JPS6373149A - 細胞の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、生細胞もしくは死細胞を選択的に単離するこ
とができる細胞の単離方法に関する。

〈従来の技術〉 従来より細胞の単離方法としてはフローサイトメトリー
、コールタ−カウンターの原理を用いた単離方法がある
。

フローサイトメトリーの原理を用いた単離方法は、細胞
その他の粒子の懸濁液を水滴１個に細胞２粒子が１個含
まれるように液流を調節してミクロノズルより噴流とし
て流し、各水滴中の試料にレーザー光あるいは水銀光を
照射して励起された蛍光や散乱光を検知し、これを電気
信号に変換して信号を鮮析することにより試料溶液の細
胞２粒子の大きさ及び組成を知るとともに、電気信号に
応じて懸濁流に電荷を与えることにより目的の細胞や粒
子を含んだ水滴を選択的に異なる位置へ落下させるとい
うものである。

また、コールタ−カウンターの原理を用いた単離方法は
、微小孔であるアパーチャーで連結されろ２つの液槽に
それぞれ電極を設け、アパーチャーに細胞などの粒子を
含む液を流してそのときの両電極間のインピーダンスを
測定し、これにより細胞などの粒子がアパーチャーを通
過したことをインピーダンスの変化として検出し、この
検出に応じて単離・分注を行うものである。

〈発明が解決しようとする問題点〉 ところで、細胞融合後、培養を続けた融合細胞は、ある
時期になるとそれまで培養を続けてきたウェルから他の
培養器に移植して培養を続けていく必要があるが、この
際、ウェル内には融合細胞（生細胞）とともに融合時及
び培養時に死滅していた死細胞が混在している。よって
、このような培養液中より生細胞のみを選択的に単離す
ることは、次の培養を状態よ〈実施するための重要な要
素となる。

ところが、上述した従来の単離方法によって生細胞のみ
を選択的に単離するには問題があった。すなわち、フロ
ーサイトメトリーの原理を用いた方法により生細胞のみ
を分離しようとすると、試料溶液そのものを蛍光色素等
で染色しなくてはならないため、細胞の活性へ影響が出
るという問題がある。また、フローサイトメトリーある
いはコールタ−カウンターの原理を用いｔこ方法におい
て、カウントされた死細胞をその信号の大きさによって
判断して生細胞のみを単離しようとすることは可能であ
るが、融合細胞の径及び分布が各ウェルによって異なる
ので、信号の区切すの大きさを適切に決定するのが困難
であるという問題がある。

本発明は、このような事情に鑑み、生細胞のみを選択的
に単離することができる細胞の単層方法を提供すること
を目的とする。

く問題点を解決するための手段〉 前記目的を達成する本発明の構成は、ウェル中の細胞を
含む培養液における細胞を検出し、単離する方法におい
て、各ウェル中の培養液の一部を予め採取し、この採取
試料中に染色試料を混入することにより該採取試料中の
細胞の生死を判別してそれぞれの直径あるいは長径の分
布を測定し、この結果より単離する細胞の直径あるいは
長径を限定し、単離・分注することを特徴とする。

ここで、前記生細胞及び死細胞の直径あるいは長径の測
定は画像処理により行うことが好ましい。また、細胞の
単離は、細胞の流路の細胞が検出される位置より流路後
方の位置に連通ずる第３の流路より液を流して押し流す
ようにするのが好ましい。

以下に本発明の構成をさらに説明する。

各ウェルからの採取試料中の生死細胞の判別は細胞学実
験で通常行っている染色法により行えばよく、染色試料
としてはエリスロシンＢ、　　！−リパンブルー、ニグ
ロシン等を用いればよい。これらの染色色素は何れも陰
性電荷を持ち、生細胞の細胞膜（通常、負性荷電してい
る）を通過できないため、死細胞だけにとりこまれる。

