JPS6361320B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
この発明は卵透明帯への精子の種特異的結合を
促進する能力を有する糖蛋白質及びその製造方法
に関する。 〔従来の技術〕 哺乳類動物において受精が成立する過程におい
ては、精子が卵の外表を構成する透明帯に到達し
これを通過しなければならず、この透明帯におい
て種間認識、単精をまもるための多精拒否等の過
程が行われると考えられるが、その物質的性質は
必ずしも完全に解明されているとは言えない。本
発明者等は哺乳類卵子の大量回収法をブタ卵巣を
用いる実験系として開発し〔ガメート・リサーチ
（Gamate Res.）１、265―267（1978）、後にこの
方法はDunbar、B.S.等〔バイオケミストリー
（Biochemistry）２、356―365（1980）〕、及び
Gwatkin、R.B.L.等〔ガメート・リサーチ
（Gamate Res.）３、217―231〕により改良され
た。そして、この方法用いてDunbar等〔バイオ
ロジー・オブリプロダクシヨン（Biol.Reprod.）
24、1111―1124（1981）はブタ及びウサギの未成
熟卵透明帯にZP―１、ZP―２、及びZP―３と称
する３種類の糖蛋白質が含有されていることを明
らかにした。しかしながら、精子を直接受容する
成熟卵の透明帯の物質組成は明らかにされていな
かつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つてこの発明は、成熟卵の透明帯の構成成分
を明らかにし、この知見に基いて、ヒトの不妊症
の治療、動物における人工受精率の向上、体外受
精率の向上等のための薬剤として使用することが
でき、又受精を阻止することができる抗体を製造
する際の抗原として使用することができる物質、
及びこの物質の製造方法を提供しようとするもの
である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は、小型実験動物のための卵子大量回
収法を開発し、これによつて小型動物の透明体を
物質レベルで解析することを可能にし、これに基
いて未成熟卵透明帯と成熟卵透明帯の構成成分を
比較したところ、成熟卵透明帯には、未成熟卵透
明帯に含有される前記のZP―１、ZP―２及びZP
―３のほかに今まで知られていなかつた分子量の
一層大きい物質が含まれていることが明らかにな
つた。 本発明者はさらに、この物質の由来、生物学的
機能、及び理化学的性質を追求した結果、この新
規な物質は卵管から分泌され、卵管中で、排卵後
の卵子の透明帯のZP―２成分と結合して成熟卵
の透明帯中の１成分となること、この成分が、受
精の成立過程において透明体に精子が結合するた
めに重要な機能を果すこと、及び分子量約200000
〜240000からなる糖蛋白質であること等を明らか
にし、これらの知見に基いて本発明を完成した。 従つてこの発明は、次の性質すなち(1)哺乳類動
物の卵管に由来し、(2)SDS―ポリアクリルアミド
密度勾配電気泳動法により測定される分子量が約
200000〜240000であり、(3)等電点電気泳動法によ
り測定される等電点が約４〜6.2であり、(4)SDS
―デイスク電気泳動法により試験した場合サブフ
ラグメントを示さず、(5)二次元電気泳動法（等電
点とSDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳
動）においてカルバミレーシヨントレーンを形成
し、そして(6)卵透明帯への精子の種特異的結合を
促進する性質を有する新規な糖蛋白質；及び、前
記糖蛋白質の製造方法であつて、次の段階すなわ
ち、(a)哺乳類動物の卵管を用意し、(b)前記卵管
を、所望により緩衝液と共に、破砕し、(c)破砕物
から前記糖蛋白質を含有する上清液を得、(d)前記
糖蛋白質を不溶性担体に結合したレクチンに吸着
せしめ、(e)前記糖蛋白質を前記不溶性担体から遊
離せしめ、そして(f)前記糖蛋白質を採取する段階
を含んで成る方法を提供する。 製造方法 本発明の糖蛋白質は哺乳類動物の卵管から分離
することができる。この出発材料としての卵管を
入手するための動物として、例えばヒト、サル、
ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、
ラツト、マウス、ハムスター等を挙げることがで
きる。摘出採取した材料は、血液、脂肪等のきよ
う雑物を除去するためのに、目的物質を変性せし
めない適当な溶液、例えばリンゲル液、リン酸緩
衝液、酢酸緩衝液等により十分に洗浄するのが好
ましい。 次に目的物質を抽出するため前記の材料を、例
えば、常用の機械的手段、例えばホモジナイザー
を用いて十分に破砕し均質化する。この際、目的
物質を変性せしめない適当な緩衝液、例えばPH約
7.0〜8.0、好ましくはPH7.4の、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等を、前記材料に対して２〜６倍容量、
例えば４倍容量添加するのが便利である。破砕
は、目的物質の変性を防止するために、低温、例
