JPS6387990A - 微生物によるニコチアナミンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アンジオテンシン変換酵素抑制作用をもつニ
コチアナミンの微生物学的製造法に関する。

〔従来の技術〕

本発明の方法によシ製造されるニコチアナミンは、下記
式（１）で表される化合物である。

ニコチアナミンは／り７１年にツマ（Ｎｏｍａ　）らに
よってタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍＬ
、　）葉中から発見され（Ｍ、　Ｎｏｍａ　ｅｔ　ａｌ
、　、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、　／
ｆ６２２　、　ｐｐ、！０　／　７−２０２０　（／２
７／）、但し、構造はＫｒｌｓ℃ｅｎｅｓｎ　ｅｔ　ａ
ｌ−＊　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ−１ｓｔｒｙ、　／　３　
、　ｐｐ　、２７り／−，２７りｒ（／り７グ）によシ
訂正〕、続いて、イネ、クコ、ブナなど多くの植物から
単離され、この物質が広く植物界に分布していることが
確認されている。また、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙ
ｃｅｔｓｓ）　　の菌体中にもその存在が報告されてい
る（Ｒ，Ａｒｍ１ｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

Ｐｈｙｅｉｏｘ、Ｐｆｌａｎｚ、ｅ　／♂Ｏ（♂）、！
！７−６３（／りｒり〕。

しかし、接合菌類（旦ム巳竺■二す狂−）の液体培養物
中にニコチアナミンが蓄積されることは知られていない
。また、ニコチアナミンの生理活性については、細胞内
の鉄の移動あるいは代謝に重要な役割を演じているｐｈ
ｙｔｏｓ　１ｄｅｒ１０ｐｈｏｒｅであるとの報告ＣＭ
、　Ｂｕｄｅｎｓｋｙ　ｅｊ、　ａｌ、　ｒ　Ｐｈｙｔ
ｏ（Ｈｈｓｍｌ−ｓｔｒｙ、ヱム（７ｚ）、ｘ−タよ−
２２２７（／り♂Ｏ）〕はあるものの、アンジオテンシ
ン変換酵素を阻害するとの報告はされていない。アンジ
オテンシン変換酵素を阻害する化合物は、人の高血圧の
治療に有効であることが知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ニコチアナミンは、植物の葉などからの抽出法や化学合
成法などによって製造されることが知られているが、植
物体からの抽出法では大量の植物体を恒常的に確保する
ことが困難であシ、化学合成法ではラセミ体が生成する
ため、その分割のための工程が必要となるので、製造工
程〔問題点を解決する六めの手段〕 本発明者らは、微生物培養物中にアンジオテンシン変換
酵素阻害物質の検索を続けた結果、バシデイオボルス属
に属するある菌株の培養物中にニコチアナミンが大量に
蓄積されていることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、バシデイオボルス属に属しニコチ
アナミンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し
、培養物中にこれを生成蓄積させ採取することを特徴と
するニコチアナミンの製造法を提供するものである。

以下にニコチアナミンの製造法について具体的に説明す
る。

（１）　　生産菌及び生産菌の菌学的性状本発明の方法
に使用されるニコチアナミン生産菌としては、バシデイ
オボルス属に属す　　□る微生物であってその培養物中
に採取するに充分な量のニコチアナミンを生産する能力
を有するものであればいかなるものであってもよい。こ
のような菌株の例としては、本発明者らによシ土壌より
新たに分離されたＭＫ３り２２株がある。ＭＫ　Ｊり♂
？株の菌学的性状は下記の通シである。

（１）各種培地上における培養上の特徴及び形態的性質 ／、　ジャガイモ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）上、３
０℃、！日間培養 コロニーは！日間で直径弘〜！創に拡がる。色調は白色
。栄養菌糸は分枝する、直径−！μｍに至る、隔壁が入
り分節菌体（ｈｙｐｈａ　ｓｅｇｍｅｎｔ）　ｆ形成す
る。分生子柄は単一に栄養菌糸あるいは分節菌体かも生
じる、分枝せず、巾はり、６〜ＩＱμｍ１先端が槍形上
に膨潤して、胞子嚢工下部膨潤部を形成する。胞子表下
部膨潤部は長さ２／、０〜２ｇ、０１℃ｍ、巾／　０．
７〜／　ｊ、０　μｒｎの大きさ；膨潤部は先端に１個
の出芽型分生子を形成する（第一次分生子）分生子は無
色、洋ナシ形、コ／、ｊ−Ａよ、４　ｘ　２　ｏ、６〜
６０８ｍの大きさ、生分子基部に微細な円錐形の突出部
を有する。分生子は胞子（下部膨潤部の内圧が高まるに
つれ、能動的に射出される。射出分生子は発芽して菌糸
を出しるか、又は第二次分生子あるいは粘着性分生子（
Ａｄｈｅｎｓｉｖｅ　ｃｏｎｉｄｉａ）を生じる。第二
次分生子は第一次分生子とほぼ同形同大。

