JPS644513B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は７−（Ｓ−ベンジル−システニル）−４
−メチルクマリニルアミドまたはその塩類並びに
それらを用いるシスチンアミノペプチダーゼ（以
下CAPと略す。）の測定法に関する。 CAPはオキシトシナーゼとほぼ同一酵素活性
でオキシトシンのＮ末端半シスチン残基の結合に
働いて、その環状構造を解離して不活化するアミ
ノペプチダーゼの１種で、妊娠血清中に特に多く
存在する。このCAP活性値を測定することによ
り妊娠の診断、胎盤機能の状態等を知ることがで
きる。 現在一般的に行なわれているCAP活性測定法
はＬ−シスチン−ビス−β−ナフチルアミド、Ｌ
−シスチン−ビス−Ｐ−ニトロアニリドあるいは
Ｓ−ベンジル−Ｌ−シスチン−Ｐ−ニトロアニリ
ドを基質とし、これに対してCAPがこのシスチ
ンアミド結合を加水分解することにより生成する
芳香族一級アミンを測定し、標準液としてＬ−シ
スチン芳香族アミドに対応する既知量の芳香族一
級アミンの発色を比較し測定している。従つて使
用する基質はCAPとの反応性即ち基質特異性が
臨床的所見と良く相関し、且つ感度即ち基質反応
性が高いことも必要であるが、さらに正確な測定
ができるためには発色が血液中の夾雑物の影響を
受けないような条件が望ましい。 上記の様に従来法は発ガン性物質であるβ−ナ
フルアミンを使用したり、あるいはＰ−ニトロア
ニリンを用いるため血液の夾雑物質の影響を受け
ることがある等満足し難い。そこで新しい基質の
開発が望まれていた。 本発明者らはこれらの欠点を解決すべく鋭意研
究を行なつた結果、新規な合成基質を見出し本発
明を完成した。 本発明は前記欠点を解決したのみならず、本新
規合成基質を用いることにより、試料の量及び下
記の如く測定時間をも改善することができた。 従来法（臨床病理、特29巻、227頁、1981年）
と本発明法との加温反応時間の比較 【表】 本基質を使用しCAP活性を測定する方法は例
えば本基質またはその塩類を弱酸性〜弱アルカリ
性、好ましくは中性の緩衝液中でCAPを含む試
料（例えば血清）を作用せしめ、生成する７−ア
ミノ−４−メチルクマリンの螢光の増加を測定
し、CAP活性を求める。 緩衝剤は通常リン酸塩が使用されるがこれに限
定されるものではない。 次に本発明の新規基質の製造法について記載す
る。 例えばChemische Berichte、86巻、1116頁、
1953年に記載の方法により得たN〓−カルボベン
ゾキシ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインと縮合剤
例えばイソブチルクロロホルメートを有機塩基の
存在下溶媒中低温で反応させた後７−アミノ−４
−メチルクマリンを氷冷〜室温下、溶媒中で反応
させることにより７−（N〓−カルボベンゾキシ−
Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニル）−４−メチルク
マリニルアミドが得られる。使用する溶媒として
はテトラヒドロフラン（以下THFと略す。）、ジ
メチルホルムアミド（以下DMFと略す。）、メチ
レンクロライド、ジオキサンあるいは酢酸エチル
等が使用できる。縮合剤としては前記のイソブチ
ルクロロホルメートの他にクロロ炭酸エチル、ク
ロロ炭酸メチル等が用いられる。有機塩基として
はトリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジ
ンあるいはピペリジンが使用できる。 次にこのようにして得た７−（N〓−カルボベン
ゾキシ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニル）−４−
メチルクマリルアミドのカルボベンゾキシ基を常
法により除去すればよい。例えば臭化水素／酢酸
を加えることによりカルボベンゾキシ基が除去さ
れ目的物質である７−（Ｓ−ベンジル−Ｌ−シス
テニル）−４−メチルクマリニルアミドが得られ
る。また、この得られた物質をアルコール等の溶
媒下Ｐ−トルエンスルホン酸を加えた後エーテル
等の溶媒で結晶化させればＰ−トルエンスルホン
酸塩として単離することもできる。なお、同様に
して塩酸塩、硫酸塩等にすることも出来る。 以下実施例を挙げて詳細に説明する。 実施例 １ ７−（N〓−カルボベンゾキシ−Ｓ−ベンジル−
Ｌ−システニル）−４−メチルクマリニルアミ
ド N〓−カルボベンゾキシ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−