えば５℃以下の温度において、そして好ましくは
氷冷しながら行うのが好ましい。この処理により
かゆ状物が得られる。 このかゆ状物を常用の分離手段、例えば遠心分
離にかけることにより沈澱と上清液とに分離す
る。この方法にかえて、かゆ状物を濾過すること
により濾液と残渣との分離することができる。こ
うして得られた上清液又は濾液は目的物質を含有
し、さらに他の水溶性物質、微細な粒状物、例え
ば細胞破片、脂肪粒等を含有する。 このため、上記の上清液又は濾液を、上記のよ
うな不純物を除去するためにさらに処理するのが
好ましい。例えば上記の上清液又は濾液を適当な
濾材、例えば比較的高分子の物質を通過せしるメ
ンブランフイルター、例えば東洋濾紙TM―４メ
ンブランフイルターにより濾過し粒子状不純物を
除去し濾液を得る。また、この方法に代えて、前
記の上清液又は濾液を一層強力な遠心分離にかけ
て粒子状不純物を除去することができる。 上記の処理により得られた濾液又は上清液は目
的物質の他に、低分子化合物、例えば糖類、無機
塩類、比較的低分子の蛋白質等の不純物を含有し
ている。従つて、これらの不純物を除去するため
の処理を行うのが好ましい。この方法として、例
えば分子量200000以上の物質を分離することがで
きるメンブランフイルターにより濾過するのが好
ましい。このようなメンブランフイルターとし
て、例えば東洋濾紙UK―200メンブランフイル
ターを挙げることができる。 次に、こうして得られた主として分子量約
200000以上の物質を含有する画分を、レクチン不
溶性担体を用いるアフイニテイークロマトグラフ
イーによりさらに精製する。ここでレクチン不溶
性担体とはレクチンと不溶性担体とが結合した担
体を意味し、レクチンとしてコンカナバリンＡ、
ヒマレクチン―、ジヤガイモレクチン、等を挙
げることができ、不溶性担体として例えばセフア
ロース、ポリアクリルアミドビーズ、寒天ビーズ
等を挙げることができる。本発明において使用す
る最も典型的なレクチン不溶性担体としてコンカ
ナバリンＡ―セフアロース4B（ConA―
Sepharose4B）カラムを挙げることができる。例
えば、コンカナバリンＡ―セフアロース担体を使
用する場合、この担体をカラムに詰、酢酸緩衝
液、例えば1MNaCl、1mM CaCl2、1mM
MgCl2及び1mM MnCl2を含有する100mM酢酸
緩衝液（PH6.0）によりあらかじ緩衝化しておく。
次にこのカラムに、上記酢酸緩衝液に調整した目
的物質含有画分を負荷する。この操作により、本
発明の目的物質を含む糖蛋白質類が特異的に吸着
される。次に、このカラムを前記酢酸緩衝液によ
り十分に洗浄し、非特異的に付着している物質を
除去する。次に、このカラムに溶離液を通過せし
めることにより、カラムに特異的に吸着している
糖蛋白質を溶出する。この溶離液としては、例え
ば前記の組成を有する酢酸緩衝液に0.2M濃度の
Ｄ―グルコースを添加したものが好ましい。 このアフイニテイー精製により、ほぼ純粋な形
で本発明の糖蛋白質を含有する画分が得られる。
しかしながら、さらに精製し、濃縮するには、さ
らにメンブランフイルターにより最終処理を行う
のが好ましい。このためには、例えば分子量
200000以上の物質を分画することができる前記の
メンブランフイルター、例えば東洋UK―200メ
ンブランフイルターを用いて限外濾過を行うのが
好ましい。 この最終処理によりSDS―ポリアクリルアミド
密度勾配電気泳動（５〜15％）において均一な本
発明の糖蛋白質が得られる。 物質の性質 （所 在） 本発明の物質は哺乳類動物の卵管に存在し、こ
れから分泌される。分泌された物質は排卵後の卵
子の透明帯に移行し、その成分として存在する。 （理化学的性質） (1) 糖蛋白質である。これはコンカナバリンＡ―
セフアロース4Bに特異的に結することにより
証明される。 (2) SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法によつて測定した分子量は約200000〜240000
である。 (3) 等電点電気泳動法によつて測定した場合の等
電点は約４〜6.2である。 (4) SDS―デイスク電気泳動法によつて試験した
場合サブフラグメントを示さない。 (5) 二次元電気泳動法（等電点とSDS―ポリアク
リルアミド密度勾配電気泳動）においてカルバ
ミレーシヨントレーン（約10数個のスポツト）
を形成する。 （生物学的性質） (1) 卵子の透明帯に存在する糖蛋白質ZP―２と
結合し、精子が卵子の透明体に結合するのを促
進する。 (2) 本発明の糖蛋白質に対して特異的な抗体を産
生するための抗原となり得る。 なお、上記の理化学的性質の測定は次の方法に
より行つた。 Ａ SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法による分子量の測定 ポリアクリルアミドゲル５％〜15％（勾配）、
SDS（90μ、10％／９ml）、PH8.8のゲル上で、
10mA／cm2の電流密度にて３時間、サンプルと
分子量マーカー（フアルマシア社製、SDS電気
泳動用スタンダードマーカー）とを並行して泳
