JPS6393731A - 悪性腫瘍等の治療方法 - Google Patents

悪性腫瘍等の治療方法

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JPS6393731A
JPS6393731A JP24067686A JP24067686A JPS6393731A JP S6393731 A JPS6393731 A JP S6393731A JP 24067686 A JP24067686 A JP 24067686A JP 24067686 A JP24067686 A JP 24067686A JP S6393731 A JPS6393731 A JP S6393731A
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JP
Japan
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protein
immune complex
living body
serum
malignant tumor
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JP24067686A
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English (en)
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Kenichi Kawamura
河村 研一
Yoshiko Takahashi
佳子 高橋
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Sekisui Chemical Co Ltd
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、悪性腫瘍等の治療方法に関する。
(従来の技術) 悪性腫瘍の有効な治療方法のひとつとしてパンセル(B
ansal : 197B) 、ターマン(Tera+
an : 1980) 。
レイ (Ray  ; 1982)らにより、ブドウ状
球菌の一種のスタフィロコッカス オーレウス ツー9
フ1株(Staphylococcus aureus
 Cohan I )の細胞膜成分であるプロティンA
 (Protein A ) ’tr:不活性担体に担
持させたプロティンA担持体を用いる方法が報告されて
いる。このプロティンA担持体に例えば生体からの血液
を分離して得られた血泰を接触させ、接触後の血漿を再
び血液固形分と合わせて全血とし、生体に戻すと悪性腫
瘍細胞が速やかに壊死することが確認されている。
Ban5alらは悪性腫瘍を有する生体内には、正常な
免疫機能を阻止する因子が増加し、生体にとっては異物
である癌細胞を認識する機能が働かないために悪性腫瘍
の増殖が助長されると考えた。このような阻止因子(血
清阻止因子)としては、悪性腫瘍細胞表面が特異抗原と
なり、この特異抗原により生成する抗体、抗原−抗体結
合物にさらに補体が結合して大きなマトリックスを形成
した免疫複合体、免疫抑制酸性糖蛋白質などが挙げられ
これらを除去することにより悪性腫瘍の増殖が阻止され
ると考えた。上記プロティンAは、はとんどの哺乳動物
の免疫グロブリン(Ig;主として免疫グロブリンG 
(IgG))のFc部分と結合する性質を有する。その
ため、彼らはプロティンA担持体に血漿を接触させると
、上記血清阻止因子を包含するIgが吸着・除去され、
その結果、正常な免疫系が復活して腫瘍細胞が排除され
るものと考えた。しかし、 Termanらが用いたプ
ロティンAの量はわずか数■である。このような微量の
プロティンAに血清阻止因子が吸着することにより腫瘍
が急速に壊死することを説明することができない。
そのため、 Ray 、ベル°トラム(Bertram
)らは、上記プロティンAが原因となりγ−インターフ
ェロンやナチュラルキラー活性が誘導され、これらが悪
性腫瘍細胞に作用し急速にこれを壊死させる。
という仮説をたてた。しかし、その詳細な機構は不明で
ある。
(発明が解決しようとする問題点) 本発明者は上記プロティンAの作用機構を解明し、より
効果的な悪性腫瘍等の治療方法を開発し本発明を完成し
た0本発明の目的は、効果的な悪性l@瘍等の治療方法
を捷供することにある。
(問題点を解決するための手段) 発明者らは、悪性腫瘍患者から、免疫複合体を多量に含
