JPS6368073A - ハイブリッド細菌株 - Google Patents
ハイブリッド細菌株Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はコレラ菌のＯ−体細胞抗原（■１ｂｒｉ。
ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｏ−ｓｏｍｏ−５ｏ ａｎｔｌｇｅ
ｎ ： Ｖｅ ＯＡｇと略す）の高レベル発現のために
使用し得るハイブリッド細菌株に関する。
ｎ ： Ｖｅ ＯＡｇと略す）の高レベル発現のために
使用し得るハイブリッド細菌株に関する。
［従来の技術］
コレラ菌の両血清型からの〇−抗原をコードする遺伝子
は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ −１２にクローニング
されている。このようなプラスミドクローンはｐＰ Ｍ
ｌｏｏＩ、 ｐ Ｐ Ｍ１００２． ｐ Ｐ Ｍ２Ｏ２
Ｓ、およびｐＰＭｌｏｏｌから誘導されるｐＰＭ１００
４である。
は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ −１２にクローニング
されている。このようなプラスミドクローンはｐＰ Ｍ
ｌｏｏＩ、 ｐ Ｐ Ｍ１００２． ｐ Ｐ Ｍ２Ｏ２
Ｓ、およびｐＰＭｌｏｏｌから誘導されるｐＰＭ１００
４である。
〔これらのプラスミドは先の特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５
１０００１５ （その記載内容はすべて参照によりこ
こに引用される）、およびマニング（Ｍａｎｎｌｎｇ）
ら、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、 ５３ （２）、
２７２〜２７７ （１９８Ｂ）に開示されている。〕こ
れらのプラスミドを保有する大腸菌Ｋ−１２株はリポ多
糖（Ｌ Ｐ Ｓ）の形のＶｃ ＯＡｇを高レベルで産生
じ、それ故にそれは標準的な熱フェノール／Ｈ２０法で
抽出可能であり、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル」二
で電気泳動にかけた細胞外被物質の銀染色により検出可
能であり、そしてそれはコレラ菌に対する抗血清との凝
集により判定したときクローンの細胞表面上に存在する
。
１０００１５ （その記載内容はすべて参照によりこ
こに引用される）、およびマニング（Ｍａｎｎｌｎｇ）
ら、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、 ５３ （２）、
２７２〜２７７ （１９８Ｂ）に開示されている。〕こ
れらのプラスミドを保有する大腸菌Ｋ−１２株はリポ多
糖（Ｌ Ｐ Ｓ）の形のＶｃ ＯＡｇを高レベルで産生
じ、それ故にそれは標準的な熱フェノール／Ｈ２０法で
抽出可能であり、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル」二
で電気泳動にかけた細胞外被物質の銀染色により検出可
能であり、そしてそれはコレラ菌に対する抗血清との凝
集により判定したときクローンの細胞表面上に存在する
。
しかしながら、ｐＰＭ１００４をネズミチフス菌（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕＩｎ） Ｇ
３０株、またはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉ ） Ｔｙ ２１ａ株、両方のｇａｌＥ突然変
異株に導入するとき、Ｖｅ ＯＡｇは低レベルで産生さ
れしかもリポ多糖の形をしていない。それ故に、それは
熱フェノール／Ｈ２０法で抽出できず、上記のように銀
染色することもできない。これらおよび他のサルモネラ
菌株はＶｃ ＯＡｇを豊富に発現しないので、このこと
は経口生ワクチンにおけるＶｃ ＯＡｇのキャリア菌株
としてサルモネラ菌を使用する上で大きな障害となって
いる；ＶｃＯＡｇはコレラの免疫のための防御抗原であ
ることが知られている。
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕＩｎ） Ｇ
３０株、またはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉ ） Ｔｙ ２１ａ株、両方のｇａｌＥ突然変
異株に導入するとき、Ｖｅ ＯＡｇは低レベルで産生さ
れしかもリポ多糖の形をしていない。それ故に、それは
熱フェノール／Ｈ２０法で抽出できず、上記のように銀
染色することもできない。これらおよび他のサルモネラ
菌株はＶｃ ＯＡｇを豊富に発現しないので、このこと
は経口生ワクチンにおけるＶｃ ＯＡｇのキャリア菌株
としてサルモネラ菌を使用する上で大きな障害となって
いる；ＶｃＯＡｇはコレラの免疫のための防御抗原であ
ることが知られている。
大腸菌に−１２におけるＶｃ ＯＡｇの発現と比較して
、サルモネラ菌におけるその発現が乏しい理由は２つの
菌種間の多くの差異のいずれかが原因であると思われる
。発現の妨害は遺伝子発現または生合成および結合（ａ
ｓｓｅｍｂｌｙ）のレベルで起こりうる。
、サルモネラ菌におけるその発現が乏しい理由は２つの
菌種間の多くの差異のいずれかが原因であると思われる
。発現の妨害は遺伝子発現または生合成および結合（ａ
ｓｓｅｍｂｌｙ）のレベルで起こりうる。
［発明の構成］
従って、本発明の目的は従来技術に関連した１つ以上の
障害を克服するか、または少なくとも軽減することであ
る。
障害を克服するか、または少なくとも軽減することであ
る。
それに従って、大腸菌とサルモネラ菌との間の１つの大
きな差異は２つの菌種間のＬＰＳのコア領域の組成の差
異にあることが今や究明され、その差異は有意であると
考えられる。第１図は大腸菌に−１２およびネズミチフ
ス菌におけるＬＰＳのコア糖の配列ならびに組成を示す
。大腸菌に−１２のｇａｌ Ｅ突然変異株はそのＬＰＳ
の末端糖としてジグルコースをもつが、サルモネラ菌の
ｇａｌＥ突然変異株は末端糖としてモノグルコース残基
をもつことに注意するとおもしろい。
きな差異は２つの菌種間のＬＰＳのコア領域の組成の差
異にあることが今や究明され、その差異は有意であると
考えられる。第１図は大腸菌に−１２およびネズミチフ
ス菌におけるＬＰＳのコア糖の配列ならびに組成を示す
。大腸菌に−１２のｇａｌ Ｅ突然変異株はそのＬＰＳ
の末端糖としてジグルコースをもつが、サルモネラ菌の
ｇａｌＥ突然変異株は末端糖としてモノグルコース残基
をもつことに注意するとおもしろい。
大腸菌に−１２によるＶｃ ＯＡｇ発現におけるＬＰＳ
コアの役割は、ＬＰＳコアに影響する欠陥をもつ種々の
大腸菌Ｋ−１２株によるＶｃ ＯＡｇ（オガワ型）の発
現を調べることにより究明された。要約すると、野生型
またはｇａｌＥ型のＬＰＳコアをもつ大腸菌Ｋ−１２株
はＶｅ ＯＡｇを発現した。ＬＰＳコア中にヘプトース
およびグルコースの両方μたはグルコースのみを欠くか
、あるいはただ１つのグルコース残基をもつ大腸菌Ｋ−
１２突然変異株ではＶｅ ＯＡｇの発現がまったく観察
されなかった（第１図参照）。この結果は、大腸菌に−
１２におけるＶｃ ＯＡｇが大腸菌に−１２のＬＰＳコ
アに結合されることを示している。さらに、コア糖の見
地から推測される必要条件は、“ｇａｌＥ”型ＬＰＳが
Ｖｅ ＯＡｇ鎖の有効な受容体である以上末端ジグルコ
ースが存在しなければならないということである（第１
図参照）。
コアの役割は、ＬＰＳコアに影響する欠陥をもつ種々の
大腸菌Ｋ−１２株によるＶｃ ＯＡｇ（オガワ型）の発
現を調べることにより究明された。要約すると、野生型
またはｇａｌＥ型のＬＰＳコアをもつ大腸菌Ｋ−１２株
はＶｅ ＯＡｇを発現した。ＬＰＳコア中にヘプトース
およびグルコースの両方μたはグルコースのみを欠くか
、あるいはただ１つのグルコース残基をもつ大腸菌Ｋ−
１２突然変異株ではＶｅ ＯＡｇの発現がまったく観察
されなかった（第１図参照）。この結果は、大腸菌に−
１２におけるＶｃ ＯＡｇが大腸菌に−１２のＬＰＳコ
アに結合されることを示している。さらに、コア糖の見
地から推測される必要条件は、“ｇａｌＥ”型ＬＰＳが
Ｖｅ ＯＡｇ鎖の有効な受容体である以上末端ジグルコ
ースが存在しなければならないということである（第１
図参照）。
サルモネラ菌のＬＰＳコアはガラクトース残基が配置さ
れているために末端ジグルコースをもたず、またサルモ
ネラ菌のｇａｌＥ突然変異株はただ１つの末端グルコー
スをもつＬＰＳを産生ずる（第１図参照）。
れているために末端ジグルコースをもたず、またサルモ
ネラ菌のｇａｌＥ突然変異株はただ１つの末端グルコー