動せしめ、サンプルの示すバンドと分子量マー
カーの示すバンドを比較した。 この結果、スタンダードマーカーの分子量約
200000〜240000に相当する位置にバンドが観察
された。 Ｂ 等電点電気泳動法による等電点の測定 アンホライン（PH３、濃度0.8％）及びアン
ホライン（PH10、濃度0.8％）からなるPH勾配
上で300〜400Vにて12〜16時間サンプルを泳動
せしめ、バンドの位置から等電点を求めた。 この結果ゲル上のPH４〜6.2の位置にバンド
が観察された。 Ｃ SDS―デイスク電気泳動法によるサブフラグ
メントの有無の確認 ポリアクリルアミド10％、SDS（90μ、10
％／９ml）を含有するゲルデイスク上でサンプ
ルの電気泳動を行い、バンドの数を観察した。 この結果単一のバンドが観察された。 Ｄ カルバミレーシヨントレインの形成 尿素9.5M、ノニレツトP40 2.0W／Ｖ％、ア
ンホライン（PH５〜７）1.6％、アンホライン
（PH3.5〜10）0.4％、２―メルカプトエタノー
ル5.0％を含有する媒体中にサンプルを添加し
た後100℃にて３分間加熱処理した。次に、こ
の処理サンプルを、尿素9.2M、ポリアクリル
アミド４％、ノニレツトP40 2.0％、アンホラ
イン２％を含有するゲルデイスク上で前記Ｂに
記載したようにして泳動せしめた後、デイスク
を取り出し、これを前記Ａに記載したのと同じ
ゲルに適用し、前記Ａと同様にして電気泳動し
た。 本発明の糖蛋白質をZP―１、ZP―２及びZP―
３と比較した結果を第２図に示す。 〔発明の効果〕 本発明の新規な糖蛋白質は、精子が卵子の透明
体に結合するのを促進する作用を有する。従つ
て、不妊症の治療、人工授精における受精率の向
上、体外授精における受精率の向上等のために使
用する薬剤の活性成分として有用である。 また、本発明の糖蛋白質は、それに対して特異
的な抗体をＢリンパ球に産生せしめるための抗原
として機能する。従つて、動物を免疫して抗血清
を製造する場合、及びハイブリドーマを形成して
これを用いてモノクローナル抗体を製造する場合
の免疫原として有用である。 実施例 １ 本発明の糖蛋白質の性質 ハムスターから卵管0.4gを摘出し、これをリン
ゲル液で十分に洗浄した。次に、この洗浄された
組織に、リン酸緩衝液によりPHを7.4に調整した
冷生理食塩水２mlを加え、氷冷しながらホモジナ
イザーで組織を完全に破砕し、かゆ状物を得た。
このかゆ状物を遠心管に入れ、20000×ｇにて10
分間冷凍遠心分離し、沈澱と上清液に分離し、２
mlの上清液を回収した。この上清を東洋濾紙TM
―４メンブランフイルターで濾過し、1.8mlの濾
液を得た。この濾液を、分子量200000以上の物質
を撫離することができる東洋濾紙UK―200メン
ブランフイルターを装着た限外濾過装置で濾過し
た。この際、容積が減少した不透過画分に1M
NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM
MnCl2を含有する100mM酢酸緩衝液（PH6.0）を
補給しながら濾過を続けることにより限外濾過と
同時に緩衝液の交換を行つた。この様にして前記
酢酸緩衝液に本発明の目的物質を含有する画分
0.1mlを得た。 コンカナバリンＡ―セフアロース4Bカラム
（直径25mm、長さ50mm）を、上記の酢酸緩衝液で
平衡化し、このカラムに上記の画分を負荷した。
次に、カラムに上記酢酸緩衝液を通し非特異的に
付着している物質を洗浄除去した。この操作を、
流出液の280nmにおける吸光度が0.005以下にな
るまで継続した。次にこのカラムに、上記酢酸緩
衝液に0.2M濃度のＤ―グルコースを添加した溶
離液を通し、カラムに特異的に結合した糖蛋白質
を溶出した。この液出液の内、280nmにおける吸
光度が0.005以上の分画を全部一緒にし、15mlの
溶出液を回収した。 次に、この画分を、分子量200000以上の物質を
分画することができる東洋濾紙UK―200メンブ
ランフイルターを装着した限外濾過装置により濃
縮し、同時に遊離の糖類を除去した。この際、容
積が減少した不透過画分に前記のリン酸緩衝化生
理食塩水溶液を補給しながら限外濾過を続けるこ
とにより、濃度及び脱糖と同時に緩衝液の交換を
行つた。このようにして0.5mlの最終画分を得た。 この画分をSDS―ポリアクリルアミド密度勾配
電気泳動（５〜15％）法により分析したところ、
この画分は200000〜240000の分子量を有する糖蛋
白質のみを含有し、他の高分子成分は検出されな
かつた。 なお、第１図に、上記のようにして製造した本
発明の糖蛋白質調製物、卵管から採取した卵子
（成熟卵）の透明帯の蛋白質調製物、及び卵巣か
ら採取した卵子（未成熟卵）の透明帯の蛋白質調
製物の電気泳動パターンを示す。左端のレーンは
マーカー蛋白質のそれを示す。未成熟卵の透明体
由来の調製物はZP―１、ZP―２及びZP―３物質
を含み、成熟卵の透明体由来の調製物は上記３種
類の物質のほかにZP―０と称する物質を含み、
これが本発明の糖蛋白質に相当する。 なお、本発明においては、本発明の糖蛋白質を
確認するために、糖蛋白質と特異的に結合する性
質を有するBSレクチン―１と螢光色素フルオレ