み濁度の大きな血清を得て、これをプロティンA担持体
と接触させたところ、血清が清澄化しかつ血清中に悪性
腫瘍特異抗原と強力な反応性を示すIgGが含有されて
いるのを確認した。このことから9発明者らは、悪性腫
瘍患者の血漿もしくは血清中には本来悪性腫瘍と特異的
に反応してこれを壊死させる悪性腫瘍特異抗体が存在し
これが上記IgGに相当すると考えた。さらに、この悪
性腫瘍特異抗体は免疫複合体として存在するため、その
活性能がブロックされているが、プロティンAの作用に
より悪性腫瘍特異抗体が免疫複合体から遊離し、そのこ
とにより悪性腫瘍特異抗体の悪性腫瘍細胞に対する活性
能が回復するとの仮説をたてた。この仮説が正しいとす
れば、血漿もしくは血清から免疫複合体を分離し、この
免疫複合体を解離させて得られる悪性腫瘍特異抗体を投
与すれば悪性腫瘍等を効果的に治療しうる。この考えを
もとに種々の実験を重ねた結果、この発明を完成するに
至った。
本発明の悪性腫瘍等の治療方法は、生体から得られた血
漿もしくは血清から悪性腫瘍特異抗体を単離し、これを
該生体と同一または同種の生体内に注入することを包含
し、そのことにより上記目的が達成される。
本発明によれば、血漿もしくは血清からの免疫複合体の
分離は1次の処理工程のうちの少なくとも一種により行
われる: ■Raji細胞法。
■水溶性ポリマーおよび/または液状多糖類を用いる処
理。
■C1q法。
■プロティンAを用いる処理。
■プロティンGを用いる処理。
■色素結合法。
■シュークロース密度勾配分画法、および■ゲル濾過法
これらはいずれも免疫複合体の単離法として既知の手法
である。これらのうち■は、 Barkittリンパ腫
由来の培養株であるRaji細胞が補体成分に対するレ
セプターを有することを利用したものである。免疫複合
体は抗体のFc部分に補体を有するためRaji細胞に
結合して血漿もしくは血清から分離される。
■の処理を行うには、血漿もしくは血清を水溶性ポリマ
ーおよび/または液状多wt類と混合する。
水溶性ポリマーとしてはポリエチレングリコール。
ポリリジンなどが、液状多m類としてはデキストランな
どが用いられる。特にポリエチレングリコール(PEG
)が好適に用いられる0例えば、 PEG濃度が3〜1
0%となるように血漿もしくは血清にPEGを加えると
免疫複合体が沈澱する。
■のC1qは補体の第1成分であり免疫複合体との結合
性が極めて高いため、これに免疫複合体を結合させて分
離する。
■および■のプロティンAおよびプロティンGはそれぞ
れ黄色ブドウ状球菌およびグループGストレプトコッカ
ス菌由来の蛋白質である。プロティンAおよびプロティ
ンGはいずれも免疫複合体。
悪性腫瘍特異抗体などのFc部分を認識し免疫複合体や
悪性腫瘍特異抗体を吸着する能力を有し。
他方、免疫複合体を解離させる能力をも有する。
免疫複合体を吸着するか解離させるかは、接触時の状況
により異なる0例えばプロティンAを固定化したカラム
に免疫複合体を含む血漿もしくは血清を流した場合は、
使用する緩衝液の種類、免疫複合体の濃度、流速などに
より該免疫複合体が吸着するか解離するかが決まる。こ
のように、特定の状況を設定することにより免疫複合体
を血奉もしくは血清から分離することができる。通常、
プロティンAやプロティンGはセルロース、アガロース
、ポリアミノスチレンなどの不活性担体に担持させて血
漿もしくは血清と接触させる。
■の処理に用いられる色素は1例えばシバコロンブルー
であり、この色素と例えば、ジエチルアミノエチル基と
を不活性担体に結合させ、血漿もしくは血清と接触させ
ると免疫複合体が選択的に吸着される。
■および■はそれぞれ免疫複合体が所定の比重および分
子量を有することを利用する処理である。
次に、このようにして得られる免疫複合体を解離させる
。免疫複合体の解離は。
■酸と接触させてpH5,0以下とすること。
■アルカリと接触させてpH9,0以上とすること。
00.56以上の有機もしくは無機塩溶液と接触させる
こと。
00.5M以上のカオトロピック性イオンを含む溶液と
接触させること。
■プロティンAと接触させること、および■プロティン
Gと接触させること。
のうちの少なくとも一種により行われる。
上記■の酸との接触に用いられる酸としては。
塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸などの通常の無機酸また
は有機酸水溶液が用いられ得、好ましくは各種酸性の緩
