JPWO2002040644A1 - 外部刺激に対する抵抗性付与剤 - Google Patents
外部刺激に対する抵抗性付与剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002040644A1 JPWO2002040644A1 JP2002543641A JP2002543641A JPWO2002040644A1 JP WO2002040644 A1 JPWO2002040644 A1 JP WO2002040644A1 JP 2002543641 A JP2002543641 A JP 2002543641A JP 2002543641 A JP2002543641 A JP 2002543641A JP WO2002040644 A1 JPWO2002040644 A1 JP WO2002040644A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- resistance
- lectin
- cell
- cona
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/59—Lectins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、動物培養細胞および生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤、並びに該抵抗性付与剤を用いた外部刺激に対する抵抗性を付与する方法およびキットに関する。
背景技術
近年、自家および同種間において、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞および歯髄細胞などの培養細胞の移植が、骨折、変形性関節炎、軟骨損傷、骨髄腫瘍、歯周病、歯髄炎などの軟骨、骨または歯の疾患による軟骨、骨および/または歯根膜や歯髄の欠損を修復するために有効であることが提唱されている。しかし、これらの培養細胞を移植すると、周囲組織または炎症性もしくは免疫系の細胞によって移植細胞が損傷または破壊され、移植組織の脱落、吸収、懐死などが観察される。特に、歯髄細胞は細胞外基質量が少ないために、機械的刺激により容易にはがれ、培養歯髄細胞を移植に供することは困難であった。
移植組織を容易に周囲組織に定着させて組織の修復を促進するためには、移植される組織の細胞が、周囲組織または炎症性もしくは免疫系の細胞による外部刺激、具体的には機械的刺激および/または蛋白質分解反応に対して抵抗性を保持することが重要である。さらに、修復/再生中の間葉系組織、骨組織、軟骨組織、歯根膜組織、歯髄組織における未熟な細胞および/または組織の外部刺激に対する抵抗性を高めることは、種々の骨、軟骨または歯根膜や歯髄の疾患の治療にも有効である。
このため、移植組織をグラスファイバーで包んだり、免疫隔離膜で包むことが行われている。例えば、糖尿病患者に対して、インスリンを産生するマウスのランゲルハンス細胞を免疫隔離膜で包んで移植することが行われている。しかし、人工材料の使用は免疫拒絶を起こしうるとともに、接着強度が弱いという点で問題がある。免疫隔離膜には、免疫系の補体蛋白質は透過させずに細胞が分泌する有益蛋白質は透過させ、さらに酸素と栄養分も十分に透過させる高強度の高分子膜の合成が困難であるという問題がある。(蛋白質 核酸 酵素,Vo.45,No.13(2000),pp.2139−2141,2171−2178,2307−2312)。その他には、免疫抑制剤の使用、培養細胞を用いた人工臓器を作製して体外循環により血液を通すことや、免疫応答の高い欠損・障害部位を避けて免疫細胞による拒絶反応の少ない部位に移植することなどが試みられてきたが、免疫抑制剤による副作用、体外循環による患者の負担、欠損・障害部位が残るなどいずれも問題があった。このため、細胞および/または組織自体に抵抗性を付与することが望まれていた。
一方、レクチンは、主に植物や動物に見出されている、結合特異性を有する結合価が2価以上の糖結合性タンパク質であり、種々の動物・植物細胞を凝集させ、多糖類や複合糖質を沈降させる作用を有する。また、一部のレクチン、例えばコンカナバリンAなどは、T細胞を幼若化する活性を有することが知られている。さらに種々のレクチンの軟骨細胞の分化、増殖に及ぼす効果が検討され、α−D−マンノース残基およびα−D−グルコース残基に親和性を有するレクチン(例えばコンカナバリンA)がプロテオグリカン(proteoglycan)の合成を増大させることなどを指標として軟骨細胞の分化を強く促進することが報告されている(Yan et al.,J.Biol.Chem.,vol.265,pp.10125−10131,1990)。しかし、コンカナバリンAを含むレクチンが、動物細胞、特に培養細胞および/または生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与しうることは知られていない。
発明の開示
従って、本発明の課題は、動物細胞および/または組織に外部刺激に対する抵抗性を付与する薬剤および外部刺激抵抗性を付与する方法を提供することである。
本発明者は、移植に用いるための間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞などの培養細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与することを目的として鋭意研究した結果、レクチンが該細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与しうることを見出した。
従って、本発明は、動物培養細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤を提供する。
本発明はまた、動物細胞および/または組織をレクチンで処理することからなる、細胞および/または組織に外部刺激に対する抵抗性を付与する方法を提供する。前記方法において、レクチン処理は、該レクチンを細胞および/または組織に直接適用するか、または細胞が培養細胞である場合には培地中に添加して当該細胞を培養することからなる。
本発明において、「外部刺激に対する抵抗性」における外部刺激とは、移植する周囲組織または移植体の炎症性もしくは免疫系の細胞による移植組織への刺激であり、具体的には機械的刺激および/または蛋白質分解反応である。