スをもつＬＰＳを産生ずる（第１図参照）。
これらの観察は、サルモネラ菌のＬＰＳコアがＶｃ Ｏ
Ａｇのための適当な受容体でないという本発明者らの仮
説を支持するものである。
Ａｇのための適当な受容体でないという本発明者らの仮
説を支持するものである。
従って、第１の面において、本発明は大腸菌株のコア領
域の少なくとも一部の合成をコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメントを保有する無毒性サルモネラ菌株を提
供する。
域の少なくとも一部の合成をコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメントを保有する無毒性サルモネラ菌株を提
供する。
大腸菌株は大腸菌Ｋ−１２株であり得る。そのＤＮＡフ
ラグメントに含まれる遺伝子座はｒｆａと呼ばれる。こ
うして、従来技術の問題を回避するために、サルモネラ
菌−大腸菌に−１２ハイブリツド菌株がＬＰＳのコア領
域をつくるのに必要な酵素をコードする大腸菌Ｋ−１２
染色体の領域をサルモネラ菌に移入することによって構
築された。この遺伝子座ｒｆａは大腸菌Ｋ−１２遺伝子
地図上の約８１分のところに存在する。
ラグメントに含まれる遺伝子座はｒｆａと呼ばれる。こ
うして、従来技術の問題を回避するために、サルモネラ
菌−大腸菌に−１２ハイブリツド菌株がＬＰＳのコア領
域をつくるのに必要な酵素をコードする大腸菌Ｋ−１２
染色体の領域をサルモネラ菌に移入することによって構
築された。この遺伝子座ｒｆａは大腸菌Ｋ−１２遺伝子
地図上の約８１分のところに存在する。
大腸菌Ｋ−１２由来のｒｆａ、 （ｒｆａ） 、
を含むこのようなサルモネラ菌−大腸菌ハイブリッド菌
株は、適当なプラスミドクローンを保有するように構築
されると、リポ多糖の形のＶｃ ＯＡｇを高−１１＝ レベルで発現することができ、さらにリポ多糖の形をし
たサルモネラ菌のＯ−体細胞抗原を産生ずることも可能
である。
を含むこのようなサルモネラ菌−大腸菌ハイブリッド菌
株は、適当なプラスミドクローンを保有するように構築
されると、リポ多糖の形のＶｃ ＯＡｇを高−１１＝ レベルで発現することができ、さらにリポ多糖の形をし
たサルモネラ菌のＯ−体細胞抗原を産生ずることも可能
である。
上記のサルモネラ菌−大腸菌ハイブリッド菌株を構築す
るために、別の面において、本発明は特定の抗生物質耐
性をコードするように修飾された大腸菌株を提供する。
るために、別の面において、本発明は特定の抗生物質耐
性をコードするように修飾された大腸菌株を提供する。
その大腸菌株は大腸菌Ｋ −１２株であり得る。
大腸菌Ｋ−１２株はいずれの適当な型のものであっても
よい。大腸菌Ｋ−１２株の大腸菌Ｋ−１２ＰＫ３ （そ
の関連特徴はＨｆｒ 坊Ｌ 尺監 肪りである）を使
用することができる。大腸菌Ｋ−１２Ｋ Ｌ ２２ｇ株
（その関連特徴はＨｆｒ ｔｈｉ ｌｅｕである）
も使用し得る。特定の抗生物質耐性をコードするための
修飾は、これらの菌株を以下で述べるような簡単な選択
技法により容易に単離できるようにするものであること
が理解されるだろう。
よい。大腸菌Ｋ−１２株の大腸菌Ｋ−１２ＰＫ３ （そ
の関連特徴はＨｆｒ 坊Ｌ 尺監 肪りである）を使
用することができる。大腸菌Ｋ−１２Ｋ Ｌ ２２ｇ株
（その関連特徴はＨｆｒ ｔｈｉ ｌｅｕである）
も使用し得る。特定の抗生物質耐性をコードするための
修飾は、これらの菌株を以下で述べるような簡単な選択
技法により容易に単離できるようにするものであること
が理解されるだろう。
例えば、大腸菌株はクロラムフェニコール耐性をコード
しうる。大腸菌Ｋ−１２菌はｍｔｌ：：Ｔｎ９挿入変異
を含むように修飾され、その修飾は形質導入＝１２− （ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって行うことができ
る。
しうる。大腸菌Ｋ−１２菌はｍｔｌ：：Ｔｎ９挿入変異
を含むように修飾され、その修飾は形質導入＝１２− （ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって行うことができ
る。
本明細書では、以下に示すように多数の大腸菌、ネズミ
チフス菌、およびチフス菌がそれらの略号で表されるで
あろう。これらの菌株はそれぞれオーストラリア、アゾ
レード大学のカルチャー・コレクションに維持されてい
る。以下の表１は下記細菌株のそれぞれの略号および関
連特徴を示す。
チフス菌、およびチフス菌がそれらの略号で表されるで
あろう。これらの菌株はそれぞれオーストラリア、アゾ
レード大学のカルチャー・コレクションに維持されてい
る。以下の表１は下記細菌株のそれぞれの略号および関
連特徴を示す。
表 １
ＰＮ２ １（ｆｒ ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉＫＬ２２８
１１ｆｒ ｔｈｉ １ｅｕ ＮＫ８７０１ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９ＥＸ１７８
Ｈｆｒ ｔｈｉ ｔｈｙＡ ［ｐＰＭ１００
４］ＥＸ１７０ ＰＮ２ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９ＥＸ
１７３ ＫＬ２２８ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９Ｐ２４９
５ ｔｏｌｃ２１０：：ＴｎｌＯＥＸ２６０ ＥＸ１７
０ｔｏｌｃ２１Ｑ：：ＴｎｌＯＥＸ３２０ Ｈｆｒ ｔ
ｈｉ ｔｈｙＡ ｔｏｌｃ２１０：：ＴｎｌＯ［ｐＥＶ
Ｘ１４コ＊ 表 １ （続き） ネズミチフス菌株 Ｇ３０ ■卦 Ｖ２Ｏ３Ｇ３０ ５ｔｒＲ［ｐＰＭＩＯ０４］ＥＸ２０
６ Ｖ２Ｏ３（ｒｆａ 、大腸菌Ｋ−１
２山来のｃｍｌ Ｒ） ＥＸ２Ｂ２ ０３０ （ｒｆａ ｍｔｌ−１６
：：Ｔｎ’ｊ）ト１２ＬＢ５０１０ ｔｒｐ
ｍｅｔＡ ｍｅｔＥ ｉｌｖ −…−■ｇａｌ
Ｅ ｈｓｄＬ ｈｓｄｓ ｈｓｄＴ ｒｐｓＬ
ＥＸ２００ ＬＢ５０１０ （ｍｅｔ 、
ｉｌｖ 、 ｒｆａ。
１１ｆｒ ｔｈｉ １ｅｕ ＮＫ８７０１ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９ＥＸ１７８
Ｈｆｒ ｔｈｉ ｔｈｙＡ ［ｐＰＭ１００
４］ＥＸ１７０ ＰＮ２ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９ＥＸ
１７３ ＫＬ２２８ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎ９Ｐ２４９
５ ｔｏｌｃ２１０：：ＴｎｌＯＥＸ２６０ ＥＸ１７
０ｔｏｌｃ２１Ｑ：：ＴｎｌＯＥＸ３２０ Ｈｆｒ ｔ
ｈｉ ｔｈｙＡ ｔｏｌｃ２１０：：ＴｎｌＯ［ｐＥＶ
Ｘ１４コ＊ 表 １ （続き） ネズミチフス菌株 Ｇ３０ ■卦 Ｖ２Ｏ３Ｇ３０ ５ｔｒＲ［ｐＰＭＩＯ０４］ＥＸ２０
６ Ｖ２Ｏ３（ｒｆａ 、大腸菌Ｋ−１
２山来のｃｍｌ Ｒ） ＥＸ２Ｂ２ ０３０ （ｒｆａ ｍｔｌ−１６
：：Ｔｎ’ｊ）ト１２ＬＢ５０１０ ｔｒｐ
ｍｅｔＡ ｍｅｔＥ ｉｌｖ −…−■ｇａｌ
Ｅ ｈｓｄＬ ｈｓｄｓ ｈｓｄＴ ｒｐｓＬ
ＥＸ２００ ＬＢ５０１０ （ｍｅｔ 、
ｉｌｖ 、 ｒｆａ。
ｍｔｌ−１８： ：Ｔｎ９）Ｋ−１２
ＥＸ２１６ ＥＸ２００ ［ｐ
ＰＭＩＯ０４コＥＸ３６１ ＥＸ２００ ｔｈ
ｙＡＳＧＳＣ２６２ｔｒｐ ｍｃｔＡ ｍｃｔＥ
ｉｌｖ ｘｙｌｈｓｄＬ ｈｓｄＳ ｒｐｓＬ
ｒｆａＧ３０３７ＥＸ２２５ ５ＧＳＣ２８
２（ｉｌｖ ｘｙｌ ｒｆａ ｍｔｌ−１８：：Ｔ
ｎ２）Ｋ−１２ 表 １ （続き） チフス菌株 Ｖ４８７ Ｔｙ２１ａ ｒｉｆＲ［ｐＰＭ１
００４］ＥＸ２１０ Ｖ４８７ （ｒｆａ ｍ
ｔｌ−１６：：Ｔｎ９）ト１２ＥＸ２３３ Ｅ
Ｘ２１０ ［ｐＰＭＩＯ０４欠除］ＥＸ２５６
ＥＸ２３３ ｍｔｌ ”ＥＸ２５９ ＥＸ２
５Ｂ庫０ ＥＸ’（８３ＥＸ２５９ ［ｐＥＶＸ１４］＊（）Ｋ−
１２は大腸菌Ｋ−１２由来の遺伝子領域を示す。
ＰＭＩＯ０４コＥＸ３６１ ＥＸ２００ ｔｈ
ｙＡＳＧＳＣ２６２ｔｒｐ ｍｃｔＡ ｍｃｔＥ
ｉｌｖ ｘｙｌｈｓｄＬ ｈｓｄＳ ｒｐｓＬ
ｒｆａＧ３０３７ＥＸ２２５ ５ＧＳＣ２８
２（ｉｌｖ ｘｙｌ ｒｆａ ｍｔｌ−１８：：Ｔ
ｎ２）Ｋ−１２ 表 １ （続き） チフス菌株 Ｖ４８７ Ｔｙ２１ａ ｒｉｆＲ［ｐＰＭ１
００４］ＥＸ２１０ Ｖ４８７ （ｒｆａ ｍ
ｔｌ−１６：：Ｔｎ９）ト１２ＥＸ２３３ Ｅ
Ｘ２１０ ［ｐＰＭＩＯ０４欠除］ＥＸ２５６
ＥＸ２３３ ｍｔｌ ”ＥＸ２５９ ＥＸ２
５Ｂ庫０ ＥＸ’（８３ＥＸ２５９ ［ｐＥＶＸ１４］＊（）Ｋ−
１２は大腸菌Ｋ−１２由来の遺伝子領域を示す。
＊ ｐＥＶＸ１４はコレラ菌のオガヮ型〇−抗原をコー