衝液が用いられる。酸性の緩衝液としてはグリシン−塩
酸緩衝液、クエン酸緩衝液。
酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、硼酸緩衝液、フタル酸カリ
ウム−塩酸緩衝液などがある。上記酸性水溶液のpHは
血漿もしくは血清と混合したときに5.0以下、好まし
くは3.5以下となるように調整される。■のアルカリ
との接触に用いられるアルカリには、炭酸ナトリウム、
水酸化ナトリウムなど通常のアルカリ水溶液が用いられ
得、好ましくは各種アルカリ性の緩衝液が利用されうる
。アルカリ性の緩衝液としては、グリシン−硼酸緩衝液
、炭酸ナトリウム緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液、ジェタノールアミン−塩酸緩衝液などがある。
上記アルカリ性水溶液のpHは血漿もしくは血清と混合
したときに9.0以上、好ましくは9.0〜12.0と
なるように調整される。これら■および■の処理におい
ては酸やアルカリの濃度にもよるが2通常、血漿もしく
は血清1vplに対して酸またはアルカリ溶液が1〜1
00/!の割合で用いられる。酸またはアルカリ処理後
の血漿もしくは血清は生理食塩水で透析などを行い含有
される酸またはアルカリを除去する。免疫複合体を充分
に解離させるために上記酸またはアルカリ処理を繰り返
し行うことが推奨される。
■の塩溶液の接触に用いられる有機もしくは無機塩には
1例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネ
シウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カ
リウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、
クエン酸ナトリウム。
酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウムがある。これらの有機
もしくは無機塩は0.5M以上、好ましくは1〜4M程
度の水溶液(高張塩)とし、血漿もしくは血清l1m1
あたり1〜100mfの割合で用いられる。
■のカオトロピック性イオンとは、疎水性基の周囲に形
成される氷状の水分子の配列を破壊する性質を有するイ
オンであり、このようなイオンの働きにより免疫複合体
の抗原−抗体間の疎水性結合が切断される。このような
イオンには例えば。
CC13COO−、5CN−、CF3CO0−、ドがあ
る。カオトロピック性イオンを含む化合物としてはチオ
シアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、トリフロロ酢酸
ナトリウムなどがある。これらは0.5M以上。
好ましくはIM〜4M程度の水溶液とし、血漿もしくは
血清Lralあたり1〜100 taβの割合で用いら
れる。
■および■のプロティンAおよびプロティンGは既述の
ように免疫複合体を吸着する能力と解離させる能力とを
有するため、適宜条件を設定して免疫複合体の解離が効
果的に行われるようにする。
免疫複合体から遊離した悪性腫瘍特異抗体の精製は。
■免疫複合体の解離物をプロティンAと接触させること
■免疫複合体の解離物ををプロティンGと接触させるこ
と。
■免疫複合体の解離物をゲル濾過にかけること。
■免疫複合体の解離物をイオン交換クロマトグラフィに
かけること、および ■免疫複合体の解離物を抗イムノグロブリン抗体と接触
させること。
のうちの少なくとも一種により達成される。
■および■のプロティンAおよびプロティンGは既述の
ように悪性腫瘍特異抗体を吸着させる能力を有する。例
えば、プロティンAをセファロースなどに固定化してカ
ラムに充填し、これに免疫複合体解離物を含む溶液を流
すと悪性腫瘍特異抗体が吸着する。このときにも使用す
る緩衝液の種類や流速などを悪性腫瘍特異抗体が効果的
に吸着されるように適宜設定する。
■のゲル濾過法および■のイオン交換クロマトグラフィ
法はそれぞれ、悪性腫瘍特異抗体が所定の分子量および
電気的特性を有することを利用するもので、それぞれ通
常の処理法が適用される。
イオン交換クロマトグラフィに用いられるゲルは。
ジエチルアミノエチル基などを有する陰イオン型のゲル
が好適に用いられる。
■は悪性腫瘍特異抗体と特異的に反応する抗Ig抗体を
利用する処理である。例えばウサギのIgGを投与して
得たヤギの血清(抗つサギIgG抗ヤギ血清)はウサギ