本発明の抵抗性付与剤で処理すべき動物細胞は、任意の動物細胞であるが、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞が好ましい。また該細胞は、哺乳類、例えばげっ歯類(マウス、ラット、ウサギ)、イヌ、サル、ウシ、ヤギおよびヒツジ並びにヒト由来の細胞であるのが好ましく、ヒト由来の細胞であるのが最も好ましい。
本発明において、外部刺激に対する抵抗性付与剤として用いることができるレクチンは、動物細胞に外部刺激抵抗性を付与する作用を有する任意のレクチン、例えば動物由来のレクチンまたは植物由来のレクチンであり、好ましくはコンカナバリンA(ConA)、フィトヘマグルチンE(PHA−E)、フィトヘマグルチンP(PHA−P)または小麦胚レクチン(WGA)、より好ましくはConAまたはPHA−Eである。用いるレクチンの濃度は、レクチンの種類および/または処理すべき細胞により異なるが、培地への添加の場合も一時的処理の場合も共に、0.01〜1000μg/mL、好ましくは0.1〜100μg/mL、さらに好ましくは1〜20μg/mL、最も好ましくは5〜10μg/mLである。また、該動物細胞をレクチンで処理する時間は、用いるレクチンの種類や濃度、処理すべき細胞により異なるが、1分間〜10日以上、好ましくは1〜48時間、例えば24時間である。ConAまたはPHA−Eを用いる場合には、ConAまたはPHA−Eで細胞を一時的に処理するだけでもよいが、ConAまたはPHA−Eの存在下に数分〜数日インキュベートしてもよい。同時に軟骨の分化を促進する目的がある場合には、低濃度のConAまたはPHA−Eの存在下に細胞を長時間培養する。高濃度のConAまたはPHA−Pを所望する場合には、短時間培養とする。
動物細胞
本発明において外部刺激抵抗性を付与すべき動物細胞の例には、前述したとおり間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞が包含される。
間葉系幹細胞は、該細胞を有する任意の骨髄または骨膜から採取することができるが、多量の細胞が採取可能であることおよび採取が容易であることから、大腿骨、脛骨および骨盤(腸骨)から採取するのが好ましい。ヒト以外の哺乳動物については、腸骨および脛骨などからも間葉系幹細胞を採取することができる。
骨芽細胞は、該間葉系幹細胞を骨分化誘導に適する培地、例えば前記M.F.Pittengerらに記載の培地にて培養して骨分化を誘導することにより、インビトロで得ることができる。
軟骨細胞は、任意の軟骨組織、例えば耳介軟骨、肋軟骨、関節軟骨、椎間軟骨および気管軟骨の軟骨細胞から採取することができる。関節軟骨には、下顎関節、上腕関節、肘関節、肩関節、手関節、股関節、腰関節および足関節が包含されるが、何れの関節軟骨でもよい。さらに軟骨細胞は、間葉系幹細胞を遠心管培養系、浮遊培養系、アガロース培養系またはアルギン酸培養系に移して、軟骨分化誘導に適する培地、例えばM.F.Pittengerら,Science 284,pp.143−147,1999年に記載の培地を用いて軟骨細胞を誘導することによりインビトロで得ることができる。
歯根膜細胞は、Shimazuら(Shimazu A.ら,J.Dent.Res.78,pp.1791−1799,1999)の方法に従って抜去歯牙から採取することができる。
歯髄細胞は、Yokoseら(Yokose S.ら,Calcif.Tissue Int.66,pp.139−144(2000))の方法に従って、歯髄から採取することができる。具体的には、歯から歯髄組織を無菌的に取り出し、これを酵素(例えばコラゲナーゼなど)で処理し、遊離した細胞を遠心分離により回収することにより歯髄細胞を採取する。
骨髄由来の間葉系幹細胞の採取方法としては、公知の方法、例えば医療において用いられている任意の採取方法を用いることができる。ヒト以外の哺乳動物について骨髄から該細胞を採取する際には、実験室的方法として例えば骨(大腿骨、脛骨)の両端を切断し、間葉系幹細胞の培養に適する培地で骨内を洗浄して、洗い出された該培養液から間葉系幹細胞を得ることができる。間葉系幹細胞の採取法を具体的に説明する:
(1)ウサギの大腿骨、脛骨の両端を切断する。次いで(例えばDMEM培地)、所望する場合には抗生物質(例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど)およびヘパリンをさらに添加した培地で骨髄内を洗浄する。
(2)ヒト腸骨の場合や歯槽骨の場合は、該腸骨または歯槽骨の骨髄から骨髄液を採取する。
(3)洗い出された培地または骨髄液を300×g、3分程度遠心分離して、凝固塊などを沈澱として除去し、上清中の細胞を組織培養用培養皿に播種する。培養3日後に接着細胞を間葉系幹細胞として計測する。
(4)その後、適当な培地(例えば10%FBS含有DMEM培地)で培養する。
骨膜から該幹細胞を採取するには、当該技術分野において公知の方法を用いることができる[M.Iwasaki et al.,Endocrinology 132,1603−1608(1993);J.Fang & B.K.Hall,Developmental Biol.180,701−712(1996);S.Bahrami et al.,The anatomical Record 259,124−130(2000)]。
軟骨細胞もまた、種々の動物の軟骨組織から公知の方法により採取することができるが、例えばウサギの肋軟骨成長板から加藤らの方法(Kato et al.,J.Cell Biol.,vol.100,pp.477−485,1985)に従い、プロテアーゼ及びコラゲナーゼ処理により軟骨細胞を採取することができる。
得られた間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞は、そのまま播種して培養に供することができるが、通常は適当な培地中にて10〜20日程度培養してから使用する。また、該細胞を凍結保存することもできる。
動物細胞に外部刺激抵抗性を付与する方法
上述のようにして得られた細胞は、例えば次のようにして外部刺激抵抗性が付与される:
(1)得られた細胞、例えば3000個/cm2にて該細胞の培養に適する任意の培地、例えば10%FBS含有DMEM培地中に播種して、ほぼ集密的(confluent)になるまで増殖させる。培養は、動物細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、哺乳動物の細胞の場合、一般的には37℃にて5%CO2存在下で行うのが好ましい。
(2)次いで培地中に種々の濃度、例えば1〜50μg/mLのレクチンを添加し、さらに24時間培養する。
(3)細胞(細胞層)を適当な溶液、例えばPBSで洗浄した後、培地中に静置する。
このように処理された細胞は、外部刺激(例えば機械的刺激および/または蛋白質分解反応)に対して顕著な抵抗性を示すようになる。また、これ以外に生体中の細胞に対してレクチンを適用することにより、生体中の各組織に外部刺激抵抗性を付与することもできる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例1 動物細胞の取得
1)骨髄からの間葉系幹細胞の採取
4週齢ウサギから大腿骨、脛骨を摘出し、筋肉および靱帯などを除去した後、両端を切断する。次いで、DMEM培地(32単位/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシン、および6000単位/mL ヘパリンを含有)で骨髄内を洗浄した。洗い出された培地を300×g、3分遠心分離して、凝固塊などを沈殿として除去した。上清中の細胞を組織培養用の培養皿に播種して3日間培養し、接着細胞を間葉系幹細胞として計測した。
2)腸骨からの間葉系幹細胞の採取
同様に、4週齢ウサギから腸骨を摘出した後、腸骨から骨髄液を採取し、得られた骨髄液を300×g、3分遠心分離して、凝固塊などを沈殿として除去した。上清中の細胞を組織培養用の培養皿に播種して3日間培養し、接着細胞を間葉系幹細胞として計測した。
3)歯根膜細胞の採取
歯根膜細胞を、Shimazuらの方法に従って、抜去歯牙から採取した。
4)歯髄細胞の採取
歯髄細胞は、8週齢のWistar系ラットの下顎切歯より歯髄組織を無菌的に取り出し、その歯髄組織に酵素溶液3ml(0.1%コラゲナーゼ、0.05%トリプシン、4mM EDTA含むPBS)を添加し、37℃で20分間処理し、上清を回収した。この操作を6回繰り返した。回収した細胞を、10%FBS含有DMEM培地を用い10cmディッシュに播種して培養した。70%集密的に達したとき、0.05%トリプシン、0.02%EDTAを含むPBSで37℃、5分間処理し、単離した細胞を回収してこれを歯髄細胞として計測した。
5)軟骨細胞の採取
軟骨細胞としてはウサギの軟骨細胞を用いた。生後4週令のニュージーランド白色ウサギの肋軟骨成長板を外科的に摘出した。次いで、得られた肋軟骨成長板を加藤らの方法に従ってトリプシンおよびコラゲナーゼ処理することにより軟骨細胞を分離した。この方法によりウサギ一羽当たり約4×106個の軟骨細胞が得られた。
6)骨芽細胞の取得
上記1)で得られた間葉系幹細胞を下記の組成の骨分化誘導培地に移した。
骨分化誘導培地
αMEM培地
100nM デキサメタゾン
10mM βグリセロールリン酸
50μg/ml アスコルビン酸−2−リン酸
間葉系幹細胞を、上記培地中で37℃、5%CO2存在下に培養した。2日毎に培地を交換し、12日間培養して骨化を誘導し骨芽細胞を得た。
実施例2 外部刺激に対する抵抗性の検討
1)蛋白質分解反応に対する抵抗性(間葉系幹細胞)
実施例1にて得られた間葉系幹細胞を3000個/cm2の密度で培養皿(10%FBS含有DMEM培地)に播種して、37℃、5%CO2存在下に集密的になるまで7〜10日間培養した。これにレクチンとして5μg/mLのコンカナバリンA(ConA)を添加してさらに24時間培養した。一方、何も添加せずに24時間培養したものを対照群とした。培養した細胞層をPBSで洗浄した後、1)0.25%トリプシン/4mM EDTA含有DMEM培地、2)0.1%コラゲナーゼ(シグマ社typeIA)含有DMEM培地、または3)2mg/mLプロナーゼ含有DMEM培地を添加して、1〜24時間インキュベートした。次いで蛋白分解酵素処置により細胞層から遊離して単離した細胞の数をコールターカウンターを用いて測定した。0.1%コラゲナーゼ含有培地におけるConA添加群、対照群についての結果を図1に示す。5μg/mLのConAは0.1%コラゲナーゼによる細胞の分散を著明に抑制した(図1)。同様な結果が、インキュベート24時間後の0.25%トリプシン/4mM EDTA添加培地および2mg/mLプロナーゼ添加培地でも観察された。
さらに過酷な条件下でのConAの効果を検討するため、間葉系幹細胞に10μg/mLのConAを添加して24時間培養し、得られた細胞層を、0.25%トリプシン+1mM EDTA+0.1%コラゲナーゼ含有DMEM培地を添加して、1〜12時間インキュベートした。次いで遊離した細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、対照群ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ConA処理群では細胞の遊離が顕著に抑制された(図2)。
次に種々の濃度のConAについて抵抗性付与作用を検討した結果、間葉系幹細胞におけるConAによる抵抗性付与作用は1μg/mLから観察され20μg/mLでほぼ最大となった。
2)蛋白質分解反応に対する抵抗性(歯髄細胞)
実施例1にて採取した歯髄細胞を、10%FBSおよび50μg/mLアスコルビン酸含有DMEM培地が入った6穴プレートに2×104細胞/cm2の密度で播種した。細胞が90%集密的に達したとき、培養液を0.5%FBSおよび50μg/mLアスコルビン酸含有DMEM培地に交換して24時間前培養した。次いで同じ培養液に交換し、これにConAを様々な濃度(1,5,10μg/mL)で添加し、24時間処理した。その後、細胞をPBSで洗浄し、0.2%コラゲナーゼを含むDMEM培地を添加し、各々の時間で浮遊した細胞を回収し、コールターカウンターを用いて細胞数を測定し、細胞層から遊離した割合を算定した。
その結果、ConA処理していない対照群ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ConA処理群(1,5,10μg/mL)ではコラゲナーゼによる細胞の分散が著明に抑制された(図3参照)。
