血清又は非血清状態で、かつ優位な負のRas及びMEKの存在下において緑色蛍光蛋白質−MEF融合蛋白質を使用することによりMEFの細胞内の局在を決定した。A549細胞には、K−Rasの変異を持っており[Mitchell,1995年]、その結果Ras−MEK−MAPK経路の活性化が生じている。MEFは核で局所化されるのがわかった。ETS−2は非刺激の状態では細胞質と核に局所していた。ETS因子群は細胞の形質転換を制御している。即ち、MEFとESE−3はETS−2のような発癌性ETS転写因子に対する癌抑制物質として作用する。
本発明者らは、以前にMEFはA549細胞においてリゾチームのプロモーターを活性化することを報告した[Kai,1999年]。しかしながら、本発明ではMEFはMMP−9及びIL−8のプロモーターを抑制することが示された。すなわち、MEFによる転写の調節はプロモーターと細胞の状況に依存している。同様に、Fli−1はテナスシン−Cのプロモーターのためのアクチベータとして機能することができ[Shirasaki,1999年]、一方、コラーゲンのプロモーターの状況によってはリプレッサーとして機能している[Czuwara−Ladykowska,2001年]。MEFによるリゾチームのアップレギュレーションに関して、本発明者らは以前に、ウシのリゾチーム遺伝子5Aの近位のプロモーターのets結合部位(−46/−40)に加えて、第二のエレメント(−100/−51)サイトが存在していることを報告してきた[Kai,1996年;Kai,1999年]。このエンハンサーは未だ確認されていないが、MEFはリゾチームの発現を活性化するためにエンハンサー−結合蛋白質との特異的な相互作用を必要としている。いずれにしても、標的プロモーターの状況に依存しているETS因子群の間の相互作用は、遺伝子の抑制と活性化の分子スイッチとして作用しており、逆もまた同様である。
本発明における「おとり型」DNAを使用する癌療法だけではなく、診療所での癌におけるLOH、SNPs、およびMEF遺伝子の後成の(epigenetic)修飾の発見に基づく癌診断に貢献する。
従って本発明は、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、肺癌、大腸癌、子宮癌、腎細胞癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫神経芽細胞種および脳腫瘍、およびこれらが転移したことによる腫瘍に対する抗腫瘍治療薬、並びに抗リウマチ治療薬として有用である。
本発明のETS転写因子としては、ETS結合部位を認識し得る各種の転写因子を挙げられるが、この中でもMEFが好ましい。MEFは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、本発明において使用できるMEFはこのアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、GM−CSF、β−ディフェンシン−1、−2の少なくとも1種の発現を調整し得る活性を有するものであれば良く、好ましくはETS結合部位を認識し得るアミノ酸配列を有するものであればよい。したがって、本発明のMEFとしては配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は2個以上のアミノ酸が置換、又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは1個又は2個以上のアミノ酸が配列番号1に記載のアミノ酸配列に付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、MEFの変異タンパクであり前記活性を有する限り本発明に含まれる。
同様に、本発明のETS転写因子をコードする遺伝子としては、前記した本発明のETS転写因子をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の好ましいETS転写因子をコードする遺伝子としては、前記したMEFをコードする遺伝子が挙げられる。MEFをコードする遺伝子の例を配列表の配列番号2に記載するが、本発明の遺伝子はこの塩基配列を有するものに限定されるものではない。例えば。配列番号2に記載のヌクレオチド配列において、1又は2以上のヌクレオチドが置換、または欠失されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、或いは1又は2以上のヌクレオチドが配列番号2に記載のヌクレオチド配列に付加されたポリヌクレオチドも本発明の遺伝子に包含される。
また、本発明の遺伝子としては前記した塩基配列を有する遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含される。
通常のタンパク質の多くには糖鎖が付加され、アミノ酸を1個若しくは複数個変換することにより糖鎖付加を調節することが出来る。配列番号1に記載のアミノ酸配列において、その糖鎖付加を調節されたポリペプチドも上記活性を有する限り、本発明に包含される。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明に包含される。
さらに本発明は、上皮細胞内のETS転写因子、好ましくはMEFタンパク質あるいはMEF遺伝子の発現を増強するタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質等を用いた疾患治療法もしくは治療薬を包含する。
(遺伝子治療)
本発明は、MEFを治療用ベクターに組み込みこむことにより、先に列挙した様々な疾患に対する遺伝子治療に用いることが可能である。
本発明において、遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、特に限定されていないが、例えば、組換えワクチンウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、HIVウイルス、センダイウイルス等から誘導されるベクターを用いることが出来る。さらに、上記ベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、RNAスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入する。
本発明は、上記ベクターに組み込み、通常の方法により遺伝子治療薬として使用する。すなわち、遺伝子治療を行う場合には、該組み換えウイルスベクターを治療の標的となる細胞に接触させるか、或いはプラスミドベクター等の発現ベクターに挿入し、標的細胞を導入すればよい。このとき遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、リポソーム法、電気穿孔法、DEAE−デキストラン法等、公知の方法により行うことが出来る。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチドおよびその類似体を意味する。従って、この用語が含む第1群は、天然に存在する種、または天然に存在するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された合成種である。ここで、サブユニットに対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またオリゴヌクレオチドの第2の群はその類似体であり、これらは前記オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない部分を有する残基を持つ。これらには、安定性を増加するためのリン酸基、糖部分、3’,5’末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の1つを硫黄に置換したオリゴホスホロチオエート、−CH3に置換したオリゴメチルホスホネート等があげられる。またホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。以上のようなオリゴヌクレオチド類も本発明のアンチセンスDNAと同様な機能を果たす限り、該DNAの誘導体として本発明に包含される。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするmRNAの標的部分は転写開始部位、翻訳開始部位、イントロン・エキソン結合部位または5’キャップ部位であることが好ましいが、mRNAの2次構造を考慮して立体傷害のない部位が選択されるべきである。
(MEFの製造および用途)
本発明のMEFは、配列番号2に記載のDNA、およびベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、RNAスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入した発現ベクターにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換し、各宿主細胞においてMEF遺伝子を発現させ、製造することが可能である。また、本発明に関するDNAに他のタンパク質をコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、MEFの精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、産生するMEFを切り出し、製造することも可能である。
また、配列番号2に記載のDNAの1または2以上のヌクレオチドを変異させたり、これに他のヌクレオチドを付加させたり、3’又は5’側の一部を切断したり、途中の1または2以上のヌクレオチドを除去させたりすることにより、変異したMEFを製造することもできる。
上記目的のために、発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌が挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。代わりに、Sf9等の昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えばCOS細胞、CHO細胞が挙げられる。
上記手法により製造された本発明はMEFを宿主細胞内または細胞外から分離、精製し、使用することが出来る。MEFの分離、精製には、通常のタンパク質に用いられる分離、精製法を使用することが出来る。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせて使用することが出来る。
本発明は、MEFを静脈内投与、患部への局所投与、経口投与等により投与可能である。投与の際、MEFに必要ならば、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、溶解補助剤等の添加物を加えて前記投与に適した製剤とする。
また、本発明は、MEFのアミノ酸配列(配列番号1)のうち、少なくとも5個の連続するアミノ酸を有するオリゴペプチドを認識する抗体を作製することも可能である。具体的には、前記オリゴペプチドを抗原として動物に免役し、生体内にて産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体があり、それぞれの精製方法について当業者に公知である。このようにして得られるいずれの抗MEF抗体もELISA等のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫法等、各種免疫学的測定法を用いるMEFの検出および定量、或いは上述のMEFのカラムによる精製に用いることが出来る。
さらに本発明の有効成分としては、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子のみならず、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質であって生体内又はインヴィトロにおいて結果として前記したと同じ結果をえることができるので、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を用いることもできる。
本発明のETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質としては、生体内又はインヴィトロにおいてETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の発現を調節することができるものであればよく、例えば、これらの発現を調節することができるタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質であってもよい。また、本発明の方法における「作用を調節する」ということは、作用を抑制したり、又は作用を増強するものであり、条件によって両方の作用を有するものであってもよいが、好ましくは抑制するか又は増強するかのどちらか一方の作用を有する物質である。
また、本発明は、これらの物質をスクリーニングする方法を提供する。即ち、本発明は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞ののETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を制剤することがでる物質を提供する。
本発明のETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞としては、天然のETS転写因子をコードする遺伝子を有する細胞をそのまま使用してもよいが、好ましくはETS転写因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに導入し、これを上皮細胞や各種の微生物細胞に導入した形質転換体を用いることができる。この方法に使用される微生物細胞としては、前記した原核生物の宿主細胞や真核微生物の宿主細胞を用いることができる。
本発明のこの方法は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞、又はその周辺に種々の濃度の被検物質を添加して、当該細胞におけるETS転写因子の発現量を測定したり、または細胞増殖の抑制を測定することにより、目的の合致する物質であるか否かを知ることができる。
本発明のこの方法により得られる物質は、細胞、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質であり、細胞増殖を抑制することができ、より具体的には前記した各種の良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの疾患の治療剤、予防剤、又は処置剤と有用な物質である。したがって、本発明はこの方法によって得られる細胞増殖を抑制することができる物質を包含している。
さらに本発明は、この方法よってスクリーニングされた物質を有効成分として含有する治療剤、予防剤、又は処置剤などの医薬組成物、それを用いた良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞増殖を抑制することが必要とされている疾患の治療方法、及び医薬組成物の製造のための使用を包含している。
さらに、本発明は、ETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤又はIL−8産生抑制剤を提供する。MMPとしては、MMP−9が好ましいい。また、IL−8は強力な脈管形成因子である[Arenberg,1996年]ことが知られており、IL−8の産生を抑制することにより脈管形成が抑制されるが、本発明のIL−8産生抑制作用によりIL−8の脈管形成作用のみならずIL−8に起因する各種の作用を抑制できるものと考えられる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。試薬の出所は便宜上のものであり、本発明を限定することを意味しない。
ヒト非小細胞肺癌細胞由来A549、ヒト胎児肝臓由来細胞由来HEK293、ヒト大腸癌由来Caco−2は、ATCC(American Type Culture Collection)より入手した。細胞は、2×105cells/mlとなるように、10%ウシ胎児血清を含むDMEM(100U/mlペニシリン、0.1g/lストレプトマイシンを含む)に懸濁し培養フラスコに播種後、5%CO2、37℃下で経代培養を行った。
実施例1 (MEF遺伝子安定高発現細胞株の作製)
1.ヒト肺上皮由来A549細胞株の培養
ヒト肺上皮由来細胞株A549を、基礎培養液(Dulbecco’s modified Eagle Medium、pH=7.4)に10% FBS(fetal bovine serum)(Hyclone,Lot.No.AGB 6235)、抗生物質(penicillin G(100units/ml)、streptomycin(100μg/ml))を添加した細胞増殖用培養液で、5% CO2、37℃の条件下で静置培養した。
2.遺伝子の調製
MEF cDNAを組み込んだ発現ベクター(pCB6)100μgを制限酵素ApaLIにて制限酵素消化し、直鎖状DNAを調製した。
3.MEF遺伝子の細胞への導入
サブコンフルエント状態(50〜60%)にある細胞をトリプシン消化により回収し、前項記述のDNA(100μg)を含むサイトミックス溶液(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,pH7.6,25mM Hepes,pH7.6,2mM EGTA,pH7.6,5mM MgCl2,2mM ATP,pH7.6;5mM glutathione;pH adjusted with KOH)で懸濁後、それをキュベット(ELECTROPORATION CUVETTES PLUSTM,2mm gap,BTX)に注入して、氷上に10分間静置した。その後、パルス発生装置(ELECTRO CELL MANIPULATOR ECM600,BTX)で電気ショック(500V,1350mF)を与え、再び氷上に10分間静置し、5% CO2、37℃条件下で培養した。なお、用いたDNAの量はUV(260nm)の吸光度より求め、純度85%以上のものを用いた。
4.MEF遺伝子安定高発現株の判定
該細胞が約50%集密的(confluent)になった時点でG418(ナカライテスク)を最終濃度1.0mg/mlとなるよう添加し、さらに1週間培養した。なお、G418は遺伝子導入が行われていない細胞が1週間で死滅する濃度を用いた。1週間後、生存している細胞のコロニーを回収し、各々別の60mmの培養皿(culture dish)にて培養し、G418を用いた選択を再度行った。最後に各々の細胞におけるMEF遺伝子の発現をノーザンブロッティング分析(Northern blotting analysis)およびRT−PCRによって確認し、MEF遺伝子安定高発現細胞株(No.71株)を得た。
実施例2 (細胞増殖抑制活性)
肺上皮ガン由来細胞株A549および実施例1で作製したMEF高発現細胞株を10%血清(仔ウシ血清)を含有、または含有しない培地(ダルベッコ改変イーグル培地)に1x104個/mlとなるように播種し、24時間、37℃、5% CO2下にて培養し、播種後経日的な細胞数をMMT法により測定した。
MMT法は下記のように行った。まず、測定の4時間前の細胞にMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム臭素)のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS(−)溶液)に加えて更に96穴マイクロプレート1ウェルあたり塩酸酸性(0.04N)イソプロパノール100mlおよび3%SDS水溶液20mlを加えて生細胞のミトコンドリアの作用により生成したホルマザンを溶解した後、溶液の595nmの吸光度(対照655nm)を測定した。結果を第1図に示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではMEF高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
実施例3 (腫瘍形成に対する影響)
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株1×106個/100μlをPBS(−)溶液中に懸濁後、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。2ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した。結果を示す写真を第2図に示す。
この結果、A549を接種したヌードマウスに比べ、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制された。
実施例4 (MMP産生および活性に対する影響)
