JPS648789B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、エンドキシン類の存在を決定するた
めの改良されたカブトガニ（limulus lysate）溶
解物法および改良された溶解物試薬に関する。 カブトガニ、Limulus Polyphemus、の血リン
パは変形細胞を含有する。これらの変形細胞の溶
解は、エンドキシンと反応してゲルを形成する物
質を遊離する。カブトガニの変形細胞溶解物（以
後時々“LAL”または“溶解物”と呼ぶ）とエ
ンドキシンとの間のこの反応は、製薬的もしくは
医学的に興味ある種々の流体中のエンドキシンを
検出もしくは定量する方法の基準をつくる。しか
しながら、この試験はある生成物、たとえば、脂
質乳濁、塩溶液および血漿生成物中のエンドキシ
ン類の存在を決定するために使用されるが、これ
らの生成物は存在するエンドキシン類の反応を変
え、溶解物との反応をさせにくくすることがあ
る。これは反応性を減少して、これらの生成物中
のエンドキシンの検出を不適切とする。 本発明の目的は、エンドキシンとLALとの間
の反応を妨害する傾向のある生成物中のエンドキ
シンの存在を検出または決定するために適した
LAL法を提供することである。 本発明によれば、存在するエンドキシンと
LALとの間の反応を妨害し、これにより決定を
不適切にするある流体中のLALにより、エンド
キシン決定条件下にエンドキシンの存在を決定す
る生体外試験法の改良が提供される。この改良
は、前記妨害を減少するための妨害減少量の水溶
性妨害減少剤と、妨害減少剤のキレート化能力に
打ち勝つのに十分な２価の陽イオンとの存在下に
前記方法を実施することからなる。 本発明の実施において使用する流体は、通常非
経口的に投与され、そして静脈内供給用の脂質乳
濁液、たとえば、植物油の水性乳濁液、たとえ
ば、５〜30重量％の濃度で入手できる大豆油；た
とえば米国薬局方の注射用、潅注用および吸入用
塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液のような
塩溶液；および血液誘導体、たとえば、５％〜25
％Ｗ／Ｖで入手できる、正常の血清アルブミン、
血漿たんぱく質分屑および抗血友因子USP、免
疫グロブリン、Rho(D)免疫グロブリンおよび抗ヒ
トグロブリン血清を包含する。 本発明において有用な妨害減少剤は、重量平均
分子量が少なくとも1000、好ましくは1600〜
200000、より好ましくは1600〜50000であり、そ
して脂肪族不飽和基の重合により誘導される実質
的に線状の連続な炭素鎖を有する高分子電解質で
ある。こうして、この型の高分子電解質は、実質
的に線状の連続な炭素原子の分子に沿つて分布し
た、多数の側鎖を有するエチレン系ポリマーであ
る。側鎖は炭化水素基、カルボン酸基またはそれ
らの誘導体、アミノアルキル基、アルコキシ基お
よび他の有機基であることができ、それらの基の
数および親水性基と疎水性基との相対的比率はき
わめて多くのイオン化可能な基を有する水溶性重
合体化合物を生成するようなものである。ここで
使用する表現“水溶性”ポリマーとは、水溶性ポ
リマーおよび水の存在で膨潤し、少なくともある
程度溶解する難溶性ポリマーと均質混合物を形成
するものを包含する。 適当な高分子電解質はアクリル酸誘導体のポリ
マーたとえばアクリル酸、そのアルカリ金属塩、
例、ナトリウム塩、カリウム塩およびアンモニウ
ム塩、アクリルアミド、アクリロニトリル、アク
リル酸のＮ−アルキル置換アミド、Ｎ−アミノア
ルキルアミド、および対応するＮ−アルキルアミ
ノアルキル置換アミド、アミノアルキルアクリレ
ート、アミノアルキルメタクリルアミドおよびＮ
−アルキル置換アミノアルキルエステルのポリマ
ーである。これらのポリマー組成物は、ホモポリ