粘着性分生子は第一あるいは第二次分生子から生じた毛
細管状の柄の先端に形成される。＃１円形、長さ弘Ｏ−
≠よμｍ１巾は１３〜２１μｍ１脱落性、先端に粘着性
のサックを有する。

接合胞子は近接した分節菌体の融合によって形成される
、球形〜亜球形、直径３０．７〜弘Ｏμｍに至る。接合
胞子内部には油滴状物質が含有されている。接合胞子壁
はλ〜≠μｍの厚さ、平滑。ホモタリック種。

２　麦芽寒天粉末培地（ＭＡ）上、 ２７℃、！日間の培養 本培地上での培養上の特徴、形態上の性ズは上記ＰＤＡ
上での性質と一致する。

（２）　　生理的性質 ／、　最適生育条件（ＰＤＡ培地、！日間の培養） 最適ｐＨ：　！〜７ 最適温度：３０〜３７℃ ２　生育の範囲 ｐＨ：ｊ〜り 温度：λＯ〜３７℃、ａＯ℃では生育せず（３）分類学
的考案 ／、　属レベルの同定 本菌株（ＭＫｊり♂♂）はｓ　　’）基底菌糸が隔壁の
挿入によシ分節菌体（ｈｙｐｈａｌθｅｇｍｅ−ｎｔｓ
　）　を形成する、り分生子柄は下部膨潤部を形成する
、３）分生子は下部膨潤部よシ出芽によって常に７個形
成される、り分生子は能動的に射出される、ｊ）有性生
殖は隣接菌糸あるいは分節菌体の接合（配偶子１接合）
による％６）本モタリツク種。

これらの諸性質はＯ−Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ　＃　ＪＯｕ
ｒ＊Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　Ａｃａｄ、８ｃｉ　　’
Ｉ　！　　：　　’Ｉ　　ターｊ６（／りｊｌ）及びＪ
、○ｏｒｅｍａｎｓ−ｐｅ１ｓｅｎｅｅｒ、　Ａｃｔａ
　ｚｏｏｌｏ−ｇｉＣａ　　ａｔ　　ＰａｔｈＯｌｏｇ
ｉＣａ　　ｇ　Ｏ：　／−／　１７３　（／り７≠）に
記載されているバシデイオボルス （Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　）属の特徴によく合致し
た。

よって本菌株（ＭＫＪり♂ｔ）は接合菌亜門−接合菌網
−ハエカビ目−Ｂａθｔａｉｏｂｏ１ａｃｅａｅのバシ
デイオボルス（ＢａｓｉｄｉｏｂｏＬｕｓ）属に帰属す
る。

２　種レベルの同定 ０、　Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ、Ｊｏｕｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｍ　Ａｃａｄ−８ｃｉ４ｊｊ　；　ＩＩターｒｇ（
ｉ９ｚｓ）、Ｒ，に、Ｂ　ｅｎｊａｍｉｎｅＡｌｌｓｏ
　ｊ（２）、２２３−２３３（／９Ａ２）、Ｄ、Ｌ。