ツセイン―イソ―チオシアナート（FITC）との
接合体FITC―BCレクチン―１を用いて糖蛋白質
の存在を確認し、さらに精子との結合により本発
明の糖蛋白質を確認した。 実施例 ２ 生物学的活性の確認 ハムスター、ラツト、及びマウスの精子を採取
し、これらに常法に従つて授精可能化処理を施し
た。他方、ハムスター、ラツト、マウス及びブタ
から卵子を採取し、ブタの卵子サンプルは２つに
分けて一方には本発明の糖蛋白質標品を添加して
混合した。次に、上記の精子サンプル（３種類）
と卵子サンプル（５種類）とをそれぞれ混合して
15種類のサンプルを作り、精子と卵子の結合を顕
微鏡観察した。 この結果を次の表に示す。
促進する能力を有する糖蛋白質及びその製造方法
に関する。 〔従来の技術〕 哺乳類動物において受精が成立する過程におい
ては、精子が卵の外表を構成する透明帯に到達し
これを通過しなければならず、この透明帯におい
て種間認識、単精をまもるための多精拒否等の過
程が行われると考えられるが、その物質的性質は
必ずしも完全に解明されているとは言えない。本
発明者等は哺乳類卵子の大量回収法をブタ卵巣を
用いる実験系として開発し〔ガメート・リサーチ
（Gamate Res.）１、265―267（1978）、後にこの
方法はDunbar、B.S.等〔バイオケミストリー
（Biochemistry）２、356―365（1980）〕、及び
Gwatkin、R.B.L.等〔ガメート・リサーチ
（Gamate Res.）３、217―231〕により改良され
た。そして、この方法用いてDunbar等〔バイオ
ロジー・オブリプロダクシヨン（Biol.Reprod.）
24、1111―1124（1981）はブタ及びウサギの未成
熟卵透明帯にZP―１、ZP―２、及びZP―３と称
する３種類の糖蛋白質が含有されていることを明
らかにした。しかしながら、精子を直接受容する
成熟卵の透明帯の物質組成は明らかにされていな
かつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つてこの発明は、成熟卵の透明帯の構成成分
を明らかにし、この知見に基いて、ヒトの不妊症
の治療、動物における人工受精率の向上、体外受
精率の向上等のための薬剤として使用することが
でき、又受精を阻止することができる抗体を製造
する際の抗原として使用することができる物質、
及びこの物質の製造方法を提供しようとするもの
である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は、小型実験動物のための卵子大量回
収法を開発し、これによつて小型動物の透明体を
物質レベルで解析することを可能にし、これに基
いて未成熟卵透明帯と成熟卵透明帯の構成成分を
比較したところ、成熟卵透明帯には、未成熟卵透
明帯に含有される前記のZP―１、ZP―２及びZP
―３のほかに今まで知られていなかつた分子量の
一層大きい物質が含まれていることが明らかにな
つた。 本発明者はさらに、この物質の由来、生物学的
機能、及び理化学的性質を追求した結果、この新
規な物質は卵管から分泌され、卵管中で、排卵後
の卵子の透明帯のZP―２成分と結合して成熟卵
の透明帯中の１成分となること、この成分が、受
精の成立過程において透明体に精子が結合するた
めに重要な機能を果すこと、及び分子量約200000
〜240000からなる糖蛋白質であること等を明らか
にし、これらの知見に基いて本発明を完成した。 従つてこの発明は、次の性質すなち(1)哺乳類動
物の卵管に由来し、(2)SDS―ポリアクリルアミド
密度勾配電気泳動法により測定される分子量が約
200000〜240000であり、(3)等電点電気泳動法によ
り測定される等電点が約４〜6.2であり、(4)SDS
―デイスク電気泳動法により試験した場合サブフ
ラグメントを示さず、(5)二次元電気泳動法（等電
点とSDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳
動）においてカルバミレーシヨントレーンを形成
し、そして(6)卵透明帯への精子の種特異的結合を
促進する性質を有する新規な糖蛋白質；及び、前
記糖蛋白質の製造方法であつて、次の段階すなわ
ち、(a)哺乳類動物の卵管を用意し、(b)前記卵管
を、所望により緩衝液と共に、破砕し、(c)破砕物
から前記糖蛋白質を含有する上清液を得、(d)前記
糖蛋白質を不溶性担体に結合したレクチンに吸着
せしめ、(e)前記糖蛋白質を前記不溶性担体から遊
離せしめ、そして(f)前記糖蛋白質を採取する段階
を含んで成る方法を提供する。 製造方法 本発明の糖蛋白質は哺乳類動物の卵管から分離
することができる。この出発材料としての卵管を
入手するための動物として、例えばヒト、サル、
ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、
ラツト、マウス、ハムスター等を挙げることがで
きる。摘出採取した材料は、血液、脂肪等のきよ
う雑物を除去するためのに、目的物質を変性せし
めない適当な溶液、例えばリンゲル液、リン酸緩
衝液、酢酸緩衝液等により十分に洗浄するのが好