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これに等量の溶菌緩衝液(lysis buffer)(20mM Tris−HCl,0.1MNaCl,0.5%Triton−X,pH7.4)に浸し、4℃にて一夜静置後、上清を回収した。調製した上清をSDSサンプルバッファー(sample buffer)(0.185M Tris−HCl,30%glycerol,6%SDS,pH6.8)と2:1の割合で懸濁し、20mg相当のタンパク質溶液を0.5mg/mlのゼラチンを含む10%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。泳動後、ゲル中に含有のSDSを除去するために洗浄溶緩衝液(washing buffer)(2.5% Triton−X)にて20分間洗浄し、これを3回繰り返した。更にゲル洗浄緩衝液(gel rinse buffer)(50mM Tris−HCl,0.1MNaCl,pH7.4)にて20分間洗浄した。その後、ゲルインキュベーション緩衝液(gel incubation buffer)(50mM Tris−HCl,10mM CaCl2,0.02% NaN3)を用い37℃下、20時間酵素反応を行った。反応後、染色溶液(0.5% CBB−G250,45% methanol,10% acetic acid)にてゲルを染色、更に脱色液(5% methanol,7.5% acetic acid)にてゲルを脱色し、染色像をLas−100(FUJIFILM)を用いて解析した。結果を第3図の上段に示す。
その結果、MMP−9の活性がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
更に、上述の上清20mg相当を10%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った後、MMP−9に対する抗体を用いて常法に従いウエスタンブロッティング分析(Western Blotting Analysis)を行った。結果を第3図の下段に示す。
この結果、MMP−9の発現がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
実施例5 (移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響)
1.腫瘍切片の作製
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、OCT化合物(OCT compound)を用いて、凍結保存した。保存した組織をクリオスタット(cryostat)(LEICA CM 1100)を用いて、組織を10μmの薄さの切片を作り、ポリL−リジンコートしたスライドグラスに貼付した。これを4%パラホルムアルデヒド水溶液に浸し、15分間反応させ組織を固定後、洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返し、組織標本を作製した。
2.ヘマトキシリン−エオシン染色
組織標本をマイヤーヘマトキシリン溶液に3分間浸した後、蒸留水で色出しを行った。更に、0.5%エオシン溶液に1分間浸した後、蒸留水にて洗浄した。その後、脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第4図に示す。その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において血管新生が顕著に抑制された。
実施例6 (アポトーシスの誘導)
アポトーシス検出キット(Apoptosis in situ Detection kit wako(wako))を用い、前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。まず、100倍希釈したTdT反応液100μlを組織標本に添加し、湿潤箱のなかで15分間、37℃にて反応させた。その後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。更に、標本の内因性のペルオキシダーゼを不活性化するために3%H2O2水溶液に5分間作用させた。その後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。更に、POD接合抗体(POD−conjugated antibody)をPBS(−)にて100倍希釈し、100μlを標本に滴下し、湿潤箱のなかで15分間37℃にて反応させた。この後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。次に、DAB溶液100μlをスライドに添加し、室温で5分間反応させた後、メチルグリーン酢酸溶液を用いて標本を対比染色した。その後、標本を後脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第5図に示す。
その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
実施例7 (ウサギ膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響)
日本白色種ウサギ(体重約3kg)から摘出した膝関節滑膜組織よりWerb and Burleigh(1974)の方法に準じてoutgrowth法により調製した滑膜線維芽細胞を使用した。培養液として10%非働化ウシ胎児血清を添加した25mM HEPES,100U/mlのペニシリンGおよび100μg/mlのストレプトマイシン硫酸塩含有MEM(Sigma)(以下、10%FCS/MEM)を用い、5% CO2,95%空気の加湿条件下で37℃に調整されたCO2のインキュベーター中で細胞を増殖させた。継代培養は0.25%トリプシン(trypsin)/0.02%EDTA液を用いて常法に従い行った。第3〜7代の滑膜線維芽細胞を用い、2000cells/0.1ml/wellの細胞密度で96 well plateに継代し、10%FCS/MEM中で、5% CO2、95%空気の加湿条件下で37℃に調整されたCO2のインキュベーター中で培養した。24時間培養後、MEF遺伝子をトランスファクタム(transfectam)を用いて遺伝し導入した。導入24時間後、ヒトリコンビナントインターロイキン−1(5ng/ml)を添加した。その後24〜72時間経過後の滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてMTT法により検討した。結果を前記「表1」に示した。
その結果MEFを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用が観察された。
実施例8 (RT−PCR法)
培養細胞からの全RNAの抽出にはイソゲン(lsogen(ニッポンジーン))を用いて行った。培養細胞の各種遺伝子発現を比較するためにRT−PCRを行った。RT−PCRには、RNA PCR kit(AMV)ver.2.1(TaKaRa)を用いた。本発明において発現を確認した遺伝子について、以下にその方法の概要を示す。
1.MEF
A549およびその他の細胞から抽出した全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側のプライマー(5’−GGAAGACCCCTCTGTGTTCCCAGCTG−3,)および下流側のプライマー(5,−CAGTCTTCTTGGCTCTTTCCTCTCTGG−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル)を行った。
2.IL−8
A549およびMEF遺伝子高発現細胞株より全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側プライマー(5’−ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGCT−3’)および下流側プライマー(5’−TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル)を行った。
3.SE−3
A549およびMEF遺伝子高発現細胞株より全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側プライマー(5’−ACAGACAGCTACTCCACGTGCAATG−3’)および下流側プライマー(5’−CTCGTCTTTCCAGGTGTTCATGATGG−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を30サイクル)を行った。
実施例9 (F−アクチン(F−actin)染色)
ガラスボトムディッシュ(Glass−bottom dish)上で培養した細胞に4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で10分間静置し、細胞を固定した。その後、0.5%トリトンX−PBSで細胞を浸透(permealize)し、PBSで50倍に希釈したローダミンファロイディン(rhaodamine phalloidin(Molecular Probes))を加え、室温で30分間反応させた。
実施例10 (ゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography))
1.無血清培養上清(conditioned media)の調製
細胞培養の前記した方法に従い、サブコンフルエントまで培養した細胞の培養液を、無血清培養に置換し、48時間培養後培養液を回収し、濃縮した。
2.腫瘍溶解産物(tumor lysate)の調製
単離した腫瘍片を1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、ハサミで細片化した。これに溶解緩衝液(20ml Tris−HCl、0.1M NaCl、0.5%トリトンX−100、pH7.4)に懸濁し、氷中で1時間静置した。その後、2000×gの遠心操作により上静を回収して腫瘍溶解産物とした。
3.ゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography)
前記1.及び2.により調製したサンプルとSDSサンプルバッファー(0.185M Tris−HCl、30%グリセリン、6%SDS、pH6.8)を2:1の割合で混合し、チモグラフィー用試料とした。この試料を、0.5mg/mlのゼラチンを含む12.5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後のゲルをゲル洗浄液(2.5% Triton X−100)中で20分間室温で振盪させSDSを除去した。この操作を3回行った後、ゲルリンス緩衝液(50mM Tris−HCl、0.1M NaCl、pH7.4)中で室温で5分間、3回振盪し、トリトンX−100を除去した。その後、ゲルをゲルインキュベーション緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM CaCl2又は10mM EDTA、0.02% NaN3、pH7.4)中で20時間、37℃で振盪しながら、酵素反応を行った。反応後、ゲル染色溶液(0.25%w/v CBB−G250、45%メタノール、10%酢酸)で染色後、ゲル脱色溶液(5%メタノール、7.5%酢酸)で脱色した。
実施例11 (ウエスタンブロッティング(Western blotting))
前記したゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography)で用いた試料を試料とした。試料を12.5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った後、PVDF膜に転写(250mA、1.5時間)した。転写したPVDF膜は5%スキムミルクを含む0.05%ツウィーン20−PGS(PBS−T)中で室温で1時間振盪しマスキングした。その後、PBS−Tで1000倍希釈したヒツジ抗MMP−91gG(Santa Cruz)を用いて室温で1時間振盪し、1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、10,000倍希釈したマウスHRP標識抗ヒツジ抗体(Jackson lmmunoResearch Laboratories,Inc.)を用いて室温で1時間振盪し、2次抗体反応を行った。2次抗体反応後、ECL試薬(Amersham)により抗体反応を検出した。
実施例12 (マトリゲルへの細胞浸潤能の測定)
1.0×106/mlとなるように調製したそれぞれの細胞懸濁液を8μm孔(pore)のマトリゲル浸潤チェンバー(matrigel invasion chamber(BD Biocoat Matrigel))の上層に200μl添加し、無血清の培養液を700μl添加する。24時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきた細胞をヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例13 (細胞増殖率の測定)
細胞増殖率はWSTキット(Dojindo)を用いそのプロトコールに従った。概要を以下に示す。1.0×104個の細胞を24−ウエルのプレートに播き、4日間培養した。0日目と4日目の細胞に、培養液で20倍希釈したWST試薬を加え、2時間反応させた。その後、405nmの吸光度をそれぞれ測定し、4日目の吸光度を0日目の吸光度で割り、細胞増殖率とした。
実施例14 (軟寒天内コロニー形成法)
6−ウエルのプレートに0.5%寒天−DMEM溶液を2ml添加し、室温で固化するまで放置し下層を形成させた。次に、0.33%寒天−DMEM溶液に2.5×104/mlとなるように、それぞれの細胞を混合した混合液2mlを下層の上に添加し、室温で固化させ上層を作製した。さらに、作製した上層の上に培養液を1ml添加し、2週間5%CO2、37℃の条件下で培養した後、形成したコロニーを顕微鏡下で観察した。
実施例15 (免疫組織染色)
1.PECAM−1
作製した組織標本に4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で10分間放置し固定した。次に常法に従いPBS−Tで100倍希釈したラット抗PECAM−1lgG(Parmingen)を添加し、4℃で16時間1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、PBS−Tで100倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットlgG(Vector Laboratories)を用いて、室温で1時間2次抗体反応を行った。対比染色は3%メチルグリーン酢酸溶液で行った。なお血管新生の定量は、倍率200倍の視野をランダムに4視野選択し、50μm以上又は50μm以下の血管数を測定し、平均を求めた。
2.MMP−9
作製した組織標本に4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で10分間放置し固定した。次に常法に従いPBS−Tで150倍希釈したヒツジ抗MMP−9lgG(Santa Cruz)を添加し、4℃で16時間1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、PBS−Tで100倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットlgG(Vector Laboratories)を用いて、室温で1時間2次抗体反応を行った。対比染色は3%メチルグリーン酢酸溶液で行った。
実施例16 (HUVEC の遊走能の測定)
HUVECsが2.5×105個/mlとなるような細胞懸濁液を、8μmの孔を有するマトリゲル浸潤房(matrigel invasion chamber(BD Biocoat Matrigel))の上層に200μl添加した。次に、実施例10の1.に従い調製した無血清培養上清700μlを下層に添加した。24時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきたHUVECsをヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例17 (レポーター遺伝子の調製)
1.MMP−9レポーター遺伝子の調製
細胞におけるMMP−9の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子を用いた。ヒトゲノムDNAを鋳型とし、5’−MMP−9pro(プライマー)、及び3’−MMP−9pro(プライマー)を用い第1回目のPCR(94℃ for 30sec,58℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。さらに得られたPCR産物を鋳型とし、5’−MMP−9pro2(プライマー2)、及び3’−MMP−9pro2(プライマー2)を用い第2回目のPCR(94℃ for 30sec,58℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。得られたPCR産物をPCR2.1(Invitrogen)に挿入した後、KpnIおよびXhoIで制限酵素処理し、pGL2ベーシックベクター(basic vector)のKpnIおよびXhoI部位に挿入した。
2.IL−8レポーター遺伝子の調製
細胞におけるIL−8の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子を用いた。ヒトゲノムDNAを鋳型とし、5’IL−8pro(プライマー)、および3’−IL−8pro(プライマー)を用い第1回目のPCR(94℃ for 30sec,54℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。得られたPCR産物をPCR2.1(Invitrogen)に挿入した後、Hind IIIおよびXhoIで制限酵素処理し、pGL2ベーシックベクター(basic vector)のHind IIIおよびXhoI部位に挿入した。
実施例18 (Ets転写因子たんぱく発現遺伝子の構築)
ヒトMMP−9およびIL−8の転写活性に対する影響を検討するため蛋白発現ベクターとしてpCB6を用いた。Ets転写因子のpCB6へのサブクローニングは以下の様に行い、DNAの塩基配列はサイクルシークエンス(cycle sequence)法を用いて確認した。
1.pCB6/MEF
気道上皮細胞由来の癌細胞株NCI−H292のmRNAよりcDNAを作製し、これを鋳型に5’−MEF(BamH I)、及び3’−MEF(EcoRI)を用いPCR(94℃ for 1min,64℃ for 1min,65℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をオリジナルTAクローニングキット(Original TA Cloning Kit)によりpCR2.1ベクターにクローニングした(pCR2.1/MEF)。このクローンをHind IIIおよびXbaIにより制限酵素処理し、pCB6ベクターのHind IIIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/MEFベクターを得た。
2.pCB6/ESE−1
pCl/ESE−1(Dr.T.A.Libermannより供与)をHind IIIおよびXba Iにより制限酵素処理し、pCB6のHind IIIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/ESE−1ベクターを得た。
3.pCB6/EIf−1
ヒト心臓由来cDNAライブラリーよりクローニングしたpUC118/Elf−1を鋳型に、5’−EIf−1(KpnI)、及び3’−EIf−1(XbaI)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をKpnIおよびXbaIにより制限処理し、pCB6ベクターのKpnIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/EIf−1ベクターを得た。
4.pCB6/Ets−1
pBluescrIpt/Ets−1(Dr.D.K.Watsonより供与)を鋳型にし、5’−ets1(Bgl II)、及び3’−ets1(Hind III)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をBgl IIおよびHind IIIにより制限処理し、pCB6ベクターのBgl IIおよびHind III部位に挿入して、pCB6/Ets−1ベクターを得た。
5.pCB6/Ets−2
pBluescript/Ets−2(Dr.D.K.Watsonより供与)5’−ets2(Bgl II)、及び3’−ets2(Hind III)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をBgI IIIおよびHind IIIにより制限処理し、pCB6ベクターのBgl IIおよびHind III部位に挿入して、pCB6/Ets−2ベクターを得た。
6.pCB6/PEA3
pGEM/PEA3(Dr.J.A.Hasselより供与)をXbaIにより制限酵素処理し、pCBベクターのXbaI部位に挿入して、pCB6/PEA3ベクターを得た。
7.pCB6/アンチセンスMEF