Ｇｒｅｅｒ＆　Ｌ、　Ｆｒｉｅｄｍａｎ＋５ａｂｏｕｒ
ａｕｄｉａ　ＩＩ　：　２３　／−，２４ｔ／　（／９
＆Ａ）、Ｍ、Ｏ，５ｒｉｎｉｖａｓａｎ＆Ｍ−Ｔ、Ｔｈ
ｉｒ−ｕｍａｌａｃｈａｒ、Ｍｙｃｏｐａｔｈ、Ｍｙｃ
ｏｌｏｇｉａ　ＡｐｐｌｉｃａｔａｊＪ：ｊＡ−４４４
（／り６７）及びＪ、ｃｏｒｅｍａｎｓ−Ｐｅ１ｓｎｅ
ｅｒ、　Ａｃｔａ　Ｚｏｏｌｏｇｉｃａ　ｅｔ　ｐａｔ
ｈｏｘｏｇ１ｃａＩ！ｌＯ：／−／≠Ｊ（／り７弘）の
バシデイオボルス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属菌に
関する分類学的文献によれば、木馬には５種（Ｂ、ｒａ
ｎａｒｕｍ　ｌＢ、ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ、ｍａ
ｇｎｕｓ　、Ｂ、ｈａｐｔｏｓｐｏｒｕｓ。

Ｂ、ｍａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ）　　が含まれている
。これらの５種は／）接合胞子の細胞壁の肥厚度合、り
３７℃での生育の可否、３）気中菌糸の発達程度、り放
線菌臭（ストレプトマイセス臭１．シ！旦夏践皿り迂旦
臭）の有無、ｊ）ミクロコ ？ニブイア（ｍｉｃｒｏｃｏｈｉｄｉａ　）の有無によ
って識別されている。

本菌株（ＭＫＪ？♂♂）は％　’）接合胞子外壁は平滑
である、コ）３７℃での生育良好、３）各種培地上での
気中菌糸の形成顕著、リストレブトマイセス（ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）臭を欠く、りミクロ、Ｎ＝ニブイア
ｍｉｃｒｏｃｏｎｉ−ａｌａ　）を形成しないという特
徴を有することから、Ｏ、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ　、　Ｊ
ｏｕｒ　、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎとよく一致した。

従って本菌株はバジデイオボルスメリストスポルス（Ｂ
ａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ
）ＭＫＪりｌ♂と同定された。

ＭＫ３９１＃株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第ｇｆｓ’、３号（ＦｇＲＭｘｓ−’ｉデ句と
して受託されている。

本菌株、すなわちＭＫｊりｒｒ株は他の微生物の場合に
みられるようにその性状が変化しやすい。たとえば、Ｍ
ＫＪり♂ｒ株の、またはこの株に由来する突然変異株（
自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換
え体であってもニコチアナミンの生産能全有するバシデ
イオボルス属の菌はすべて本発明の方法に使用すること
ができる。

（１〕　　培養法 本発明の方法では、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養ｔ３゜栄養源としては、
グルコース、水あめ、デキストリン、シュクロース、澱
粉、糖蜜、動・植物油等を使用できる。また窒素源とし
て、大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープ・リカー、
綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アン
モニウム、硝酸ンーダ、尿素等を使用できる。その他、
必要に応じ、ナ）　ＩＪウム、カリウム、カルシウム、
マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、及びその
他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加する
ことは有効である。また菌の生育を助け、ニコチアナミ
ンの生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加
することができる。

培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養
法が最も適している。培養に適当な温度は／！−ｊ７℃
であるが、多くの場合、２６−３０℃付近で培養する。

ニコテアナミンの生産は培地や培養条件によシ異なるが
、振とり培養、タンク培養とも通常／−１０日の間でそ
の蓄積が最高に達する。培養物中のニコチアナミンの蓄
積量が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的
物質を単離精製する。

（３）精　製 本発明によって得られるニコチアナミンの培養物からの
採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段
、たとえば、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は
分配カラムクロマト法、ゲルろ適法、透析法、沈殿法等
を単独で又は適宜組合わせて抽出精製することができる
。たとえば、ニコチアナミンは培養菌体中からはアセト
ン−水又はメタノール−水で抽出される。また、培養液
中に蓄積されたニコチアナミンは強塩基性イオン交換樹
脂である０ダイヤイオンＰＫ２０ｇ”（三菱化成工業株
式会社製）等に吸着される。

ニコチアナミンをさらに精製するには、シリカゲル（″
ワコーゲルＯ−，２００”、和光純薬工業株式会社製等
）、アルミナ等の吸着剤とよい。

このようにして培養物中に生産されたニコチアナミンは
遊離の形、す々わちニコチアナミンそれ自体として分離
することができ、またニコチアナミンを含有する溶液又
はその濃縮液を塩基、たとえば水酸化す）　ＩＪウム、
水酸化カリウム等のアルカリ金属化合物、たとえば水酸
化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金
属化合物、アンモニア等のような無機塩基、たとえばエ
タノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシル
アミン等の有機塩基、または酸、たとえば塩酸、硫酸、
燐酸などの無機酸またはたとえばギ酸、クエン酸、酒石
酸等の有機酸によシ、各工程の操作中、たとえば抽出、
分離又は精製の各工程の操作中に処理した場合、ニコチ
アナミンは対応するその塩類の形に変化し、分離される
。また別にこのようにして製造されたニコチアナミンの
塩類は、常法によシ遊離のかたち、すなわちニコチアナ
ミンそれ自体に容易に変化させることができる。