実施例1にて得られた軟骨細胞、歯根膜細胞および間葉系幹細胞から作成した骨芽細胞について同様な実験をした。その結果、5μg/mLおよび10μg/mLでのConA処理は、トリプシン、コラゲナーゼおよびプロナーゼの各種蛋白分解酵素による各細胞の細胞層からの遊離を顕著に抑制した。これは、ConA処理により各細胞に、蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すものである。これらの結果を下記の表にまとめる。
3)機械的刺激に対する抵抗性の付与
2)の操作に従って歯髄細胞をConA(10μg/mL、24時間)で処理した後、細胞層をPBSで洗浄した。次に該細胞を、DMEM培地中にてシェーカー(Water Bath Shaker,Personal−11,TAITEC社製)を用いて1分間に80回震盪する条件にて5分間機械的に震盪し、培養皿から剥離した細胞数を計測した。その結果、対照群では細胞が培養皿より剥離したが、ConA処理群ではほとんど剥離しなかった。この結果を下記の表2に示す。
4)細胞外基質プロテオグリカンの分解に対する抵抗性
細胞外基質プロテオグリカンの分解に対する抵抗性を、Shimazuら(Arthritis and Rheumatism,Vol.36,pp.247−253)の方法に従って、[35S]ラベルしたプロテオグリカンの遊離を測定することにより試験した。実施例2−1)と同様にウサギ肋軟骨由来の軟骨細胞を集密的になるまで培養した。次いで集密的になった細胞を[35S]−硫酸とともに24時間インキュベートし、軟骨細胞外基質の主要成分であるプロテオグリカンを[35S]でラベルした。細胞層を血清非含有培地(PBS)でよく洗浄して、次いで10μg/mLのConA在在下(ConA処理群)またはは非存在下(対照群)にて37℃でインキュベートして、2、4、6、8、10日後に培地を一部採取し、分解して培地に遊離した[35S]−プロテオグリカンを測定した。その結果、ConA処理が細胞外基質プロテオグリカンの分解と培地への遊離を抑制することが判明した(図4)。
実施例3 インビボでの抵抗性の検討
実施例1にて得られたウサギ軟骨細胞8×104個を1mLの10%FBS、50μg/mLアスコルビン酸含有MEM培地に播種し、37℃、5%CO2存在下にて遠心管培養系で3週間培養した。その間、10μg/mLのConAを2回添加した。その際、ConAは細胞増殖を抑制するため、培養による組織量の変化はなかった。次いで培養により得られた軟骨組織を同系統のウサギ皮下へ移植し、3週間後に移植組織を摘出した。その組織切片を作成し、移植された軟骨組織を観察するため、切片をトルイジンブルーにて染色し、その組織を観察した。その結果、対照群では数層の軟骨、骨組織であるのに対して、ConA添加群では組織の厚さがおよそ2倍に増加していた(図5)。これは、ConA処理が移植した軟骨細胞/組織に外部刺激に対する抵抗性を付与し、これにより移植体において移植組織の定着が向上することが示された。
実施例4 各種レクチンの検討
他のレクチンについてConAと同様に動物細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与し得るかを検討した。なお、本実施例ではConA以外のレクチンとして、フィトヘマグルチンE(PHA−E)、小麦胚レクチン(WGA)を用いた。
実施例1−1)に従ってマウス骨髄由来の間葉系細胞を採取した。実施例2と同様に細胞を播種し、10%FBS含有αMEM培地中で培養した。次いで、得られたマウス間葉系細胞に各種レクチンを5μg/mLまたは10μg/mLの濃度で添加し、37℃で3時間インキュベートした。ここでレクチン処理しないものを対照とした。細胞層をPBSで洗浄した後、0.25%トリプシン+1mMEDTAを添加して37℃で15分間インキュベートした。次いで実施例2に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、対照ではほとんどの細胞が遊離したのに対し、ConA処理群、PHA−E処理群では5μg/mL、10μg/mLにて細胞の遊離が顕著に抑制された(図6)。また、WGA処理群では5μg/mLでは細胞が遊離したものの、10μg/mLでは細胞の遊離が抑制された。これらの結果から、PHA−EがConAと同様に、顕著に優れた作用を有することが示された。
実施例5 レクチン濃度の検討
ConAおよび実施例4にて効果が示されたPHA−Eについて、種々の濃度における抵抗性の付与の効果を詳細に検討した。
実施例1で得られたウサギ骨髄由来の間葉系細胞を10%FBS含有αMEM培地中で培養し、集密的になる前に種々の濃度(0.01,0.1,0.5,1,2,5または10μg/mL)のConAまたはPHA−Eを添加し、37℃で3時間インキュベートした。細胞層をPBSで洗浄した後、0.25%トリプシン+1mM EDTAを添加して37℃で15分間インキュベートした。次いで実施例2に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、ConAおよびPHA−E共に0.01〜0.1μg/mLという低濃度においても効果があり、特にPHA−EはConAより低濃度で強い効果を有することが示された(図7)。
実施例6 レクチン処理時間の検討
ConA、PHA−Eが細胞にプロテアーゼに対する抵抗性を付与する必要な時間(処理時間)について検討した。
実施例4と同様にマウス骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。次に、トリプシン処理(0.25%トリプシン+1mM EDTA)の前60分、20分、10分、5分、2分、1分または0分に5μg/mLの濃度のConAまたはPHA−Eを添加した。なお、0分ではレクチンとトリプシンを同時に添加した。トリプシン処理後、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、レクチンで10〜20分間処理することによりほぼ最大のプロテアーゼに対する抵抗性が細胞に付与された(図8)。
実施例7 各種プロテアーゼに対する効果の検討
ConA、PHA−Eが蛋白質分解反応として各種プロテアーゼに対して効果を有するかを検討した。