ましい。 次に目的物質を抽出するため前記の材料を、例
えば、常用の機械的手段、例えばホモジナイザー
を用いて十分に破砕し均質化する。この際、目的
物質を変性せしめない適当な緩衝液、例えばPH約
7.0〜8.0、好ましくはPH7.4の、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等を、前記材料に対して２〜６倍容量、
例えば４倍容量添加するのが便利である。破砕
は、目的物質の変性を防止するために、低温、例
えば５℃以下の温度において、そして好ましくは
氷冷しながら行うのが好ましい。この処理により
かゆ状物が得られる。 このかゆ状物を常用の分離手段、例えば遠心分
離にかけることにより沈澱と上清液とに分離す
る。この方法にかえて、かゆ状物を濾過すること
により濾液と残渣との分離することができる。こ
うして得られた上清液又は濾液は目的物質を含有
し、さらに他の水溶性物質、微細な粒状物、例え
ば細胞破片、脂肪粒等を含有する。 このため、上記の上清液又は濾液を、上記のよ
うな不純物を除去するためにさらに処理するのが
好ましい。例えば上記の上清液又は濾液を適当な
濾材、例えば比較的高分子の物質を通過せしるメ
ンブランフイルター、例えば東洋濾紙TM―４メ
ンブランフイルターにより濾過し粒子状不純物を
除去し濾液を得る。また、この方法に代えて、前
記の上清液又は濾液を一層強力な遠心分離にかけ
て粒子状不純物を除去することができる。 上記の処理により得られた濾液又は上清液は目
的物質の他に、低分子化合物、例えば糖類、無機
塩類、比較的低分子の蛋白質等の不純物を含有し
ている。従つて、これらの不純物を除去するため
の処理を行うのが好ましい。この方法として、例
えば分子量200000以上の物質を分離することがで
きるメンブランフイルターにより濾過するのが好
ましい。このようなメンブランフイルターとし
て、例えば東洋濾紙UK―200メンブランフイル
ターを挙げることができる。 次に、こうして得られた主として分子量約
200000以上の物質を含有する画分を、レクチン不
溶性担体を用いるアフイニテイークロマトグラフ
イーによりさらに精製する。ここでレクチン不溶
性担体とはレクチンと不溶性担体とが結合した担
体を意味し、レクチンとしてコンカナバリンＡ、
ヒマレクチン―、ジヤガイモレクチン、等を挙
げることができ、不溶性担体として例えばセフア
ロース、ポリアクリルアミドビーズ、寒天ビーズ
等を挙げることができる。本発明において使用す
る最も典型的なレクチン不溶性担体としてコンカ
ナバリンＡ―セフアロース4B（ConA―
Sepharose4B）カラムを挙げることができる。例
えば、コンカナバリンＡ―セフアロース担体を使
用する場合、この担体をカラムに詰、酢酸緩衝
液、例えば1MNaCl、1mM CaCl2、1mM
MgCl2及び1mM MnCl2を含有する100mM酢酸
緩衝液（PH6.0）によりあらかじ緩衝化しておく。
次にこのカラムに、上記酢酸緩衝液に調整した目
的物質含有画分を負荷する。この操作により、本
発明の目的物質を含む糖蛋白質類が特異的に吸着
される。次に、このカラムを前記酢酸緩衝液によ
り十分に洗浄し、非特異的に付着している物質を
除去する。次に、このカラムに溶離液を通過せし
めることにより、カラムに特異的に吸着している
糖蛋白質を溶出する。この溶離液としては、例え
ば前記の組成を有する酢酸緩衝液に0.2M濃度の
Ｄ―グルコースを添加したものが好ましい。 このアフイニテイー精製により、ほぼ純粋な形
で本発明の糖蛋白質を含有する画分が得られる。
しかしながら、さらに精製し、濃縮するには、さ
らにメンブランフイルターにより最終処理を行う
のが好ましい。このためには、例えば分子量
200000以上の物質を分画することができる前記の
メンブランフイルター、例えば東洋UK―200メ
ンブランフイルターを用いて限外濾過を行うのが
好ましい。 この最終処理によりSDS―ポリアクリルアミド
密度勾配電気泳動（５〜15％）において均一な本
発明の糖蛋白質が得られる。 物質の性質 （所 在） 本発明の物質は哺乳類動物の卵管に存在し、こ
れから分泌される。分泌された物質は排卵後の卵
子の透明帯に移行し、その成分として存在する。 （理化学的性質） (1) 糖蛋白質である。これはコンカナバリンＡ―
セフアロース4Bに特異的に結することにより
証明される。 (2) SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法によつて測定した分子量は約200000〜240000
である。 (3) 等電点電気泳動法によつて測定した場合の等
電点は約４〜6.2である。 (4) SDS―デイスク電気泳動法によつて試験した
場合サブフラグメントを示さない。 (5) 二次元電気泳動法（等電点とSDS―ポリアク
リルアミド密度勾配電気泳動）においてカルバ
ミレーシヨントレーン（約10数個のスポツト）
を形成する。 （生物学的性質） (1) 卵子の透明帯に存在する糖蛋白質ZP―２と
結合し、精子が卵子の透明体に結合するのを促
進する。 (2) 本発明の糖蛋白質に対して特異的な抗体を産
生するための抗原となり得る。 なお、上記の理化学的性質の測定は次の方法に