pCB6/MEFプラスミドをEcoRIおよびBamH Iで制限酵素処理し、て得られた約2kbpのDNA断片を精製後、再び連結反応を行った。得られたプラスミドを制限酵素処理することにより、インサートの方向を確認し、MEF cDNAがアンチ−センス方向に導入された目的のプラスミドDNAを得た。
8.pCB6/アンチセンスESE−1
pCl/ESE−1(Dr.T.A.Libermannより供与)をHind IIIおよびKpnIにより制限酵素処理し、pCB6ベクターのHind IIIおよびKpnI部位に挿入して、pCB6/アンチセンスESE−1ベクターを得た。
実施例19 (レポーター道伝子の細胞内へ導入およびプロモーター活性の測定)
(1)レポーター遺伝子および蛋白発現遺伝子の細胞内への導入
細胞へのDNAの導入は、トランスフェクタム(Transfectam)ならびにLT1を用い、そのプロトコールに従った。以下にその方法の概要を示す。
1.トランスフェクタム(Transfectam)
レポーターブラスミドDNA500ng、蛋白発現用ブラスミドDNA0.5μg−5.0μgと、トランスフェクタム(Transfectam)溶液2μl−10μlを混合し、全量をDMEMにて150μlとした。この混合液を室温にて10分間反応後、24ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、pRL−CMVベクター(10ng/well)を共導入(cotransfection)した。2時間、37℃にて培養後、10%FBS+DMEMを新たに0.5ml加えて、導入した。
2.LT1
オプティ−メン(Opti−MEM)50μlとLT1の1−6μlを混合し、室温で10分間静置した。この混合液をレポーターブラスミドDNA500ng、蛋白発現用ブラスミドDNA0.5μg−5.0μgを含むDNA溶液に添加して、10分間反応させた。その後、24ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、pRL−CMVベクター(10ng/well)を共導入(cotransfection)した。なお、プラスミドDNAのサンプルの量はUV(260nM)の吸光度より求め、純度85%以上のものを用いた。
(2)プロモーター活性の測定
レポーター遺伝子を導入した細胞におけるプロモーター活性は、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(dual−luciferase reporter assay system(Promega))を用いて測定した。48時間培養した細胞から、培地を除き、冷PBS(−)にて2回洗浄し、100μlの細胞溶解液を加え、室温にて15分間穏やかに振盪させた。その後、細胞溶解液を回収し、この溶液20μlと発光基質液100μlを室温で混和し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター(Lumat LB9507,eg & g berthtold)にて測定した。
産業上の利用可能性
本発明は、ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子、好ましくはETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、細胞増殖抑制剤、又はMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤として有効であることを開示するものである。本発明の細胞増殖抑制剤、又はMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤若しくはIL−8産生抑制剤は、悪性腫瘍、すなわち小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、大腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫に対する抗腫瘍治療法および抗腫瘍治療薬、さらに抗リウマチ治療薬として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図はMTT法を用いて血清存在下、非存在下におけるヒト肺上皮由来細胞株A549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)における細胞増殖活性を示す図である。
第2図は、RT−PCR法によりヒト癌細胞と正常細胞のMEFの発現を分析した結果を示す図面に代わる写真である。第2図のGAPDHはコントロールとして示したものである。第2図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、NCIH292細胞、およびHela細胞を示す。
第3図は、RT−PCR法によるヒト癌細胞と正常細胞におけるMEFの発現の脱メチル化剤5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AC)及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンA(TSA)の併用効果を検討した結果を示す図面に代わる写真である。GAPDHはコントロールとして示したものであり、第3図の上段の左側から、HEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、下段の左側からA549細胞、Caco−2細胞を示す。第3図のDMSOはジメチルスルホキサイドを示す。
第4図は、MEF遺伝子高発現セルライン(クローン71)の生体外における特性を示す図面に代わる写真である。第4図の上段は形態学的な状況を示し、第4図の下段はF−アクチン(F−actin)染色を示す。第4図の左側からA549細胞、MEF遺伝子高発現A549細胞、BB94(10μM)で処理したA549細胞をそれぞれ示す。
第5図は、A549細胞及びMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清におけるMMP−9蛋白質の含有量を抗MMP−9抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果(第5図右側)、及びMMP−9のゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−zymogrphy)の結果(第5図左側)をそれぞれ示す図面に代わる写真である。
第6図は、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためのマトリゲル浸潤アッセイの実験の概要を図示したものである。第6図の上の房(chamber)にA549細胞(第6図左側)、MEF遺伝子高発現細胞(第6図中央)、およびBB94によって処理されたA549細胞(第6図右側)をそれぞれ播種し、24時間後に8μmのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。
第7図は、第6図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の細胞の数をコントロール(A549細胞)に対する百分率(%)として示した図である。
第8図は、第6図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の各細胞の状況を示す図面に代わる写真である。第8図の左側からA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、及びBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ示す。
第9図はヌードマウスの背部皮下にヒト肺上皮由来細胞株A549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種後2ヶ月後の腫瘍の形成を示す、図面に代わる写真である。
第10図は、第9図のヌードマウスにおける各腫瘍の大きさをグラフにして示したものである。第10図の縦軸は腫瘍の体積(mm3)を示し、左側はA549細胞を示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞を示す。
第11図は、ゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法を用いて、MEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織におけるMMP−9の産生、活性が抑制されていることを示す、図面に代わる写真である。
第12図は、第9図のヌードマウスにおける各腫瘍細胞のHE染色(第12図上段)の結果、及びリゾチームによるもの(第12図下段)を示す図面に代わる写真である。
第13図は、HE染色法を用いてA549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織の形態学的変化について示す、図面に代わる写真である。
第14図は、TUNEL法を用いてMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織において、アポトーシスが誘導されたことを示す、図面に代わる写真である。
第15図は、CD31の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した結果を示す図である。第15図の縦軸はA549細胞の脈管数に対する相対的な(%)値を示し、横軸は脈管サイズが50mm以上のものと50mm以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はA549細胞のものを示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)のものを示す。
第16図は、A549細胞のMEF遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響についての実験の概要を示すものである。第16図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を播種し、8μmのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
第17図は、第16図に示した実験の結果を示す図面に代わる写真である。第17図の左上は無処理の場合を示し、右上はbFGFを添加した場合を示し、左下はA549細胞の培地(media)の場合を示し、右下はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)を示す。
第18図は、第16図に示した実験の結果をグラフ化したものである。第18図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な(%)移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、bFGFの場合、A549細胞の場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。
第19図は、ヌードマウスの腫瘍におけるIL−8のmRNAの発現のRT−PCRによる結果を示す図面に代わる写真である。第19図のGAPDHは確認のためのコントロールである。
第20図は、MMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第20図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、MEFを1.0μM添加した場合、MEFを3.0μM添加した場合、MEFを5.0μM添加した場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。
第21図は、MMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第21図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を添加した場合、及びアンチEst−2を添加した場合をそれぞれ示す。
第22図は、Est−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第22図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。
第23図は、Est−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイにおけるEst−2の発現のウエスタンブロットの結果を示す図面に代わる写真である。台23図の左からA549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。
本発明者らは、遺伝子転写調節活性を有するETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細には、転写調節タンパク質Myeloid Elf−1 like Factor(以下、MEFまたはMEFタンパク質という)、およびそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質がガン細胞増殖抑制作用、滑膜線維芽細胞増殖抑制作用などの細胞増殖抑制作用を有することを見出した。したがって、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細にはETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子、からなる細胞増殖抑制剤に関する。また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はそれらの作用を調節する物質、より詳細にはETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子又はそれらの作用を調節する物質、からなるマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease、MMP)、より詳細にはMMP−9産生抑制剤、及びIL−8産生抑制剤に関する。また本発明は、これらの作用に基づく細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、及び、これらの有効成分となり得る物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞は秩序ある増殖の後、その増殖は停止する機構を持っている。しかし、ガン細胞は秩序を逸脱し、無限増殖を遂げ、正常組織にまで浸潤し、正常組織の機能を破壊する。従ってこれら逸脱した無限増殖に秩序を提供する、もしくは正常組織への浸潤を抑制することによってその増殖を停止させる−すなわち死滅させることがガンの治療には必要である。
今日までに、シスプラチン、5−フルオロウラシルに代表される抗腫瘍治療薬および放射線療法や外科的切除による抗腫瘍治療法が開発されてきたが、その効果および副作用の面における問題が指摘されている。前者は腫瘍細胞と正常細胞に及ぼす質的な差異が少ないことから、抗腫瘍効果の高いものほど副作用が重篤である。さらに、癌の種類によっては薬剤に対して感受性が異なることから、抗腫瘍治療薬の使用には十分な注意が必要である。また後者は、一時的に腫瘍細胞を選択的に切除または死滅させるため非常に効果が高い治療法である一方、目に見えない腫瘍細胞を標的とする治療が不可能であるため、常に再発の危険性を秘めている。そこで、上記治療法および治療薬に代わり、サイトカイン、細胞周期調節因子、転写因子等をコードする遺伝子を用いた抗腫瘍治療の試みが行われている。
ところで、転写因子は細胞における遺伝子発現を調節するのみならず、分化・増殖を含めた細胞の機能をも調節する。従って、細胞の機能−すなわち無限増殖、正常細胞への浸潤および正常組織の破壊などガン細胞の機能を調節する転写因子を用い遺伝子治療に用いることが可能である。ETS(E26 transforming specific)転写因子群は、ショウジョウバエからヒトまで約50種が報告され、相同性が高い85アミノ酸からなるDNA結合領域を持ち、ETS転写因子群が結合する塩基配列(以下、ETS結合部位という)を共通して認識し、血球系細胞に特異的に発現する遺伝子の発現調節を行うことが知られている。また、ETS転写因子群は遺伝子の発現調節活性を持つのみならず、血球系細胞をはじめ多くの細胞の分化・増殖・機能発現に対する関与が報告されている。癌細胞においても癌細胞の増殖や抑制にETS転写因子が関与しているかもしれない。
単球・マクロファージやリンパ球にのみ発現するETS転写因子PU.1は、DMSO刺激における分化において、白血病細胞に高発現させることによってアポトーシスによる細胞死を誘導することが報告された(Kihara−Negishi et.al.,Int.J.Cancer,76(4),523−530,1998)。さらに、ガン細胞の無限増殖の阻害は、ガン細胞の浸潤転移および血管新生への関与が報告されているマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease、以下MMPという)類の産生分泌、またはその活性を抑制することにより可能である。そして、上記ETS転写因子PU.1が、MMP−1のプロモーター活性を他の転写因子に比べ劇的に抑制することが報告された(Kahari et.al.,Oncogene,14(22),2651−2660,1997)。
発明の開示
本発明は、ETS転写因子、より詳細にはETS転写因子MEFが強い抗細胞増殖作用、MMP産生抑制作用、及びIL−8産生抑制作用を有することを見出し、ETS転写因子MEF又はそれをコードする遺伝子を用いた新規な細胞増殖抑制剤、より詳細には新規抗腫瘍治療薬ならびに新規抗リウマチ治療薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記ETS転写因子に関して鋭意検討した結果、ETS転写因子MEFを安定高発現させたガン細胞は親細胞に対し著明にMMP−9活性が低く、ヌードマウスに移植した際、顕著に腫瘍の増殖を抑制することを見いだした。更に滑膜線維芽細胞の増殖に対して顕著な抑制作用を示した。
すなわち、本発明は以下1〜21に記載の事項を提供する。
1.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤。
2.ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子が、ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子である前記1に記載の細胞増殖抑制剤。
3.ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記1又は2に記載の発現調節剤。
4.ETS転写因子MEFタンパク質が、配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列、又はその1個若しくは2個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記2又は3に記載の細胞増殖抑制剤。
5.ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号2に記載のヌクレオチド配列、若しくはその1又は2以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である前記2又は3に記載の細胞増殖抑制剤。
6.細胞が、上皮細胞である前記1〜5のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
7.細胞が、ガン細胞である前記1〜6のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
8.細胞が、滑膜細胞である前記1〜6のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
9.細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である前記1〜7のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
10.細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である前記1〜6又は前記8のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
11.ETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤、又はIL−8産生抑制剤。
12.MMPが、MMP−9である前記11に記載のMMP産生抑制剤。
13.ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
14.ETS転写因子をコードする遺伝子が、MEFタンパク質をコードする遺伝子である前記13に記載の方法。