マーであることができ、あるいは他の共重合モノ
マー、たとえば、エチレン、プロピレン、イソブ
チレン、スチレン、α−メチルスチレン、酢酸ビ
ニル、ギ酸ビニル、アルキルエステル、アクリロ
ニトリル、メタクリロニトリル、塩化ビニル、塩
化ビニリデン、マレイン酸アルキルおよびフマル
酸アルキルとのコポリマー、およびそれらとコポ
リマーを形成することが可能な他のオレフイン系
モノマーであることができる。前述のアルキル基
は１〜６個の炭素原子を含有する。少なくとも20
モル％、好ましくは50モル％、より好ましくは80
モル％のアクリル酸誘導体を有する、この型のコ
ポリマーは、好ましくは、ことにコモノマーが疎
水性であり、すなわち、イオン性基をもたないと
き、好ましい。 この型のポリマーは、適当なモノマー、たとえ
ば、親水性基、たとえば、カルボキシル基を含有
するモノマーを直接に重合または共重合すること
により、製造することができる。他の高分子電解
質のポリマーは、ポリマーおよびコポリマーの引
き続く反応により製造できる。たとえば、ニトリ
ル基を含有するポリマーを加水分解して水溶性ア
ミドおよびカルボキシ含有ポリマーを生成し、あ
るいは水素化してアミノ含有ポリマーを生成でき
る。このようなポリマーまたはコポリマーを加水
分解するとき、それらは加水分解可能な基の25％
〜100％程度に、好ましくは少なくとも80％の程
度に加水分解する。 とくに好ましいポリマーは、重量平均分子量が
約2000のポリアクリル酸；分子量が1600の、75モ
ル％のアクリル酸と25モル％のアクリルアミドの
ナトリウム塩とのコポリマー；およびアクリロニ
トリルコポリマーを酸で50モル％程度に加水分解
してアクリロニトリル−アクリル酸コポリマーを
生成したものを包含する。 このような高分子電解質は酸型で使用されると
き、それらはLAL試験法中塩型に変えられる。 前述のように、前述の妨害減少剤は通常２価の
陽イオンをキレート化する。すなわち、減少剤の
キレート化能力を減少しまたはそれに打ち勝つた
めに２価の陽イオンを含むことが必要である。通
常、これはこの能力に打ち勝つために十分な量、
一般に妨害減少剤のカルボキシル基１モルあたり
約0.05〜1.0モル、好ましくは0.1〜0.5モル％であ
る。これは後述する溶解物の感受性を増加するた
めに使用する２価の陽イオンのほかに使用する。
通常、この２価の陽イオンは妨害減少剤と組み合
わせる。こうしてアルカリ金属塩の妨害減少剤の
場合において、２価の陽イオンとの組み合わせ
は、混合塩、たとえば、分子量が1600である約75
モル％のアクリル酸と約25モル％のアクリルアミ
ドとのコポリマーのナトリウムカルシウム塩を形
成する。 本発明の試薬によれば、米国薬局方基準エンド
キシンEC−２標準で少なくとも0.25ナノグラ
ム／mlの適当な感受性をもつLAL、妨害減少量
の前述の妨害減少剤の１種、および前記減少剤の
キレート化能力に打ち勝つために十分な２価の陽
イオンを含有する試薬が提供される。この試薬は
好ましくは凍結乾燥する。 LALは、ここに引用によつて加える英国特許
1522127に記載されている方法により製造できる。 たとえば、リムリス・ポリフエムス（Limulus
polyphemus）の健康な標準からの血リンパを、
一般に、LevinおよびBang−−“Clottable
protein in Limulus：Its Localization and
Kinetics of Its Coagula tion by Endotoxin”、
Thromb.Diath.Haemorrh 19：186−197（1968）
に記載されているように、抗凝固食塩溶液中に集
める−−変形細胞を集め、そして抗凝固食塩溶液
で洗浄しそして遠心分離する。 分離した変形細胞を水中に懸濁し、そしてこの
細胞の浸透分裂が複数回の機械的撹拌によつて補