ドする１）ＥＶＸ３由来の２０Ｋｂ Ｓａｃ Ｉフラグ
メントを含むｐＥＶＸ５である（オーストラリア国特許
出願３８９００／８５に開示されている）。
ドする１）ＥＶＸ３由来の２０Ｋｂ Ｓａｃ Ｉフラグ
メントを含むｐＥＶＸ５である（オーストラリア国特許
出願３８９００／８５に開示されている）。
上記のハイブリッド菌株の構築に用いられる大腸菌Ｋ−
１２供与菌株の例はＥＸ１７０ 、 ＥＸ１７３ 。
１２供与菌株の例はＥＸ１７０ 、 ＥＸ１７３ 。
ＥＸ１７８ 、 ＥＸ２６ＧおよびＥＸ３２０と称され
るも＝ １６− のであり、これらの試料はオーストラリア、アゾレード
大学のカルチャーコレクションに維持されている。従っ
て、本発明の別の好適な面では大腸菌供与菌株ＥＸ１７
０ 、 ＥＸ１７３ 、 ＥＸ１７ｇ 。
るも＝ １６− のであり、これらの試料はオーストラリア、アゾレード
大学のカルチャーコレクションに維持されている。従っ
て、本発明の別の好適な面では大腸菌供与菌株ＥＸ１７
０ 、 ＥＸ１７３ 、 ＥＸ１７ｇ 。
ＥＸ２８０およびＥＸ３２０が提供される。
上記のハイブリッド菌株の構築に用いられるサルモネラ
供与菌株の例はネズミチフス菌Ｖ４９０およびチフス菌
ｖ４８７と称されるものであり、これらの試料はオース
トラリア、アゾレード大学のカルチャーコレクションに
維持されている。従って、本発明の別の好適な面ではサ
ルモネラ供与菌株のネズミチフス菌ｖ４９０およびチフ
ス菌Ｖ４８７が提供される。
供与菌株の例はネズミチフス菌Ｖ４９０およびチフス菌
ｖ４８７と称されるものであり、これらの試料はオース
トラリア、アゾレード大学のカルチャーコレクションに
維持されている。従って、本発明の別の好適な面ではサ
ルモネラ供与菌株のネズミチフス菌ｖ４９０およびチフ
ス菌Ｖ４８７が提供される。
大腸菌に−１２のｒｆａ遺伝子座はその遺伝子地図上の
約８１分のところにあり、マンニトール利用のための遺
伝子ｍｔｌにきわめて接近している。
約８１分のところにあり、マンニトール利用のための遺
伝子ｍｔｌにきわめて接近している。
（ｒｆａ）Ｋ−１２領域はＨｆｒ媒介染色体遺伝子転移
によりサルモネラ菌に導入された。ＨｆｒＰ Ｋ ３が
使用された：転移の起点は約７８分のところであり、初
期マーカーとしての（ｒｆａ）Ｋ−１２の転移は時計の
針と反対の方向に起こる。大腸菌遺伝子の転 移につい
て選択することができるように、菌株ＰＫ３はｍｔｌ
： ：Ｔｎ９挿入変異をもつべく形質導入により修飾さ
れた（Ｔｎ ９はクロラムフェニコール耐性をコードす
る）。ｍｔｌ遺伝子座はＨｆｒ転移起点と（ｒｆａ）Ｋ
−１２との間に存在し、そしてクロラムフェニコール耐
性決定因子は大腸菌染色体の転移についての直接選択を
可能にする。ｍｔｌおよび（ｒｆａ）Ｋ−１２は接近し
て連結されるので、ｍｔｌ：：Ｔｎ９を受は入れる大多
数の受容菌は（ｒｆａ）Ｋ−１２をも受は入れることが
予期された。
によりサルモネラ菌に導入された。ＨｆｒＰ Ｋ ３が
使用された：転移の起点は約７８分のところであり、初
期マーカーとしての（ｒｆａ）Ｋ−１２の転移は時計の
針と反対の方向に起こる。大腸菌遺伝子の転 移につい
て選択することができるように、菌株ＰＫ３はｍｔｌ
： ：Ｔｎ９挿入変異をもつべく形質導入により修飾さ
れた（Ｔｎ ９はクロラムフェニコール耐性をコードす
る）。ｍｔｌ遺伝子座はＨｆｒ転移起点と（ｒｆａ）Ｋ
−１２との間に存在し、そしてクロラムフェニコール耐
性決定因子は大腸菌染色体の転移についての直接選択を
可能にする。ｍｔｌおよび（ｒｆａ）Ｋ−１２は接近し
て連結されるので、ｍｔｌ：：Ｔｎ９を受は入れる大多
数の受容菌は（ｒｆａ）Ｋ−１２をも受は入れることが
予期された。
構築された供与菌株はＥＸ１７０と呼ばれた。それは受
容菌が耐性である抗生物質により反選択（ｃｏｎｔｒａ
ｓｅｌｃｃｔ）される。この供与菌株はまたいくつかの
成長因子要求性（トレオニンおよびロイシン要求性）を
もち、これらを利用して供与菌株を反選択することもで
きる。
容菌が耐性である抗生物質により反選択（ｃｏｎｔｒａ
ｓｅｌｃｃｔ）される。この供与菌株はまたいくつかの
成長因子要求性（トレオニンおよびロイシン要求性）を
もち、これらを利用して供与菌株を反選択することもで
きる。
別法として、または追加的に、大腸菌Ｋ−１２供与菌株
はデオキシコール酸ナトリウムに対する特異的感受性を
コードするように修飾することができる。大腸菌はｔｏ
ｌｃ２１０： ：ＴｎｌＯ挿入変異を含むように修飾さ
れる。この変異は形質導入を用いて挿入しうる。
はデオキシコール酸ナトリウムに対する特異的感受性を
コードするように修飾することができる。大腸菌はｔｏ
ｌｃ２１０： ：ＴｎｌＯ挿入変異を含むように修飾さ
れる。この変異は形質導入を用いて挿入しうる。
例えば、もう１つのＥＸ２８０と呼ばれる供与菌株が開
示される。それはＥＸ１７０から誘導され、ｔｏｌｃ２
１０： ：ＴｎｌＯ挿入変異をもつという点でＥＸ１７
０と異なっている。この追加の変異は、選択培地中０．
０２％（Ｗ／Ｖ）のデオキシコール酸ナトリウムを使用
することにより、供与菌の反選択を可能にする。クロラ
ムフェニコールとデオキシコール酸塩はともにサルモネ
ラ菌−大腸菌ハイブリッドの選択に必要とされるすべて
であるので、これは栄養培地上での（ｒｆａ）”２の転
移についての選択を可能にするであろう。
示される。それはＥＸ１７０から誘導され、ｔｏｌｃ２
１０： ：ＴｎｌＯ挿入変異をもつという点でＥＸ１７
０と異なっている。この追加の変異は、選択培地中０．
０２％（Ｗ／Ｖ）のデオキシコール酸ナトリウムを使用
することにより、供与菌の反選択を可能にする。クロラ
ムフェニコールとデオキシコール酸塩はともにサルモネ
ラ菌−大腸菌ハイブリッドの選択に必要とされるすべて
であるので、これは栄養培地上での（ｒｆａ）”２の転
移についての選択を可能にするであろう。
他のＨｆｒ供与菌株も類似の技法を用いて構築すること
ができる。ＥＸ１７０の構築方法と類似の方法を用いて
、ｒｆａ領域を時計の針と同じ方向で（約８４分の起点
から）初期に転移する大腸菌株Ｋ Ｌ ２２８は形質導
入によりａｉｌ：：Ｔｎ９とされた。得られたこの菌株
はＥＸ１７３と呼ばれた。
ができる。ＥＸ１７０の構築方法と類似の方法を用いて
、ｒｆａ領域を時計の針と同じ方向で（約８４分の起点
から）初期に転移する大腸菌株Ｋ Ｌ ２２８は形質導
入によりａｉｌ：：Ｔｎ９とされた。得られたこの菌株
はＥＸ１７３と呼ばれた。
−１９＝
このようにして形成された供与菌株は、上記のサルモネ
ラ菌−大腸菌ハイブリッドの構築において利用される。
ラ菌−大腸菌ハイブリッドの構築において利用される。
こうして、本発明のさらに別の面では大腸菌のコア領域
の少なくとも一部の合成をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａフラグメントを保有する無毒性サルモネラ菌株をつ（
る方法が提供され、その方法は （ｉ） 無毒性サルモネラ菌株、および（１１）特定
の抗生物質耐性をコードするように修飾された大腸菌株 を用意し； これらの菌株を染色体遺伝子転移に付し；そして 大腸菌株においてコードされる特定の抗生物質耐性を利
用して、斯く形成されたハイブリッド菌株を選択する； ことを含んでいる。
の少なくとも一部の合成をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａフラグメントを保有する無毒性サルモネラ菌株をつ（
る方法が提供され、その方法は （ｉ） 無毒性サルモネラ菌株、および（１１）特定
の抗生物質耐性をコードするように修飾された大腸菌株 を用意し； これらの菌株を染色体遺伝子転移に付し；そして 大腸菌株においてコードされる特定の抗生物質耐性を利
用して、斯く形成されたハイブリッド菌株を選択する； ことを含んでいる。
染色体遺伝子転移はＨｆｒにより媒介される染色体遺伝
子転移であり得る。
子転移であり得る。
その大腸菌株は上記の供与菌株から選択可能である。
好適な形態において、無毒性サルモネラ菌株は明確に定
められた非復帰性のｇａｌＥ遺伝子変異を含みうる。こ
うしてｇａｔ Ｅ変異は形成されたサルモネラ菌−大腸
菌ハイブリッドのための試験を提供する。
められた非復帰性のｇａｌＥ遺伝子変異を含みうる。こ
うしてｇａｔ Ｅ変異は形成されたサルモネラ菌−大腸
菌ハイブリッドのための試験を提供する。
無毒性サルモネラ菌はチフス菌株またはネズミチフス菌
株であり得る。サルモネラ菌株はネズミチフス菌Ｌ Ｂ
５０１０株、ネズミチフス菌ＬＴ２ｒｆａＧ、ネズミ
チフス菌Ｇ３Ｇ、その変異体およびその突然変異体から
選ばれる。
株であり得る。サルモネラ菌株はネズミチフス菌Ｌ Ｂ
５０１０株、ネズミチフス菌ＬＴ２ｒｆａＧ、ネズミ