より行つた。 Ａ SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法による分子量の測定 ポリアクリルアミドゲル５％〜15％（勾配）、
SDS（90μ、10％／９ml）、PH8.8のゲル上で、
10mA／cm2の電流密度にて３時間、サンプルと
分子量マーカー（フアルマシア社製、SDS電気
泳動用スタンダードマーカー）とを並行して泳
動せしめ、サンプルの示すバンドと分子量マー
カーの示すバンドを比較した。 この結果、スタンダードマーカーの分子量約
200000〜240000に相当する位置にバンドが観察
された。 Ｂ 等電点電気泳動法による等電点の測定 アンホライン（PH３、濃度0.8％）及びアン
ホライン（PH10、濃度0.8％）からなるPH勾配
上で300〜400Vにて12〜16時間サンプルを泳動
せしめ、バンドの位置から等電点を求めた。 この結果ゲル上のPH４〜6.2の位置にバンド
が観察された。 Ｃ SDS―デイスク電気泳動法によるサブフラグ
メントの有無の確認 ポリアクリルアミド10％、SDS（90μ、10
％／９ml）を含有するゲルデイスク上でサンプ
ルの電気泳動を行い、バンドの数を観察した。 この結果単一のバンドが観察された。 Ｄ カルバミレーシヨントレインの形成 尿素9.5M、ノニレツトP40 2.0W／Ｖ％、ア
ンホライン（PH５〜７）1.6％、アンホライン
（PH3.5〜10）0.4％、２―メルカプトエタノー
ル5.0％を含有する媒体中にサンプルを添加し
た後100℃にて３分間加熱処理した。次に、こ
の処理サンプルを、尿素9.2M、ポリアクリル
アミド４％、ノニレツトP40 2.0％、アンホラ
イン２％を含有するゲルデイスク上で前記Ｂに
記載したようにして泳動せしめた後、デイスク
を取り出し、これを前記Ａに記載したのと同じ
ゲルに適用し、前記Ａと同様にして電気泳動し
た。 本発明の糖蛋白質をZP―１、ZP―２及びZP―
３と比較した結果を第２図に示す。 〔発明の効果〕 本発明の新規な糖蛋白質は、精子が卵子の透明
体に結合するのを促進する作用を有する。従つ
て、不妊症の治療、人工授精における受精率の向
上、体外授精における受精率の向上等のために使
用する薬剤の活性成分として有用である。 また、本発明の糖蛋白質は、それに対して特異
的な抗体をＢリンパ球に産生せしめるための抗原
として機能する。従つて、動物を免疫して抗血清
を製造する場合、及びハイブリドーマを形成して
これを用いてモノクローナル抗体を製造する場合
の免疫原として有用である。 実施例 １ 本発明の糖蛋白質の性質 ハムスターから卵管0.4gを摘出し、これをリン
ゲル液で十分に洗浄した。次に、この洗浄された
組織に、リン酸緩衝液によりPHを7.4に調整した
冷生理食塩水２mlを加え、氷冷しながらホモジナ
イザーで組織を完全に破砕し、かゆ状物を得た。
このかゆ状物を遠心管に入れ、20000×ｇにて10
分間冷凍遠心分離し、沈澱と上清液に分離し、２
mlの上清液を回収した。この上清を東洋濾紙TM
―４メンブランフイルターで濾過し、1.8mlの濾
液を得た。この濾液を、分子量200000以上の物質
を撫離することができる東洋濾紙UK―200メン
ブランフイルターを装着た限外濾過装置で濾過し
た。この際、容積が減少した不透過画分に1M
NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM
MnCl2を含有する100mM酢酸緩衝液（PH6.0）を
補給しながら濾過を続けることにより限外濾過と
同時に緩衝液の交換を行つた。この様にして前記
酢酸緩衝液に本発明の目的物質を含有する画分
0.1mlを得た。 コンカナバリンＡ―セフアロース4Bカラム
（直径25mm、長さ50mm）を、上記の酢酸緩衝液で
平衡化し、このカラムに上記の画分を負荷した。
次に、カラムに上記酢酸緩衝液を通し非特異的に
付着している物質を洗浄除去した。この操作を、
流出液の280nmにおける吸光度が0.005以下にな
るまで継続した。次にこのカラムに、上記酢酸緩
衝液に0.2M濃度のＤ―グルコースを添加した溶
離液を通し、カラムに特異的に結合した糖蛋白質
を溶出した。この液出液の内、280nmにおける吸
光度が0.005以上の分画を全部一緒にし、15mlの
溶出液を回収した。 次に、この画分を、分子量200000以上の物質を
分画することができる東洋濾紙UK―200メンブ
ランフイルターを装着した限外濾過装置により濃
縮し、同時に遊離の糖類を除去した。この際、容
積が減少した不透過画分に前記のリン酸緩衝化生
理食塩水溶液を補給しながら限外濾過を続けるこ
とにより、濃度及び脱糖と同時に緩衝液の交換を
行つた。このようにして0.5mlの最終画分を得た。 この画分をSDS―ポリアクリルアミド密度勾配
電気泳動（５〜15％）法により分析したところ、
この画分は200000〜240000の分子量を有する糖蛋
白質のみを含有し、他の高分子成分は検出されな
かつた。 なお、第１図に、上記のようにして製造した本
発明の糖蛋白質調製物、卵管から採取した卵子
（成熟卵）の透明帯の蛋白質調製物、及び卵巣か