われる。細胞の切片を溶解物から遠心分離し、溶
解物の画分を集め、０〜４℃で貯蔵する。 エンドキシンに対する溶解物の感受性を、異な
る感受性の溶解物の他のバツチによる希釈または
それとの混合により、所望レベルの感受性に調整
する。この溶液を、適当な緩衝剤、たとえば、ト
ロメタミン〔トリス−（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン〕およびトロメタミン塩酸塩で、PH範囲
6.5〜7.5に調整する。 前述のように調整した緩衝溶解物溶液を、血清
の小びん、たとえば、1.2mlまたは5.2mlの溶液を
含有する小びんに分割し、そして分割した溶液を
凍結乾燥する。凍結乾燥後、小びんを密閉し、冷
蔵する。 凍結乾燥した溶解物は白色粉末の形または白色
のもろいペレツトである。 エンドキシンに対する溶解物の感受性は、低濃
度の２価の陽イオンと１価の陽イオンを含めるこ
とによつて増加する。カルシウムイオンは好まし
い２価のイオンであるが、他のアルカリ土類金属
イオン、たとえば、マグネシウムイオンまたは他
の２価のイオンを使用できる。ナトリウムイオン
は好ましい１価のイオンであるが、他の１価のイ
オン、ことにアルカリ金属イオン、たとえば、リ
チウムイオンを使用できる。塩化物（CaCl₂、
NaClなど）はこれらの加えるイオンの便利な源
であるが、他の塩を使用できる。好ましくはこれ
らの電解質はエンドキシン感受性を増加する量で
加え、たとえば、凍結乾燥した溶解物を再構成す
るとき、２価のイオン（例、Ca⁺²）の濃度が
0.0001〜0.1モルの濃度範囲であり、そして１価
の陽イオン（例、Na⁺）の濃度が0.001〜0.1モル
濃度の範囲であるような量で加える。 前述の作業のすべては、最終生成物が滅菌され
かつエンドキシンを含有しないことを確保する条
件下で、実施する。エンドキシン類を含有しない
ようにする方法は、この分野で知られている。た
とえば、無機添加剤（CaCl₂、NaCl）は、乾燥
した塩を250℃に少なくとも120分間加熱すること
によつて、エンドトキシン非含有とすることがで
きる。有機添加剤類は、それらの融点のため、通
常溶かさなくてはならず、そしてこの溶液を121
℃において60分間以上オートクレープ処理して存
在するかもしれないエンドキシンを分解しなくて
はならない。 エンドキシン類を決定する方法についての一般
的説明は、前記英国特許に記載されている。 通常、凍結乾燥した溶解物を、十分な滅菌した
発熱原不含水で再構成する。それを一定量づつ、
たとえば、0.1mlずつ試験管中に分配し、エンド
キシンについて試験する等量の液体と混合する。
ゲルの形成は、エンドキシンの存在を示す。 この方法は、エンドキシン決定条件下で、十分
な量の、たとえば、0.01〜１mlの適当な活性、た
とえば、0.01〜0.25nｇ／ml米国薬局方基準エン
ドキシンEC−２の再構成した溶解物を用いて実
施する。このような条件は、適当な反応時間、た
とえば、10分〜60分、反応温度、たとえば、36℃
〜40℃、決定中PH約6.0〜8.0を維持するための緩
衝剤、たとえば、Tris HClの使用を包含する。 本発明によれば、妨害減少剤は溶解物エンドキ
シン反応の間、好ましくは全反応中存在する。有
利には、妨害減少剤は溶解物の前に試験すべき液
体へ加え、あるいは凍結乾燥前にLAL試薬中に
混合する。それは妨害減少量で使用し、たとえ
ば、それを試験前に溶解物へ加える場合、それは
試験試料の合計の体積に基づいて0.05％Ｗ／Ｖ〜
3.0％Ｗ／Ｖ、好ましくは0.4％Ｗ／Ｖの量で使用
し、そしてそれを試薬中に加え、凍結乾燥すると
き、それは溶解物溶液の体積に基づいて約0.05％
Ｗ／Ｖ〜約3.0％Ｗ／Ｖ、好ましくは0.4％Ｗ／Ｖ
の量で使用する。 次の実施例により本発明を説明する。すべての