の抗体に特異的なりギの抗体を含む、この抗つサギIg
G抗ヤギ血清を不活性担体に担持させてカラムに充填し
、これに悪性腫瘍を有するウサギから得た免疫複合体解
難物を流すとウサギの悪性腫瘍特異抗体が得られる。
本発明方法により治療を行うには9例えば、まず、悪性
腫瘍を有する生体から一定量の血液を抜きとって血漿も
しくは血清を得る。これを上記■〜■(免疫複合体の単
離工程)のうちのいずれかで処理すると免疫複合体が得
られる。この免疫複合体を次に、上記■〜■(免疫複合
体の解離工程)のうちのいずれかで処理する。免疫複合
体の解離により悪性腫瘍特異抗体、悪性腫瘍特異抗原、
免疫複合体の解離残金、低分子物質などを含む免疫複合
体解離物が得られる。これを上記■〜■(免疫複合体の
精製工程)のうちのいずれかで処理すると悪性腫瘍特異
抗体を高純度で含有するIgが得られる。これをもとの
生体と同一または同一種の生体に注入する(例えば静脈
注射を行う)と。
悪性腫瘍特異抗体が悪性腫瘍細胞に作用してこれを壊死
させる。
(作用) このように、従来技術のプロティンAの作用機構を検討
した結果、効果的な悪性腫瘍の治療方法を開発すること
ができた0本発明によれば、悪性腫瘍を有する生体の血
漿もしくは血清から免疫複合体を単離し、これを特定の
条件下で処理することにより免疫複合体が解離して悪性
腫瘍特異抗体が遊離する。これを精製すると純度の高い
悪性腫瘍特異抗体を含有するIg分画が得られる。この
Igは、悪性腫瘍特異抗原と特異的に反応する0例えば
、このIgと悪性腫瘍特異抗原とでゲル内沈降反応を行
うと沈降線が形成される。この悪性腫瘍特異抗体を含む
Igを生体にもどすと、悪性腫瘍特異抗体は悪性腫瘍細
胞に特異的に作用してこれを壊死もしくは縮小させる。
悪性腫瘍特異抗体を含む1gをもとの生体と同種の生体
へ注入しても同様の効果が得られる。悪性腫瘍特異抗体
の純度が高いため副作用も極めて少ない。
(実施例) 以下に本発明を実施例につき説明する。
塞】l1上 生後6適齢の家兎の背部皮下に腫瘍細胞Vx2を5X1
0’個移植し、4週間後に耳介静脈から採血した。遠心
分離し、血球成分を除去して血清を得た。血清30s 
1を7%ポリエチレングリコール(和光純薬社製; P
EG 6000)30m Ilに溶解し室温でゆるやか
に攪拌した。遠心分離後上清を除去し、沈澱物(免疫複
合体)を得た。これに3M塩化ナトリウムを含有する0
、01Mリン酸緩衝液(pH7,0)50calを加え
、室温でゆるやかに攪拌し免疫複合体の解離を行い、さ
らに0.01Mリン酸緩衝液(pH8,2)で透析を行
なった* 5 mlのセファローズ(ファルマシア社製
)に10■のプロティンA(牛丼化学社製)を担持させ
て不溶化し、カラムに充填した。これに上記透析後の免
疫複合体解離物をアプライした。プロティンA−セファ
ローズに吸着したものを0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
(pH3,0)で溶出させ、  0.1Mグリシン−水
酸化ナトリウム(pH10,0)で直ちに中和した。こ
れを150mM塩化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩
衝液で透析を行い。
Vx2特異抗体を含む約3511wのイムノグロブリン
溶液(30mjりを得た。
他方、  Vx2腫瘍細胞10’個を3M塩化カリウム
を含有する0、OIM PBS (pH7,0)に加え
、4℃で16時時間中かに攪拌した。不溶部分を40.
000 cで30分間遠心処理して除去し、その上清を
0.01MPBS (pH7,0)で−晩透析にかけた
。これをさらに40.000 Gで30分間遠心分離し
、不溶部分を除去した。上清を減圧濃縮して1 rsl
のVx2表面抗原溶液を得た。
このVx2表面抗原溶液と上記イムノグロブリン溶液と
でゲル内沈降反応を行なったところ沈降線が形成された
。上記免疫複合体を生理食塩水に溶解し、この溶液とV
x2表面抗原溶液とでゲル内沈降反応を行なったが沈降
線は形成されなかった。
実施■1 実施例1と同様にしてVx2特異抗体を含むイムノグロ
ブリン溶液を得た。この溶液をVx2担癌家兎に耳介静
脈より緩やかに注入したところ1時間で背部表面に形成
された潰瘍部の壊死が認められた。
ス】11灸 生後6週齢の家兎の背部皮下に腫瘍細胞Vx2を5X1
0’個移植し、5週間後に心臓採血を行なった。これを
遠心分離し、血球成分を除去して血清約60+m j!