チフス菌Ｇ３Ｇ、その変異体およびその突然変異体から
選ばれる。
好適な形態において、無毒性サルモネラ菌株はさらに、
〇−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグ
メントを保有する。
〇−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグ
メントを保有する。
その〇−抗原はコレラ菌の〇−抗原（Ｖｃ ＯＡｇ）で
あり得る。
あり得る。
無毒性サルモネラ菌株は、適当なプラスミドを用いて形
質転換することにより〇−抗原を発現する遺伝子を含む
ように修飾することができる。
質転換することにより〇−抗原を発現する遺伝子を含む
ように修飾することができる。
従って、好適な面において、無毒性サルモネラ菌株をつ
くる上記方法はさらに 〇−抗原を発現する遺伝子およびｔｈｙＡ＋郭抗生物質
マーカーを含むプラスミド、および上記の無毒性サルモ
ネラ菌株のｔｈｙＡ誘′導体を準備し；そして その無゛毒性ｔｈｙＡサルモネラ菌株の染色体にプラス
ミド上のクローン化遺伝子を挿入する；ことを包含する
。
くる上記方法はさらに 〇−抗原を発現する遺伝子およびｔｈｙＡ＋郭抗生物質
マーカーを含むプラスミド、および上記の無毒性サルモ
ネラ菌株のｔｈｙＡ誘′導体を準備し；そして その無゛毒性ｔｈｙＡサルモネラ菌株の染色体にプラス
ミド上のクローン化遺伝子を挿入する；ことを包含する
。
ｔｈｙＡ＋郭抗生物質マーカーを保有するプラスミドの
作製技術は本発萌者らの係属中のオーストラリア特許出
願第７４２０２７８７号に開示されており、その記載内
容はすべて参照によりここに引用される。〇−抗原を発
現し且つ陽性選択マーカーとしてのｔｈｙＡ＋を含むと
してそこに開示されたプラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥ
ＶＸ９が使用される。
作製技術は本発萌者らの係属中のオーストラリア特許出
願第７４２０２７８７号に開示されており、その記載内
容はすべて参照によりここに引用される。〇−抗原を発
現し且つ陽性選択マーカーとしてのｔｈｙＡ＋を含むと
してそこに開示されたプラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥ
ＶＸ９が使用される。
上記の型の無毒性サルモネラ菌−大腸菌ハイブリッド菌
株の例は、下記のＥＸ２００ 、 ＥＸ２２５ 。
株の例は、下記のＥＸ２００ 、 ＥＸ２２５ 。
ＥＸ２６２ 、 ＥＸ２０Ｂ 、ＥＸ２１０およびＥＸ
３６３と称されるものである。これらの菌株の試料はオ
ーストラリア、アゾレード大学のカルチャーコレクジョ
ンに維持されている。
３６３と称されるものである。これらの菌株の試料はオ
ーストラリア、アゾレード大学のカルチャーコレクジョ
ンに維持されている。
従って、本発明の好適な面では無毒性サルモネラ菌−大
腸菌ハイブリッド菌株が提供される：ＥＸ２００
ＬＢ５０１０（ａ＋ｅｔ 、ｉｌｖ 、ｒｆａ、ｍ
ｔｌ−１６：：に−１２ Ｔｎｐ） 大腸菌Ｋ−１２山来 ＥＸ２２５ ５ＧＳＣ２６２（ｆｌｙ ｘｙｌ
ｒｆａ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎｐ）Ｋ（２ ＥＸ２Ｂ２ Ｇ３０（ｒｆａ ｍｔｌ−１６：：Ｔ
ａ２）Ｋ−１２ＥＸ２０６ Ｖ４９０（ｒｆａＫ−
１２゜大腸菌Ｋ−１２山来のｃ＋ｎ１Ｒ） ＥＸ２１０ Ｖ４８７（ｒｆａ ｍｔｌ−１８：：
Ｔｎｐ） Ｋ−１２ＥＸ２３３ １ＥＸ２Ｌｏ（ｐＰ
Ｍｌｏ０４欠除）÷ ＥＸ２５６ ＥＸ２３３ ｍｔｌＥＸ２５９
ＥＸ２５６ ｔｈｙＡＥＸ３６３ ＥＸ２
５９（１）ＥＶＸ１４）本発明のさらに別の面によれば
、大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成をコード
する遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、および〇−抗原
の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
保有する無毒性サルモネラ菌株を含有する、腸疾患に対
して免疫を生じさせるのに有用なワクチン組成物が提供
される。
腸菌ハイブリッド菌株が提供される：ＥＸ２００
ＬＢ５０１０（ａ＋ｅｔ 、ｉｌｖ 、ｒｆａ、ｍ
ｔｌ−１６：：に−１２ Ｔｎｐ） 大腸菌Ｋ−１２山来 ＥＸ２２５ ５ＧＳＣ２６２（ｆｌｙ ｘｙｌ
ｒｆａ ｍｔｌ−１６：：Ｔｎｐ）Ｋ（２ ＥＸ２Ｂ２ Ｇ３０（ｒｆａ ｍｔｌ−１６：：Ｔ
ａ２）Ｋ−１２ＥＸ２０６ Ｖ４９０（ｒｆａＫ−
１２゜大腸菌Ｋ−１２山来のｃ＋ｎ１Ｒ） ＥＸ２１０ Ｖ４８７（ｒｆａ ｍｔｌ−１８：：
Ｔｎｐ） Ｋ−１２ＥＸ２３３ １ＥＸ２Ｌｏ（ｐＰ
Ｍｌｏ０４欠除）÷ ＥＸ２５６ ＥＸ２３３ ｍｔｌＥＸ２５９
ＥＸ２５６ ｔｈｙＡＥＸ３６３ ＥＸ２
５９（１）ＥＶＸ１４）本発明のさらに別の面によれば
、大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成をコード
する遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、および〇−抗原
の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
保有する無毒性サルモネラ菌株を含有する、腸疾患に対
して免疫を生じさせるのに有用なワクチン組成物が提供
される。
腸疾患はコレラであり得る。〇−抗原はコレラ菌のＯ−
体細胞抗原（Ｖｃ ＯＡｇ）であり得る。
体細胞抗原（Ｖｃ ＯＡｇ）であり得る。
その無毒性菌株はＥＸ２１０およびＥＸ３Ｂ３から選択
可能である。
可能である。
本発明の別の面では、哺乳動物に予防上有効な量の上記
ワクチンを投与することを含む、哺乳動物における腸疾
患の予防処置法が提供される。
ワクチンを投与することを含む、哺乳動物における腸疾
患の予防処置法が提供される。
本発明は今や添付の実施例に関してさらに詳しく説明さ
れるであろう。しかしながら、以下の記載は例示のため
のものであって、上記の本発明の一般原理を何ら制限す
るものでないことを理解すべきである。
れるであろう。しかしながら、以下の記載は例示のため
のものであって、上記の本発明の一般原理を何ら制限す
るものでないことを理解すべきである。
［実 施 例］
菌株ＥＸ２００の構築
菌株ＥＸ１７０はネズミチフス菌株Ｌ ８５０１０と接
合させた。５ｔｒＲ（ストレプトマイシン耐性）、１１
ｖ ｍｅｔ （イソロイシンおよびバリン、ならび
にメチオニンなしで生育）、およびクロラムフェニコー
ル耐性（ｍｔｌ：：Ｔａ２）である接合完了体が選択さ
れた。
合させた。５ｔｒＲ（ストレプトマイシン耐性）、１１
ｖ ｍｅｔ （イソロイシンおよびバリン、ならび
にメチオニンなしで生育）、およびクロラムフェニコー
ル耐性（ｍｔｌ：：Ｔａ２）である接合完了体が選択さ
れた。
このようなサルモネラ菌−大腸菌ハイブリッドは、８０
分と８８分の間の大腸菌Ｋ−１２染色体を、サルモネラ
菌染色体の同等領域の代わりにもつことが期待された。
分と８８分の間の大腸菌Ｋ−１２染色体を、サルモネラ
菌染色体の同等領域の代わりにもつことが期待された。
この種の接合完了体は（ｒｆａ） Ｋ−１２遺伝子座を
もたねばならない。菌株Ｌ Ｂ ５０１０はｇａｌＥ変
異体でもあるので、ネズミチフス菌のＬＰＳに対する作
用はＬＰＳ依存性バクテリオファージで試験することに
より測定できるだろう。
もたねばならない。菌株Ｌ Ｂ ５０１０はｇａｌＥ変
異体でもあるので、ネズミチフス菌のＬＰＳに対する作
用はＬＰＳ依存性バクテリオファージで試験することに
より測定できるだろう。
ファージＰ２２はそのレセプターとして〇−抗原を必要
とし、ファージフエリックス０ （ＦＯ）は完全なコア
を必要とし、そしてファージＰ１およびＣ２１は末端グ
ルコースをもつコアを必要とする。
とし、ファージフエリックス０ （ＦＯ）は完全なコア
を必要とし、そしてファージＰ１およびＣ２１は末端グ
ルコースをもつコアを必要とする。
所望の表現型を示すサルモネラ菌−大腸菌ハイブリッド
は接合完了体の中から見出された。ＥＸ２００と呼ばれ
る１つのこのようなハイブリッドは、ガラクトース含有
培地上で試験したとき、ファージＦＯに耐性であること
が判明した。ＦＯは付着するためにサルモネラ菌の完全
なＬＰＳコア領域を使用するが、大腸菌に−１２には感
染しないファージである。それ故、サルモネラ菌のｒｆ
ａ遺伝子座は大腸菌に−１２のｒｆａ遺伝子座によって
置き換えられたと思われる。Ｅ Ｘ ２００は、増殖培
地がガラクトースを含む場合、ファージＰ２２に感受性