部は、特記しないかぎり、重量による。 実施例 記載するすべての作業は、最終生成物が滅菌さ
れておりかつエンドキシンを含有しないことを確
保する条件下に、実施する。 実施例 １ リムルス・ポリフエムス（Limulus・
polyphemus）の健康な標本からの血リンパを、
LevinおよびBang（1969−上を参照）により概説
されているように、食塩の抗凝固溶液中に集め
た。変形細胞を遠心分離器中に集め、食塩の抗凝
固溶液で洗浄する。 分離した変形細胞を水中に懸濁し、変形細胞の
浸透分裂を複数回の機械的撹拌によつて完結させ
た。細胞の切片を溶解物から遠心分離し、溶解物
の画分を集め、０〜４℃で貯蔵する。 エンドキシンに対する溶解物の感受性を、所望
レベルの感受性に調整する。この溶液を、トロメ
タミン〔トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン〕およびトロメタミン塩酸塩により6.5〜7.5
のPH範囲に緩衝し、そして塩化カルシウムを0.01
モルとし、塩化ナトリウムを0.077モルとする。
添加剤のすべては前もつてエンドキシン類不含と
しておく。 次いで緩衝した溶解物（）を血清小びん中に
分割して、各小びんに5.2mlの溶液を収容し、次
いで分割した溶液を凍結乾燥する。凍結乾燥後、
小びんを密閉し、冷蔵する。 ５mlの米国薬局方注射用滅菌水、50mgのCa
（OH）₂を５mlの水中の43％Ｗ／Ｖのポリアクリ
ル酸−ポリアクリルアミドコポリマー（75モル％
の酸25モル％のアクリルアミド）ナトリウム塩、
分子量1600に加えることによつて、妨害減少剤
（）を調製する。この溶液を121℃で30分間オー
トクレープ処理して脱発熱原し、次いで0.2mlの
12NのHClでPH7.5に調整する。次いで4.0mlの
（）を、前述したように調製した、200mlの緩衝
した溶解物（）溶液に、凍結乾燥前に、加え
る。次いで、得られる妨害減少溶解物溶液（）
を血清小びん中に分割し、各小びんが5.2mlの溶
液を含有するようにし、そして分割した溶液を凍
結乾燥するようにする。凍結乾燥後、小びんを密
閉し、冷蔵する。 無菌条件とエンドキシンの外部からの導入がな
いことを確保する条件下で、次の作業を実施し
た。 次の溶液の各々の中のE.coli055：B5エンドキ
シンから、系統的に希釈したエンドキシン溶液を
調整した：米国薬局方注射用滅菌水；20％の脂質
乳濁液（Cutter Labs製のIntra Lipid）；および
血漿たんぱく質切片（Cutter Labs製）。次いで
これらの系統的に希釈したエンドキシン試料を、
溶解物（）と妨害減少溶解物（）の両者で試
験した。試験は溶解物（）および（）を5.2
mlの米国薬局方注射用滅菌水で再構成し、次いで
数秒間おだやかに渦を巻かせることによつて残留
物を完全に溶解した。再構成した溶解物（）お
よび（）の0.1mlのアリコートを10mm×75mmの
試験管中に分配する；各試験管中に上のように調
整した適当な系統的に希釈したエンドキシンから
0.1mlを加えた。試験管をおだやかに渦を巻かせ
て混合し、次いで静置して37℃で60分間保温し
た。 この時間の終りにおいて、LAL試験において
陽性の結果を与えたエンドキシンの最小濃度とし
て、力価を決定した。試験管を180゜転倒したとき
その一体性を維持するクロツトを形成した場合、
試験を陽性とし、180゜に完全に転倒する前にゲル
が壊れた場合、陰性とした。この分野で普通であ
るように、LALによるエンドキシンの検出を妨
害しない流体は、注射用滅菌水の力価と、２倍希
釈で±１異ならない力価を生ずるであろう。 適当な溶解中のエンドキシン濃度についての試
験結果を、下に記載する：

【表】 屑
実施例 ２ 溶解物（）と妨害減少剤（）は、実施例１
において前述したように調製した。 系統的希釈したエンドキシン溶液をE.