システイン2.11ｇ（10ミリモル）、トリエチルア
ミン1.01ｇ（10ミリモル）をTHF10mlに溶かし、
−５〜０℃に冷却下撹拌しながらイソブチルクロ
ロホルメート1.37ｇ（10ミリモル）を加え10分間
撹拌後、７−アミノ−４−メチルクマリン1.75ｇ
（10ミリモル）のDMF溶液20mlを加える。反応は
氷冷下１時間及び室温下10時間で完結する。反応
液を減圧濃縮後残留物をメチレンクロライド20ml
に溶かし、10％塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液、水の順で洗い、芒硝乾燥、溶媒留去し、
酢酸エチルより再結晶する。収量3.57ｇ（収率71
％）、融点172〜174℃ 元素分析 計算値(%) C66.91 H5.21 N5.57 S6.38 実測値(%) C67.05 H5.25 N5.62 S6.17 ７−（Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニル）−４−メ
チルクマリニルアミドのトシル酸塩。７−（N〓−
カルボベンゾキシ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニ
ル）−４−メチルクマリニルアミド1.06ｇ（２ミ
リモル）に25％臭化水素／酢酸６mlを加え、振り
まぜながら40分室温に保つ。無水エール100mlを
加えると油状物質が分離するが、その油状物質を
数回エーテルルで洗つた後、エチルアルコール３
mlに溶かし、トシル酸ヒドラート600mgを加え、
エーテルを加えると沈澱が生成する。エチルアル
コール−エーテルより再結晶する。収量822mg
（収率76％）、融点174〜177℃〔α〕²⁰ _D＋32.2゜（Ｃ
＝
1.3、AcOH） 元素分析 計算値(%) C59.98 H5.22 N5.18 S11.86 実測値(%) C59.77 H5.35 N5.17 S11.82 実施例 ２ 試 薬 (a) 1.08ｍM7−（Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニ
ル）−４−メチルクマリニルアミドのトシル酸
塩溶液の調製。 ジメトキシエタン10mlに７−（Ｓ−ベンジル
−Ｌ−システニル）−４−メチルクマリニルア
ミドのトシル酸塩5.84mgを溶解する。 (b) 0.1ｍM7−アミノ−４−メチルクマリン溶液
の調製。 精製水100mlに７−アミノ−４−メチルクマ
リン1.81mgを撹拌溶解する。 (c) 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）の調製。 KH₂PO₄1.36ｇを約50mlの精製水に溶解し、
1N NaOHでPH7.0に調製した後精製水で100ml
とする。 (d) 0.5μM7−アミノ−４−メチルクマリン溶液
の調製。 前記(b)の溶液１mlに前記(c)の溶液100mlを加
え、さらに精製水を加え全量を200mlとする。 測定法 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）（(c)液）1.95ml（50
ｍＭ）に1.08ｍM7−（Ｓ−ベンジル−Ｌ−システ
ニル）−４−メチルクマリニルアミドのトシル酸
塩(a)液）50μ（27μM）を加え混合した後37℃
恒温槽で３分間加温する。次いで血清10μを加
え37℃でさらに60秒間正確に加温し直ちに励起波
長365nｍ、測定波長440nｍで螢光の増加を測定
し、この値を△ｆとする。 なお、国際単位（I.U.／）への換算は下記式
より求める。 I.U.／＝△ｆ／Ｆ×100×1.2 〔Ｆ：0.5μM7−アミノ−４−メチルクマリン溶
液(d)液）２mlに血清10μを加えた時の螢光強
度〕

【図面の簡単な説明】

本発明法で求めたCAP活性値（横軸）とClin.
Biochem.、６巻、60頁、1973年に記載の方法で
求めたCAP活性値（縦軸）との相関図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式(1)で示される ７−（Ｓ−ベンジル−システニル）−４−メチルク
   マリニルアミド。 ２ システインがＬ体である特許請求の範囲第１
   項記載の化合物。 ３ 酸付加塩である特許請求の範囲第１項記載の
   化合物。 ４ ７−（Ｓ−ベンジル−Ｌーシステニル）−４−
   メチルクマリニルアミドまたはその塩類を用いる
   ことを特徴とするシスチンアミノペプチダーゼ活
   性の測定法。