であるので、このことはネズミチフス菌の０−抗原が大
腸菌に−１２のＬＰＳコア糖に結合されたことを立証す
るものである。これらの観察はチフス菌の場合に得られ
たデータにより支持される（下記参照）。
は接合完了体の中から見出された。ＥＸ２００と呼ばれ
る１つのこのようなハイブリッドは、ガラクトース含有
培地上で試験したとき、ファージＦＯに耐性であること
が判明した。ＦＯは付着するためにサルモネラ菌の完全
なＬＰＳコア領域を使用するが、大腸菌に−１２には感
染しないファージである。それ故、サルモネラ菌のｒｆ
ａ遺伝子座は大腸菌に−１２のｒｆａ遺伝子座によって
置き換えられたと思われる。Ｅ Ｘ ２００は、増殖培
地がガラクトースを含む場合、ファージＰ２２に感受性
であるので、このことはネズミチフス菌の０−抗原が大
腸菌に−１２のＬＰＳコア糖に結合されたことを立証す
るものである。これらの観察はチフス菌の場合に得られ
たデータにより支持される（下記参照）。
（ｒｆａ） を含むサルモネラ菌株がＶｃ ＯＡｇ
を発現するかどうか調べるために、プラスミドｐＥＶＸ
８およびｐＥＶＸ９ （これらのプラスミドはオースト
ラリア国特許出願番号に開示されている）はＥＸ３６１
と呼ばれるＥＸ２００のｔｈｙＡ誘導体に形質転換され
た。この種の形質転換体は、抗コレラ菌血清を用いるス
ライド凝集により判定したとき、Ｖｃ ＯＡｇを発現し
た。
を発現するかどうか調べるために、プラスミドｐＥＶＸ
８およびｐＥＶＸ９ （これらのプラスミドはオースト
ラリア国特許出願番号に開示されている）はＥＸ３６１
と呼ばれるＥＸ２００のｔｈｙＡ誘導体に形質転換され
た。この種の形質転換体は、抗コレラ菌血清を用いるス
ライド凝集により判定したとき、Ｖｃ ＯＡｇを発現し
た。
他の実験では、プラスミドｐ Ｐ Ｍ１００４がＥＸ−
つρ − １７８と接合させることによりＥＸ２００中に導入され
た。１つの接合完了菌株ＥＸ２１Ｂは、ＳＤＳ −ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた細胞外被の銀
染色により判定したとき、ｐＰＭ１００４をもつ大腸菌
Ｋ−１２株に匹敵するＶｃ ＯＡｇを産生じた。
つρ − １７８と接合させることによりＥＸ２００中に導入され
た。１つの接合完了菌株ＥＸ２１Ｂは、ＳＤＳ −ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた細胞外被の銀
染色により判定したとき、ｐＰＭ１００４をもつ大腸菌
Ｋ−１２株に匹敵するＶｃ ＯＡｇを産生じた。
菌株ＥＸ２２５の構築
菌株ＥＸ１７０はネズミチフス菌ＬＴ２ｒｆａＧ突然変
異株５ＧＳＣ２８２と接合させ、そしてｃＩＩｌＩＲ（
クロラムフェニコール耐性）、５ｔｒＲ接合完了体を選
択した。試験したすべての接合完了体はｒｆａＧ に
なり、すなわちそれらは〇−抗原特異的ファージＰ２２
に感受性となり、そしてコア特異的ファージＰ１および
Ｃ２１に耐性となった。それ故、大腸菌に−１２のｒｆ
ａ領域は効率よくサルモネラ菌に転移されることが、上
記の結果より確認された。このような接合完了体の１つ
の例はＥＸ２２５である。この菌株および得られた他の
すべての接合完了体はｉｌｖ” （８４分に位置する
）であり、このマーカーがｍｔｌおよびｒｆａに接近し
て連結さＱ’７ − れていることを示している。他の接合完了体もまたｘｙ
ｌ” （７９分に位置する）になったが、ｍｅｔ”（
８９分に位置する）になったものは皆無だった。
異株５ＧＳＣ２８２と接合させ、そしてｃＩＩｌＩＲ（
クロラムフェニコール耐性）、５ｔｒＲ接合完了体を選
択した。試験したすべての接合完了体はｒｆａＧ に
なり、すなわちそれらは〇−抗原特異的ファージＰ２２
に感受性となり、そしてコア特異的ファージＰ１および
Ｃ２１に耐性となった。それ故、大腸菌に−１２のｒｆ
ａ領域は効率よくサルモネラ菌に転移されることが、上
記の結果より確認された。このような接合完了体の１つ
の例はＥＸ２２５である。この菌株および得られた他の
すべての接合完了体はｉｌｖ” （８４分に位置する
）であり、このマーカーがｍｔｌおよびｒｆａに接近し
て連結さＱ’７ − れていることを示している。他の接合完了体もまたｘｙ
ｌ” （７９分に位置する）になったが、ｍｅｔ”（
８９分に位置する）になったものは皆無だった。
それ故、供与菌から受は取った大腸菌染色体の量は、ｍ
ｔｌマーカーの両側の数分に最大限度制限される。
ｔｌマーカーの両側の数分に最大限度制限される。
菌株ＥＸ２６２の構築
（ｒｆａ） ”２領域・をもつネズミチフス菌Ｇ３０の
誘導体は次のようにしてつくられた。
誘導体は次のようにしてつくられた。
普遍形質導入を行うファージＰｌｖｉｒは菌株ＥＸ２０
０１で増殖させた。このファージ溶菌液を使用してＧ３
０に感染させ、そしてクロラムフェニコール耐性形質導
入体コロニーを選択した。ＥＸ２６２と呼ばれる１つの
形質導入体が回収され、それはｍｔｌ−（すなわちｍｔ
ｌ ： ：Ｔｎ９）であり、またガラクトースを含む栄
養培地上て゛ファージＦＯに耐性であった。大部分の形
質導入体はｌｌ１ｔｌ であり、このことはトランス
ポゾンＴｎ ９が形質導入現象の間中に他の位置に移動
したことを示唆している。
０１で増殖させた。このファージ溶菌液を使用してＧ３
０に感染させ、そしてクロラムフェニコール耐性形質導
入体コロニーを選択した。ＥＸ２６２と呼ばれる１つの
形質導入体が回収され、それはｍｔｌ−（すなわちｍｔ
ｌ ： ：Ｔｎ９）であり、またガラクトースを含む栄
養培地上て゛ファージＦＯに耐性であった。大部分の形
質導入体はｌｌ１ｔｌ であり、このことはトランス
ポゾンＴｎ ９が形質導入現象の間中に他の位置に移動
したことを示唆している。
菌株ＥＸ２６２はマウスのバイエル板（Ｐｅｙｅｒ’５
ｐａｔｃｈ）を集落化するその能力の点でＧ３０と全く
同に−１２ 様にふるまう。これは（ｒｆａ） がネズミチフス
菌のこの特性に影響を及ぼさなかったことを示している
。この交雑（ｃｒｏｓｓ ；雑種形成）においては形質
導入体が少数しか得られなかったことに注意すべきであ
る。これは恐らく菌株ＥＸ２００中のに−１２ （＋ｎｔｌ ： ：Ｔｎ９） の両側にある大腸菌
Ｋ−１２染色体ＤＮＡによってもたらされる非常に減少
した組換え頻度によるものと思われる。
ｐａｔｃｈ）を集落化するその能力の点でＧ３０と全く
同に−１２ 様にふるまう。これは（ｒｆａ） がネズミチフス
菌のこの特性に影響を及ぼさなかったことを示している
。この交雑（ｃｒｏｓｓ ；雑種形成）においては形質
導入体が少数しか得られなかったことに注意すべきであ
る。これは恐らく菌株ＥＸ２００中のに−１２ （＋ｎｔｌ ： ：Ｔｎ９） の両側にある大腸菌
Ｋ−１２染色体ＤＮＡによってもたらされる非常に減少
した組換え頻度によるものと思われる。
菌株ＥＸ２０Ｂの構築
菌株ｖ４０９はネズミチフス菌Ｇ３０であるが、５ｔｒ
Ｒであってｐ Ｐ Ｍ１００４（ｔｅｔＲ、テトラサイ
クリン耐性、Ｖｃ ＯＡｇクローン）を保有する。この
菌株はＶｃ ＯＡｇを豊富に発現しない。このＶ４９０
を菌株ＥＸ１７３と接合させ、そしてｃＩＲ。
Ｒであってｐ Ｐ Ｍ１００４（ｔｅｔＲ、テトラサイ
クリン耐性、Ｖｃ ＯＡｇクローン）を保有する。この
菌株はＶｃ ＯＡｇを豊富に発現しない。このＶ４９０
を菌株ＥＸ１７３と接合させ、そしてｃＩＲ。
５ｔｒＲ，ｔｅｔＲ（ｐ Ｐ Ｍ１００４保有）接合完
了体を選択した。
了体を選択した。
５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により
Ｖｃ ＯＡｇ生産についてスクリーニングした接合完了
体のうち、１つはＶｃ ＯＡｇを高レベルで発−２８＝ 現することがわかった。この菌株はＥＸ２０６と呼ばれ
た。
体のうち、１つはＶｃ ＯＡｇを高レベルで発−２８＝ 現することがわかった。この菌株はＥＸ２０６と呼ばれ
た。
菌株ＥＸ２０Ｂはｍｔｌ” （すなわちマンニトール
醗酵陽性）であることが見出され、さらにｃｍｌＲであ
った。この菌株は染色体の別の位置に再配置されたＴｎ
９を含み得る（上記参照）。もう１つの可能性はＦ’
ｍｔｌ：：Ｔｎ９が接合中に転移されたということで
ある。しかしながら、ＥＸ２０６のプラスミド内容物の
試験はＦ′の存在を明らかにしなかったが、それはｐ、
ＰＭ１００４およびネズミチフス菌の未解明プラスミド
を含む。
醗酵陽性）であることが見出され、さらにｃｍｌＲであ
った。この菌株は染色体の別の位置に再配置されたＴｎ
９を含み得る（上記参照）。もう１つの可能性はＦ’
ｍｔｌ：：Ｔｎ９が接合中に転移されたということで
ある。しかしながら、ＥＸ２０６のプラスミド内容物の
試験はＦ′の存在を明らかにしなかったが、それはｐ、
ＰＭ１００４およびネズミチフス菌の未解明プラスミド