15.抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である前記13又は14に記載の方法。
16.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
17.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記16に記載の抗腫瘍剤。
18.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記13〜15のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記16又は17に記載の抗腫瘍剤。
19.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
20.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記19に記載の抗リウマチ剤。
21.ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記13〜15のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記19又は20に記載の抗リウマチ剤。
即ち、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物、より詳細には上皮細胞における細胞増殖抑制剤として有用な医薬組成物、当該医薬組成物の有効量を良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を有する患者に投与することからなる細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を治療、予防又は処置する方法、及び、当該医薬組成物を製造するためのETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質の使用に関する。
また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、より詳細には上皮細胞における抗腫瘍剤、又は抗リウマチ剤に関する。
また、本発明は、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤、及びIL−8産生抑制剤に関する。
さらに本発明は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を抑制、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質に関する。
本発明の好ましいETS転写因子又はそれをコードする遺伝子としては、ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が挙げられる。
以下に、本発明について詳細に説明する。
(MEFタンパク質およびMEF遺伝子)
MEFは1996年、Miyazakiらによってヒト巨核球細胞株であるCMKのmRNAから単離されたETS転写因子群に属する663アミノ酸、分子量約100kDaの転写因子である。(Miyazaki,Y.et.al.,Oncogene,13,1721−1729,1996)。本発明者らはすでに、血球系細胞におけるETS転写因子PU.1の機能、すなわち該細胞におけるリゾチームの発現調節を行うごとく、MEFが上皮細胞におけるリゾチームの発現調節を行うことを明らかにした(Kai,H.et.al.,J.Biol.Chem.,274(29),20098−20102,1999)。すなわち、血球系細胞においてPU.1により調節される機能は、上皮細胞においてはETS転写因子MEFにより調節される可能性が示唆される。そこで、上皮細胞系ガン細胞にMEFを安定高発現させ、ヌードマウスに移植した該細胞株におけるアポトーシスの有無、MMP活性、血管新生ならびに腫瘍増殖性について検討した。
まず、細胞増殖抑制活性について検討した。
肺上皮ガン由来細胞株A549、およびMEF高発現細胞株について血清存在下、及び非存在下での細胞増殖活性を試験した結果を第1図に示す。第1図の左側は10%血清(仔ウシ血清)を含有した条件のものを示し、第1図の右側は血清非存在下のものを示す。第1図の白四角印(□)は親細胞のA549株の場合を示し、白菱形印(◇)はMEF高発現細胞株を示す。グラフの縦軸はABSを示し、横軸は培養日数(日)を示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではMEF高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
さらに、正常細胞と癌細胞系におけるMEF発現の制御について検討した。RT−PCR法によりヒト癌細胞と正常細胞のMEFの発現を分析した。結果を第2図に図面に代わる写真で示す。第2図のGAPDHはコントロールとして示したものである。第2図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、NCIH292細胞、およびHela細胞を示す。
この結果、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞において、MEFは非常に多く発現されていた。しかしながら、他の癌細胞においては、GAPDH mRNAの発現量により標準化されたデータに基づけば、MEFの発現量は正常細胞のHEK293細胞と比べて非常に低いか又はほとんど検出できない量であった。
また、エキソン1とプロモータ領域の周辺でCpGリッチ領域が見出されたことから、本発明者らは癌細胞における低い発現量がMEF遺伝子のメチル化によるものであるかどうかを検討した。この領域のメチル化されたCpGを調べるために、A549、Caco−2、NCIH292、およびHela細胞からのゲノムDNAをメチルシトシンに感受性があり、かつそのアイソシゾマー酵素(イソ制限酵素)に抵抗力があるHpaIIおよびMsp Iによって消化した。そして、CpG領域(アイランド)を含有するエキソン1を増幅することができるプライマーを用いてPCRで増幅した。+500から+1500までの領域でメチル化されていたのは、MEFの発現量が少ないA549細胞でのみであり、他の細胞では無かった。DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT−1)がA549細胞で高発現し、DNMT−1のmRNAのアンチセンスがA549細胞の中でのp21の転写活性および細胞の成長を抑制することは既に報告されている[Knoxら,2000年;Milutinovicら,2000年]。
次に、メチルシトシンがHDACと相互作用しているタンパク質MeCP2に結合しているメチル化DNAによって認識されるので[Ngら,1999年]、本発明者らは、A549細胞のMEFの発現における、脱メチル化剤5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−aza−2’deoxycytidine)(5−アザシチジン)及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンA(tricostatin A)の併用効果を検討した。結果を第3図の図面に代わる写真で示す。第3図は第2図と同様に各条件におけるMEFの発現量をRT−PCR法により検定した結果を示している。GAPDHはコントロールとして示したものであり、第3図の上段の左側から、HEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、下段の左側からA549細胞、Caco−2細胞を示す。第3図のDMSOはジメチルスルホキサイドを示し、5−ACは5−アザシチジンを示し、TSAはトリコスタチンAをそれぞれ示す。第3図に示されるように、5−アザシチジン(1μM)およびトリコスタチンA(300nM)の併用(第3図の下段の各細胞の右端)は、A549細胞の中でMEFの発現を明らかに増加させた。しかし、これらの試薬の単独での使用はMEFの発現を僅かに増加させただけである。これらの結果は、メチル化のパターンは、メチル化と脱メチル化の力学的なバランス及びヒストンアセチル化の局在化状態によって維持されるという最近の発見によっても支持されるものである[Cervoniら,2001年]。同様の効果は、Caco−2で観測されるが、HEK293とHela細胞では観測されなかった。HeLa細胞でのMEFの低い発現は、他の未知のメカニズムによるものと考えられる。これは、公知のメチル化依存性の抑制剤MeCP2を欠くHeLa細胞は、MBD2を含む別の経路を使用してサイレンスメチル化遺伝子になると報告されている[Ngら,1999年]ことからも支持される。したがって、これらの知見から、MEF遺伝子のメチル化が少なくともA549細胞とCaco−2細胞におけるMEFの低い発現に関係していることが示されたことになる。
また、MEFが癌抑制遺伝子であるならば、MEF遺伝子高発現はMEFが少ししか発現していないA549細胞の腫瘍形成を抑制することができる。そこで、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の生体外(in vitro)における特性を検討するためにA549細胞の安定なトランスフェクタント(これをクローン71と呼ぶ。)を調製した。このA549細胞の安定なトランスフェクタントはMEFを発現する。
第4図はMEF遺伝子高発現セルラインの生体外(in vitro)における特性を示すもので、第4図の上段は形態学的な状況を図面に代わる写真示したものである。第4図の下段はF−アクチン(F−actin)染色を示す。第4図の左側からA549細胞、MEF遺伝子高発現A549細胞、BB94(10μM)で処理したA549細胞をそれぞれ示す。
この結果、細胞の外観を観察すると、MEF遺伝子高発現細胞は強い細胞−細胞接触を失って形態的変化を誘導した。また、第4図に示されるように、F−アクチンがMEF遺伝子高発現細胞の細胞間の境界に局在化しているのが観察され、これはMEF遺伝子高発現によって機能的な接触点の形成が促進され、細胞の運動性が抑制されたことを示している。また、A549細胞を5−アザシチジン(10μM)を含有する培地で培養したところ、MEF遺伝子高発現細胞と同様の形態学的変化が引き起こされた。さらに、上皮から間葉への転移がE−カドヘリンの欠乏あるいはMMP類の活性化によって引き起こされるとの報告があることから[Llorensら,1998年]、次にMMP類とE−カドヘリンの発現を検討した。第5図の右側はA549細胞及びMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清(conditioned media)におけるMMP−9蛋白質の含有量を抗MMP−9抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果を示し、第5図の左側はMMP−9のゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−zymogrphy)をそれぞれ示す図面に代わる写真である。第5図のウエスタンブロット分析とゼラチンザイモグラフィーに示されるように、MMP−9の発現はMEF遺伝子高発現細胞で減少したが、E−カドヘリンのmRNAレベルは変化しなかった。MEF遺伝子高発現細胞におけるMMP−9の活性の低下を検討するために、A549細胞をMMP阻害剤であるBB94で処理した。第4図に示されるように、BB94(10μM)は典型的な形態学的変化を誘発し、MEF遺伝子高発現細胞のようにな細胞と細胞の境界にF−アクチンの局在を引き起こした。一般に、これらの形態学的変化は浸潤活性の軽減を示している。したがって、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためにマトリゲル浸潤アッセイを行った。実験の概要を第6図に示す。第6図の上の房(chamber)に2.5X105個のA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、およびBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ播種し、24時間後に、8μmのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。細胞の数をコントロール(A549細胞)に対する百分率(%)として第7図に示した。また、各細胞の状況を第8図に図面に代わる写真で示す。第8図の左側からA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、及びBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ示す。第7図及び第8図に示されるように、A549細胞は強力な浸潤作用を示したが、MEF遺伝子高発現細胞はBB94の抑制効果と同程度に低い浸潤作用を示した。
さらに、BB94がMMP類によって誘導される様々な成長因子のプロセッシングの阻止及び/又は抑制による、癌細胞の細胞成長を抑制することが報告されていることから[Bergersら,2000年;Miraら,1999年]、BB94(10μM)によるA549細胞の生体外の細胞成長への影響を検討した。無血清条件におけるMEF遺伝子高発現細胞の細胞成長速度はA549細胞に比べて遅かった。これは、おそらくMMPの阻害による影響である。
以上のことから、MMP−9あるいは他のMMP類の発現の抑制により、MEFが形態学的変化、浸潤作用、および細胞の成長に影響することが示された。
次に、MEFが生体外又は生体内でA549細胞の細胞形質転換と腫瘍発生の活性を抑制するかどうかを検討した。寒天培地におけるコロニーの形成評価により、MEF遺伝子高発現細胞はコロニーを形成しなかったが、A549細胞を形成した。このことは、MEFが悪性腫瘍のマーカーとして知られている足場非依存性増殖を抑制することを示している。
次に、腫瘍形成に対する生体内での影響を検討した。前記のA549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。2ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した結果を第9図に図面に代わる写真で示す。第9図の左側のマウスはA549株を接種したものであり、右側はMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したものである。第9図の矢印部分が腫瘍を示している。投与から2カ月経過して、A549細胞の腫瘍は直径約2cmまで成長したが、MEF遺伝子高発現細胞の腫瘍は0.4cm以上成長しなかった。各腫瘍の大きさをグラフにして第10図に示す。第10図の縦軸は腫瘍の体積(mm3)を示し、左側はA549細胞を示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞を示す。この結果、A549を接種したヌードマウスに比べ、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制されることがわかった。
さらにこれらの株についてMMP産生および活性に対する影響を調べた。A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これらの組織におけるMMPの産生をゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法により検討した。結果を第11図に図面に代わる写真で示す。第11図の上段はゼラチンザイモグラフィーの結果を示し、下段はMMP−9に対する抗体を用いて常法に従いウェスタンブロッティングを行った結果を示す。第11図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子安定高発現細胞株のものであり、各3例ずつ示す。
その結果、MMP−9の活性がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。また、MMP−9の発現がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。
さらに、これらの細胞に対してヘマトキシリン−エオシン(Haematoxilin−eosin(HE))染色を行った。結果を第12図に図面に代わる写真で示す。第12図の上段はHE染色の結果を示し、下段はリゾチームによるものを示す。この結果、A549細胞の腫瘍は不完全に分化していたが、MEF遺伝子高発現細胞の腫瘍は多数の中央内腔を有する腺に十分に分化していた(第12図)。以前に、本発明者らは腺漿液細胞分化のマーカーとしてA549細胞のリゾチームの発現によりMEFがアップレギュレーションされることを示してきた[Kai,1999年]。これによれば、リゾチームの高発現はMEF遺伝子高発現腫瘍の中央内腔のみに見られた(第12図下段)。してみれば、MEFによる上皮細胞の分化の誘導は生体内におけるA549細胞の腫瘍の発生の抑制と関係している。
次に、A549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響を検討した。
即ち、A549株、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、これを凍結保存し、保存した組織を10μmの薄さの切片を作り、組織標本を作製した。これをHE染色法を用いて染色した結果を、第13図に図面に代わる写真で示す。第13図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)のものである。
この結果、MEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスでは血管新生が顕著に抑制されていることがわかった。
次に、アポトーシスの誘導について検討した。
アポトーシス検出キットを用いて前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。結果を第14図に図面に代わる写真で示す。第14図の左側はA549株のものであり、右側はMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)のものである。
その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
さらに、ウサギを用いて膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響を調べた。
日本白色種ウサギ(体重約3kg)から摘出した膝関節滑膜組織よりWerb and Burleigh(1974)の方法に準じてアウトグロース(outgrowth)法により調製した滑膜線維芽細胞を使用して、滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてMTT法により検討した。結果を次の表1に示す。
その結果MEFを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用があることがわかった。
これらの結果から、MEFを遺伝子導入した細胞株はアポトーシスの誘導が観察され、親細胞株と比較し、顕著なMMP産生並びに活性の低下、血管新生の抑制、腫瘍増殖性の抑制が観察された。従って、本発明により、ETS転写因子MEFを疾患に起因する細胞に導入、発現させることにより、優れた細胞増殖抑制効果を発揮することがわかった。
さらに、MEFが腫瘍の脈管形成に影響しているかどうかを検討するために、脈管上皮細胞のマーカーであるCD31の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した。MEF遺伝子高発現腫瘍における中程度及び大きな脈管の数はコントロールに対してそれぞれ75%及び31%も明らかに減少していた。結果を第15図に示す。第15図の縦軸はA549細胞の脈管数に対する相対的な(%)値を示し、横軸は脈管サイズが50mm以上のものと50mm以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はA549細胞のものを示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)のものを示す。
続いて、A549細胞のMEF遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響するかどうかをさらに調べた。実験の概要を第16図に示す。第16図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を播種し、8μmのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