を得た。この血清30−lを10%ポリエチレングリコ
ール(和光純薬社製PEG6000) 30m lに溶
解し室温で緩やかに攪拌した。遠心分離後上清を除去し
、ペレット(免疫複合体)を得た。これに0.1Mグリ
シン−塩酸緩衝液(pH3,0) 100a+j!を加
え、4℃で30分間撹拌し、免疫複合体の解離を行なっ
た。さらに150mMの塩化ナトリウムを含有する0、
01Mリン酸緩衝液(pH7,0)で透析を行なった。
セファローズに抗つサギIgG抗ヤギ血清(生化学工業
社製)を担持させて不溶化し、カラムに充填した。この
カラムに上記透析後の免疫複合体解離物をアプライし、
カラムに吸着したIgG成分をO,1Mグリシン−塩酸
緩衝液(pH3,0)で溶出させ、直ちに150mM塩
化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)で透析を行なった。このようにして、 Vx2特異抗
体を含む約30■のイムノグロブリン溶液(30mjり
を得た。この溶液をVx2担癌家兎に耳介静脈より緩や
かに注入したところ1時間はどで背部表面に形成された
潰瘍部が黒色化して壊死が観察され、翌日には注入前の
半分程度に潰瘍が縮小した。
(発明の効果) 本発明によれば、このように、悪性腫瘍を有する生体の
血漿もしくは血清から免疫複合体を得。
これを処理することにより悪性腫瘍抗体を効果的に得る
ことができる。この悪性腫瘍抗体を投与することにより
悪性腫瘍等が速やかに壊死・縮小する。悪性腫瘍抗体は
精製されているために純度が高く、そのため副作用も極
めて少ない。
以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、生体から得られた血漿もしくは血清から悪性腫瘍特
    異抗体を単離し、これを該生体と同一または同種の生体
    内に注入することを包含する悪性腫瘍等の治療方法。 2、前記悪性腫瘍特異抗体が、血漿もしくは血清からの
    免疫複合体を解離し、これを精製することにより得られ
    る特許請求の範囲第1項に記載の治療方法。 3、前記免疫複合体が、 (1)Raji細胞法、 (2)水溶性ポリマーおよび/または液状多糖類による
    処理、 (3)C1q法。 (4)プロテインAによる処理、 (5)プロテインGによる処理、 (6)色素結合法、 (7)シュークロース密度勾配分画法、および(8)ゲ
    ル濾過法、 のうちの少なくとも一種により血漿もしくは血清から分
    離される特許請求の範囲第2項に記載の治療方法。 4、前記免疫複合体の解離が、 (1)酸と接触させてpH5.0以下とすること、(2
    )アルカリと接触させてpH9.0以上とすること、 (3)0.5M以上の有機もしくは無機塩溶液と接触さ
    せること。 (4)0.5M以上のカオトロピック性イオンを含む溶
    液と接触させること、 (5)プロテインAと接触させること、および(6)プ
    ロテインGと接触させること、 のうちの少なくとも一種により行われる特許請求の範囲
    第2項に記載の治療方法。 5、前記精製が、 (1)前記免疫複合体の解離物をプロテインAと接触さ
    せること、 (2)前記免疫複合体の解離物をプロテインGと接触さ
    せること、 (3)前記免疫複合体の解離物をゲル濾過にかけること
    。 (4)前記免疫複合体の解離物をイオン交換クロマトグ
    ラフィにかけること、および (5)前記免疫複合体の解離物を抗イムノグロブリン抗
    体と接触させること、 のうちの少なくとも一種により行われる特許請求の範囲
    第2項に記載の治療方法。 6、前記プロテインA、プロテインGまたは抗イムノグ
    ロブリン抗体が不活性担体に担持された特許請求の範囲
    第4項または第5項に記載の治療方法。
JP24067686A 1986-10-09 1986-10-09 悪性腫瘍等の治療方法 Pending JPS6393731A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02157656A (ja) * 1988-10-12 1990-06-18 Biotest Ag 固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02157656A (ja) * 1988-10-12 1990-06-18 Biotest Ag 固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法

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