実施例4と同様にマウス骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。次いでレクチンとしてConAまたはPHA−Eを5μg/mLの濃度で添加し、37℃で20分間インキュベートした。細胞層をPBSで洗浄した後、血清(10%FBS)含有αMEM培地または血清不含αMEM培地を添加した。各種プロテアーゼとして、血清不含αMEM培地には0.25%トリプシン(tri)+1mM EDTAまたは0.5%トリプシン(tri)を添加し、血清含有αMEM培地には50U/mLディスパーゼまたは1mg/mLプロナーゼを添加し、37℃で15分間インキュベートした。次いで実施例2に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。その結果、レクチン未処理群(−)ではほとんどの細胞が培地中に遊離したのに対し、レクチン処理群(+)ではConAとPHA−Eともに細胞の遊離が顕著に抑制された(図9)。これは、ConAおよびPHA−Eの効果が、特定のプロテアーゼに対するものではなく、種々のプロテーゼによる蛋白質分解反応に及ぶことを示す。
実施例8 各種動物細胞の検討
線維芽細胞系、上皮細胞系、筋芽細胞系の各種細胞および細胞系に対してレクチンが抵抗性を付与し得るかを検討した。
(1)細胞
組織から採取・培養した細胞(非セルライン)に加えて知られている種々の細胞系(セルライン)についてもレクチンが効果を奏するかを調べた。ここで用いた細胞および細胞系を下記に示す。
細胞(非セルライン) 細胞形態
ウサギ骨髄細胞(BMC) 線維芽細胞
ラット歯髄細胞 線維芽細胞
ラット骨膜細胞 線維芽細胞
ラット横隔膜細胞 線維芽細胞
ヒト歯肉細胞 線維芽細胞
細胞系(セルライン) 由来
・線維芽細胞系
10T1/2 マウス,C3H,胎児
MC3T3−G2/PA6 マウス,C57BL/6
MC3T3−E1 マウス,C57BL/6
・上皮細胞系
BCE ウシ,角膜
ATDC5 マウス,129
HBL−100 ヒト,乳腺
COS−7 サル、腎臓
HeLa ヒト,子宮
HepG2 ヒト,肝臓
・筋芽細胞系
C2C12 マウス,C3H,筋肉
(2)実験
実施例4と同様に各種細胞を播種して培養した。レクチンとしてConAまたはPHA−Eを1μg/mL、5μg/mLまたは10μg/mLの濃度で添加し、37℃で20分間インキュベートした。細胞層をPBSで洗浄した後、0.25%トリプシン(tri)+1mM EDTAを添加し、37℃で15分間インキュベートした。次いで実施例2に従って、細胞層中に残存する細胞数をコールターカウンターを用いて測定した。
(3)結果
組織から採取・培養した細胞(非セルライン)では、ConAおよびPHA−Eともに5〜10μg/mLの濃度にて細胞層からの細胞の遊離が抑制された(図10)。確立された細胞系(セルライン)では、線維芽細胞系(図11)、上皮細胞系(図12)および筋芽細胞系(図13)のいずれの場合おいてもConAおよびPHA−Eともに5〜10μg/mLの濃度にて細胞層からの細胞の遊離が抑制された。これらの結果から、ConAおよびPHA−Eは、線維芽細胞系、上皮細胞系、筋芽細胞系の各種細胞および細胞系に蛋白質分解反応に対する抵抗性しうることが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、動物細胞、特に哺乳類細胞(例えば間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞)およびその培養細胞並びに生体中の各種組織に外部刺激に対する抵抗性を付与するための、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤が提供される。本発明の外部刺激抵抗性付与剤を用いることにより、該動物細胞および/または組織に機械的刺激および/または蛋白質分解反応に対して抵抗性が付与され、該細胞および/または組織並びにこれらを培養して得られる移植用組織の移植体中における定着性が向上する。このため、本発明の抵抗性付与剤は、修復/再生中の間葉系組織、骨組織、軟骨組織、歯根膜組織、歯髄組織の移植が必要とされる種々の骨、軟骨または歯の疾患の治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
図1は、ConA処理により間葉系幹細胞に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図2は、ConA処理により間葉系幹細胞に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図3は、ConA処理により歯髄細胞にコラゲナーゼ処理に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図4は、ConA処理が軟骨細胞の細胞外基質であるプロテオグリカンの分解と培地中への遊離を抑制したことを示すグラフである。
図5は、ConA処理より軟骨移植体において移植組織の定着が向上したことを示す顕微鏡写真である。
図6は、種々のレクチンについての蛋白質分解反応に対する抵抗性の付与の効果を示すグラフである。
図7は、種々の濃度におけるのConAおよびPHA−Eの効果を示すグラフである。
図8は、ConA、PHA−Eが蛋白質分解反応に対する抵抗性を付与する必要な処理時間を示すグラフである。
図9は、ConAおよびPHA−Eが、種々のプロテーゼによる蛋白質分解反応に対して抵抗性を付与しうることを示すグラフである。
図10は、ConA、PHA−Eにより線維芽細胞(非セルライン)に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図11は、ConA、PHA−Eにより線維芽細胞系の細胞(セルライン)に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図12は、ConA、PHA−Eにより上皮細胞系の細胞(セルライン)に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
図13は、ConA、PHA−Eにより筋芽細胞系の細胞(セルライン)に蛋白質分解反応に対する抵抗性が付与されたことを示すグラフである。
Claims (18)
- 動物細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与する、レクチンを有効成分とする抵抗性付与剤。
- レクチンがコンカナバリンAである請求項1に記載の抵抗性付与剤。