結果を第17図に図面に代わる写真で示す。第17図の左上は無処理の場合を示し、右上はbFGFを添加した場合を示し、左下はA549細胞の培地(media)の場合を示し、右下はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)を示す。この結果をグラフ化したものを第18図に示す。第18図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な(%)移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、bFGFの場合、A549細胞の場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。A549細胞の無血清培養上清(conditioned media)ではヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)の移行が促進され、これに対してMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清では同じ効果はなかった。陽性のコントロールにおいて、塩基性FGF(bFGF)はHUVECsの移行を増加させた(第17図、第18図)。
IGF−1のシグナル系の封鎖によりA549腫瘍における腺分化が誘導されることが報告されている[Jiang,1999年]。様々な成長因子が基質のマトリックス中に見出されており、様々な結合性蛋白質及び細胞外マトリックスに結合している[Bergers,2000年]。MMP類が腫瘍の浸潤だけではなく、VEGFやIGF−1などの様々な成長因子の処理と放出にかかわると報告されている[Bergers,2000年;Mira,1999年]。したがって、MMP類はこれらの成長因子を統合するのに必要であって、そして間接的に腫瘍の成長と脈管形成に関係している。これらの因子がMEFの腫瘍抑制作用に関係していることを確認するために、本発明者らは最初にMMP類の発現と活性に着目した。その理由は、特にA549細胞におけるVEGFとIGF−1の発現がMEF遺伝子高発現によるものでないからである。ゼラチンザイモグラフィーによれば、MEF遺伝子高発現腫瘍ではMMP−9とMMP−2の発現はかなり減少していた。MMP−9のこの結果はウエスタンブロッティング分析と免疫組織化学によっても確認された。MEFはMMP−2の発現を阻害した。etsコンセンサスモチーフを含んでいないと推定されるMMP−2のプロモーターがETS転写因子によって直接制御されていないにもかかわらず、MMP−2の阻害が悪性腫瘍の抑制に大きな寄与をしている。この理由のひとつはMMP−2単独の抑制が腫瘍発生における脈管前の状態(prevascular)から脈管への転移を阻害し、次いで腫瘍の成長を阻害するという知見に基づくものである。
脈管形成は血管内皮細胞の増殖と移動で引き起こされ、そしてA549細胞の場合には脈管形成因子により促進される。IL−8は強力な脈管形成因子である[Arenberg,1996年]。最近、PEA3がIL−8の誘発により腫瘍の脈管形成に関係していることが報告された[Arenberg,1996年]。そこで、MEFがIL−8の発現を阻害することにより腫瘍の脈管形成を抑制するのかもしれないと考察した。ヌードマウスの腫瘍における免疫組織化学的分析は、IL−8の発現がMEF遺伝子高発現腫瘍の中で減少していることが示された(第19図)。生体外の培養において、IL−8のmRNAの発現はA549細胞との比較においてMEF遺伝子高発現細胞ではかなり減少した(第19図)。第19図はIL−8のmRNAの発現のRT−PCRによる結果を示す図面に代わる写真である。第19図のGAPDHは確認のためのコントロールである。
これらの結果は、MEFがIL−8の転写を抑制することにより、少なくとも一部分において、腫瘍の脈管形成を阻害することを示唆した。
そこで、本発明者らは、MMP−9およびIL−8の転写へのMEFの作用をさらに調べた。MEFがMMP−9とIL−8の転写を直接抑制するかどうか調べるために、本発明者らはMMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った。結果を第20図に示す。第20図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、MEFを1.0μM添加した場合、MEFを3.0μM添加した場合、MEFを5.0μM添加した場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。A549細胞中では、MMP−9とIL−8のプロモーターの高いルシフェラーゼ活性が観察された(第20図)。MEFはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を濃度依存的に減少させた。これに対して、ETS転写因子(ELF−1、ETS−1、PEA3、ESE−1)中のETS−2のみがMMP−9及びIL−8プロモーターのルシフェラーゼ活性を増加させ、そいてETS−2のmRNAのアンチセンスはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を減少させた(第21図)。第21図はMMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第21図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を添加した場合、及びアンチEst−2を添加した場合をそれぞれ示す。
ETS−2によるMMP−9の活性化の発見は、マウスを用いたEts−2のターゲットされた欠失に関する研究によっても支持される[Yamamoto,1998年]。MEFはPU−1と異なって[Kihara−Negishi,2001年]リプレッサー領域を持たないで、かつデアセチラーゼ活性を有するHDACやSin3Aと相互作用をすることから、本発明者らは次にMEFがこれらのプロモーターのets結合部位におけるETS−2とのコンペティターであると仮定した。第22図はEst−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第22図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。また、これらの各々の場合におけるEst−2の発現のウエスタンブロットの結果を第23図に図面に代わる写真で示す。
第22図に示したように、ETS2はMEFの共導入でこれらのプロモーターを活性化しかった。MEFのETSドメインのみが発現する発現ベクターの共導入によってさえもETS2誘発活性は抑制された。プロモーターのets結合部位に結合するETS−2をブロックすることによりプロモータの活性が抑制されるかどうかをさらに検討するために、MMP−9及びIL−2のプロモーターの3つのets結合モチーフ並びに腫瘍発生に重要なサイトカインであるマクロファージコロニー誘起因子(GM−CSF)からなる二本鎖の合成オリゴヌクレオチドによる「おとり型核酸」を作成した。ets結合モチーフを有するこの「おとり型核酸」は、ETS2過発現によって誘発されるプロモータ活性を抑制したが、5’−GGAA−3’が5’−TCAA−3’に変異したets結合モチーフの変異体の「おとり型核酸」は抑制しなかった。前述した知見に基づき、MEF遺伝子の脱メチル化がMMP−9及びIL−8のプロモータ活性を制御するかどうかを確認するために、これらのプロモータ活性における5−アザシチジン(1μM)とトリコサミンA(1μM)の効果を検討した。MMP−9およびIL−8のプロモータ活性は、A549細胞の中で5−アザシチジンとトリコサミン Aによって抑制された。
以上のことから、MEFが癌抑制遺伝子であり、また、これは癌細胞中のメチル化によって下流側で制御されているものであることが示された。
そして、以上のことから、MEFが生体外及び生体内でヒト非小細胞肺のカルシノーマA549細胞の腫瘍形成を抑制することが明らかとなり、これはMMP類とIL−8の双方を抑制することに起因している。その抑制のメカニズムは、MMP類とIL−8のプロモーターの上のets結合部位へのETS−2の結合に競合することである。さらに、いくつかの癌細胞におけるMEFの発現は、MEF遺伝子のエキソン1領域の周囲のCpGアイランドのメチル化によりダウンレギュレーションされている。したがって、MEFがX染色体に局在している新規の癌抑制遺伝子であると考察した。このことは、LOHが卵巣癌と乳癌においてXq25−26.1で見出されるという臨床の場においてよく見られる[Choi,1997年;Choi,1998年]ことによっても強く支持される。MEFによる転写制御が細胞周期のG1ファージを制限する[Miyazaki,2001年]という最近の研究によってもさらに支持される。癌抑制遺伝子としてのMEFが腫瘍の成長を抑制するので、MEFが細胞周期のS期の間不活性にされるのは、理にかなっている。その上、腺分化による癌形成遺伝子であるESE−3[Tugores,2001年]の発現は、MEF遺伝子高発現の腫瘍におけるアップレギュレーションをかなり示した。したがって、MEFには、悪性腫瘍の抑制作用についてESE−3と相乗的な作用があるかもしれない。本発明者らは、最近、GM−CSFが、蛋白質キナーゼCのターゲットであるETS−2によりアップレギュレーションされていることを見出した。そして、このアップレギュレーションはMEFによっても阻害される。この知見もまた、GM−CSFの生産が生体外の侵入性と肺のへん平細胞癌の進行の両方にかかわると報告もあることから[Tsuruta,1998年]、本発明の癌抑制遺伝子としてMEFが作用することが支持される。また、GM−CSFはヒト非肺小細胞癌に誘起効果を持つことができ、さらに、GM−CSFが腫瘍脈管形成のための内皮前駆細胞の移行を活性化するとも報告された[Takahashi,1999年]。
腫瘍の進行には増殖、脈管形成、および転移といった段階があり、各段階は正又は負の調節のバランスによって制御されている。例えば、脈管形成は脈管形成のスイッチによって制御されている。脈管形成のスイッチは、VEGF、MMP類、IL−8、およびbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)などの正の調節のレベルが、トロンボスポンジン−1と、2とエンドスタチンなどの負の調節のレベルよりも高くなることによりスイッチが入れられる[Hanahan,1996年;Bergers,2000年]。腫瘍細胞においては、いくつかのETS転写因子がMMP類やIL−8などの正の調節の転写をアップレギュレートすることが示されている[Iguchi,2000年;Sementchenko,2000年]。さらに、オンコジーン因子群によって活性化されたETS因子群が腫瘍の進行を制御している。
多くの研究者が細胞外性要因が細胞の形質転換にどのように作用するかということに着目してきたが、転写因子などの細胞内因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということは明らかにされていない。同じファミリーにおける転写因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということを見出すために、本発明者らはETS転写因子に着目した。転写因子のETSファミリーは細胞の成長、死滅、および分化における重要な役割を担っている。多くの形質転換関連遺伝子類はETSとAP−1ファミリーの転写因子の双方に対する隣接する結合部位を含んでおり、そのようなエレメントは活性化された個体発生の広い範囲において転写の活性化を調整している[Sharrocks,1997年]。いくつかのETS転写因子がRas−Raf−MEKシグナリング経路の下流側のターゲットであることが知られている[Wasylyk,1998年]。この系路の発癌性の促進は転写活性を活性化し、そして主要な領域におけるトレオニン残基のリン酸化によるETS−1及びETS−2の局所化を変化させる[Yang,1996年;Wasylyk,1997年]。ETS−2は細胞の形質転換の重要なメディエーターとして知られている。なぜならば、ETS−2の優位なネガティブな構造はRas又はHER2による形質転換をブロックすることができるからである[Foos,1998年]。そして、乳癌細胞は、ETS−2のターゲット変異を起こした異形接合マウスとの交尾によって抑制される[Neznanov,1999年]。本発明によって支持されるように、ETS−2はA549細胞におけるMMP−9、およびIL−8のような腫瘍の悪性の因子群を活性化させる。ETS−2によるMMP−9の活性化を見出したことは、マウスのEts−2の標的化欠失に関する研究によっても支持される[Yamamoto,1998年]。したがって、ETS−2の抑制が分子癌腫療法には良い標的であるかもしれない。
最近、いくつかのETS転写因子がMMPsとHER2の転写を抑圧すると報告された[Mavrothalassitis,2000年]。したがって、腫瘍の進行が正又は負のETS因子群のバランスによって制御することが可能である。本発明において、癌細胞の中のMEFとETS−2のバランスが悪性腫瘍を決定する重要な役割を示すことが明らかとなった。いくつかのETS転写因子がRasシグナル伝達によってリン酸化され、核に入り、その結果発癌遺伝子の転写を制御すると示した。しかしながら、ESE−3(ETS転写因子の1種)は、核のタンパク質であり、Rasシグナル伝達による転写を抑制するとの最近の報告もある[Tugores,2001年]。したがって、ESE−3などの核ETS因子群が細胞質のETS因子群に対して負の調節をし、細胞の恒常性を安定化している。血清又は非血清状態で、かつ優位な負のRas及びMEKの存在下において緑色蛍光蛋白質−MEF融合蛋白質を使用することによりMEFの細胞内の局在を決定した。A549細胞には、K−Rasの変異を持っており[Mitchell,1995年]、その結果Ras−MEK−MAPK経路の活性化が生じている。MEFは核で局所化されるのがわかった。ETS−2は非刺激の状態では細胞質と核に局所していた。ETS因子群は細胞の形質転換を制御している。即ち、MEFとESE−3はETS−2のような発癌性ETS転写因子に対する癌抑制物質として作用する。
本発明者らは、以前にMEFはA549細胞においてリゾチームのプロモーターを活性化することを報告した[Kai,1999年]。しかしながら、本発明ではMEFはMMP−9及びIL−8のプロモーターを抑制することが示された。すなわち、MEFによる転写の調節はプロモーターと細胞の状況に依存している。同様に、Fli−1はテナスシン−Cのプロモーターのためのアクチベータとして機能することができ[Shirasaki,1999年]、一方、コラーゲンのプロモーターの状況によってはリプレッサーとして機能している[Czuwara−Ladykowska,2001年]。MEFによるリゾチームのアップレギュレーションに関して、本発明者らは以前に、ウシのリゾチーム遺伝子5Aの近位のプロモーターのets結合部位(−46/−40)に加えて、第二のエレメント(−100/−51)サイトが存在していることを報告してきた[Kai,1996年;Kai,1999年]。このエンハンサーは未だ確認されていないが、MEFはリゾチームの発現を活性化するためにエンハンサー−結合蛋白質との特異的な相互作用を必要としている。いずれにしても、標的プロモーターの状況に依存しているETS因子群の間の相互作用は、遺伝子の抑制と活性化の分子スイッチとして作用しており、逆もまた同様である。
本発明における「おとり型」DNAを使用する癌療法だけではなく、診療所での癌におけるLOH、SNPs、およびMEF遺伝子の後成の(epigenetic)修飾の発見に基づく癌診断に貢献する。
従って本発明は、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、肺癌、大腸癌、子宮癌、腎細胞癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫神経芽細胞種および脳腫瘍、およびこれらが転移したことによる腫瘍に対する抗腫瘍治療薬、並びに抗リウマチ治療薬として有用である。
本発明のETS転写因子としては、ETS結合部位を認識し得る各種の転写因子を挙げられるが、この中でもMEFが好ましい。MEFは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、本発明において使用できるMEFはこのアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、GM−CSF、β−ディフェンシン−1、−2の少なくとも1種の発現を調整し得る活性を有するものであれば良く、好ましくはETS結合部位を認識し得るアミノ酸配列を有するものであればよい。したがって、本発明のMEFとしては配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は2個以上のアミノ酸が置換、又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは1個又は2個以上のアミノ酸が配列番号1に記載のアミノ酸配列に付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、MEFの変異タンパクであり前記活性を有する限り本発明に含まれる。
同様に、本発明のETS転写因子をコードする遺伝子としては、前記した本発明のETS転写因子をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の好ましいETS転写因子をコードする遺伝子としては、前記したMEFをコードする遺伝子が挙げられる。MEFをコードする遺伝子の例を配列表の配列番号2に記載するが、本発明の遺伝子はこの塩基配列を有するものに限定されるものではない。例えば。配列番号2に記載のヌクレオチド配列において、1又は2以上のヌクレオチドが置換、または欠失されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、或いは1又は2以上のヌクレオチドが配列番号2に記載のヌクレオチド配列に付加されたポリヌクレオチドも本発明の遺伝子に包含される。
また、本発明の遺伝子としては前記した塩基配列を有する遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含される。
通常のタンパク質の多くには糖鎖が付加され、アミノ酸を1個若しくは複数個変換することにより糖鎖付加を調節することが出来る。配列番号1に記載のアミノ酸配列において、その糖鎖付加を調節されたポリペプチドも上記活性を有する限り、本発明に包含される。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明に包含される。
さらに本発明は、上皮細胞内のETS転写因子、好ましくはMEFタンパク質あるいはMEF遺伝子の発現を増強するタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質等を用いた疾患治療法もしくは治療薬を包含する。
(遺伝子治療)
本発明は、MEFを治療用ベクターに組み込みこむことにより、先に列挙した様々な疾患に対する遺伝子治療に用いることが可能である。
本発明において、遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、特に限定されていないが、例えば、組換えワクチンウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、HIVウイルス、センダイウイルス等から誘導されるベクターを用いることが出来る。さらに、上記ベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、RNAスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入する。
本発明は、上記ベクターに組み込み、通常の方法により遺伝子治療薬として使用する。すなわち、遺伝子治療を行う場合には、該組み換えウイルスベクターを治療の標的となる細胞に接触させるか、或いはプラスミドベクター等の発現ベクターに挿入し、標的細胞を導入すればよい。このとき遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、リポソーム法、電気穿孔法、DEAE−デキストラン法等、公知の方法により行うことが出来る。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチドおよびその類似体を意味する。従って、この用語が含む第1群は、天然に存在する種、または天然に存在するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された合成種である。ここで、サブユニットに対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またオリゴヌクレオチドの第2の群はその類似体であり、これらは前記オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない部分を有する残基を持つ。これらには、安定性を増加するためのリン酸基、糖部分、3’,5’末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の1つを硫黄に置換したオリゴホスホロチオエート、−CH3に置換したオリゴメチルホスホネート等があげられる。またホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。以上のようなオリゴヌクレオチド類も本発明のアンチセンスDNAと同様な機能を果たす限り、該DNAの誘導体として本発明に包含される。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするmRNAの標的部分は転写開始部位、翻訳開始部位、イントロン・エキソン結合部位または5’キャップ部位であることが好ましいが、mRNAの2次構造を考慮して立体傷害のない部位が選択されるべきである。