を含む。
菌株ＥＸ２１０の構築
Ｔｙ２１ａであり、しかもｒｉｆＲ（リファンピシン耐
性）であり、かツｐ Ｐ Ｍ１００４ （ｔｅｔ Ｒ。
性）であり、かツｐ Ｐ Ｍ１００４ （ｔｅｔ Ｒ。
Ｖｃ ＯＡｇコーン（ｃｏｎｅ） ）を保有する菌株Ｖ
４８７は菌株ＥＸ１７０と接合させ、そしてｃｍｌＲ。
４８７は菌株ＥＸ１７０と接合させ、そしてｃｍｌＲ。
ｒｉｆＲ，ｔｅｔＲ接合完了体を適当に補給した栄養培
地上で選択した。得られたコロニーはＳＤＳ −ポリア
クリルアミドゲルで分離した細胞外被物質の銀染色によ
りＶｅ ＯＡｇ発現について調べた。
地上で選択した。得られたコロニーはＳＤＳ −ポリア
クリルアミドゲルで分離した細胞外被物質の銀染色によ
りＶｅ ＯＡｇ発現について調べた。
サルモネラ菌のコアの代わりに大腸菌に−１２のコアを
もつＬＰＳ分子のハイブリッド菌株中での存在は、ＳＤ
Ｓ −ＰＡＧＥで分離した全細胞溶菌液または細胞外被
の銀染色により容易に検出することができるだろう。大
腸菌コアをもつＬＰＳはサルモネラ菌コアをもつＬＰＳ
よりも比較的遅く泳動する。さらに、ハイブリッドのＬ
ＰＳの移動度は大腸菌に−１２のそれとよく似ている。
もつＬＰＳ分子のハイブリッド菌株中での存在は、ＳＤ
Ｓ −ＰＡＧＥで分離した全細胞溶菌液または細胞外被
の銀染色により容易に検出することができるだろう。大
腸菌コアをもつＬＰＳはサルモネラ菌コアをもつＬＰＳ
よりも比較的遅く泳動する。さらに、ハイブリッドのＬ
ＰＳの移動度は大腸菌に−１２のそれとよく似ている。
Ｖｃ ＯＡｇを発現しかつｍｔｌ−である１つの接合完
了体はＥＸ２１０と呼ばれた。
了体はＥＸ２１０と呼ばれた。
菌株ＥＸ２１０は培地にガラクトースを添加したときで
さえファージＦＯに耐性であるが、ファージＰ２２に感
受性であり、このことはサルモネラ〇−抗原がこの菌株
により発現されたことを示している。この菌株はＬＰＳ
としてのＶｅ ＯＡｇを産生じ、それ故にそれは熱フェ
ノール／Ｈ２０法で抽出可能である。Ｖｃ ＯＡｇは細
胞外被、または５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離された全細胞溶
菌液の銀染色により検出可能である。ガラクトースを培
地に添加するとき、サルモネラ〇−抗原およびＶｃ Ｏ
Ａｇの両方が銀染色により検出される。
さえファージＦＯに耐性であるが、ファージＰ２２に感
受性であり、このことはサルモネラ〇−抗原がこの菌株
により発現されたことを示している。この菌株はＬＰＳ
としてのＶｅ ＯＡｇを産生じ、それ故にそれは熱フェ
ノール／Ｈ２０法で抽出可能である。Ｖｃ ＯＡｇは細
胞外被、または５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離された全細胞溶
菌液の銀染色により検出可能である。ガラクトースを培
地に添加するとき、サルモネラ〇−抗原およびＶｃ Ｏ
Ａｇの両方が銀染色により検出される。
ＥＸ２ＬＱ細胞はコレラ菌に対する抗血清により凝集さ
れ、このことはＯＡｇが細胞表面に存在することを示し
ている。ＥＸ２ＬＯからの単離ＬＰＳは、コレラ菌５８
９Ｂ Ｌ Ｐ Ｓで被覆した５ＲＢＣを用いる赤血球
凝集阻害検定において特異的に阻害する。ホルマリンで
固定したＥＸ２１０細胞もまたこの種の検定で阻害する
。これらの検定は、ＥＸ２１０が重量基準でコレラ菌そ
れ自体により産生されるＶｃ ＯＡｇの１０％〜５０％
を生産することを示唆している。
れ、このことはＯＡｇが細胞表面に存在することを示し
ている。ＥＸ２ＬＯからの単離ＬＰＳは、コレラ菌５８
９Ｂ Ｌ Ｐ Ｓで被覆した５ＲＢＣを用いる赤血球
凝集阻害検定において特異的に阻害する。ホルマリンで
固定したＥＸ２１０細胞もまたこの種の検定で阻害する
。これらの検定は、ＥＸ２１０が重量基準でコレラ菌そ
れ自体により産生されるＶｃ ＯＡｇの１０％〜５０％
を生産することを示唆している。
ＥＸ２１０から単離されたＬＰＳ、ホルマリンで固定し
たＥＸ２ＬＯおよび生存ＥＸ２１０それ自体はウサギに
おいて５８９Ｂ Ｌ Ｐ Ｓに対して免疫応答を誘起
することができる。
たＥＸ２ＬＯおよび生存ＥＸ２１０それ自体はウサギに
おいて５８９Ｂ Ｌ Ｐ Ｓに対して免疫応答を誘起
することができる。
菌株ＥＸ２１０はコレラの経口生ワクチンとしての使用
可能性をもつ。
可能性をもつ。
菌株ＥＸ３６３の構築
菌株ＥＸ２１０は自然消失によってｐ Ｐ Ｍ１００４
を除いてＥ Ｘ ２３３とした。ＥＸ２３８の自然ｍｔ
ｌ＋復帰変異体は最少培地で選択し、菌株ＥＸ２５Ｂと
命名した。ＥＸ２５１３のｔｈｙＡ変異株はチミンおよ
びトリメトプリムを含む最少培地上で培養することによ
り選択した。この菌株はＥＸ２５９と呼ばれ、非復帰性
（１０−８）であることが見出された。それ故、ＥＸ２
５９はＴｙ ２１ａ ｒｌｆＲ（ｒｆａ） ”２ｔｈｙ
Ａである。菌株ＥＸ２５９と菌株ＥＸ３２０とを接合す
ることにより、ｔｈｙＡ” Ｖｃ ＯＡｇ （オガワ
型）プラスミドｐＥＶＸ１４を菌株ＥＸ２５９へ移入し
た。
を除いてＥ Ｘ ２３３とした。ＥＸ２３８の自然ｍｔ
ｌ＋復帰変異体は最少培地で選択し、菌株ＥＸ２５Ｂと
命名した。ＥＸ２５１３のｔｈｙＡ変異株はチミンおよ
びトリメトプリムを含む最少培地上で培養することによ
り選択した。この菌株はＥＸ２５９と呼ばれ、非復帰性
（１０−８）であることが見出された。それ故、ＥＸ２
５９はＴｙ ２１ａ ｒｌｆＲ（ｒｆａ） ”２ｔｈｙ
Ａである。菌株ＥＸ２５９と菌株ＥＸ３２０とを接合す
ることにより、ｔｈｙＡ” Ｖｃ ＯＡｇ （オガワ
型）プラスミドｐＥＶＸ１４を菌株ＥＸ２５９へ移入し
た。
ｔｈｙ” ＤＯＣＲ（デオキシコール酸耐性）接合完了
体について選択した。得られたコロニーはプラスミド内
容物についてスクリーニングされた。１つの接合完了体
がｐＥＶＸ１４をもつことがわかり、これは菌株ＥＸ３
６３と呼ばれた。この菌株はプロティナーゼにで処理し
たのち５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した
全細胞溶菌液の銀染色により判定したとき、Ｖｅ ＯＡ
ｇを発現した。
体について選択した。得られたコロニーはプラスミド内
容物についてスクリーニングされた。１つの接合完了体
がｐＥＶＸ１４をもつことがわかり、これは菌株ＥＸ３
６３と呼ばれた。この菌株はプロティナーゼにで処理し
たのち５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した
全細胞溶菌液の銀染色により判定したとき、Ｖｅ ＯＡ
ｇを発現した。
ＥＸ３６３はコレラの経口生ワクチンとしての使用可能
性をもち、ただ１つの抗生物質耐性マーカーｒ１ｆＲを
有している。
性をもち、ただ１つの抗生物質耐性マーカーｒ１ｆＲを
有している。
一 ３２ −
サルモネラ（ｒｆａ）Ｋ−１２ハイブリッド菌株は、〇
−抗原が防御抗原である場合（その例は赤痢菌種の〇−
抗原であり得る）、他のダラム陰性病原菌からの〇−抗
原の発現にとって有用でありうる。
−抗原が防御抗原である場合（その例は赤痢菌種の〇−
抗原であり得る）、他のダラム陰性病原菌からの〇−抗
原の発現にとって有用でありうる。
発現が達成されない場合は、サルモネラ菌株の別の修飾
が必要であるかもしれない。例えば、発現は（ｒｆａ）
”２および大腸菌に−１２の他の染色体領域を必要とす
るかもしれない。
が必要であるかもしれない。例えば、発現は（ｒｆａ）
”２および大腸菌に−１２の他の染色体領域を必要とす
るかもしれない。
大腸菌Ｋ−１２ＬＰｓコア糖構造（第１図参照）のほか
に、少なくとも４種の他の型が知られている。このよう
なコア型はいろいろな型の〇−抗原の発現にとって必要
でありうる。それ故、それぞれのＬＰＳコア型をもつ一
連のサルモネラ菌株が構築されるだろう。これらは異な
るダラム陰性病原菌からの〇−抗原の発現のために有用
であるだろう。
に、少なくとも４種の他の型が知られている。このよう
なコア型はいろいろな型の〇−抗原の発現にとって必要
でありうる。それ故、それぞれのＬＰＳコア型をもつ一
連のサルモネラ菌株が構築されるだろう。これらは異な
るダラム陰性病原菌からの〇−抗原の発現のために有用
であるだろう。
方 法
細菌株および増殖培地
使用される細菌株、およびそれらの関連特徴は表１に示
される。
される。
細菌株は次の培地の１つで増殖させた＝（１） Ｌ
Ｂ ： ｌｏｇ／ｌバクトートリプトン５ｇ／ρバクト
ー酵母エキス ５ｇ／ρＮａＣ］ （１１）ジフコ（Ｄｌｆｃｏ）ＮＢ ：ｌｅｇ／ρジフ
コ栄養ブロス ５ｇ／ρＮａＣＩ （ｉｎ ）オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）Ｎ Ｂ ：１０ｇ