かくて、死細胞のみが染色きれ、また生細胞は明瞭な像
となる。なお、染色条件は色素によって異なる。

このようにして染色した試料をスライドグラスに添加し
、倒立顕微鏡で観察する。そして画像処理により試料中
の生細胞、死細胞ごとの長径あるいは直径を求める。

第１図及び第２図は何れもＢａ１ｂ／ｃマウスの牌細胞
とＢａ１ｂ／ｃ由来のミエローマ細胞ＳＰ２１０−Ａｇ
１４をＰＥＧ４０００にて融合し、選択培養を７日間行
い、さらに十数日間の培養を行った際のウェル中の生細
胞及び死細胞の長径分布を示すピストグラムである。両
図より、生細胞及び死細胞の細胞径分布の差異が明らか
である。第１図では生細胞の平均径は１５．８μｍ１死
細胞の平均径は９．６μｍ１第２図では生細胞の平均径
は２１．３μｍ、死細胞の平均径は１４．４μｍである
。また、両者とも同一条件で融合、培養を行ったにもか
かわらず両者の径分布は異っている。よって径の大きさ
から生死細胞の判別を行うには各ウェルごとに径分布測
定を行う必要がある。

このような径分布より生細胞のみを単離するには単離す
べき細胞径の閾値を決定しなければならない。この閾値
を決定するアルゴリズムは実施者の任意の方法で決めれ
ばよい。

上記の径分布を見れば明らかなように、確実に生細胞の
みを単離しようとするには閾値を高くしなければならず
、この場合には単離効率は悪くなる。一方、生細胞単離
効率を良くしようとすると死細胞の混入がかなり増える
可能性がある。よって、この閾値は目的に応じて適宜、
定める必要がある。

このように決定された閾値以上の細胞径が検出されたと
きに単離するようにすれば生細胞のみ、あるいは生細胞
の多いものが単離できる。

ここで、本発明方法に用いて好適な単離分注装置の１例
を第３図を参照しながら説明する。

同図に示すように、この単離分注装置は液槽２、アパー
チャー１及び液槽３を経る細胞６の流路のほかに、第３
の流路８を有している。この装置は電極４及び電極５の
間のインピーダンスの変化を測定する乙とによりアパー
チャー１を通過する細胞６を検出するものであり、第３
の流路８は、細胞６が検出される位置より流路後方に位
置するように設けるようにし、図示の場合は流路後方側
の電極５に関してはそれよりは流路前方に位置している
。また、第３の流路８の途中には弁９が設けられており
、この弁９が開くと第３の流路８から粒子６の流路に対
し所定量の液を流すようになっている。上記弁９の開閉
については、６の検出に応動して行なわれる。また、そ
の場合に第３の流路８から流れ出る液量については、細
胞６と共に流れて来る液量より多く、例えば細胞６と共
に流れる液量が０．０１ｅｅの場合、これに対し第３０
流路８から流れ出る液量は０．２ｃｃ程度とする。さら
に、この例の装置は、液槽３の下部にフレキシブルチュ
ーブ１０を備えている。乙のフレキシブルチューブ１０
は細胞６の流路の出口部を構成するもので、細胞６が検
出された場合これによって流路出口が新たな容Ｗｉ７へ
通ずるように、そして細胞６が検出されないときは流路
出口が常に排液部に通ずるようにフレキシブルチューブ
可動機構１１によって出口が移動せしめられるようにな
っている。この可動機構１１によるフレキシブルチュー
ブ１０の移動は、上述の弁９の場合と同様、細胞６の検
出に応動して行なわれる。

したがって、上述のように決定した閾値以上の細胞６を
検出されたときに流路出口は新たな容器７に通じるよう
にし、かつ第３の流路８から所定量の液を流すようにす
ることにより、その流した液に細胞６を含ませて容器７
に分注することができる。

く実　施　例〉 試料 Ｂａ１ｂ／ｃ　ｖ　ｆｐ　Ｘ牌細胞とＢａ１ｂ／ｃ由来
ミエローマ細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１４を５＝　１でＰＥ
Ｇ４０００の５０％ＨＥＰＥＳ溶液で融合したもの。