coli055：B5エンドキシンまたはUS参照エンドキ
シンEC−２から、次の溶液の１種または２種以
上を用いて、調製した：米国薬局方注射用滅菌
水；５％のアルブミン（Cutter Labs）；0.9％米
国薬局方のNaCl（Travenol）：10％の脂質乳濁液
（Cutter）；および血漿たんぱく質切片（Cutter）。
試料を各適当な系統的に希釈した溶液から取り出
し、そして溶解物（）で検査した。これらの試
料を取り出した後、妨害減少剤（）を加えて２
％Ｖ／Ｖ（0.1mlのプラス５mlの試料）の濃度に
した。溶液をよく混合し、次いでもう一度溶解物
（）で試験した。 適当な溶液中のエンドキシン濃度について結果
を下に記載する。

【表】 ＊ 試験せず
実施例 ３ 溶解物（）を実施例１に記載するように調製
した。 約50％加水分解したポリアクリル酸−アクリロ
ニトリルコポリマー（）を、15mlのH₂Oと50
mlの濃H₂SO₄を100ml容のビーカー内の２ｇのポ
リアクリロニトリルに加えて調製した。この溶液
を25℃において20分間磁気かきまぜ棒でかきまぜ
た。生ずるポリマー（）を次いで100mlのエタ
ノールの添加により沈殿した。固体を遠心により
集め、200mlのエタノールで４回洗つた。次いで
生ずるポリマー（）を60℃において８時間真空
乾燥した。 50mgのポリマー（）をH₂Oと0.5mlの5Nの
NaOHとの溶液に溶解して、妨害減少剤（）
を調製した。この溶液に、25mgのCa（OH）₂を加
え、次いで生ずる混合物を121℃で30分間オート
クレープ処理した。この溶液を冷却し、PHを12N
のHClでPH7.0に調整した。 米国薬局方による通常の0.9％食塩水
（Travenol）および米国薬局方注射用滅菌水に溶
解した米国薬局方エンドトキシンEC−２から、
系統的に希釈したエンドキシンを調整した。次い
で適当な系統的に希釈したエンドキシン溶液を、
実施例１に記載するように溶解物（）で試験し
た。系統的に希釈した後、エンドキシン溶液を溶
解物（）で試験した。妨害減少剤（）を加え
て10％Ｖ／Ｖ（0.6mlのＶ＋５mlの試料）の最終濃
度にした。溶液をよく混合し、もう一度溶解物
（）で試験した。 試験結果を、下に記載する。

【表】 水
0.9％の正常の米国薬 500pg／ml 125pg／ml
局方生理食塩水
実施例 ４ 溶解物を実施例１におけるようにして調整し
た。 25mlの65％のポリアクリル酸（分子量2000）−
H₂O溶液を75mlのH₂O、7.5ｇのHaOHおよび107
mgのCa（OH）₂と混合して、妨害減少剤（）を
調製した。この溶液を121℃で30分間オートクレ
ープ処理し、次いでPHをPH＝8.0に5NのHClで調
整した。 0.9％の正常の食塩水USPおよび注射用滅菌水
USP中のUS参照エンドキシンEC−２から、系統
的に希釈したエンドキシン溶液を調製した。次い
で適当に希釈したエンドキシン溶液を、実施例１
に希釈するように溶解物（）で処理した。系統
的に希釈後、エンドキシン溶液を溶解物（）で
試験し、妨害減少剤（）を７％の最終濃度にな
るように加え、もう一度溶解物（）で試験し
た。 試験結果を、下に記載する。

【表】 水
米国薬局方による通常 500pg／ml 30pg／ml
の0.9％食塩水
実施例 ５ 溶解物（）を実施例１に記載するようにして
調整した。 2.1ｇのアクリル酸−アクリルアミドコポリマ
ー（分子量200000）を19mlの注射用水と100mgの
Ca（OH）₂との溶液に加えることによつて、妨害
減少剤（）を調製した。すべての固体が溶ける
まで、この溶液を混合し、次いでPHを0.7mlの5N
のHClでPH＝8.0に調整した。 米国薬局方による通常の0.9％食塩水および米
国薬局方注射用滅菌水から、系統的に希釈したエ
ンドキシン溶液を調整した。次いで適当に系統的
に希釈したエンドキシン溶液を、実施例１に記載
するように溶解物（）で試験した。系統的に希
釈した後エンドキシン溶液を溶解物で試験し、妨
害減少剤（）を４％Ｖ／Ｖ（0.2mlの＋５mlの
試料）の最終濃度になるように加えた。溶液をよ
