JPS648601B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な血液脳関門透過性リポゾーム状
マイクロカプセルに係る。 テイ・ザツクス病、フアブリ病、GM₁―ガン
グリオシド―シス等のように、生まれつき脂質や
ムコ糖質を分解する酵素の生産能が欠けていたり
又は生産能が極めて低いために生ずる種々の遺伝
的脳疾患を治療するために、血液を介して必要と
される酵素を直接的に脳内に投与する治療法の早
期確立が望まれている。 しかるに、最も重要とされる器官である脳には
血液脳関門があり一般に酵素のような大きな分子
がこれを透過することは不可能とされて来てお
り、又血管内に酵素を投与する場合にはこれが血
液循環中に壊れたり、酵素を注射することでシヨ
ツクを起こす所謂アナフイラキシーシヨツクの発
生等の問題がある。従つて、脳内に酵素を投与す
る有効な方法は未だ報告されるに至つていないの
が実情である。 しかるに、本発明者等は、鋭意研究の結果、ホ
スフアチジルコリンと、コレステロールと、サル
フアタイドとを構成成分とするリポゾーム状マイ
クロカプセルが血液脳関門透過性を有しており且
つ種々の脳内酵素の有効な担体であることを見出
し、本発明を完成するに至つた。 本発明による血液脳関門透過性マイクロカプセ
ルは安定性が高く、従つて脳内酵素用の担体とし
てのみならず、一般薬剤用の担体としても使用可
能である。 次に製造例及び薬効薬理試験例に関連して本発
明を更に詳細に説明する。 製造例 (A) 原料の入手先乃至調製法 １ アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus
niger）タイプからのＤ―グルコースオキシ
ダーゼ及びコレステロール アメリカ合衆国セントルイス在、シグマケミ
カル（Sigma Chemical）社から市販のものを
使用。 ２ ホスフアチジルコリン ジヤーナル・オブ・アメリカン・オイル・ケ
ミカル・ソサイエテイ（J.Ameri.Oil Chem.
Soc.）第42巻第53―56頁に記載のスイングルト
ン（Singleton）等の方法により卵黄から調製
された。 ３ グルコース及びその他の試薬 京都在、半井化学株式会社より市販されてい
るものが使用された。 ４ 原形質膜 バイオケミストリー・アンド・バイオフズイ
ツクス・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第
135巻第573―579頁に記載のコールマン
（Coleman）等の方法によりラツト肝から調製
された。 ５ その他の各種脂質 ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem）第226巻第497―509頁
に記載のホルチ（Folch）等の方法によりラツ
ト肝原形質膜から抽出され、更に、ジヤーナ
ル・オブ・リピツド・リゾリユーシヨン（J.
Lipid Res.）第８巻第621―630頁に記載のバン
ス（Vance）等の方法に従い、カラムクロマト
グラフにより中性脂質と、糖脂質と、燐脂質と
に分けられた。 ６ セレブロサイド、サルフアタイド及びガング
リオサイドはヒトの脳から単離され、これらの
純度はシリカゲル板を使用し且つクロロホルム
とメタノールとの65対34対４容量部混合物を展
開剤とする薄層クロマトグラフにより確認され
た。 (B) リポゾーム状マイクロカプセルの調製 マイクロカプセルを形成する基体自体は本発明
者等がバイオケミストリー．アンド・バイオフイ
ズイツクス・アクタ（Biochim.Biophys.Act）第
471巻第305―310頁に発表した方法により調製さ
れた。即ち、ホスフアチジルコリン105μmolと、
コレステロール30μmolとをクロロホルムに溶解
し、又は上記のホスフアチジルコリン及びコレス
テロールの他に第３の脂質成分として既述の原形
質膜（脂質混合物を含有）；この原形質膜から分
画された中性脂質、糖脂質又は燐脂質；ガングリ
オサイド；セレブロサイド；又はサルフアタイド
15μmolとをクロロホルムに溶解し、回転式蒸発
器を用い真空中でフイルム状となし、粒状KOH
上で１時間に亘り更に乾燥することにより調製さ
れた。 得られたフイルム状物質に、50mM NaCl含有
10mMトリス―HCl緩衝液（PH8.5）10ml中に予
め溶解されたＤ―グルコースオキシダーゼ400mg
を添加し、上記緩衝液中で５℃において３時間に
亘り透析処理した。 次いで、アルゴンガス雰囲気下に15分間に亘り
室温において混合物を撹拌した。この撹拌中に薄
片状構造体が形成された。 このようにして得られる懸濁液をアルゴンガス
雰囲気下に水浴型超音波発生器（シヤープ製
Ultra―Sonicator UC 302A―商標）を用いて10
分間処理した。５℃において一夜放置した後に、
ベツクマン・スピンコ（BecKman Spinco）L5
―50B（商標）を用いて30分間に亘り200000xgに
て懸濁液を遠心処理した。得られたペレツトに上
記緩衝液10mlを加えてこれを再懸濁せしめ、次い
で同様の条件で遠心処理した。洗浄処理を繰返し
た。得られたペレツトは燐酸緩衝液（PH7.4）中
に懸濁され５℃に保持された。 薬効薬理試験 １ 体重150〜170ｇのSD種ラツトを用い、上記
製造例記載の方法により得たるリポゾーム懸濁
液（リポゾームの構成脂質がそれぞれ後記の組
成度及びVIIIに相当するもの0.5mlを上記ラ
ツトの尾静脈より投与し、30分経過断頭して常
法により解剖した。血液は凝固防止のためにヘ
パリンにて洗浄されたビーカー内に採取され
た。各器官は切除後直ちに冷食塩水にて、次い
で0.2M燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.4）にて洗
浄された。脳の硬膜及び軟膜は慎重に除去され
た。肝臓には緩衝液を散布して血液が除去され
た。各器官即ち肝臓、腎臓及び脳は４倍容の、
肺は８倍容の、又脾臓は16倍容の0.2M燐酸塩
緩衝液にて均質化された。次いで各器官に含有
される酵素の活性につき、30℃でバイオキシグ
ラフ（東京在株式会社キユースイ化学研究所
製）を使用してポーラログラフ的に測定した。 尚、投与後60分経過した後に断頭した群につ
いても同様の操作により各器官に含まれる酵素
量を測定した。 結果は下記の表に示されている通りであ
り、構成脂質がホスフアチジルコリンとコレス
テロールのみであるマイクロカプセル（後記の
組成例）は脳内に到達し得ないこと、並びに
本発明によるマイクロカプセル即ち構成脂質と
してサルフアタイドが付加されたマイクロカプ
セル（後記の組成例VIII）は血液脳関門を通過
して脳内に到達し、従つて酵素を脳組織内に給
送する担体として利用し得ることが判明した。