培養は２０％ＦＣ３，ＤＭＥ溶液を使用し、ＨＡＴ培養
を７日間、ＨＴ培養を６日間行った後、通常培地にて１
０日間行った。

染色 染色用試薬として０．２％ニグロシン。

ＤＭＥ溶液を用いた。なお、ニグロシンの溶媒としてＤ
　Ｍ　Ｅを用いたのは浸透圧の差による細胞の体積変化
を除くためである。

試料となる培養液はウェル内で撹拌を行って細胞を均一
に分散させる。これより５０μｌを分取し、これに０．
２％ニグロシン溶液を５０μｌ混ぜ、血球算定用スライ
ドに添加した。

画像処理 試料添加スライドグラスを倒立ｗＬ徴鏡上におき、カメ
ラを介してマイクロコンピュータ（画像処理装置付属）
にその細胞画像を取り込んだ。この取り込み時期は染色
開始から５分段７ある。

処理後のヒストグラムを第２図に示すものであり、その
詳細は下記の通りである。

生細胞：　平均径　　　２１．３μｍ 不偏分散　　±３．５μｍ ｎ　＝　６２ 死細胞：　平均径　　　１４．４μｍ 不偏分散　　±６．２μｍ ｎ　＝　２０９ 閾値決定 閾値は次のようにして決定した。

ヒストグラムの区間幅を２μｍとし、各区間ごとに小さ
い区間より、生細胞数／死細胞数を計算した。この値が
初めて４を超えた区間の開始値を閾値とした。

この場合の閾値は２２μｍである。なお同様にして第１
図の場合の閾値を求めると１４μｍである。

細胞単離 細胞単離には、上述した第３図に示す単離分注装置を用
いた。上述のようにして求めた閾値２２μｍに対応する
出力信号以上の信号が検出された場合に分注するように
した。

結果 このように単離分注した溶ｗｌｓｏウェルにつき、細胞
が実際に生細胞かどうかを染色法により確認したところ
、３８ウエルの細胞が生細胞であった。このときの単離
生細胞率は７２％である。元の試料中の生細胞率は２１
．９％であるので生細胞が選別単離されているのは明ら
かである。また第２図より２２μｍ以上の生細胞率は７
９．５％であり、上記方法による閾値設定に効果があっ
たことを示している。

（発明の効果〉 以上、実施例とともに具体的に説明したように、本発明
方法によれば、生死細胞それぞれについて測定した直径
あるいＣよ長径の分布を後の細胞単離時の信号閾値に反
映させるため、単離された細胞の生細胞率を著しく高め
ろことができ、モノクローナル抗体産生細胞の選別を典
型的な例とする特別な細胞の単離において大きな効果を
発揮することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ本発明の実施例における生
死細胞の長径分布を示すヒストグラム、第３図は細胞の
単離分注装置の１例を示す説明図である。 図　面　中、 １はアパーチャー、 ２．３は液槽、 ４．５は電極、 ６は細胞、 ７は容器、 ８は第３の流路、 １０はフレキシブルチューブである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ウェル中の細胞を含む培養液における細胞を検出し
   、単離する方法において、各ウェル中の培養液の一部を
   予め採取し、この採取試料中に染色試料を混入すること
   により該採取試料中の細胞の生死を判別してそれぞれの
   直径あるいは長径の分布を測定し、この結果より単離す
   る細胞の直径あるいは長径を限定し、それを単離・分注
   することを特徴とする細胞の単離方法。 ２）細胞の直径あるいは長径の測定は画像処理により行
   う特許請求の範囲第１項記載の細胞の単離方法。 ３）細胞を単離・分注するのに、細胞の流路の細胞が検
   出される位置より流路後方の位置に連通する第３の流路
   より液を流して押し流すようにした特許請求の範囲第１
   項あるいは第２項記載の細胞の単離方法。