ら採取した卵子（未成熟卵）の透明帯の蛋白質調
製物の電気泳動パターンを示す。左端のレーンは
マーカー蛋白質のそれを示す。未成熟卵の透明体
由来の調製物はZP―１、ZP―２及びZP―３物質
を含み、成熟卵の透明体由来の調製物は上記３種
類の物質のほかにZP―０と称する物質を含み、
これが本発明の糖蛋白質に相当する。 なお、本発明においては、本発明の糖蛋白質を
確認するために、糖蛋白質と特異的に結合する性
質を有するBSレクチン―１と螢光色素フルオレ
ツセイン―イソ―チオシアナート（FITC）との
接合体FITC―BCレクチン―１を用いて糖蛋白質
の存在を確認し、さらに精子との結合により本発
明の糖蛋白質を確認した。 実施例 ２ 生物学的活性の確認 ハムスター、ラツト、及びマウスの精子を採取
し、これらに常法に従つて授精可能化処理を施し
た。他方、ハムスター、ラツト、マウス及びブタ
から卵子を採取し、ブタの卵子サンプルは２つに
分けて一方には本発明の糖蛋白質標品を添加して
混合した。次に、上記の精子サンプル（３種類）
と卵子サンプル（５種類）とをそれぞれ混合して
15種類のサンプルを作り、精子と卵子の結合を顕
微鏡観察した。 この結果を次の表に示す。
【表】
この表において＋は精子と卵子が結合したこと
を示し、−は結合しなかつたことを示す。ハムス
ター、ラツト及びマウスの精子及び卵子を組み合
わせた試験において、精子・卵子間の種特異的結
合が確認される。ブタの未処理卵子はハムスタ
ー、ラツト及びマウスの精子と結合しないのに対
して、ハムスターの卵管から調製した本発明の糖
蛋白質により処理したブタの卵子はハムスターの
精子と結合した。このことから、本発明の糖蛋白
質が卵子透明帯への精子の種特異的結合を促進す
ることが明らかである。
を示し、−は結合しなかつたことを示す。ハムス
ター、ラツト及びマウスの精子及び卵子を組み合
わせた試験において、精子・卵子間の種特異的結
合が確認される。ブタの未処理卵子はハムスタ
ー、ラツト及びマウスの精子と結合しないのに対
して、ハムスターの卵管から調製した本発明の糖
蛋白質により処理したブタの卵子はハムスターの
精子と結合した。このことから、本発明の糖蛋白
質が卵子透明帯への精子の種特異的結合を促進す
ることが明らかである。
第１図に本発明の糖蛋白質調製物、未成熟卵透
明帯蛋白質、及び成熟卵透明帯蛋白質の電気泳動
パターンを示す。第２図は、本発明の糖蛋白質、
ZP―１、ZP―２及びZP―３のカルバミレーシヨ
ントレインの結果をスケツチしたものである。
明帯蛋白質、及び成熟卵透明帯蛋白質の電気泳動
パターンを示す。第２図は、本発明の糖蛋白質、
ZP―１、ZP―２及びZP―３のカルバミレーシヨ
ントレインの結果をスケツチしたものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の性質すなわち、 (1) 哺乳類動物の卵管に由来し、 (2) SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法により測定される分子量が200000〜240000で
あり、 (3) 等電点電気泳動法により測定される等電点が
４〜6.2であり、 (4) SDS―デイスク電気泳動法により試験した場
合サブフラグメントを示さず、 (5) 二次元電気泳動法（等電点とSDS―ポリアク
リルアミド密度勾配電気泳動）においてカルバ
ミレーシヨントレーンを形成し、そして (6) 卵透明帯への精子の種特異的結合を促進する
性質を有する糖蛋白質。 ２ 次の性質すなわち、 (1) 哺乳類動物の卵管に由来し、 (2) SDS―ポリアクリルアミド密度勾配電気泳動
法により測定される分子量が200000〜240000で
あり、 (3) 等電点電気泳動法により測定される等電点が
４〜6.2であり、 (4) SDS―デイスク電気泳動法により試験した場
合サブフラグメントを示さず、 (5) 二次元電気泳動法（等電点とSDS―ポリアク
リルアミド密度勾配電気泳動）においてカルバ
ミレーシヨントレーンを形成し、そして (6) 卵透明帯への精子の種特異的結合を促進する
性質を有する糖蛋白質の製造方法であつて、次
の段階すなわち、 (a) 哺乳類動物の卵管を用意し、 (b) 前記卵管を、所望により緩衝液と共に、破
砕し、 (c) 破砕物から前記糖蛋白質を含有する液を
得、 (d) 前記糖蛋白質を不溶性担体に結合したレク
チンに吸着せしめ、 (e) 前記糖蛋白質を前記不溶性担体から遊離せ
しめ、そして (f) 前記糖蛋白質を採取する、段階を含んで成
る方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60152466A JPS6216422A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 生理活性糖蛋白質及びその製造方法 |
| US06/854,470 US4801689A (en) | 1985-07-12 | 1986-04-22 | Physilogically active glycoprotein and process for production thereof |