さらに遊離の形で得られたニコチアナミン全前記塩基に
よシ常法で対応するその塩類に変化させてもよい。

したがってニコチアナミンと同様に前記のようなその塩
類の製造法も、この発明の範囲内に包含されるものとす
る。

前記製造−法にしたがって得られたニコチアナミンは下
記の物理化学的性質を有する。

■　分子量及び分子式 ％式％ ■　赤外線吸収スペクトル（Ｋ　Ｂ　ｒ　＠　ｃｍ−’
　）３１１２０．３０！０．２１７０．２１．００．．
２３７０゜／！１０．　　／！００．　　／’１７０．
　　／１１１０．　　／３７０゜／３３０．　　／３１
０．　　／＋２り０．　　／、！４１０．　　／＋２２
０゜１１７０　、　　♂００．　７乙Ｏ１乙７０．　　
！９０．　　！；７０゜μり０．　　≠１０ ■　紫外線吸収スペクトル〔λｍａｗ　ｎｍ（ε）〕水
溶液中、ｉｏｏμｇ／−の濃度で特徴的な吸収を示さな
かった。

■　’ＨＮＭＲスペクトル（≠ＯＯＭＨ２）重水溶液中
、ＴＳＦを内部標準（ｏ　ｐｐｍ　）として測定した。

δ（ｐｐｍ）　：　’Ｉ−Ｊ’　０　（／　Ｈ＃　ｍ）
　、４’　−／−２（／Ｊ　ａｔ）　ｓ３、り、ｒ（／
Ｌａａ）、　　Ｊ、りｏ（ｉＨ−ａａ）ｅｊ、７Ｆ（／
Ｈ，ｄｄ）、　Ｊ、！弘（／Ｈ，ｍ）。

Ｊ、Ｊ７（／Ｈ，ｍ）、　ｊ、Ｊｊ（，２Ｈ，ｍ）。

、ｘ、ｒ７（／Ｌｍ）、　ｘ、ｔｇ（／ａ、ｍ）。

ｘ、ｘｔ（ｘＨ，ｍ）、　ｕ、／７（，２ｔｍ）。

■　”ＯＮＭＲスペクトｋ　Ｃ１００ＭＥＺ　）重水溶
液中、ジオキサンを内部標準 （４７，１１ｐｐｍ　）　　として測定した。

δ（ｐｐｍ）：　／７１Ａ、３．　／７１Ａ、２．　／
７３．６゜Ｉ、７．り、　　ｌｓＯ，６，Ｊｊ、ｒ、　
　６コ、コ。

ｊ／、ｉ≠６．ｏ、コ♂、３．２６．Ｏｅ＋２２．／ ■　溶解性 水に可溶。メタノール、クロロホルム、酢ｏ：ｒ−チル
、トルエン、ヘキサンに不溶。

■　物質の色及び性状 白色微粉末 ■　呈色反応 ニンヒドリン試薬に陽性 ■　薄層クロマトグラフィー 展開溶媒系　　　　　　　　Ｒｆ値 ブタノール−メタノール−水（２：／：／）　　　　０
．コＯ〔実施例〕 以下に本発明の実施例を示すが、本発明は、その要旨を
越えない限υ以下の実施例によって　□限定されるもの
ではない。

実施例１ （培養） 水飴≠、θ％、大豆油０．３％、大豆粉λ−ｏ！Ａｚ綿
実粕八〇　Ｘ、へングレインＯＪ％、０ａ００゜０．３
免、Ｆｅ５０．　ａ　７Ｈ２００，００／　Ｘ、　０Ｏ
Ｏｔ、弓Ｂ、００．０００　／　Ｘ及びＮ１ａｔ、　−
ＩＢ、Ｏｏ、Ｏｏ　ｏ　／％を含有する培地（ｐＨ６，
ｏ）　　をｐｏｄずつ２００ｍ１三角フラスコｌＯ本に
分注し、／、２／”Ｃにおいて２０分間高圧滅菌する。