(MEFの製造および用途)
本発明のMEFは、配列番号2に記載のDNA、およびベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、RNAスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入した発現ベクターにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換し、各宿主細胞においてMEF遺伝子を発現させ、製造することが可能である。また、本発明に関するDNAに他のタンパク質をコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、MEFの精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、産生するMEFを切り出し、製造することも可能である。
また、配列番号2に記載のDNAの1または2以上のヌクレオチドを変異させたり、これに他のヌクレオチドを付加させたり、3’又は5’側の一部を切断したり、途中の1または2以上のヌクレオチドを除去させたりすることにより、変異したMEFを製造することもできる。
上記目的のために、発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌が挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。代わりに、Sf9等の昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えばCOS細胞、CHO細胞が挙げられる。
上記手法により製造された本発明はMEFを宿主細胞内または細胞外から分離、精製し、使用することが出来る。MEFの分離、精製には、通常のタンパク質に用いられる分離、精製法を使用することが出来る。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせて使用することが出来る。
本発明は、MEFを静脈内投与、患部への局所投与、経口投与等により投与可能である。投与の際、MEFに必要ならば、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、溶解補助剤等の添加物を加えて前記投与に適した製剤とする。
また、本発明は、MEFのアミノ酸配列(配列番号1)のうち、少なくとも5個の連続するアミノ酸を有するオリゴペプチドを認識する抗体を作製することも可能である。具体的には、前記オリゴペプチドを抗原として動物に免役し、生体内にて産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体があり、それぞれの精製方法について当業者に公知である。このようにして得られるいずれの抗MEF抗体もELISA等のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫法等、各種免疫学的測定法を用いるMEFの検出および定量、或いは上述のMEFのカラムによる精製に用いることが出来る。
さらに本発明の有効成分としては、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子のみならず、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質であって生体内又はインヴィトロにおいて結果として前記したと同じ結果をえることができるので、ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を用いることもできる。
本発明のETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質としては、生体内又はインヴィトロにおいてETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の発現を調節することができるものであればよく、例えば、これらの発現を調節することができるタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質であってもよい。また、本発明の方法における「作用を調節する」ということは、作用を抑制したり、又は作用を増強するものであり、条件によって両方の作用を有するものであってもよいが、好ましくは抑制するか又は増強するかのどちらか一方の作用を有する物質である。
また、本発明は、これらの物質をスクリーニングする方法を提供する。即ち、本発明は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞ののETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を制剤することがでる物質を提供する。
本発明のETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞としては、天然のETS転写因子をコードする遺伝子を有する細胞をそのまま使用してもよいが、好ましくはETS転写因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに導入し、これを上皮細胞や各種の微生物細胞に導入した形質転換体を用いることができる。この方法に使用される微生物細胞としては、前記した原核生物の宿主細胞や真核微生物の宿主細胞を用いることができる。
本発明のこの方法は、ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞、又はその周辺に種々の濃度の被検物質を添加して、当該細胞におけるETS転写因子の発現量を測定したり、または細胞増殖の抑制を測定することにより、目的の合致する物質であるか否かを知ることができる。
本発明のこの方法により得られる物質は、細胞、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質であり、細胞増殖を抑制することができ、より具体的には前記した各種の良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの疾患の治療剤、予防剤、又は処置剤と有用な物質である。したがって、本発明はこの方法によって得られる細胞増殖を抑制することができる物質を包含している。
さらに本発明は、この方法よってスクリーニングされた物質を有効成分として含有する治療剤、予防剤、又は処置剤などの医薬組成物、それを用いた良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞増殖を抑制することが必要とされている疾患の治療方法、及び医薬組成物の製造のための使用を包含している。
さらに、本発明は、ETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤又はIL−8産生抑制剤を提供する。MMPとしては、MMP−9が好ましいい。また、IL−8は強力な脈管形成因子である[Arenberg,1996年]ことが知られており、IL−8の産生を抑制することにより脈管形成が抑制されるが、本発明のIL−8産生抑制作用によりIL−8の脈管形成作用のみならずIL−8に起因する各種の作用を抑制できるものと考えられる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。試薬の出所は便宜上のものであり、本発明を限定することを意味しない。
ヒト非小細胞肺癌細胞由来A549、ヒト胎児肝臓由来細胞由来HEK293、ヒト大腸癌由来Caco−2は、ATCC(American Type Culture Collection)より入手した。細胞は、2×105cells/mlとなるように、10%ウシ胎児血清を含むDMEM(100U/mlペニシリン、0.1g/lストレプトマイシンを含む)に懸濁し培養フラスコに播種後、5%CO2、37℃下で経代培養を行った。
実施例1 (MEF遺伝子安定高発現細胞株の作製)
1.ヒト肺上皮由来A549細胞株の培養
ヒト肺上皮由来細胞株A549を、基礎培養液(Dulbecco’s modified Eagle Medium、pH=7.4)に10% FBS(fetal bovine serum)(Hyclone,Lot.No.AGB 6235)、抗生物質(penicillin G(100units/ml)、streptomycin(100μg/ml))を添加した細胞増殖用培養液で、5% CO2、37℃の条件下で静置培養した。
2.遺伝子の調製
MEF cDNAを組み込んだ発現ベクター(pCB6)100μgを制限酵素ApaLIにて制限酵素消化し、直鎖状DNAを調製した。
3.MEF遺伝子の細胞への導入
サブコンフルエント状態(50〜60%)にある細胞をトリプシン消化により回収し、前項記述のDNA(100μg)を含むサイトミックス溶液(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,pH7.6,25mM Hepes,pH7.6,2mM EGTA,pH7.6,5mM MgCl2,2mM ATP,pH7.6;5mM glutathione;pH adjusted with KOH)で懸濁後、それをキュベット(ELECTROPORATION CUVETTES PLUSTM,2mm gap,BTX)に注入して、氷上に10分間静置した。その後、パルス発生装置(ELECTRO CELL MANIPULATOR ECM600,BTX)で電気ショック(500V,1350mF)を与え、再び氷上に10分間静置し、5% CO2、37℃条件下で培養した。なお、用いたDNAの量はUV(260nm)の吸光度より求め、純度85%以上のものを用いた。
4.MEF遺伝子安定高発現株の判定
該細胞が約50%集密的(confluent)になった時点でG418(ナカライテスク)を最終濃度1.0mg/mlとなるよう添加し、さらに1週間培養した。なお、G418は遺伝子導入が行われていない細胞が1週間で死滅する濃度を用いた。1週間後、生存している細胞のコロニーを回収し、各々別の60mmの培養皿(culture dish)にて培養し、G418を用いた選択を再度行った。最後に各々の細胞におけるMEF遺伝子の発現をノーザンブロッティング分析(Northern blotting analysis)およびRT−PCRによって確認し、MEF遺伝子安定高発現細胞株(No.71株)を得た。
実施例2 (細胞増殖抑制活性)
肺上皮ガン由来細胞株A549および実施例1で作製したMEF高発現細胞株を10%血清(仔ウシ血清)を含有、または含有しない培地(ダルベッコ改変イーグル培地)に1x104個/mlとなるように播種し、24時間、37℃、5% CO2下にて培養し、播種後経日的な細胞数をMMT法により測定した。
MMT法は下記のように行った。まず、測定の4時間前の細胞にMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム臭素)のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS(−)溶液)に加えて更に96穴マイクロプレート1ウェルあたり塩酸酸性(0.04N)イソプロパノール100mlおよび3%SDS水溶液20mlを加えて生細胞のミトコンドリアの作用により生成したホルマザンを溶解した後、溶液の595nmの吸光度(対照655nm)を測定した。結果を第1図に示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではMEF高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
実施例3 (腫瘍形成に対する影響)
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株1×106個/100μlをPBS(−)溶液中に懸濁後、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。2ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した。結果を示す写真を第2図に示す。
この結果、A549を接種したヌードマウスに比べ、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制された。
実施例4 (MMP産生および活性に対する影響)
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これに等量の溶菌緩衝液(lysis buffer)(20mM Tris−HCl,0.1MNaCl,0.5%Triton−X,pH7.4)に浸し、4℃にて一夜静置後、上清を回収した。調製した上清をSDSサンプルバッファー(sample buffer)(0.185M Tris−HCl,30%glycerol,6%SDS,pH6.8)と2:1の割合で懸濁し、20mg相当のタンパク質溶液を0.5mg/mlのゼラチンを含む10%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。泳動後、ゲル中に含有のSDSを除去するために洗浄溶緩衝液(washing buffer)(2.5% Triton−X)にて20分間洗浄し、これを3回繰り返した。更にゲル洗浄緩衝液(gel rinse buffer)(50mM Tris−HCl,0.1MNaCl,pH7.4)にて20分間洗浄した。その後、ゲルインキュベーション緩衝液(gel incubation buffer)(50mM Tris−HCl,10mM CaCl2,0.02% NaN3)を用い37℃下、20時間酵素反応を行った。反応後、染色溶液(0.5% CBB−G250,45% methanol,10% acetic acid)にてゲルを染色、更に脱色液(5% methanol,7.5% acetic acid)にてゲルを脱色し、染色像をLas−100(FUJIFILM)を用いて解析した。結果を第3図の上段に示す。
その結果、MMP−9の活性がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
更に、上述の上清20mg相当を10%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った後、MMP−9に対する抗体を用いて常法に従いウエスタンブロッティング分析(Western Blotting Analysis)を行った。結果を第3図の下段に示す。
この結果、MMP−9の発現がMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
実施例5 (移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響)
1.腫瘍切片の作製
A549、およびMEF遺伝子安定高発現細胞株を接種し、2ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、OCT化合物(OCT compound)を用いて、凍結保存した。保存した組織をクリオスタット(cryostat)(LEICA CM 1100)を用いて、組織を10μmの薄さの切片を作り、ポリL−リジンコートしたスライドグラスに貼付した。これを4%パラホルムアルデヒド水溶液に浸し、15分間反応させ組織を固定後、洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返し、組織標本を作製した。
2.ヘマトキシリン−エオシン染色
組織標本をマイヤーヘマトキシリン溶液に3分間浸した後、蒸留水で色出しを行った。更に、0.5%エオシン溶液に1分間浸した後、蒸留水にて洗浄した。その後、脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第4図に示す。その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において血管新生が顕著に抑制された。
実施例6 (アポトーシスの誘導)
アポトーシス検出キット(Apoptosis in situ Detection kit wako(wako))を用い、前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。まず、100倍希釈したTdT反応液100μlを組織標本に添加し、湿潤箱のなかで15分間、37℃にて反応させた。その後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。更に、標本の内因性のペルオキシダーゼを不活性化するために3%H2O2水溶液に5分間作用させた。その後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。更に、POD接合抗体(POD−conjugated antibody)をPBS(−)にて100倍希釈し、100μlを標本に滴下し、湿潤箱のなかで15分間37℃にて反応させた。この後、標本を洗浄するためPBS(−)に5分間浸し、これを3回繰り返した。次に、DAB溶液100μlをスライドに添加し、室温で5分間反応させた後、メチルグリーン酢酸溶液を用いて標本を対比染色した。その後、標本を後脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第5図に示す。
その結果、MEF遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
実施例7 (ウサギ膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響)
日本白色種ウサギ(体重約3kg)から摘出した膝関節滑膜組織よりWerb and Burleigh(1974)の方法に準じてoutgrowth法により調製した滑膜線維芽細胞を使用した。培養液として10%非働化ウシ胎児血清を添加した25mM HEPES,100U/mlのペニシリンGおよび100μg/mlのストレプトマイシン硫酸塩含有MEM(Sigma)(以下、10%FCS/MEM)を用い、5% CO2,95%空気の加湿条件下で37℃に調整されたCO2のインキュベーター中で細胞を増殖させた。継代培養は0.25%トリプシン(trypsin)/0.02%EDTA液を用いて常法に従い行った。第3〜7代の滑膜線維芽細胞を用い、2000cells/0.1ml/wellの細胞密度で96 well plateに継代し、10%FCS/MEM中で、5% CO2、95%空気の加湿条件下で37℃に調整されたCO2のインキュベーター中で培養した。24時間培養後、MEF遺伝子をトランスファクタム(transfectam)を用いて遺伝し導入した。導入24時間後、ヒトリコンビナントインターロイキン−1(5ng/ml)を添加した。その後24〜72時間経過後の滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてMTT法により検討した。結果を前記「表1」に示した。
その結果MEFを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用が観察された。
実施例8 (RT−PCR法)
培養細胞からの全RNAの抽出にはイソゲン(lsogen(ニッポンジーン))を用いて行った。培養細胞の各種遺伝子発現を比較するためにRT−PCRを行った。RT−PCRには、RNA PCR kit(AMV)ver.2.1(TaKaRa)を用いた。本発明において発現を確認した遺伝子について、以下にその方法の概要を示す。
1.MEF
A549およびその他の細胞から抽出した全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側のプライマー(5’−GGAAGACCCCTCTGTGTTCCCAGCTG−3,)および下流側のプライマー(5,−CAGTCTTCTTGGCTCTTTCCTCTCTGG−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル)を行った。
2.IL−8
A549およびMEF遺伝子高発現細胞株より全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側プライマー(5’−ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGCT−3’)および下流側プライマー(5’−TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル)を行った。