- レクチンがフィトヘマグルチンEである請求項1に記載の抵抗性付与剤。
- レクチンを0.01〜1000μg/mLの濃度で含有する請求項2または3に記載の抵抗性付与剤。
- 外部刺激が機械的刺激および/または蛋白質分解反応である請求項1〜4のいずれかに記載の抵抗性付与剤。
- 動物細胞が、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞からなる群から選択される請求項1〜5のいずれかに記載の抵抗性付与剤。
- 前記細胞がヒト由来である請求項1〜6のいずれかに記載の抵抗性付与剤。
- 前記細胞が培養細胞である請求項1〜7のいずれかに記載の抵抗性付与剤。
- 動物細胞をレクチンで処理することを特徴とする、細胞に外部刺激に対する抵抗性を付与する方法。
- レクチンがコンカナバリンAである請求項9に記載の方法。
- レクチンがフィトヘマグルチンEである請求項9に記載の方法。
- レクチンを0.01〜1000μg/mLの濃度で用いる請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- 外部刺激が機械的刺激および/または蛋白質分解反応である請求項9〜12のいずれかに記載の方法。
- 動物細胞が、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、線維芽細胞、上皮細胞および筋芽細胞からなる群から選択される請求項9〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞がヒト由来である請求項9〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が培養細胞である請求項9〜15のいずれかに記載の方法。
- 請求項9〜16のいずれかに記載の方法により得られ、外部刺激に対して抵抗性を有する細胞塊および/または組織。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の抵抗性付与剤を使用するキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002543641A JP4703943B2 (ja) | 2000-11-15 | 2001-10-17 | 外部刺激に対する抵抗性付与剤 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000348469 | 2000-11-15 | ||
JP2000348469 | 2000-11-15 | ||
JP2002543641A JP4703943B2 (ja) | 2000-11-15 | 2001-10-17 | 外部刺激に対する抵抗性付与剤 |
PCT/JP2001/009118 WO2002040644A1 (fr) | 2000-11-15 | 2001-10-17 | Agent conferant une resistance a des stimuli exterieurs |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002040644A1 true JPWO2002040644A1 (ja) | 2004-03-25 |
JP4703943B2 JP4703943B2 (ja) | 2011-06-15 |
Family
ID=18822057
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002543641A Expired - Fee Related JP4703943B2 (ja) | 2000-11-15 | 2001-10-17 | 外部刺激に対する抵抗性付与剤 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6992178B2 (ja) |
JP (1) | JP4703943B2 (ja) |
WO (1) | WO2002040644A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8697139B2 (en) | 2004-09-21 | 2014-04-15 | Frank M. Phillips | Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells |
US20100145032A1 (en) * | 2007-01-18 | 2010-06-10 | Suomen Punainen Risti, Veripalelu | Novel carbohydrate profile compositions from human cells and methods for analysis and modification thereof |
WO2008087257A1 (en) * | 2007-01-18 | 2008-07-24 | Suomen Punainen Risti, Veripalvelu | Novel methods and reagents directed to production of cells |
US20100304478A1 (en) * | 2007-08-06 | 2010-12-02 | Bio Link, Incorporated | Method for isolating renal stem/progenitor cells, renal stem/progenitor cells and therapeutic agent for renal disease |
EP2315828B1 (en) * | 2008-07-11 | 2015-07-01 | Glykos Finland Oy | Method for culturing induced pluripotent stem cells with a lectin |
US20100120142A1 (en) | 2008-07-11 | 2010-05-13 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Culture of human embryonic cells |