ズ これにバシデイオボルス・メリスンルス（Ｅａｓｉｄｉ
ｏｂｏｌｕｓ　ｍ５ｒ１ｓｔ祐６ｒｕａ）ＭＫＪり２ｇ
株をｌ白金耳ずつ植菌し１．２４”Ｃにおいてμ日間、
２１０回転にて振とう培養する。別にコーンスターチ２
．０５Ａ、グｋ　コ−ス０−　ｊ　Ｘ　％大豆油ｓ５Ａ
。

大豆粉６．２ｔ％、綿実粕Ｓ、ＯＸ、スタミノールＯ０
−％及びＣａＱＯ，八〇％を含有する培地（ｐＨ６，０
）をｒｏｒＩｔｅずつ！ｒ００−三角フラスコ！θ本に
分注し、７２７℃において２０分間高圧滅菌する。各フ
ラスコに上記の方法で得られた前培養物を４を−ずつ接
種し２ｔ”Ｃにおいて２日間、２１０回転にて振とり培
養する。得られた培養物を遠心分離して、上清３．２ｔ
を得た。

実施例λ 実施例／で得られた培養ろ液３．−りを１ダイヤイオン
ＰＫ−２０１″（Ｈ＋型３ｏｏｍｔ）のカラムに通し、
通過液３．２乙のうちのｕＬ（ｉ−さらにゴー ”ダウノックスｌｘ、ｚ”（ａｘ−型３ｏｏｍｔ）のカ
ラムおよび活性炭（３００ｙｄ）のカラムを順次通過さ
せた。この通過液を濃縮乾固すると３りＳの褐色粉末が
得られた。

実施例３ 実施例λで得られた褐色粉末２Ｉｒ９を少量の水に溶か
したのちｘｏｇのシリカゲルにまぶし減圧下充分乾燥し
た。これをシリカゲル（ｉｏｏ。

−７りのカラムの上部に充填し展開溶媒プロパノ−ルー
ピリジン−酢酸−水（ｊＯ：ｌＯ：３：乙）　ａｏ。

−１次いでプロパノ−ルーピリジン−酢酸−水（）！二
１０：３ニア２）ｔＯＯＯ−で展開するとＦｒ−／！；
０−２７０　　にニコチアナミンを主に含む画分が溶出
され、これを濃縮乾固すると！３．４ｔｌの白色粉末が
得られた。

この白色粉末／♂ｇを少量の水に溶かし”セファデック
スＧ−１０″（♂ｏｃ、１）のカラムの上部に乗せ、水
で展開しニコチアナミンを主に含む画分を集め、減圧濃
縮すると２≠り■の白色粉末が得られた。

実施例≠ 実施例３で最後に得られた白色粉末１０１１■を少量の
水にとかし、”ダイヤイオンｌ’に一２０ｇ”（Ｈ”、
ｒＯｌｎｔ）のカラムに吸着させ、水洗後にＯＪＮの水
酸化アンモニウムで溶離した。

この溶離液を濃縮し濃縮液を”キレツクス１００’″（
Ｎａ”＋　ｊ　ｍｌ　＋バイオラド０社製）のカラムを
通過させた。通過液のｐＨをゝＣＭ−セファデックスＣ
−２ｚ　（Ｈ”）で４ｊ　　に調整したのち濃縮乾固す
るとｔ２■のニコチアナミンが得られた（ＩＣ１゜＝Ｏ
ｄ２μｇ／ゴ）。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、ニコチアナミンを効率よく得るこ
とができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）バシデイオボルス（￥Ｂａｓｄｉｏｂｏｌｕｓ￥
   ）属に属し、ニコチアナミン（￥Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍ
   ｉｎｅ￥）を生産する能力を有する微生物を栄養培地に
   培養し、培養物中にニコチアナミンを生成蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とする微生物によるニコチア
   ナミンの製造法。
2. （２）バシデイオボルス属に属する生産菌がバシデイオ
   ボルス・メリストスボルス（￥Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕ
   ｓ￥￥ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ￥）ＭＫ３９８８（
   微工研菌寄第８９８３号）である特許請求の範囲第１項
   記載の製造法。