3.SE−3
A549およびMEF遺伝子高発現細胞株より全RNA 1μgを鋳型とし、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応(42℃で60分、99℃で5分、5℃で5分)を行った。その後、上流側プライマー(5’−ACAGACAGCTACTCCACGTGCAATG−3’)および下流側プライマー(5’−CTCGTCTTTCCAGGTGTTCATGATGG−3’)を用いて、PCR(94℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を30サイクル)を行った。
実施例9 (F−アクチン(F−actin)染色)
ガラスボトムディッシュ(Glass−bottom dish)上で培養した細胞に4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で10分間静置し、細胞を固定した。その後、0.5%トリトンX−PBSで細胞を浸透(permealize)し、PBSで50倍に希釈したローダミンファロイディン(rhaodamine phalloidin(Molecular Probes))を加え、室温で30分間反応させた。
実施例10 (ゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography))
1.無血清培養上清(conditioned media)の調製
細胞培養の前記した方法に従い、サブコンフルエントまで培養した細胞の培養液を、無血清培養に置換し、48時間培養後培養液を回収し、濃縮した。
2.腫瘍溶解産物(tumor lysate)の調製
単離した腫瘍片を1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、ハサミで細片化した。これに溶解緩衝液(20ml Tris−HCl、0.1M NaCl、0.5%トリトンX−100、pH7.4)に懸濁し、氷中で1時間静置した。その後、2000×gの遠心操作により上静を回収して腫瘍溶解産物とした。
3.ゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography)
前記1.及び2.により調製したサンプルとSDSサンプルバッファー(0.185M Tris−HCl、30%グリセリン、6%SDS、pH6.8)を2:1の割合で混合し、チモグラフィー用試料とした。この試料を、0.5mg/mlのゼラチンを含む12.5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後のゲルをゲル洗浄液(2.5% Triton X−100)中で20分間室温で振盪させSDSを除去した。この操作を3回行った後、ゲルリンス緩衝液(50mM Tris−HCl、0.1M NaCl、pH7.4)中で室温で5分間、3回振盪し、トリトンX−100を除去した。その後、ゲルをゲルインキュベーション緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM CaCl2又は10mM EDTA、0.02% NaN3、pH7.4)中で20時間、37℃で振盪しながら、酵素反応を行った。反応後、ゲル染色溶液(0.25%w/v CBB−G250、45%メタノール、10%酢酸)で染色後、ゲル脱色溶液(5%メタノール、7.5%酢酸)で脱色した。
実施例11 (ウエスタンブロッティング(Western blotting))
前記したゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−Zymography)で用いた試料を試料とした。試料を12.5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った後、PVDF膜に転写(250mA、1.5時間)した。転写したPVDF膜は5%スキムミルクを含む0.05%ツウィーン20−PGS(PBS−T)中で室温で1時間振盪しマスキングした。その後、PBS−Tで1000倍希釈したヒツジ抗MMP−91gG(Santa Cruz)を用いて室温で1時間振盪し、1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、10,000倍希釈したマウスHRP標識抗ヒツジ抗体(Jackson lmmunoResearch Laboratories,Inc.)を用いて室温で1時間振盪し、2次抗体反応を行った。2次抗体反応後、ECL試薬(Amersham)により抗体反応を検出した。
実施例12 (マトリゲルへの細胞浸潤能の測定)
1.0×106/mlとなるように調製したそれぞれの細胞懸濁液を8μm孔(pore)のマトリゲル浸潤チェンバー(matrigel invasion chamber(BD Biocoat Matrigel))の上層に200μl添加し、無血清の培養液を700μl添加する。24時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきた細胞をヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例13 (細胞増殖率の測定)
細胞増殖率はWSTキット(Dojindo)を用いそのプロトコールに従った。概要を以下に示す。1.0×104個の細胞を24−ウエルのプレートに播き、4日間培養した。0日目と4日目の細胞に、培養液で20倍希釈したWST試薬を加え、2時間反応させた。その後、405nmの吸光度をそれぞれ測定し、4日目の吸光度を0日目の吸光度で割り、細胞増殖率とした。
実施例14 (軟寒天内コロニー形成法)
6−ウエルのプレートに0.5%寒天−DMEM溶液を2ml添加し、室温で固化するまで放置し下層を形成させた。次に、0.33%寒天−DMEM溶液に2.5×104/mlとなるように、それぞれの細胞を混合した混合液2mlを下層の上に添加し、室温で固化させ上層を作製した。さらに、作製した上層の上に培養液を1ml添加し、2週間5%CO2、37℃の条件下で培養した後、形成したコロニーを顕微鏡下で観察した。
実施例15 (免疫組織染色)
1.PECAM−1
作製した組織標本に4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で10分間放置し固定した。次に常法に従いPBS−Tで100倍希釈したラット抗PECAM−1lgG(Parmingen)を添加し、4℃で16時間1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、PBS−Tで100倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットlgG(Vector Laboratories)を用いて、室温で1時間2次抗体反応を行った。対比染色は3%メチルグリーン酢酸溶液で行った。なお血管新生の定量は、倍率200倍の視野をランダムに4視野選択し、50μm以上又は50μm以下の血管数を測定し、平均を求めた。
2.MMP−9
作製した組織標本に4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で10分間放置し固定した。次に常法に従いPBS−Tで150倍希釈したヒツジ抗MMP−9lgG(Santa Cruz)を添加し、4℃で16時間1次抗体反応を行った。1次抗体反応後、PBS−Tで100倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットlgG(Vector Laboratories)を用いて、室温で1時間2次抗体反応を行った。対比染色は3%メチルグリーン酢酸溶液で行った。
実施例16 (HUVEC の遊走能の測定)
HUVECsが2.5×105個/mlとなるような細胞懸濁液を、8μmの孔を有するマトリゲル浸潤房(matrigel invasion chamber(BD Biocoat Matrigel))の上層に200μl添加した。次に、実施例10の1.に従い調製した無血清培養上清700μlを下層に添加した。24時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきたHUVECsをヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例17 (レポーター遺伝子の調製)
1.MMP−9レポーター遺伝子の調製
細胞におけるMMP−9の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子を用いた。ヒトゲノムDNAを鋳型とし、5’−MMP−9pro(プライマー)、及び3’−MMP−9pro(プライマー)を用い第1回目のPCR(94℃ for 30sec,58℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。さらに得られたPCR産物を鋳型とし、5’−MMP−9pro2(プライマー2)、及び3’−MMP−9pro2(プライマー2)を用い第2回目のPCR(94℃ for 30sec,58℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。得られたPCR産物をPCR2.1(Invitrogen)に挿入した後、KpnIおよびXhoIで制限酵素処理し、pGL2ベーシックベクター(basic vector)のKpnIおよびXhoI部位に挿入した。
2.IL−8レポーター遺伝子の調製
細胞におけるIL−8の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子を用いた。ヒトゲノムDNAを鋳型とし、5’IL−8pro(プライマー)、および3’−IL−8pro(プライマー)を用い第1回目のPCR(94℃ for 30sec,54℃ for 30sec,72℃ for 30sec,30cycle)を行った。得られたPCR産物をPCR2.1(Invitrogen)に挿入した後、Hind IIIおよびXhoIで制限酵素処理し、pGL2ベーシックベクター(basic vector)のHind IIIおよびXhoI部位に挿入した。
実施例18 (Ets転写因子たんぱく発現遺伝子の構築)
ヒトMMP−9およびIL−8の転写活性に対する影響を検討するため蛋白発現ベクターとしてpCB6を用いた。Ets転写因子のpCB6へのサブクローニングは以下の様に行い、DNAの塩基配列はサイクルシークエンス(cycle sequence)法を用いて確認した。
1.pCB6/MEF
気道上皮細胞由来の癌細胞株NCI−H292のmRNAよりcDNAを作製し、これを鋳型に5’−MEF(BamH I)、及び3’−MEF(EcoRI)を用いPCR(94℃ for 1min,64℃ for 1min,65℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をオリジナルTAクローニングキット(Original TA Cloning Kit)によりpCR2.1ベクターにクローニングした(pCR2.1/MEF)。このクローンをHind IIIおよびXbaIにより制限酵素処理し、pCB6ベクターのHind IIIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/MEFベクターを得た。
2.pCB6/ESE−1
pCl/ESE−1(Dr.T.A.Libermannより供与)をHind IIIおよびXba Iにより制限酵素処理し、pCB6のHind IIIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/ESE−1ベクターを得た。
3.pCB6/EIf−1
ヒト心臓由来cDNAライブラリーよりクローニングしたpUC118/Elf−1を鋳型に、5’−EIf−1(KpnI)、及び3’−EIf−1(XbaI)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をKpnIおよびXbaIにより制限処理し、pCB6ベクターのKpnIおよびXbaI部位に挿入して、pCB6/EIf−1ベクターを得た。
4.pCB6/Ets−1
pBluescrIpt/Ets−1(Dr.D.K.Watsonより供与)を鋳型にし、5’−ets1(Bgl II)、及び3’−ets1(Hind III)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をBgl IIおよびHind IIIにより制限処理し、pCB6ベクターのBgl IIおよびHind III部位に挿入して、pCB6/Ets−1ベクターを得た。
5.pCB6/Ets−2
pBluescript/Ets−2(Dr.D.K.Watsonより供与)5’−ets2(Bgl II)、及び3’−ets2(Hind III)を用いPCR(94℃ for 1min,60℃ for 1min,72℃ for 1.5min,40cycles,72℃ for 20min,1cycle)を行った。得られたPCR産物をBgI IIIおよびHind IIIにより制限処理し、pCB6ベクターのBgl IIおよびHind III部位に挿入して、pCB6/Ets−2ベクターを得た。
6.pCB6/PEA3
pGEM/PEA3(Dr.J.A.Hasselより供与)をXbaIにより制限酵素処理し、pCBベクターのXbaI部位に挿入して、pCB6/PEA3ベクターを得た。
7.pCB6/アンチセンスMEF
pCB6/MEFプラスミドをEcoRIおよびBamH Iで制限酵素処理し、て得られた約2kbpのDNA断片を精製後、再び連結反応を行った。得られたプラスミドを制限酵素処理することにより、インサートの方向を確認し、MEF cDNAがアンチ−センス方向に導入された目的のプラスミドDNAを得た。
8.pCB6/アンチセンスESE−1
pCl/ESE−1(Dr.T.A.Libermannより供与)をHind IIIおよびKpnIにより制限酵素処理し、pCB6ベクターのHind IIIおよびKpnI部位に挿入して、pCB6/アンチセンスESE−1ベクターを得た。
実施例19 (レポーター道伝子の細胞内へ導入およびプロモーター活性の測定)
(1)レポーター遺伝子および蛋白発現遺伝子の細胞内への導入
細胞へのDNAの導入は、トランスフェクタム(Transfectam)ならびにLT1を用い、そのプロトコールに従った。以下にその方法の概要を示す。
1.トランスフェクタム(Transfectam)
レポーターブラスミドDNA500ng、蛋白発現用ブラスミドDNA0.5μg−5.0μgと、トランスフェクタム(Transfectam)溶液2μl−10μlを混合し、全量をDMEMにて150μlとした。この混合液を室温にて10分間反応後、24ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、pRL−CMVベクター(10ng/well)を共導入(cotransfection)した。2時間、37℃にて培養後、10%FBS+DMEMを新たに0.5ml加えて、導入した。
2.LT1
オプティ−メン(Opti−MEM)50μlとLT1の1−6μlを混合し、室温で10分間静置した。この混合液をレポーターブラスミドDNA500ng、蛋白発現用ブラスミドDNA0.5μg−5.0μgを含むDNA溶液に添加して、10分間反応させた。その後、24ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、pRL−CMVベクター(10ng/well)を共導入(cotransfection)した。なお、プラスミドDNAのサンプルの量はUV(260nM)の吸光度より求め、純度85%以上のものを用いた。
(2)プロモーター活性の測定
レポーター遺伝子を導入した細胞におけるプロモーター活性は、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(dual−luciferase reporter assay system(Promega))を用いて測定した。48時間培養した細胞から、培地を除き、冷PBS(−)にて2回洗浄し、100μlの細胞溶解液を加え、室温にて15分間穏やかに振盪させた。その後、細胞溶解液を回収し、この溶液20μlと発光基質液100μlを室温で混和し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター(Lumat LB9507,eg & g berthtold)にて測定した。
産業上の利用可能性
本発明は、ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子、好ましくはETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、細胞増殖抑制剤、又はMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤として有効であることを開示するものである。本発明の細胞増殖抑制剤、又はMMP産生抑制剤、より詳細にはMMP−9産生抑制剤若しくはIL−8産生抑制剤は、悪性腫瘍、すなわち小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、大腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫に対する抗腫瘍治療法および抗腫瘍治療薬、さらに抗リウマチ治療薬として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図はMTT法を用いて血清存在下、非存在下におけるヒト肺上皮由来細胞株A549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)における細胞増殖活性を示す図である。
第2図は、RT−PCR法によりヒト癌細胞と正常細胞のMEFの発現を分析した結果を示す図面に代わる写真である。第2図のGAPDHはコントロールとして示したものである。第2図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるHEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、NCIH292細胞、およびHela細胞を示す。
第3図は、RT−PCR法によるヒト癌細胞と正常細胞におけるMEFの発現の脱メチル化剤5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AC)及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンA(TSA)の併用効果を検討した結果を示す図面に代わる写真である。GAPDHはコントロールとして示したものであり、第3図の上段の左側から、HEK293細胞、A549細胞、Caco−2細胞、下段の左側からA549細胞、Caco−2細胞を示す。第3図のDMSOはジメチルスルホキサイドを示す。
第4図は、MEF遺伝子高発現セルライン(クローン71)の生体外における特性を示す図面に代わる写真である。第4図の上段は形態学的な状況を示し、第4図の下段はF−アクチン(F−actin)染色を示す。第4図の左側からA549細胞、MEF遺伝子高発現A549細胞、BB94(10μM)で処理したA549細胞をそれぞれ示す。
第5図は、A549細胞及びMEF遺伝子高発現細胞の無血清培養上清におけるMMP−9蛋白質の含有量を抗MMP−9抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果(第5図右側)、及びMMP−9のゼラチン−チモグラフィー(Gelatin−zymogrphy)の結果(第5図左側)をそれぞれ示す図面に代わる写真である。
第6図は、A549細胞とMEF遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためのマトリゲル浸潤アッセイの実験の概要を図示したものである。第6図の上の房(chamber)にA549細胞(第6図左側)、MEF遺伝子高発現細胞(第6図中央)、およびBB94によって処理されたA549細胞(第6図右側)をそれぞれ播種し、24時間後に8μmのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。
第7図は、第6図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の細胞の数をコントロール(A549細胞)に対する百分率(%)として示した図である。
第8図は、第6図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の各細胞の状況を示す図面に代わる写真である。第8図の左側からA549細胞(左側)、MEF遺伝子高発現細胞(中央)、及びBB94によって処理されたA549細胞(右側)をそれぞれ示す。
第9図はヌードマウスの背部皮下にヒト肺上皮由来細胞株A549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種後2ヶ月後の腫瘍の形成を示す、図面に代わる写真である。