／Ωオキソイド・ラブ・レムコ １０ｇ／＃オキソイド細菌ペプトン ５ｇ／、Ｑ Ｎａ Ｃ１ ｇａｌＥ変異株によるサルモネラ〇−抗原の発現がガラ
クトースを必要とする場合は、ｏ、ｏｏｔ％（ｖ／ｖ）
のガラクトースを培地に加えた。
Ｂ ： ｌｏｇ／ｌバクトートリプトン５ｇ／ρバクト
ー酵母エキス ５ｇ／ρＮａＣ］ （１１）ジフコ（Ｄｌｆｃｏ）ＮＢ ：ｌｅｇ／ρジフ
コ栄養ブロス ５ｇ／ρＮａＣＩ （ｉｎ ）オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）Ｎ Ｂ ：１０ｇ
／Ωオキソイド・ラブ・レムコ １０ｇ／＃オキソイド細菌ペプトン ５ｇ／、Ｑ Ｎａ Ｃ１ ｇａｌＥ変異株によるサルモネラ〇−抗原の発現がガラ
クトースを必要とする場合は、ｏ、ｏｏｔ％（ｖ／ｖ）
のガラクトースを培地に加えた。
オキソイド寒天は培地を固化するために１．５％（ｗ／
ｖ）加えた。
ｖ）加えた。
バクテリオファージ感受性試験
ガラクトース添加または無添加のジフコＮＢ中で増殖さ
せた細菌培養物は、同−培地上に綿棒でストリーク培養
した。試験すべきファージはその乾燥ストリーク上に置
いた（２．５μｇ）。３７℃で１６時間インキュベーシ
ョン後、ファージに対する感受性を記録した。
せた細菌培養物は、同−培地上に綿棒でストリーク培養
した。試験すべきファージはその乾燥ストリーク上に置
いた（２．５μｇ）。３７℃で１６時間インキュベーシ
ョン後、ファージに対する感受性を記録した。
Ｈｆｒ接合
細菌培養物はＬＢまたはジフコＮＢ中で１６時間増殖さ
せた。供与菌（０，５ｍ１）および受容菌（５ｍｌ）を
混合し、遠心により濃縮したのち栄養寒天平板（ＬＢ寒
天、またはジフコＮＢ寒天）の表面に置いたニトロセル
ロースフィルター上にまいた。接合体は３７℃で５〜６
時間インキュベーションした。
せた。供与菌（０，５ｍ１）および受容菌（５ｍｌ）を
混合し、遠心により濃縮したのち栄養寒天平板（ＬＢ寒
天、またはジフコＮＢ寒天）の表面に置いたニトロセル
ロースフィルター上にまいた。接合体は３７℃で５〜６
時間インキュベーションした。
細胞はブロス中に再懸濁して選択培地上で培養した。
Ｐ１形質導入
Ｐｌｖｉｒによる形質導入はミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（
１９７２）に記載の如〈実施した。サルモネラ菌中のＰ
ｌｖｉｒを使用するために、まず初めにＰ１ｖ１ｒ原液
は菌株Ｌ Ｂ ５０１０に対して調製された。
１９７２）に記載の如〈実施した。サルモネラ菌中のＰ
ｌｖｉｒを使用するために、まず初めにＰ１ｖ１ｒ原液
は菌株Ｌ Ｂ ５０１０に対して調製された。
ＬＰＳの分析
（ｉ） 細胞外被は細胞をリゾチーム、ＥＤＴＡで処
理したのち、超音波および高速遠心にかけて不溶性物質
をすべて回収することにより調製した。
理したのち、超音波および高速遠心にかけて不溶性物質
をすべて回収することにより調製した。
（１１）全細胞溶菌液のプロティナーゼに処理はヒツチ
コック（Ｈｌｔｃｈｃｏｅｋ）およびブラウン（Ｂｒｏ
ｗｎ） （１９８３）に記載の如く行った。試料はＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥで調べた。
コック（Ｈｌｔｃｈｃｏｅｋ）およびブラウン（Ｂｒｏ
ｗｎ） （１９８３）に記載の如く行った。試料はＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥで調べた。
（ｉｉｉ）ＬＰＳはウェストボール（Ｗｅｓｔｐｈａｌ
）およびジャン（Ｊａｎｎ） （１９６５）に記載の
熱フェノール／Ｈ２０法により１〜６力価の細菌培養物
から抽出した。
）およびジャン（Ｊａｎｎ） （１９６５）に記載の
熱フェノール／Ｈ２０法により１〜６力価の細菌培養物
から抽出した。
（１ｖ）単離ＬＰＳまたはホルマリン固定細胞はイナバ
ＬＰＳ、オガワＬＰＳまたはサルモネラＬＰＳを被覆し
た５ＲＢＣおよび適当な抗血清を使用するＨＩＡ赤血球
凝集阻害検定により試験した。
ＬＰＳ、オガワＬＰＳまたはサルモネラＬＰＳを被覆し
た５ＲＢＣおよび適当な抗血清を使用するＨＩＡ赤血球
凝集阻害検定により試験した。
ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀染色
ＳＤＳ／ＰＡＧＥはマニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）ら（１
９８６）に記載の如＜２０％ポリアクリルアミドゲル上
で行った。
９８６）に記載の如＜２０％ポリアクリルアミドゲル上
で行った。
ゲルはサイ（Ｔｓａｉ）およびフラッシュ（Ｐｒａｔｓ
ｃｈ）（１９８２）またはヒツチコックおよびブラウン
（１９８３）に記載の如＜ＬＰＳについて染色した。
ｃｈ）（１９８２）またはヒツチコックおよびブラウン
（１９８３）に記載の如＜ＬＰＳについて染色した。
最後に、ここで概説した本発明の精神から逸脱すること
なしに、いろいろな他の修飾および／または変更がなし
得ることを理解すべきである。
なしに、いろいろな他の修飾および／または変更がなし
得ることを理解すべきである。
第１図は大腸菌に−１２およびサルモネラ菌におけるＬ
ＰＳコア糖の配列ならびに組成を示す。 （外４名）
ＰＳコア糖の配列ならびに組成を示す。 （外４名）
Claims (25)
- （１）大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成をコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを保有する無
毒性サルモネラ菌株。 - （２）サルモネラ菌株はネズミチフス菌 （￥Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ￥）またはチフス菌（￥Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ￥ ￥
ｔｙｐｈｉ￥）の菌株である、特許請求の範囲第１項記
載の無毒性菌株。 - （３）ネズミチフス菌またはチフス菌の菌株はネズミチ
フス菌株ＬＢ５０１０、ネズミチフス菌ＬＴ２ｒｆａＧ
、ネズミチフス菌Ｇ３０、チフス菌Ｖ４８７、それらの
変異体およびそれらの突然変異体から選ばれる、特許請
求の範囲第２項記載の無毒性菌株。 - （４）大腸菌株は大腸菌Ｋ−１２株であり、ＤＮＡフラ
グメントは大腸菌Ｋ−１２遺伝子地図上の約８１分のと
ころに位置しかつリポ多糖のコア領域を形成するのに必
要な酵素を含む遺伝子座ｒｆａを保持する、特許請求の
範囲第１項記載の無毒性菌株。 - （５）大腸菌株は特定の抗生物質耐性をコードするよう
に修飾される、特許請求の範囲第２項記載の無毒性菌株
。 - （６）大腸菌株はクロラムフェニコールまたはデオキシ
コール酸塩に対する耐性をコードする、特許請求の範囲
第５項記載の無毒性菌株。 - （７）大腸菌Ｋ−１２株は大腸菌ＰＫ３、大腸菌ＫＬ２
２８、大腸菌ＮＫ６７０１、大腸菌ＥＸ１７８、大腸菌
ＥＸ１７０、大腸菌ＥＸ１７３、大腸菌Ｐ２４９５、大
腸菌ＥＸ２６０、大腸菌ＥＸ３２０；それらの変異体お
よびそれらの突然変異体から選ばれる、特許請求の範囲
第４項記載の無毒性菌株。 - （８）ＥＸ１７０、ＥＸ１７３、ＥＸ１７８、ＥＸ２６
０およびＥＸ３２０；それらの変異体およびそれらの突
然変異体から選ばれる大腸菌供与菌株。 - （９）ネズミチフス菌Ｖ４９０およびチフス菌Ｖ４８７
から選ばれるサルモネラ供与菌株。 - （１０）ＥＸ２００、ＥＸ２２５、ＥＸ２６２、ＥＸ２
０６、ＥＸ２１０、ＥＸ２３３、ＥＸ２５６、ＥＸ２５
９、ＥＸ３６３；それらの変異体およびそれらの突然変
異体から選ばれる無毒性サルモネラ菌−大腸菌ハイブリ
ッド菌株。 - （１１）大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成を
コードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを保有する
無毒性サルモネラ菌株を作る方法であって、 （ｉ）無毒性サルモネラ菌株、および （ｉｉ）特定の抗生物質耐性をコードするように修飾さ
れた大腸菌株 を用意し； これらの菌株を染色体遺伝子転移に付し；そして大腸菌
株においてコードされる特定の抗生物質耐性を利用して
、斯く形成されたハイブリッド産物を選択する； ことから成り、該大腸菌株は上記の供与菌株であり得る
上記方法。 - （１２）染色体遺伝子転移はＨｆｒにより媒介される染
色体遺伝子転移である、特許請求の範囲第１１項記載の
方法。 - （１３）大腸菌株はＥＸ１７８、ＥＸ１７０、ＥＸ１７