【表】 本発明による酵素包埋マイクロカプセル（構
成脂質：後記の組成例VIII）を投与した場合に
おける各器官の細胞成分内での酵素分布を調べ
るために脳、肝臓及び腎臓に関し次の４つのフ
ラクシヨンに分別した。１群３匹のラツトの各
器官を0.25Mの蔗糖と10mMの燐酸ナトリウム
とから成る緩衝液（PH7.4）にて均質化した。

【表】 沈 渣 上 澄
(フラクシヨン) (フラクシヨン)
フラクシヨン：核及びセル破砕物フラクシヨ
ン フラクシヨン：ミトコンドリア成分フラクシ
ヨン フラクシヨン：微粒体フラクシヨン フラクシヨン：可溶性細胞質フラクシヨン 結果は表に示されている。

【表】 ２ リポゾーム状マイクロカプセルの組成につい
て 酵素としてＤ―グルコースオキシダーゼを選
定し、次の各組成のリポゾーム状マイクロカプ
セルを製造例に従つて調政し、このマイクロカ
プセル懸濁液をラツトに投与し、第１項の記載
に従い30分後にに断頭し解剖して脳内酵素活性
を測定した処平均値は第１図のグラフに示され
る通りであり、これから第８番目の組成例即ち
ホスフアチジルコリンと、コレステロールとサ
ルフアタイドとを含有している場合が最も好ま
しいことが判る。 組成例 ： ホスフアチジルコリン―コレステロール （180.6mg対20.5mg） 組成例 ： 組成＋ラツトの肝原形膜から抽出された脂
質混合物（20mg） 製成例 ： 組成＋ラツトの肝原形質膜から抽出された
中性脂質（20mg） 組成例 ： 組成＋ラツトの肝原形質膜から抽出された
糖脂質（20mg） 組成例 ： 組成＋ラツトの肝原形質膜から抽出された
燐脂質（20mg） 組成例 ： ホスフアチジルコリン―コレステロール―ガ
ングリオサイド（モル比、７対２対１） 組成例 ： ホスフアチジルコリン―コレステロール―セ
レブロサイド（モル比、７対２対１） 組成例 ： ホスフアチジルコリン―コレステロール―サ
ルフアタイド（モル比、７対２対１）

【図面の簡単な説明】

添付図面はマイクロカプセルを構成する組成を
種々に変えた場合に、これら組成のマイクロカプ
セルに担持されて投与された酵素の脳内活性を示
すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ホスフアチジルコリンと、コレステロール
   と、サルフアタイドとを構成成分としていること
   を特徴とする、医療用酵素又は薬剤の担体として
   の血液脳関門透過性リポゾーム状マイクロカプセ
   ル。