第10図は、第9図のヌードマウスにおける各腫瘍の大きさをグラフにして示したものである。第10図の縦軸は腫瘍の体積(mm3)を示し、左側はA549細胞を示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞を示す。
第11図は、ゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法を用いて、MEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織におけるMMP−9の産生、活性が抑制されていることを示す、図面に代わる写真である。
第12図は、第9図のヌードマウスにおける各腫瘍細胞のHE染色(第12図上段)の結果、及びリゾチームによるもの(第12図下段)を示す図面に代わる写真である。
第13図は、HE染色法を用いてA549、およびMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織の形態学的変化について示す、図面に代わる写真である。
第14図は、TUNEL法を用いてMEF遺伝子の安定高発現細胞株(No.71)を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織において、アポトーシスが誘導されたことを示す、図面に代わる写真である。
第15図は、CD31の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した結果を示す図である。第15図の縦軸はA549細胞の脈管数に対する相対的な(%)値を示し、横軸は脈管サイズが50mm以上のものと50mm以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はA549細胞のものを示し、右側はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)のものを示す。
第16図は、A549細胞のMEF遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響についての実験の概要を示すものである。第16図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞(HUVECs)を播種し、8μmのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
第17図は、第16図に示した実験の結果を示す図面に代わる写真である。第17図の左上は無処理の場合を示し、右上はbFGFを添加した場合を示し、左下はA549細胞の培地(media)の場合を示し、右下はMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)を示す。
第18図は、第16図に示した実験の結果をグラフ化したものである。第18図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な(%)移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、bFGFの場合、A549細胞の場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。
第19図は、ヌードマウスの腫瘍におけるIL−8のmRNAの発現のRT−PCRによる結果を示す図面に代わる写真である。第19図のGAPDHは確認のためのコントロールである。
第20図は、MMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第20図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、MEFを1.0μM添加した場合、MEFを3.0μM添加した場合、MEFを5.0μM添加した場合、及びMEF遺伝子高発現細胞(クローン71)の場合をそれぞれ示す。
第21図は、MMP−9とIL−8のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第21図の左側はMMP−9プロモーターを用いた場合を示し、第20図の右側はIL−8プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を添加した場合、及びアンチEst−2を添加した場合をそれぞれ示す。
第22図は、Est−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第22図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底(Basal)、A549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。
第23図は、Est−2とMEFを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイにおけるEst−2の発現のウエスタンブロットの結果を示す図面に代わる写真である。台23図の左からA549細胞、Est−2を1.0μM添加した場合、MEF及びEst−2を0.5μM添加した場合、MEF及びEst−2を1.0μM添加した場合、並びにMEF及びEst−2を2.0μM添加した場合をそれぞれ示す。
Claims (21)
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤。
- ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子が、ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子である請求の範囲第1項に記載の細胞増殖抑制剤。
- ETS転写因子又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第1項又は第2項に記載の発現調節剤。
- ETS転写因子MEFタンパク質が、配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列、又はその1個若しくは2個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求の範囲第2項又は第3項に記載の細胞増殖抑制剤。
- ETS転写因子MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号2に記載のヌクレオチド配列、若しくはその1又は2以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である請求の範囲第2項又は第3項に記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞が、上皮細胞である請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞が、ガン細胞である請求の範囲第1項〜第6項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞が、滑膜細胞である請求の範囲第1項〜第6項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である請求の範囲第1項〜第7項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である請求の範囲第1項〜第6項又は請求の範囲第8項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
- ETS転写因子MEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はMEFタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるMMP産生抑制剤、又はIL−8産生抑制剤。
- MMPが、MMP−9である請求の範囲第11項に記載のMMP産生抑制剤。
- ETS転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のETS転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
- ETS転写因子をコードする遺伝子が、MEFタンパク質をコードする遺伝子である請求の範囲第13項に記載の方法。
- 抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である請求の範囲第13項又は第14項に記載の方法。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第16項に記載の抗腫瘍剤。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第13項〜第15項のいずれかに記載の方法により得られた物質である請求の範囲第16項又は第17項に記載の抗腫瘍剤。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、MEFタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第19項に記載の抗リウマチ剤。
- ETS転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第13項〜第15項のいずれかに記載の方法により得られた物質である請求の範囲第19項又は第20項に記載の抗リウマチ剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001034834 | 2001-02-13 | ||
JP2001034834 | 2001-02-13 | ||
PCT/JP2002/001180 WO2002064165A1 (fr) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Inhibiteurs de la proliferation cellulaire comprenant un facteur de transcription ets ou un gene codant ce dernier |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002064165A1 true JPWO2002064165A1 (ja) | 2004-06-10 |
Family
ID=18898369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002563957A Pending JPWO2002064165A1 (ja) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Ets転写因子又はそれをコードする遺伝子からなる細胞増殖抑制剤 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050260582A1 (ja) |
EP (1) | EP1366773A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2002064165A1 (ja) |
WO (1) | WO2002064165A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1330271A4 (en) * | 2000-09-20 | 2005-11-09 | Beth Israel Hospital | USE OF TRANSCRIPTION FACTORS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATION AND OTHER DISEASES |
WO2007016037A2 (en) | 2005-07-27 | 2007-02-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for trans-differentiating cells |
WO2011103011A2 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Gene fusion targeted therapy |
EP3960191A4 (en) * | 2019-04-26 | 2023-01-04 | MD Healthcare Inc. | PROTEIN DERIVED FROM STREPTOCOCCUS PYOGENES BACTERIA AND ITS USE |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4340116A1 (de) * | 1993-11-25 | 1995-06-01 | Boehringer Ingelheim Int | Neue Transkriptionsfaktor-Mutanten und ihre Verwendung |
FR2724846B1 (fr) * | 1994-09-27 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras |
AU4357396A (en) * | 1995-02-08 | 1996-08-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Cancer control |
US5789200A (en) * | 1996-10-31 | 1998-08-04 | Smithkline Beecham Corporation | Human ETS family member, ELF3 |
JPH1175871A (ja) * | 1997-06-18 | 1999-03-23 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 細胞石灰化抑制活性タンパク質、及びそのタンパク質をコードする遺伝子 |
JP2000325100A (ja) * | 1999-05-18 | 2000-11-28 | Hsp Kenkyusho:Kk | Tcp−1含有シャペロニン発現制御物質のスクリーニング方法 |
AU2001236653A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | Musc Foundation For Research Development | Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer based on esf |
ATE530197T1 (de) * | 2000-06-27 | 2011-11-15 | Anges Mg Inc | Medizinische zusammensetzungen zur angiogenese- therapie |
-
2002
- 2002-02-13 JP JP2002563957A patent/JPWO2002064165A1/ja active Pending
- 2002-02-13 WO PCT/JP2002/001180 patent/WO2002064165A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2002-02-13 EP EP02712308A patent/EP1366773A4/en not_active Withdrawn
- 2002-02-13 US US10/467,945 patent/US20050260582A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1366773A8 (en) | 2005-07-27 |
WO2002064165A1 (fr) | 2002-08-22 |
EP1366773A1 (en) | 2003-12-03 |
US20050260582A1 (en) | 2005-11-24 |
EP1366773A4 (en) | 2006-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dooley et al. | Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats | |
JP5033420B2 (ja) | アクチビン及びTGF−bのシグナリングのCriptoによる拮抗方法 | |
AU1748200A (en) | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization | |
US7223733B2 (en) | Modulation of TRIP-Br function and method of treating proliferative disorders | |
KR100553300B1 (ko) | 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 | |
ES2323220T3 (es) | Polipeptidos humanos stra6. | |
JP2003531811A5 (ja) | ||
KR100543857B1 (ko) | 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 | |
JP2009019032A (ja) | 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害 | |
KR100739118B1 (ko) | Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 신규한 용도 | |
Huang et al. | A variant form of ETS1 induces apoptosis in human colon cancer cells | |
JPWO2002064165A1 (ja) | Ets転写因子又はそれをコードする遺伝子からなる細胞増殖抑制剤 | |
JPWO2006112451A1 (ja) | プロテインcインヒビターを含有する抗癌剤 | |
Sasaki et al. | Functional analysis of a dominant-negative ΔETS TEL/ETV6 isoform | |
JP2021520845A (ja) | マイクロペプチドとその使用 | |
CN115381949A (zh) | 靶向抑制色素上皮衍生因子在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用 | |
WO2010130073A1 (zh) | Itgb4bp及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变 | |
US20130172265A1 (en) | Methods and Compositions for Inhibiting Tumor Cell Proliferation | |
EP2042597B1 (en) | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis | |
Mukherjee et al. | and Martin T. Zanni | |
US20080200412A1 (en) | Astrocyte Elevated Gene-1 And Its Promoter In Treatments For Neurotoxicity And Malignancy | |
KR100678523B1 (ko) | Pro840 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법 | |
US20040248139A1 (en) | Eit-6, a polypeptide encoded by an estrogen regulated gene | |
Shen et al. | Pin1 Regulates IL-5 Induced Eosinophil Polarization and Migration. Cells 2021, 10, 211 | |
WO2006093494A1 (en) | Astrocyte elevated gene-1 and its promoter in treatments for neurotoxicity and malignancy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041026 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041026 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080415 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090106 |