US10328103B2 (en) | 2009-01-03 | 2019-06-25 | Ray C. Wasielewski | Medical treatment composition comprising mammalian dental pulp stem cells |
US8470308B2 (en) * | 2009-01-03 | 2013-06-25 | Ray C. Wasielewski | Enhanced medical implant comprising disrupted tooth pulp and tooth particles |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08319300A (ja) * | 1995-03-17 | 1996-12-03 | Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad | レクチンの固定化法及びそれを用いた細胞用基材 |
WO1999015628A1 (en) * | 1997-09-25 | 1999-04-01 | Glycotech Corporation | Methods and compositions for binding hematopoietic stem cells |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2997771B2 (ja) * | 1998-06-29 | 2000-01-11 | 金沢大学長 | 細胞の懸濁培養方法 |
-
2001
- 2001-10-17 WO PCT/JP2001/009118 patent/WO2002040644A1/ja active Application Filing
- 2001-10-17 US US10/416,178 patent/US6992178B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-17 JP JP2002543641A patent/JP4703943B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08319300A (ja) * | 1995-03-17 | 1996-12-03 | Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad | レクチンの固定化法及びそれを用いた細胞用基材 |
WO1999015628A1 (en) * | 1997-09-25 | 1999-04-01 | Glycotech Corporation | Methods and compositions for binding hematopoietic stem cells |
Non-Patent Citations (15)
Title |
---|
EXP. CELL RES.(1982),VOL.142,NO.2,P.471-476, JPN4007018658, ISSN: 0000896251 * |
EXP. CELL RES.(1982),VOL.142,NO.2,P.471-476, JPN6008005455, ISSN: 0000974954 * |
EXP. CELL RES.(1982),VOL.142,NO.2,P.471-476, JPN6008026334, ISSN: 0001054621 * |
J. BIOL. CHEM.(1990),VOL.265,NO.17,P.10125-10131, JPN4007018656, ISSN: 0000896249 * |
J. BIOL. CHEM.(1990),VOL.265,NO.17,P.10125-10131, JPN6008005451, ISSN: 0000974952 * |
J. BIOL. CHEM.(1990),VOL.265,NO.17,P.10125-10131, JPN6008026330, ISSN: 0001054619 * |
J.BIOL.CHEM.(1997),VOL.272,NO.12,P.7833-7840, JPN4007018657, ISSN: 0000896250 * |
J.BIOL.CHEM.(1997),VOL.272,NO.12,P.7833-7840, JPN6008005453, ISSN: 0000974953 * |
J.BIOL.CHEM.(1997),VOL.272,NO.12,P.7833-7840, JPN6008026332, ISSN: 0001054620 * |
広島大学歯学雑誌(1997),VOL.29,NO.1,P.40-57, JPN4007018660, ISSN: 0000896253 * |
広島大学歯学雑誌(1997),VOL.29,NO.1,P.40-57, JPN6008005459, ISSN: 0000974956 * |
広島大学歯学雑誌(1997),VOL.29,NO.1,P.40-57, JPN6008026339, ISSN: 0001054623 * |
関節外科(1996),VOL.15,NO.3,P.297-301, JPN4007018659, ISSN: 0000896252 * |
関節外科(1996),VOL.15,NO.3,P.297-301, JPN6008005457, ISSN: 0000974955 * |
関節外科(1996),VOL.15,NO.3,P.297-301, JPN6008026336, ISSN: 0001054622 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6992178B2 (en) | 2006-01-31 |
WO2002040644A1 (fr) | 2002-05-23 |
US20040121301A1 (en) | 2004-06-24 |
JP4703943B2 (ja) | 2011-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bunpetch et al. | Strategies for MSC expansion and MSC-based microtissue for bone regeneration | |