| US07/192,173 US4847363A (en) | 1985-07-12 | 1988-05-10 | Physiologically active glycoprotein and process for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60152466A JPS6216422A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 生理活性糖蛋白質及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6216422A JPS6216422A (ja) | 1987-01-24 |
| JPS6361320B2 true JPS6361320B2 (ja) | 1988-11-28 |
Family
ID=15541125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60152466A Granted JPS6216422A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 生理活性糖蛋白質及びその製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4801689A (ja) |
| JP (1) | JPS6216422A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0326616U (ja) * | 1989-07-26 | 1991-03-18 | ||
| JPH04138920A (ja) * | 1990-09-28 | 1992-05-13 | Toyoda Gosei Co Ltd | 自動車用ドアガラスラン |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6207594A (en) * | 1993-02-26 | 1994-09-14 | Akzo Nobel N.V. | Zona pellucida related oligosaccharides |
| US6132952A (en) * | 1997-05-30 | 2000-10-17 | Saint Barnabas Medical Center | Storage system comprising an emptied zona pellucida and spermatozoa placed therein and a method of cryopreservation |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4430428A (en) * | 1980-02-05 | 1984-02-07 | The Upjohn Company | Composition of matter and process |
| GB8305967D0 (en) * | 1983-03-04 | 1983-04-07 | Univ Liverpool | Material for treatment of spontaneous abortions |
| DE3334405A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Membranassoziierte proteine (mp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)), verfahren zu ihrer gewinnung sowie ihre verwendung |
-
1985
- 1985-07-12 JP JP60152466A patent/JPS6216422A/ja active Granted
-
1986
- 1986-04-22 US US06/854,470 patent/US4801689A/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-05-10 US US07/192,173 patent/US4847363A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0326616U (ja) * | 1989-07-26 | 1991-03-18 | ||
| JPH04138920A (ja) * | 1990-09-28 | 1992-05-13 | Toyoda Gosei Co Ltd | 自動車用ドアガラスラン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4847363A (en) | 1989-07-11 |
| JPS6216422A (ja) | 1987-01-24 |
| US4801689A (en) | 1989-01-31 |
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