く混合し、もう一度を溶解物（）で試験した。 試験結果を、下に記載する。

【表】 水
米国薬局方による通常 500pg／ml 30pg／ml
の0.9％食塩水

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a)注射用脂質乳濁液、(b)生理食塩水、(c)乳酸
   加リンゲル液、(d)正常な血清アルブミン、(e)血漿
   たんぱく質分画、および(f)存在するエンドトキシ
   ンとカブトガニ変形細胞溶解物との間の反応を妨
   害して誤差をあたえる抗血友病因子、からなる群
   から選ばれた流体中のカブトガニ変形細胞溶解物
   によつて、エンドトキシンを検出する生体外試験
   法において、(イ)前記妨害を減少するための実質的
   に線状高分子からなる水溶性妨害減少剤であつ
   て、1000〜200000の重量平均分子量を有し、(i)ア
   クリル酸−アクリルアミドコポリマー、(ii)アクリ
   ル酸−アクリロニトリルコポリマー、(iii)ポリアク
   リル酸、(iv)ポリアクリル酸のアルカリ金属塩、(v)
   加水分解したポリアクリルアミド、(vi)加水分解し
   たポリアクリルアミドのアルカリ金属塩、(vi)ｉ加
   水分解したポリアクリロニトリルおよび(viii)ポリア
   クリロニトリルのアルカリ金属塩、からなる群か
   ら選ばれた妨害減少剤、および(ロ)前記妨害減少剤
   のキレート化能力以上の量の、カルシウムおよび
   マグネシウムからなる群から選ばれた２価の陽イ
   オン、の存在下で実施することを特徴とする方
   法。 ２ 前記妨害減少剤が約0.05％〜３％の量で存在
   し、かつ前記２価の陽イオンが前記妨害減少剤の
   カルボキシル基の１モル当たり約0.05〜１モルの
   量で存在する特許請求範囲第１項記載の方法。 ３ 前記妨害減少剤が、ポリアクリル酸、ポリア
   クリル酸のナトリウム塩、アクリル酸とアクリル
   アミドとのコポリマー、加水分解したポリアクリ
   ルアミド、加水分解したポリアクリルアミドのナ
   トリウム塩、加水分解したポリアクリロニトリ
   ル、および加水分解したポリアクリロニトリルの
   ナトリウム塩からなる群から選ばれ、かつ前記２
   価の陽イオンがカルシウムである特許請求範囲第
   １項記載の方法。 ４ 前記流体が注射用脂質乳濁液である特許請求
   範囲第３項記載の方法。 ５ 前記流体が生理食塩水である特許請求範囲第
   ３項記載の方法。 ６ 前記流体が正常な血清アルブミン、血漿たん
   ぱく質分画、および抗血友病因子からなる群から
   選ばれる特許請求範囲第３項記載の方法。 ７ (a)米国薬局方基準エンドトキシンEC−２で
   0.01〜0.25nｇ／mlの感受性を有するカブトガニ
   変形細胞溶解物、(b)少なくとも1000の分子量を有
   し、(i)アクリル酸−アクリルアミドコポリマー、
   (ii)アクリル酸−アクリロニトリルコポリマー、(iii)
   ポリアクリル酸、(iv)ポリアクリル酸のアルカリ金
   属塩、(v)加水分解したポリアクリルアミド、(vi)加
   水分解したポリアクリルアミドのアルカリ金属
   塩、(vi)ｉ加水分解したポリアクリロニトリルおよ
   び(viii)ポリアクリロニトリルのアルカリ金属塩から
   なる群から選ばれた実質的に線状高分子からなる
   水溶性妨害減少剤、および(c)カルシウムおよびマ
   グネシウムからなる群から選ばれた２価の陽イオ
   ン、からなるエンドトキシンを検出する生体外試
   験のための試薬。 ８ 前記妨害減少剤が約0.05％〜３％の量で存在
   する特許請求範囲第７項記載の試薬。 ９ 前記妨害減少剤が、ポリアクリル酸、そのナ
   トリウム塩、アクリル酸とアクリルアミドとのコ
   ポリマー、加水分解したポリアクリルアミド、そ
   のナトリウム塩、加水分解したポリアクリロニト
   リル、およびそのナトリウム塩からなる群から選
   ばれた特許請求範囲第７項記載の試薬。