３、ＥＸ２６０およびＥＸ３２０から選ばれる、特許請
求の範囲第１２項記載の方法。 - （１４）無毒性サルモネラ菌株はｇａｌＥ遺伝子中に明
確に定められた非復帰性の突然変異を含む、特許請求の
範囲第１３項記載の方法。 - （１５）サルモネラ菌株はチフス菌またはネズミチフス
菌の菌株である、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１６）サルモネラ菌株はネズミチフス菌ＬＢ５０１０
株、ネズミチフス菌ＬＴ２ｒｆａＧ、ネズミチフス菌Ｇ
３０、それらの変異体およびそれらの突然変異体から選
ばれる、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 - （１７）無毒性サルモネラ菌株はさらにＯ−抗原の合成
をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを保有す
る、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 - （１８）Ｏ−抗原はコレラ菌（￥Ｖｉｂｒｉｏ￥ ￥ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ￥）のＯ−抗原（ＶｃＯＡｇ）である、
特許請求の範囲第１７項記載の方法。 - （１９）Ｏ−抗原を発現する遺伝子を含み且つｔｈｙＡ
＾＋郭抗生物質マーカーを保有するプラスミド、および
上記の無毒性サルモネラ菌株のｔｈｙＡ誘導体を用意し
；そして 該プラスミド上のクローン化遺伝子を無毒性ｔｈｙＡサ
ルモネラ菌株の染色体に挿入する；ことをさらに含む特
許請求の範囲第１７項記載の方法。 - （２０）プラスミドはプラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥ
ＶＸ９から選ばれる、特許請求の範囲第１９項記載の方
法。 - （２１）大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成を
コードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメント；およびＯ
−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメ
ント；を保有する無毒性サルモネラ菌株を含む腸疾患に
対して免疫を生じさせるのに有用なワクチン組成物。 - （２２）腸疾患はコレラである、特許請求の範囲第２１
項記載のワクチン組成物。 - （２３）Ｏ−抗原はコレラ菌のＯ−体細胞抗原（ＶｃＯ
Ａｇ）である、特許請求の範囲第２２項記載のワクチン
組成物。 - （２４）無毒性サルモネラ菌株はＥＸ２００、ＥＸ２２
５、ＥＸ２６２、ＥＸ２０６、ＥＸ２１０、ＥＸ２３３
、ＥＸ２５６、ＥＸ２５９、ＥＸ３６３；それらの変異
体およびそれらの突然変異体から選ばれる、特許請求の
範囲第２１項記載のワクチン組成物。 - （２５）大腸菌株のコア領域の少なくとも一部の合成を
コードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメント；およびＯ
−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメ
ント；を保有する無毒性サルモネラ菌株を含む腸疾患に
対して免疫を生じさせるのに有用なワクチン組成物の予
防上有効な量を哺乳動物に投与することから成る、哺乳
動物における腸疾患の予防処置法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU7545 | 1986-08-19 | ||
| AUPH754586 | 1986-08-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6368073A true JPS6368073A (ja) | 1988-03-26 |
Family
ID=3771771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62206189A Pending JPS6368073A (ja) | 1986-08-19 | 1987-08-19 | ハイブリッド細菌株 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0257837A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6368073A (ja) |
| AU (1) | AU615416B2 (ja) |
| DK (1) | DK429087A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU87207A1 (fr) * | 1988-04-29 | 1989-11-14 | Univ Louvain | Vaccin derive de bacteries du genre yersinia procede pour sa preparation et applications |
| JPH03501326A (ja) * | 1988-06-20 | 1991-03-28 | ルミニス・プロプライアタリー・リミテッド | 血清型分類用ｄｎａプローブ |
| DE4221840A1 (de) * | 1992-07-03 | 1994-01-05 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Bivalente Lebendvakazine gegen bakterielle Darmpathogene, Herstellungsverfahren sowie Plasmide und Stämme als Ausgangsmaterial |
| EP0692031B1 (en) * | 1993-02-22 | 2007-04-11 | The General Hospital Corporation | Heterologous antigens in live cell vaccine strains |
| US6036953A (en) * | 1996-11-29 | 2000-03-14 | The General Hospital Corporation | Heterologous antigens in live cell V. cholerae strains |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3856935A (en) * | 1971-04-29 | 1974-12-24 | Schweiz Serum & Impfinst | Oral typhoid vaccine and method of preparing the same |
| IT1217303B (it) * | 1984-02-01 | 1990-03-22 | Enterovax Res Pty Ltd | Ceppi batterici particolarmente utili per la produzione di vaccini per il trattamenmto di malattie intestinali e simili e metodo di ingegneria gentica per la produzione dei detti vaccini |
-
1987
- 1987-07-31 EP EP87306833A patent/EP0257837A1/en not_active Withdrawn
- 1987-08-18 DK DK429087A patent/DK429087A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-08-19 JP JP62206189A patent/JPS6368073A/ja active Pending
- 1987-08-28 AU AU76269/87A patent/AU615416B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK429087A (da) | 1988-02-20 |
| DK429087D0 (da) | 1987-08-18 |
| EP0257837A1 (en) | 1988-03-02 |
| AU7626987A (en) | 1988-02-25 |
| AU615416B2 (en) | 1991-10-03 |
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