EP1456357B1 (en) | Pluripotent embryonic-like stem cells derived from teeth and uses thereof | |
JP2001502905A (ja) | ホウォートンゼリーから分離した細胞を用いた軟骨組織の形成 | |
US8574614B2 (en) | Surgical grafts for repairing chondral defects | |
CN101035890B (zh) | 经物理/物理化学刺激处理的无定形细胞递送载体 | |
JP2002502226A (ja) | 三次元軟骨培養物 | |
JP6687757B2 (ja) | 3d軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 | |
KR101718669B1 (ko) | 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법 | |
US20040030404A1 (en) | Method for cultivating a cartilage replacement and a biomatrix produced according to this method | |
US20190015551A1 (en) | Construct for preventing immunological rejection generated when used in transplants, and method for using collagen in a gel state, in the form of dry lyophilised spongy mouldings and 3d matrices | |
BRPI0616708A2 (pt) | métodos para diferenciar células-tronco e uso das mesmas no tratamento de condições dentárias | |
KR20160095677A (ko) | 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법 | |
JP4703943B2 (ja) | 外部刺激に対する抵抗性付与剤 | |
US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
US20030215426A1 (en) | Redifferentiated cells for repairing cartilage defects | |
KR20060107897A (ko) | 이식용 연골 조성물 | |
CN108795866A (zh) | 基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法 | |
CN111214707A (zh) | 一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨及其构建方法 | |
CN103857788A (zh) | 生长和分化因子8(gdf-8)的用途 | |
KR100759388B1 (ko) | 치조골 골수 유래 성체 줄기세포의 골아세포 분화 방법 | |
Abarrategi et al. | rhBMP-2/chitosan film as titanium implant coating: in vitro characterization and in vivo bone formation | |
Hutmacher et al. | Bone repair and adult stem cells | |
Both | Embryonic stem cells in bone tissue engineering | |
Niechoda et al. | IN VITRO BEHAVIOR OF OSTEOGENICALLY STIMULATED SHEEP AND RABBIT ADIPOSE–DERIVED STROMAL FRACTIONS | |
WO2012048755A1 (en) | Er-alpha-17p peptide, effects on stem cell differentiation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040116 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040116 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20040116 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040116 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040116 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040827 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070918 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071115 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080313 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080313 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20080507 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20080530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110114 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110309 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |