JPH04507040A - 性関連膜タンパク質および子が所望の性を有する確率を増大させるための方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 タンパク　および　がＰ　の　を する確；を　大させるための １丑旦立旦 本発明の分野は、新規なタンパク質の単離および哺乳動物から生まれる子が所望 の性を有するか、または特定の性染色体関連形質の遺伝子を有する確率を増大さ せる方法へのそれらのタンパク質の使用である。本発明は、精子細胞をＸに富む 亜集団およびＹに富む亜集団に選別することに関する。さらに本発明は、Ｘ富化 およびＹ富化された精子の原形質膜およびその成分の単離に関する。さらに詳細 には、本発明は性関連膜タンパク質およびそれらに結合する抗体に関する。本発 明はこれらの抗体の、精液試料がＸ染色体を有する精子細胞またはＹ染色体を有 する精子細胞に富むようになるように、精液試料を修飾するための使用に関する 。 １五旦！見 哺乳動物の精液試料は、およそ等数のＹ染色体担持精子細胞（Ｙ精子）およびＸ 染色体担持精子細胞（Ｘ精子）を含む。 卵子にＹ精子が授精すると雄性が生まれ、Ｘ精子が授精すると雌性が生まれる。 精子試料中のＸまたはＹ精子の相対的割合を増大させるために哺乳動物の精子を 修飾し、それにより雌性または雄性の子をより生まれやすくするための、様々な 方法が提案されてきた。哺乳動物の性に影響を与えるかまたは制御する試みは、 立証することができなかった。（以前の研究の総説としては、Ｇａｒｎｅｒ、１ ９８４：　Ｐｉｎｋｅｌら、１９８５を参照。）精液のＸ精子またはＹ精子を富 化する試みのより一般的な方法の一つは、運動性および密度沈降に頼るものであ った。 （Ｋａｉｓｅｒら、１９７４または５ｏｕｐａｒｔ、　１９７５を参照。）この 方法は、Ｘ精子よりもＹ精子が運動性が高く重量が軽いという主張に基づく。こ の理論に従い、Ｙ精子はＸ精子よりも、２つの異なる媒体密度により作られた境 界面を、より容易に通り、抜ける。このような方法の一つには、アルブミン密度 勾配沈降が用いられる。しかし、成熟した精子の形態上の多様性のために、この 方法がＸ精子またはＹ精子を分離または富化し得ることは個別にはだれも、示し ていない（Ｂｒａｎｄｒｉ　ｆｆら、１９８６）。 ＸおよびＹ精子を分離する手段として、免疫学的方法もまた試みられた。これら の方法は、精子細胞のＲＮＡポリメラーゼが、半数体の遺伝子を転写可能である という事実に基づ＜　（Ｍｏｏｒｅ、　１９７１）。このＲＮＡ転写物から産生 される異なる抗原に基づき、ＸおよびＹ精子が免疫学的に分離され得ると考えら れた。性分離しない精子に見いだされた抗原はＬＤＨアイソザイムを含んでいた （ＳｔａｍｂａｕｇｈおよびＢｕｃｋｌｅｙ、　１９７１）。再び、実証可能な 分離は報告されなかった。 研究者らは、精子の亜集団を富化し、そのことにより子の性を予め選択するため の可能な手段として、雄性Ｈ−Ｙ抗原に注目した。間接的な証拠から、Ｈ−Ｙ抗 原は、雄性では産生されるが雌性では産生されない細胞表面抗原であることが示 唆された。従って、研究者らは、Ｈ−ＹはＹ染色体を含有する細胞により発現さ れ、従ってＹ精子表面には発現されるがＹ精子には発現されないと理論付けた。 続いて、幾人かの研究者らは、Ｈ−Ｙ抗体がＹ精子を不活化するがＹ精子は不活 化しないはずであると考えた。幾人かの研究者らは、この理論に基づく方法によ り、哺乳動物の性の割合を偏向することを主張した（１４ｃＣ□ｒｍ　ｉｃｋら 、１９８３；　ＢｏｙｃｅおよびＢｅｎｎｅｔ、　１９８４）。 特にＢｒｙａｎｔは、Ｈ−Ｙ抗体を用いた顕著な性割合の偏向を主張した（Ｂｒ ｙａｎｔ、米国特許第４．１９１．７４９号；　Ｂｒｙａｎｔ、米国特許第４． ４４８，７６７号）。しかし、実験はこれらの主張を確証しなかった。特にＨｏ ｐｐｅおよびＫｏｏは、Ｈ−Ｙ抗原に対する抗体を用いて性比を偏向させること は不可能であったと言明した（ＨｏｐｐｅおよびＫｏｏ、　１９８４）。我々が 知る限りでは、誰もＢｒｙａｎ　ｔの主張を確証していない。 これらの結果を確認することに失敗した理由は、２つある。 第１に、基礎となる理論が間違っているようである。最も最近の証拠は、成熟Ｘ またはＹ精子についてＨ−Ｙの存在の差異が無いことを示している。ある種の雄 組織はＨ−Ｙを産生し、それを膜内在住タンパク質として発現するが、Ｙ精子は それ自身Ｈ−Ｙ−ｔ−産生しないようである。むしろ、ＸおよびＹ精子の両者は 、表面にそれを吸着する（Ｇａｒｎｅｒ、１９８４）。ＨｏｐｐｅおよびＫｏｏ は、ＸおよびＹ精子がＨ−Ｙ抗体に反応することを示した（ＨｏｐｐｅおよびＫ ｏｏ　１９８４）。我々自身のここに示した証拠は、このことを確証する。さら にＨｏｐｐｅおよびＫｏｏは、精子は成熟するにつれて、Ｈ−Ｙ抗原と反応する 能力が減少し、Ｈ−Ｙが精子細胞表面からマスクされるか失われることが示唆さ れることを示したく前述）。第２に、これらの研究者の一部の実験技術に欠陥が あったのであろう。かれらは限られた数の動物を用いた実験に基づいて結論を出 したので、性比は偏っていたとしても統計的に有意ではなかった（Ｍａｏｒｅお よびＧｌａｄｈｉｌｌ、　１９８８）。従って、Ｈ−Ｙ抗原を、Ｘ精子とＹ精子 との分離にうまく使用し得ると考える理由はもはや存在しない。実際、我々は、 この方法を用いて成功する、ｔ）かなる現在行われている方法も知らない。 Ｆａｂｒｉｃａｎｔらの米国特許第４．７２２．８８７号は、精子細胞表面のス ルホ糖脂質（ＳＧＧ）の異なる発現に基づき、ポリマー相分離によりＸおよびＹ 精子を分離する方法につ−Ａで記載する。 しかし、著者らは、この脂質の性に依存した相違の証拠は間接的であり、脂質基 質を代謝する酵素の、性に依存した発現に基づいていると述べている。そして著 者らは、ＳＧＧそのものが性に依存することを明らかにするという予測のみを示 している。 Ｘ精子とはＹ精子との他の可能な分離方法は、Ｘ精子とＹ精子とのＤＮＡ含有量 についての周知の相違（こ基づく。Ｘ精子細胞のＤＮＡ含有量はＹ精子細胞のＤ ＮＡ含有量よりも多いので、研究者らは各々の精子集団が、密度勾配沈降また（ ｉフローサイトメトリーにより分離され得ることを期待した。 しかし、何れも不可能であることが明らかにされた。 この失敗の理由の一つは、Ｘ精子とＹ精子との間のＤＮＡ含有量の相違が小さい ことであり得る。例えば、この相違は雄ウシで僅かに約３．９％であり、雄ブタ で３．７％、雄ヒツジで４゜１％であると考えられる（Ｓｕｍｎｅｒ　１９７１ ＨＰｅａｒｓｏｎら、１９７３ＨＥｖａｎｓら、　１９７２：およびＧｌｅｄｈ ｉｌｌ、　１９８５）。これは浮力に換算して約０、００３の相違となり、利用 可能な方法を用いて全精子の分離を可能にするのに充分ではない。他の哺乳動物 は、Ｘ精子およびＹ精子の相対的なりＮＡ含有量の幾分大きな相違を示し、例え ばハタネズミ（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ　ｏｒｅｇａｎｉ）の相違は約９％であるが、 全精子の分離はこれらの動物でも可能ではない（Ｐｉｎｋｅｌら、１９８２）。 例えば、研究者らは密度勾配沈降によりこれらの異なるＤＮＡ含有量に基づき精 子分離しようと試みたが、富化された結果は確認されなかった。ある報告は、雄 ウシの精子の分画は僅かに富化されたがウサギの精子は富化されなかったと主張 した（Ｓｃｈｔｌｌｉｎｇ、１９７１；　Ｂｒａｎｄｒｉｆｆら、１９８６）。 ＤＮＡの差異により与えられる表面電荷密度に基づき分離しようとする試みもま た、一致した結果を見ず（ＨａｆｓおよびＢｏｙｄ、　１９７１）、あるいは議 論の的であるキナクリン染色に基づいていた（Ｇａｒｎｅｒ、　１９８４）＋ この失敗の他の理由は、精子の頭部、尾部、および原形質膜、その他の細胞物質 、およびその高度に密集した核が全て、Ｘ精子とＹ精子の間の小さなりＮＡ含有 量の相違をマスクするように働くことであり得る。このマスク効果の証拠の幾つ かは、サイトメトリーによる分離が、全精子には適さないが、裸出した精子核の 富化された亜集団の調製には有用であったという事実である。この方法を用いて 、精子の核はまず、膜および全精子の他の物質から分離される。次にこれらは、 染色され、フローサイトメーターを用いて部分に選別される（Ｊｏｈｎｓｏｎお よびＰｉｎｋｅｌ、　１９８６）ｏ　この結果、ＸおよびＹ染色体の富化された 核の、亜集団が得られた。 研究者らはまた１、このサイトメトリー技術を、全精子（富化されていない精子 集団）からＸおよびＹ精子を分離する様々な試みの結果の試験にも用いたａ　Ｌ ａｖｒｅｎｅｅ　Ｌｔｖｅｒ＋＋ｏｒｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔ、 ｏｒｙおよびＯｋｌａｈｏｍａ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｔｔｙは、前述の 「富化」方法の幾つかについて、比較研究を行った（Ｐｉｎｋｓｌら、　１９８ ５）。かれらは、還流一対同流一刺激（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｃ。 ｐｎｔｅｒｓｔｒｅａ＋ａｉｎｇ−ｇｌａｖａｎｔｚａｔ　ｆｉｏｎ＞、アルブ ミン密度勾配、密度勾配、電気移動度、および抗Ｈ−Ｙ抗体により分離した精子 を分析した。その結果は、［何れの場合も、どの精子集団の富化も観察されなか った。」　（前述、第１３０りこの発見は、他の試みられた富化、即ちアルブミ ン密度勾配（Ｂｒａｎｄｒ　ｉｆｆら、　１９８６）およびモノクローナル抗ト Ｙ抗体（Ｉ（ｏｐｐｅおよびＫｏｏ、１９８４）の研究と一致している。 これまでに調製された、精子表面抗原に対するモノクローナル抗体もまた、Ｘお よびＹ精子を区別しない。それらはＸ精子およびＹ精子の両者に結合し、両方の 型の精子細胞を不活化または不動化する（Ｓｃｈｍｅｌｌら、　１９８２および Ｐｅｔｅｒｓｏｎら。 １９８１）。モノクローナル抗体は、それが精子の光体、頭部、中変部、または 尾部の何れに結合Ｉ２ても、精子−非結合を阻害するように見える。さらに、特 に中片部または尾部に結合する抗体もまた、精子細胞を不動化することが観察さ れた。（授精能力を阻害する抗体に関する総説としては、Ａｌｅｘａｎｄｅｒお よびＡｎｄｅｒｓｏｎ、　１．９８７を参照のこと）。 本発明以前に、Ｘ精子またはＹ精子の何れかの富化された細胞並集団を単離し得 たかどうかは知られていなかった。また、これらの富化された亜集団の原形質膜 が、例えばタンパク質、糖タンパク質、またはりボタンバク質のような特有の性 選択性の構成成分を含有するかどうかも知られていなかった。 これらの失敗に照らして、我々は精子の分離のための可能な手段として、、精子 細胞表面に注目することに決心した。性分離しない哺乳動物の精子の細胞膜に関 する研究により、膜上に１０００個をこえるタンパク質が存在することが示され た。 例えば、Ｎｏ１ａｎｄら、　（１９８３および１９８４）：　（Ｒｕｓｓｅｌｌ ら、１９８３）：　（Ｂｒａｄｌｅｙら、　１９８１）；および（ｌｕｇｈｅｓ およびＡｕｇｕｓｔ、　１９８１およびＣｒ１ｅｈｔｏｎおよびＣｏｈｅｎ、　 １９８３）を参照のこと。これら全ての研究は、ＸおよびＹ精子の両方の混合さ れた膜を用いた。従って、かれらはＸ精子富化された亜集団に特徴的な、膜およ び構成成分と、Ｙ精子富化された亜集団のそれとの間を、区別しなかった。その 結果、これまでだれも、Ｘ精子またはＹ精子の膜を分析して、ＸまたはＹ精子の 富化された全細胞の有用な量を得、哺乳動物精子の性染色体関連膜タンパク質を 同定し、またはこのようなタンパク質を単離することはできなかった。 及五二斐１ 本発明の目的は、哺乳動物の子が所望の性を有するか、または特定の性染色体に 関連する形質の遺伝子を有する確率を、増大させる方法を提供することである。 本発明は、ワクチンとして、および抗体製造に有用であり、それ自身避妊薬とし て、あるいはＸまたはＹ精子の富化された精子試料を提供するために有用である 、性関連膜（ＳＡＭ）タンパク質を提供することにより、この目的を達成する。 本発明はまた、ＤＮＡ含有量に基づき精子を分離する方法を提供する。この方法 は、細胞をフローサイトメトリーにより分離することを包含し、このサイトメー ターは、微小な蛍光の差異を認職する能力が実質的に高まるように改善されてい る。この方法で分離された精子細胞集団は、ＸおよびＹ精子の富化された亜集団 となっている。これらの富化された亜集団から膜を単離することにより、本発明 の他の局面、即ちＸおよびＹの富化された精子原形質膜小胞が得られる。 本発明はまた、精製された実質的に純粋な性関連膜（ＳＡＭ）タンパク質を提供 する。これらのタンパク質は、富化された精子原形質膜小胞から膜タンパク質を 分離する場合、ＳＡＭタンパク質は他方のプロフィールよりも一方のプロフィー ルでより強い点で特徴付けられる。従って、ＳＡＭタンパク質は、ＸおよびＹ精 子を互いに他から区別する。 本発明のＳＡＭタンパク質は、雌をＸ精子、Ｙ精子または両方に対して免疫し、 それによりある性の子の確率を増大させるか、または両性の授精能力を減少させ るために使用され得る。 ＳＡＭタンパク質は、本発明の他の局面、即ち、ＸおよびＹ−３ＡＭタンパク質 に、従ってＸまたはＹ精子に選択的に結合するモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体を調製するために有用である。これらの抗体は、ＹまたはＸ精子に富む 精子試料を製造するために使用され得る。ＸまたはＹ−８Ａ、Ｍタンパク質に対 する抗体と共にインキュベートすると、抗体はそれぞれＸまたはＹ精子に結合し て不活化し、これらが卵子に授精するのが防止される（Ａｌｅｘａｎｄｅｒおよ びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９８７）。抗体に結合しなかった精子細胞は、活発で、 卵に授精する活性を残している。従って、本発明は、子が所望の性を有するかま たは性染色体に関連した形質の遺伝子を有する確率を、増大させることが可能な 、活性なＸまたはＹ精子に富む精子試料を製造する方法を、初めて提供する。 ＳＡＭタンパク質は、試料の抗ＳＡＮ抗体の存在を検出するためにも使用され得 る。 本発明の抗体は、人工授精法に特に有用である。本発明のこの実施態様を行うた めには、人工授精に使用される生存精子試料を、本発明の性選択的抗体調製物に インビトロまたはインビボで混合する。得られる試料はＸまたはＹ精子につぃて 富化されている。次にこの試料を、通常の方法で人工授精に使用する。 本発明の抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、精子を新 規なＸおよびＹ′Ｐ！子含有亜集団に分離するために使用し得る。これらの精製 された亜集団は、次に、所望の性の子を生むための授精に使用される。 本発明のＳＡＭタンパク質に結合する抗体はまた、精子を抗Ｘおよび抗Ｙ精子抗 体の両者に接触させることにより、避妊薬としても使用し得る。 良五ユ１旦鼠笠ユ ここに記載の発明をさらに充分に理解し得るために、以下に詳細な説明を述べる 。 本明細書において、用語「タンパク質」は、糖タンパク質、リポタンパク質、お よびリンタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド、ならびにこれらの分子の 複合体を含むことを意味する。 用語「精製された」は、少なくともここに記載の１−Ｄゲルにより得られるのと 同じくらい純粋なタンパク質を意味する。 用語「実質的に純粋な」は、少なくともここに記載の２−Ｄゲルにより得られる のと同じくらい純粋なタンパク質を意味する。 本発明は、精製され、または実質的に純粋な性関連膜（「ＳＡＭＪ）タンパク質 を提供する。ＳＡＭタンパク質は、Ｘ精子およびＹ精子の膜上に、それぞれ異な って存在することにより特徴付けられる。本発明のＳＡＭタンパク質は、ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定される分子量（ＭＷ） 、および固定化ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧ）により決定される等電点（ｐＩ）により 特徴付けられる。本発明のＳＡＭタンパク質は、以下の工程を包含する方法によ り、最初に確認される。即ち、 （ａ）　哺乳動物の精子を、Ｘ精子およびＹ精子について富化された亜集団に選 別する工程； （ｂ）これらの富化された亜集団から原形質膜を分離する工程；および （ｃ）全精子からの原形質膜タンパク質、該Ｘ富化された精子亜集団からの原形 質膜タンパク質、および該Ｙ富化された精子亜集団からの原形質膜タンパク質の 間で、２次元ＩＰＧ−ＳＤＳ／ＰＡＧＥの対応する位置に存在するタンパク質の 相対量を比較することにより、該富化された亜集団の原形質膜タンパク質のなか からＸおよびＹ性関連膜タンパク質を確認する工程。 より好ましくは、本発明のＳＡＭタンパク質は、Ｘ富化された精子の亜集団およ びＹ富化された精子の亜集団で示される原形質膜タンパク質の、２次元ＩＰＧ− ＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィールの対応する位置にあるタンパク質の相対量を比較 することにより、最初に確認される。このような２次元ゲルは、その結果、実質 的に純粋なＳＡＭタンパク質が単離されるので、好適である。タンパク質は２つ の特徴、即ち分子量およびｐ■に基づいて分離する。１次元ゲルはタンパク質を 単一の特徴、即ち分子量またはｐＩに基づいて分離する。しかＩｌ、例えば、Ｓ ＤＳ／ＰＡＧＥプロフィール（これは分子量のみによりタンパク質を分離する） またはＩＰＧプロフィール（これはｐＩに基づきタンパク質を分離する）のよう な、１次元ゲルもまた。５本発明のＳＡＭタンパク質を最初に確認するために有 用である。ノーＤゲルにより、このよ）にし、て確認されたタンパク質バンドは 、精製され；ＡＳＡＭタンパク質を含有するが、同一の分子量を有する他のタン パク質も僅かに含有し、得る。このバンドのタンパク質は、免疫源として直接使 用し得る。これはまた、通常のタンパク質精製技術を用いでさらに精製し得る。 このあまり好ましくないＳＤＳ／ＰＡＧＥ選別において、本発明のＸ、−３ＡＭ タンパク質は、全精子から調製された原形質膜タンパク質およびＹ富化された精 子並集団から調製された原形質膜タンパク質の対応するバンドと比較して、Ｘ富 化された精子並集団から調製された原形質膜タンパク質でより強いバンド密度を 示す点で、特徴付けられる。同様に、本発明のこの局面において調製される本発 明のＹ−ＳＡＭタンパク質は、全精子から調製された原形質膜タンパク質および Ｘ富化された精子並集団から調製された原形質膜タンパク質の対応するバンドと 比較して、Ｙ富化された精子並集団から調製された原形質膜タンパク質でより強 いバンド密度を示す点で、特徴付けられる。 より好ましくは、本発明のＸＸ−３ＡおよびＹ−３ＡＭタンパク質は、２次元Ｉ ＰＣ−ＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィールにより、上記の相対的に高いスボ／）・密 度を示す。 本発明のＳＡＭタンパク質を上記のようにして最初に確認した後、最初に確認さ れたＳＡＭタンパク質の分子量、ｐＩ、または他の物理的、化学的または生物学 的特性を用いて全精子の原形質膜タンパク質から、これらのタンパク質を大量に 単離し得る。従って、本発明の重要な局面は、精子を富化されたＸおよびＹ亜果 団に選別するという、時間のかかる工程は、本発明のＳＡＭタンパク質の最初の 確認のためにのみ行われる必要があることである。 富化されない精子集団から、または富化された精子集団から前述のように単離し たＳＡＭタンパク質は、本発明に従い様々な様式で用いられ得る。例えばこれら を、雌に接種してＸまたはＹ精子または同者に対して免疫するために使用し２得 る。 また、これらは、よく知られた常法によりポリクローナルまたはモノクローナル の何れかの抗体を作成するために使用し得る。さらに、ＳＡＭタンパク質は、試 料中の抗ＳＡＭ抗体の存在を検出するためにも使用し得る。このことは、授精不 能の診断にを用であり得る。 これらの方法で製造される新規な抗体は、ＸまたはＹ精子の何れかの原形質膜上 のタンパク質に、選択的に結合する。 従って、これらは精子を改変して、それから生まれる子の性を予め選択するのに 有用である。例えば、本発明の新規な抗体は、インビボまたはインビトロでＸ精 子またはＹ精子に結合させることにより、哺乳動物の子の性を選別するために使 用し得る。これらの抗体は人工授精およびインビトロでの授精に、特に有用であ る。これらの抗体は、ＸまたはＹ−３ＡＭタンパク質または全精子中のＸまたは Ｙ精子を、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより精製するのにも有用 である。 本発明は、広範囲の種に適用可能である。例えば、商業上重要な哺乳動物種・・ ・ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、およびヒツジに適用可能である。さらにヒト にも適用できる。 これらの種のそれぞれで、Ｘ精子およびＹ精子の間のＤＮＡ含有量の差は１％よ りも大きい。従って、本発明に記載のように、これらの種の各々からの精子を処 置し得る。各々の場合、細胞は、ＸおよびＹ精子に富む亜集団、確認され単離さ れたこれらの富化された亜集団の原形質膜、および、より好ましくは、これらの 確認され単離された亜集団の原形質膜からの各々のＳＡＭタンパク質に選別され 得る。次に、これらのタンパク質は、性選択および性予測法、および本発明の組 成物に使用される、性特異的な抗体を製造するために使用され得る。 本発明のＳＡ、Ｍタンパク質もまた、発現される状態でＳＡＭをコードするＤＮ Ａ配列を単離するのにも有用である。例えば、ＳＡＭタンパク質の部分アミノ酸 配列を決定し得る。 次に、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をプローブとして合成する。次に、 ＳＡＭタンパク質を産生ずる細胞から、ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを構築 する。次に、当該分野によく知られた方法により、ＤＮＡプローブを用いてｃＤ ＮＡライブリーを探索する。プローブにノ・イブリダイズするｃ　ＤＮＡを含有 するクローンを単離した後、ＳＡＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を同定 する。このことは、例えば真核細胞の発現系でｃＤＮＡを発現させ、抗ＳＡ、Ｍ タンパク質抗体に結合するタンパク質を産生ずるクローンを確認することにより 、行われる。 本明細書で特に例示されている、本発明の特定の実施態様において、我々は雄ウ シの精液を用いた。雄ウシの精液の、Ｘ精子とＹ精子との間のＤＮＡ含有量の相 違は、約４％である。この精液の精子を、Ｘ精子またはＹ精子のいずれかについ て６８％以上に富化された亜集団に選別した。次にこれらの富化された亜集団の 原形質膜を調製し、それらの中の性特異的成分を確認した。これらの結果を実施 例２に記載する。 我々はまた本発明の方法を、本明細書により詳細に記載されているように、他の 種、即ちチンチラの、Ｘ精子またはＹ精子の富化された精子並集団の原形質膜タ ンパク質およびその成分を同定した。この種では、ＸＸ−３Ａタンパク質は、５ ＤＳ−ＰＡＧＥで３３ｋＤ、　３９ｋＤおよび５３ｋＤの分子量を有する。 Ｙ−３ＡＭタンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで１７ｋＤ、３１ｋＤ。 ３６ｋＤ、　４１ｋＤ％４２ｋＤおよび５７ｋＤの分子量を有する。 本発明の実施をより容易にするために、以下の詳細な指示および実験結果を述べ る。 ｍ　フローサイトメトリーによる　の　別フローサイトメーターを用いて哺乳動 物の精子を選別し、ＸおよびＹ精子について富化された生存細胞の分画または亜 集団を得るために、以前知られていなかった装置および方法を用いた。我々はこ のような方法の一つの実施例をここに記載する。 フローサイトメ−−の　９と一 端子の選別を行うために、市販のフローサイトメーターを改造した。　Ｅｐｉｃ ｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｆｉｅｓ、Ｈ ｉａｌｅａｈ、　ＦＩｏｒｉ、ｄａから市販されているエビツクスフ５２型フロ ーサイトメーターに、特定の改変を施した。しかし、他のフローサイトメーター に対しても同様の改変を行い得る。一般にフローサイトメーターは以下のように 操作する。 フローサイトメーターは、外側のシース液に取り囲まれる懸濁細胞の試料流を、 レーザーを用いて調べる。ＤＮＡ分析のためには、紫外レーザー励起光に応答し 、ＤＮＡ＠に比例した蛍光を発する色素に細胞を結合させる。レーザービームと 試料流の両方に対して直角に配置された光電子増倍管が、この光を受容する。検 出されたＤＮＡの量により、フローサイトメーターの選別能力を用いて細胞を３ つの容器（ｘＳｙまたは廃棄）の一つへ分別し得る。この操作中、超音波振動が 試料流を、各々が個別の単一細胞を含有する個別の小滴に分裂させている。小滴 は細胞のＤＮＡ含有量に基づいて荷電され、電場により偏向させられ適切な容器 に入る。この装置は１０．０００細胞／秒までの速度で細胞を分析し選別するこ とができる。 たわみが起こらない様に２重に重ねた固定された強固なチューブ性円筒状の枠の テーブルに装置を載せることにより、７５２型フローサイトメーターを７Ｈｚ以 上の振動から防いだ。 さらに、選別の間、連続的にシース液を脱気することにより、フローサイトメー ターの分解能を改善した。このことは、ＨＰＬＣの脱気のために設計されたテフ ロンチューブを延ばして、圧力をかけたシース液を通過させることにより、達成 された。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２　Ｄ　Ｎ　Ａ染料中に懸濁した細胞を、試 料流のコア号イズを減少させるために最小圧を用いてシース液中に導入した。先 端が左右対照に斜めに切られ２０６に研磨された試料導入チューブを用いた。チ ューブは、平坦面がレーザービームの長軸に垂直であるリボン状の試料流をつく りだす（Ｓｔｏｖｅｌら、　１９７８を参照）。この幾何学的位置では、生存精 子はそれ自身、その平坦面がレーザー照射に垂直になり、それゆえ分解能が改善 されるように配向させられている。 ７５２型フローサイトメーターの電気系に対してもまた様々な改造および調整を 行った：　ＰＭＴ　（光電子増倍管）に印加する電圧は、低ノイズ性の金属フィ ルム抵抗器の抵抗性電圧分割ネットワークを用いてかけた。信号は、同軸ケーブ ルから、超高速、広い出力バンド幅、低ノイズおよび高い直線性の特性を有する オペアンプを用いて、電流から電圧に変換した。 目的のために我々は高速フーリエ変換型（１０２４チヤンネル）の信号を用いた 。ＸまたはＹ精子に伴い発生する／（ルスの周波数を−まとめにするローパスフ ィルター（Ｉ　ＭＨｚ）およびバイパスフィルター（１００ＫＨ２）を用いた。 ＤＮＡを表す信号は、次に、能動的に濾過し、１０ビツトのアナログからデジタ ルへの変換（ＡＤＣ）の前に増幅した。全てのフィルターおよび増幅抵抗器は、 使用する周波数帯域で直線性を試験しである低ノイズの金属フィルムである。増 幅ゲインを１０または２０の値に設定し、ＰＭＴＩＩ圧を検知信号をＡＤＣの上 部チャンネルで検出するように設定した。 また、フローサイトメーターに対して様々な光学的な改造および調整を行った。 試験微粒子（Ｅｐｉｃｓ　Ｇｒａｄｅ　［フルブライト粒子、ＣＶ＜１）を使用 してレーザーを基本横発振モード（ＴＥＭｏ。）または発散ビームに調整した。 調整を行った後、レーザーはソーティングに使用する出力（３００〜４００　ｍ Ｗ）でＴＥＭ。。において最大化および光軸調整された。光軸調整は、まず、光 軸調整の目標物がＰＭＴに通じるピンホールと水平方向に調整されていることの 確認に糸を使用することから始めた。共焦点光学系（Ｅｐｉｃｓ）およびその他 の光路構成部品を、参照点として働くレーザーと共に設置した。３５１．　ｎｍ のレーザー励起光により生じる微粒子の蛍光を、Ｓ／Ｎ比１０００以上の２枚の ４０８ｎｍの長波長透過フィルターを含む完全遮光の光路を通して探知した。１ ０００より大きい信号対ノイズ比を得た。微粒子より変動係数（ＣＶ）を１％以 下に調整した。これらの改造の結果、信号対ノイズ比を１０００：　１に改善す ることができた。 本発明のこの好適な実施態様においてはまた以下のことを行った。指示書に従っ て低性能のレーザーに交換した。キャリブレーション（補正）およびソーティン グ前に４時間のウオーミングアツプを行った。フローサイトメーターの操作番マ 温度を２０°Ｃに保った黒い壁と薄暗い光の部屋で行った。また、フローチャン バーを通流する機械ファンから生じる空気流を遮断した。 以下の改良を行うことにより、ＸおよびＹ精子のピークを検知することが可能で あり、従って２つの集団ζこ選別することが可能であった：　（１）少なくとも １００：　１の信号対ノイズ比；　（２）各細胞に対し少なくとも９０＋＊Ｗの レーザー出力；　（３）少なくとも８％のＰＭＴ量子収率；および（４）同じ配 向に調整された細胞。しかし信号対ノイズ比が少なくとも１．０００：１；各細 胞へのレーザー出力が少なくとも１６０　ｍ　Ｗ　；およびＰＭＴ量子効率が少 なくとも２０％である場合に最良結果が得られる。 １王立且盃 新しく射精された哺乳動物の精液を、採取の直後に等張のＰＢＳで１５ｍ１に希 釈し、５℃にゆっくりと冷やした。この温度で、精子を、フェニルメチルスルホ ニルフルオリド（ＰＭ、ＳＦ）で飽和した、等張のｐｌｉ７．２のトリスメチル アミノメタン緩衝化生理食塩水（Ｔ　Ｂ　Ｓ）および１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃ ｈｓｔＮｏ、３３３４２ビスベンズイミド色素で３回洗浄した。この溶液で細胞 を染色し、同時に酵素的分解を阻害した。精液プラズマタンパク質を除去するた めに、細胞を４８３Ｘｇで２０分間遠心し、再懸濁した。次に、洗浄した細胞を ２０Ｘ　１０’細胞／ｌｌの細胞濃度となるように染料溶液に懸濁し、少なくと も２時間染色した。　（Ａｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎら、１９７７を参照、　）　Ｂ ｏｅｃｈｓｔ染料は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃａｒｐ、、　 Ｓａｎ　Ｄｔｅｇｏ、　Ｃａ１ｔｆｏｒｎｉａから入手可能である。シース液は 、染料を除いた以外は精子の洗浄に使用した溶液と同じやり方で調製した。前述 の様に液からガスを抜いた。シース液と試料液の屈折率を合わせることが目的で あった。 １玉旦Ｕ 上記のように改造し調整した７５２型フローサイトメーターを使用して、精子を 選別した。精子を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料を用いて測定した全ＤＮＡ含有量に基づ いて選別した。Ｘ精子は全ＤＮＡ含有量がＹ精子よりも多い。雄ウシ、雄ブタ、 雄ヒツジおよび他の大きな哺乳動物に由来するＸおよびＹ精子から生じた蛍光ピ ークの平均は、典型的には３％よりも大きな値で分離される。ＴＢＳ／ＰＭＳＦ ／染料の溶液中に調製された全精子を、最大−秒当り１０．　Ｃｏｏ細胞までの 速度で分析した。サイトメーターで分けられたこれらの細胞を、Ｘ富化、Ｙ富化 または廃棄集団に選別した。Ｘ富化およびＹ富化集団は毎秒１００から５００細 胞の速度で捕収した。同時に通過した細胞は除外した。選別に用いられる実際の 流速は、機械の状態に依存し、分解能を改善するのには流速の減少が必要である 。我々は流速を、ＤＮＡヒストグラムにＸおよびＹビークへの分割の開始を示す 平坦部が見られるまで調節した。最適なシース液対試料液の流量比をわずかに２ ｍｍＨｇというピンチオフよりも大きい差圧で設定した。選別ゲートは、配向さ せられたＸ染色体を有する精子およびＹ染色体を有する精子を示す、ＤＮＡヒス トグラムの外側から１／３に含まれる細胞のみが採集されるように設定した。同 時通過補正回路は、選別の間中作動するのが好ましい。 このようにして、それぞれＸまたはＹ精子の富化された２つの生存並集団を、同 時に集めた。各々の亜集団は少なくとも６８％富化されていた。７２％まで富化 されたＹ精子の亜集団も得ることができた。このような濃縮は、本発明の目的に 充分であり、次に記載するように、新規な富化された原形質膜小胞および米発明 のＳＡＭタンパク質の、単離と確認に用いられた。選別された細胞は１ｍｌ当り それぞれ約３００，０００細胞を含有し、選別には約３０分間必要であった。毎 週およそ２０Ｘ１０’細胞を果めることができた。 夾上皇」−・な５　ハの 実施例１のＸ精子またはＹ精子の富化された細胞並集団を用いて、原形質膜小胞 （ＰＭＶ）、およびＸおよびＹ富化された非膜性精子成分を単離した。 富化されたＸ精子またはＹ精子を含有する亜集団を含有する細胞試料を、パール 　ボンベにキャビテートした。ｆｉＪな試料の量は、ｓｏ、　ｏｏｏからｓｏｏ 、ｏｏｏ細胞細胞７壱ｌむ３から１０ｍ１テあった。富化しない精子試料（Ｘお よびＹ精子の５０：５０混合物）もキャビテートした。キャビテート法（約８５ ０　ｐｓｉ）はＧ１１ｌｉＳら、　１９７ｇの記載により行った。精子頭部、尾 部および他の部位から、大部分（例えば８０％（ブタ精子のデータ））が頭部原 形質膜からなり、いくらかが（例えば２０％（ブタ精子のデータ））が尾部の原 形質膜からなる原形質膜小胞を、Ｚ５０ＱＸｇで３０分間、２回遠心分離してベ レット化することにより分離した。 ＰＭＶ物質を含有する上清を取り、１００，０ＯＯｘ　ｇで遠心分離してＰＭＶ 物質を得、これを再懸濁して、１０ｍＭ１−ＩＪス酢酸（ｐＨ５，５）で洗浄し た。これにより、単離したＰＭＶから大部分のＴＢＳ／ＰＭＳＦ／染色を除去し た。この方法を用いて、３つの原形質膜小胞集団、即ち、（１）Ｘ富化精子原形 質膜小胞（ＰＭＶ−Ｘ）　（約６８％がＸ精子）　；　（２）　Ｙ富化原形質膜 小胞（ＰＭＶ−Ｙ）　（約７２％がＹ精子）および（３）富化されない原形質膜 小胞（ＰＭＩ／−Ｘ／Ｙ）　（約等量のＸおよびＹ精子）を得た。ＸおよびＹ富 化精子の遠心分離により、ＸおよびＹ富化された非膜性の精子成分が、ベレット 化された物質として得られる。 富化されたＰＭＶおよび富化された非膜性の精子成分は、ＸまたはＹ精子に優勢 に存在する一連の性関連分子を確認するために使用され得る。これには、Ｘおよ びＹ−３ＡＭタンパク質、および他のＳＡＭ分子（例えば脂質および炭水化物） 、およびＸおよびＹの非膜性の性関連分子（例えば細胞貫タンパク質または他の 分子）が含まれる。これらの分子は、我々がＳＡＭタンパク質の確認のために記 載するのと同様の技術を用いて確認される。 ！ＪＪ！！［１−ＤゲルにょるＳＡＭタンパク　の確招実施例２のＰＭＶ−Ｘお よびＰＭＶ−Ｙを用いて、１−ＤゲルによりＸＸ−３ＡおよびＹ−３ＡＭタンパ ク質を確認した。まず初めに、ＰＭＶ−ＸおよびＰＭＶ−Ｙを２％ＳＯＳに可溶 化し、クロラミンＴを用いて１２５Ｉラベルした（Ｓｔａｎｌｅｙら。 １９７１；　Ｆｒｏｓｔ。１９７７）。タンパク質をレムリのＳＤＳ／ＰＡＧＥ 　（５％−１５％Ｔ；５％Ｃ）により分離した。比較のため、単一ゲル上にそれ ぞれ、ＰＭＶ−Ｘ、　Ｐ、ＭＶ−Ｙおよび分子量標準の３つのレーンを流した。 電気泳動け、ゲルをスタックする間１００Ｖで一定／水冷下でゲル分離の間１２ ５ｖで一定にして行った。 ＸおよびＹのオートラジオグラフィーのプロフィール（１週間後）は、一方のプ ロフィールにバンドを観察し、それを他のプロフィールの対応する位置と比較し て密度の増加または減少を見ることにより、比較した。Ｘプロフィールのバンド の密度がＹプロフィールに比較して高い場合、そのバンドをＸＸ−３Ａタンパク 質と呼んだ。バンドの密度がＹプロフィールで高く、Ｘプロフィールで低い場合 には、Ｙ−３ＡＭタンパク質と呼んだ。内部コントａ−ルとして、バンドの密度 をＸ／Ｙプロフィール（ＰＭＶ−Ｘ／Ｙから調製）の対応するバンドの密度とも 比較した。このバンドは、ＸおよびＹ−８ＡＭタンパク質のバンドと比較して中 間の密度であるはずである。次に、確認したＳＡＭタンパク質の分子量を見当付 けるためにＳＡＭと呼ばれるタンパク質バンドをオートラジオグラフィーで、分 子量標準と比較した。 銀染色を用いて同様の比較ゲルを行い、様々なタンパク質を同定した。再び、Ｘ ％　ＹおよびＸ／Ｙプロフィールの中で比較することにより、本発明のＳＡＭタ ンパク質を確認した。 ＰＭＶ−Ｘ、ＰＭＶ−ＹおよびＰＭＶ−ＸＹのタンパク質が分離された様々なゲ ルを比較する場合、分子ｔＷ準は重要である。分子量標準は、他のゲルの対応す る分子量標準とオーバーラツプするように並べられる。これを比較の基礎として 、所望のＳＡＭタンパク質をゲルプロフィール上の他のバンドに比較して、位置 、色、および染色密度により視覚的に確認し得る。 このゲルを比較する能力のために、本発明のＸおよびＹ−３ＡＭタンパク質が富 化精子集団から原形質膜タンパク質のゲル上で一度同定されたなら、その分子量 は、全（非富化）精子からの原形質膜タンパク質のゲル上でＸおよびＹ−３ＡＭ タンパク質を同定するのに用いられ得る。 本発明の重要な寄与は、最初に、特異的ＳＡＭタンパク質を同定するために、細 胞の分別および成分の富化を唯一度だけ行えば足りることである。続いて、ＳＡ 、Ｍタンパク質それ自身のゲル上の特徴が、さらなる研究と使用のためにこれら のタンパク質を多量に確認および単離するのに用いられ得る。 次に、以下の方法の一つにより、ＰＭＶ−ＸおよびＰＭＶ〜ＹからＳＡＭタンパ ク質を単離し得る。第一の方法では、ＰＭＶ−ＸおよびＰ　Ｍ　Ｖ　−Ｙ　ノＳ ＤＳ／ＰＡＧＥプロフィール（レムリ、　１９７０）は銀染色（Ｗｒａｙら、　 １９８１＞されて並列して流される。 第二の方法では、可溶化したＸおよびＹ原形質膜タンパク質をクロラミンＴを用 いて１２Ｊヨウド化しく５ｔａｎｌｅｙおよびＨａｓｌａｍ、　１９７１）、同 様のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィールをロードして分離したタンパク質のオートラ ジオグラフを得る。何れの場合にも、ＳＡＭタンパク質は実施例４の記載に従っ て単離する。 ！　１−Ｄゲルによ　釈された ウシＳＡＭタンパク ウシ精子由来のＳＡＭタンパク質を含有するバンドを１−Ｄゲルにより確認した 。前述のようにウシ精子を処理し、ＸおよびＹ富化精子原形質膜からＳＤＳ／Ｐ ＡＧＥによりタンパク質を分離し、そして一方の密度が他に対して高いバンドの 分子量を測定した。ＸＸ−５Ａを含有する１９ｋＤ、　２５ｋＤ、　２９ｋＤ、 　３２ｋＤ。 ３９ｋＤ、　７２ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量のバンドが見いだされた。Ｙ− ８ＡＭを含有する１５ｋＤ、　４５ｋＤ、５７ｋＤ、　６４ｋＤおよび１２５ｋ Ｄの分子量のバンドが見いだされた。 この方法は、実際にＳＡＭタンパク質を含有するバンドを確認し、これらゲル上 のバンドを切り出すことにより、精製されたＳＡＭタンパク質を単離可能である が、ＳＡＭタンパク質の分子量を正確に測定するには好ましい方法ではない。 この系は分子量標準偏差が４．２％であり、いくつかのバンドは僅かに分子量の 異なる１つ以上のＳＡＭタンパク質を含有し得る。 それにもかかわらず、本発明の目的のためには、分子量のみにより確認されたＳ ＡＭバンド（実施例３）が唯一のタンパク質を含むかどうかを決めることは本質 的ではない。ある与えられたバンドのタンパク質をさらに分離または特徴付ける ことなく、精製されたＳＡＭタンパク質を含有するこのバンドを直接に、Ｘまた はＹ精子に選択的に結合する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を調 製するために使用し得る。これらの抗体は、子が所望の性を有する確率を増大さ せるための本発明の方法および組成物に使用し得る。使用される方法は以下の述 べる。 支１興旦　２−ＤゲルによるＳＡＭタンノくり　の確男実施例３に記載されたＳ ＤＳ／ＰＡＧＥゲルは本発明のＳＡＭタンパク質を確認し、これらのタンパク質 を分子量により特徴付けることが可能であるが、好ましくは、ＳＡＭタンパク質 を確認し特徴付け、そして実質的に純粋なＳＡＭタンパク質を単離するために２ 次元ＩＰＧ−ＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いる。２次元ゲル分析は、タンパク質がまず 初めに、その総電荷により１次元分離され、次に、分子量により２次元に分離さ れる方法である。 ＸおよびＹ富化精子並集団から、および非富化精子からの原形質膜タンパク質に ついて、２−Ｄゲル電気泳動を行い、各々Ｘ、　ＹおよびＸ／Ｙプロフィールが 示された。 カセット型、再水和カセット、イモビリンＲ（アクリルアミド誘導体）　ｐＫ３ ．６．４．６．６．２．７．０．８．５．９．３、ＩＪＢ７　ンホリン（両性担 体）　３．５−１０、およびＩＪＢからのゲルバンドＰＡＧフィルムを含有する 垂直等電点電気泳動の装置を購入した。さらにＰｈａｒｍａｃｉａおよび５ｅｒ ｖａから、追加の両性電解質（３−１０）を購入した。アクリルアミドはＡｍｒ ｅｓｃｏから；　ビスはＦＭＣから；　ＳＤＳはＢＤＨから；尿素はＳｃｈｗａ ｒｚ／Ｍａｎｎから購入した。他の全ての化学物質はＳｉｇｍａから購入した。 本発明の好ましい２−Ｄゲル分離方法では、まず、全精子及び実施例２に従い単 離したＸおよびＹ富化精子並集団由来の可溶化された原形質膜小胞から開始した 。ＬＫＢ　２１１７　Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｌｌ　ｍ気泳動システム実験マニュア ルの指示に従い、注入される５、０％Ｔ、２．７％Ｃ５ｐＨ４，−１０の広範囲 のｐＨ勾配を有する０、５重量厚ＩＰＧゲルを処方した。５０°Ｃに加熱したオ ーブン中で１時間、ゲルを重合させた。重合の後、ゲルを型から取り出し、ＨＰ ＬＣ水で３０分間２回洗浄し、次に２．５％グリセロール溶液中で３０分間すす いだ。塵の無いキャビネット中で一晩、ゲルを空気乾燥した。電気泳動の前に８ Ｍ尿素、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５％（体積／体積）ノニ デットｐ−４０（ＮＰ−４０）、０．５％両両性体（ＣＡ）からなる溶液で［Ｐ Ｇゲルを再水和した。最良の可能なｐ■分布を保証するために、異なるブランド の両性担体（ＩＪＢアンホリン−ファルマレート８およびセルパライト”３−１ ０＞を使用した。使用した両性担体が、試料が電気泳動される範囲をおおう全ｐ ｉ範囲に広がることが重要である。塩基性イモビリンとの疎水性相互作用を減少 させるために、両性担体はゲルの再水和に含ませた。 ウシの原形質膜タンパク質は、９Ｍ尿素、２％（重量／体積）ＤＴＴ。 ２％（体積／体積）ＮＰ−４０，０，８％（体積／体積）両性担体を含む溶液に 可溶化した。可溶化を助けるため、水浴ソニケーター中で試料を４℃で１０分間 ソニケートした。残った凝集物を１３．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離によりベ レット化した。 可溶化した試料をアノード近くに予め形成しておいたウェルにロードした。アノ ライトおよびカンライトはそれぞれ、１０ｍＭリン酸および１０ｍＭ水酸化ナト リウムであった。電気泳動パラメーターは１７０ボルト、２ｍＡおよび１０００ ボルト時間まで５Ｗの後、ゲルに依存して１７００ボルトまで増加して、全体で ７０００ボルト時間であった。低い染色ボルトはタンパク質の入りを改善した。 ｐＨ勾配は、電気泳動直後に１ｃｍごとに、調節したＬＫＢ　ｐＨ表面電極で測 定した。 等電点電気泳動の後、ゲルを試料ウェルに対応する切片に切断した。切片を平衡 化緩衝液中でインキ一ベートし、これヲＳＤＳスラブゲルに直接ロードした。平 衡化は、　０．０５Ｍトリス１（Ｃ１ｐｌ（６，８，６Ｍ尿素、２％（重量／体 積）ＳＤＳ、１％（重量／体積）ＤＴＴ。 ３０％グリセロールおよび０．００１％ブロムフェノールブルーを含む８ｍｌの 溶液中で穏やかに振盪しながら室温で３０分間行った。平衡化の後、過剰の平衡 化緩衝液を除去するためにゲル切片を簡単にすすぎ、これを直接、４．８％Ｔ、 ２．７％Ｃのスタッカーを有する垂直な１１．０％Ｔ、２．７％Ｃ，１，５ｍｍ 厚ＳＤＳスラブゲルにロードした。タンパク質は１００ボルトで、色素先端がス タッカーまで動くまで電気泳動を行った。次に、電圧を１４０ボルトまで増加さ せ、残りの泳動を行った。 染色すると、これらの２−Ｄゲルには多くのスポットが出現した。内部標準を用 いて、これらのスポットの分子量およびｐｉミラ定した。バイオイメージスキャ ナー（Ｋｏｄａｋ）を用いてゲルのスポットの全体の強度を測定した。約３０個 のＸ／Ｙプロフィールから、および約３個のＸと約３個のＹプロフィールから、 スポットの総密度の平均を決定した。次に、各タンパク質スポットについて、Ｘ プロフィールの総密度の平均およびＹプロフィールの総密度の平均との差を計算 した。この差がＸ／Ｙプロフィールのタンパク質の平均縁強度から、少なくとも １．８標準偏差である場合に、タンパク質をＳＡＭタンパク質と呼んだ。 ＸＸ−５Ａタンパク質は、もちろん、Ｘプロフィールでより強く、ＸＸ−３Ａは Ｙプロフィールで強い。我々が同定したＳＡＭタンパク質を表１に示す。分子量 は４．２％以内で正しく、等電点は＋／−０，１６ｐＨ以内で正しい。このリス トは、ＳＡＭタンパク質の全クラスを示すことを意図していない。疑いなく、他 にも存在する。例えば、２−Ｄゲルを観察すると、一方のプロフィールに見られ るが他には見られない多くのスポットが明かであった。 ある場合には、スポットの非存在は、強度が検出感度の範囲以下であるタンパク 質を示している。明かに、当業者らは、ゲルに、より多くの試料をロードするか 、またはより感度の高い染色法を用いることにより、これらのタンパク質を可視 化し得る。次に、本発明で進歩した技術を用いて、これらの中にＳＡＭタンパク 質があることを確認し得る。 （以下余白） Ｊ−ユ ６２Ｊ　６．６４ ６３．９　５．８３ 以前から性関連であると主張されてきたトＹ抗原がＳＡＭタンパク質であるか否 かを決定するために、全精子原形質膜タンパク質を単離して、２−Ｄゲルについ ての記載に従いこれらを分離した。次に、Ｄｒ、　Ｇ、　Ｃ，Ｋｏｏが我々に贈 与して（れた抗トＹモノクローナル抗体を用いて、実施例９に記載のように免疫 プロットを行った。プロットにより、抗トＹモノクローナル抗体のｒ！！、ｍす るエピトープを有するタンパク質が８個明らかになった。これらのタンパク質に ついて分子量とｐｌを決定し、表２に示した。明かに、これらのタンパク質は、 表１でＳＡＭタンパク質であると確認したいずれとも合致しない。従って、■− Ｙ抗原は、本発明で定義される性関連膜タンパク質ではない。 長　ＩＩ ＊２−Ｄゲルで分離され、免疫プロットにより抗Ｈ−Ｙモノクローナル抗体に結 合する、ウシ精子原核質膜タン１＜り質夾亘ｍ　ゲルプロフィール止 全精子からタンパク質を単離することにより、本発明のＳＡＭタンパク質をより 大量に得る。 この方法の１つの実施態様においては、実施例３に記載したＰＭＶ−Ｘ、ＰＭＶ −ＹおよびＰＭＶ−ＸＹの１次元ＳＤＳ／Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅゲルを調製した。（あ るいは、実施例４に記載した２次元ゲルを用いる。）次に、ＰＭＶ−Ｘ／Ｙゲル からニトロセルロース（ＮＣ）シートにタンパク質のバンドヲトランスブロッテ イングによって移した。この方法においては、ゲルとＮＣシートとを互いに隣接 した位置に置き、その位置を維持して一定電流をかけ、ゲルからＮＣシートにタ ンノ４り質のバンドを全て移した。本発明の１つに実施態様において、ＳＤＳ／ ＰＡＧＥ　ＩＤゲルを用いるこの移動を、２５ｍＭ　Ｔｒｔｓ。 １９２ｍＭグリシン、および２０％メタノール（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９）中 で、２５０ｍＡの一定電流において、４℃で約１６時間行った。 ＮＣへの移動後、７％酢酸中の０．５％アミドブラックでそのバンドを染色した 。　（アミドブラックを用いる方法は、５ｃｈａｆｆｎｅｒら、（１９７３）に 記載されていて、この染料は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｎ＋ｆｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手可能である。）次に行うタンパ ク質からの抗血清あるいはハイブリドーマの調製を妨害しない理由から、アミノ ブラックの使用が好ましい。 ＩＤ　ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを用いる、本発明の１つの実施態様においては、動 物の免疫に用いられるＳＡＭタンパク質のバンドをＮＣシート上に確認するため に、実施例３に記載したように分子型別に分離したＳＡＭタンパク質のＳＤＳ／ ＰＡＧＥゲルプロフィールの銀染色を行ったもの（分子量の標準をともなう）に 、アミドブラック染色したトランスプロットされたＳＤＳ／ＰＡＧＥ　ＩＤプロ フィールの分子量の標準を、並べて置いた。分子量標準を並べ置くと、ＮＣシー ト上のアミドブラック染色されたタンパク質のバンドに対応して、ＳＤＳ／ＰＡ ＧＥゲル上の銀染色されたＳＡＭバンドが合致する。次に、ＳＡＭタンパク質に 対応するＮＣシート上のアミドブラック染色されたバンドをカミソリの刃を用い て切った。 我々は、この切り取ったバンドを、所望のＳＡＭタンパク質の単離、あるいはこ のタンパク質に対する抗体を調製するのに直接に用いた。例えば、１つに実施態 様において、切り取ったバンドは、抗体を生じさせるために外科的に埋め込まれ る。あるいは、これらのバンドのタンパク質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ Ｏ”）などの適当な溶媒で抽出し、そして試験動物に注射される。後者の方法が 好ましい。このような抽出には、１００μｌのＤＭＳＯでＮＣバンドを抽出する のが好ましい。次に、抗体を生じさせる動物に注射する前に、得られたＤＭＳＯ 溶液に１ｍｌのアジュバント（フロイントの完全アジュバント）を混合した。　 （好ましい実施態様は、１００μｍのアジュバントである。） イムノグロブリン分子の結合部位を分離する技術手段は、現在は入手可能である 。１つの例は、ＦａｂあるいはＦ（ａｂ’）２フラグメントを単離するキットが 、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１ｌｌｉｎ ｏｔｓから入手可能である。従って、我々が本明細書中で抗体を指す場合は、結 合部位のみを有するこのようなフラグメントを含めることを意味する。 支血匠ｌ　バイブ１ドーマおよびモノクローナル上記のように調製してプールし た１５０のＮＣ切片を用いて、数百のハイブリドーマを調製した。１９．０００ および２５．０００ダルトンのＸＸ−３Ａバンド、および５７．０００および６ ４．０００ダルトンのＹ−３ＡＭバンドのそれぞれ（＋／−５％）をまとめたく ウシ精子）。 ハイブリドーマの生産のために、アメリカンタイブカルチャーコレクシゴン（Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから得た非分ｌＢａ１ｂ／ｃマウス株Ｓ　Ｐ ２１０−ＡＧ　Ｉ　４を用いた。ミエローマ株としてＡＴＣＣＣＡ、Ｔ１５８１ −ＣＲＬ　（バッチ　Ｆ−５２８６）を用いた。細胞を１０％ＦＣ３／ＤＭＥＭ あるいはＲＰＭＩ−１６４０（後者が好ましい）中で培養して、０．２〜１．　 ＯＸ　１０８細胞／ｍｆに維持した。 我々は、実施例７に記載したようにＳＡＭ／ＤＭＳＯ／７ジーパント混合物を用 いてマウスを免疫した。マウス当たり２０〜２００μｇのタンパク質を用いた。 ２週間後、肺臓の採取および融合の４日前に、天然のＳＡＭタンパク質コンフィ グレーションに対する抗体を生産するＸあるいはＹ特異クローンを刺激するため に、１００〜１５０μｇ（７）ＰＭＶ−Ｘ／ＹあるいはＰＢＳ中のＩ　Ｘ　１． ０７全精子を皮下にブースト注射しまた。（全精子のＩＰ注射が好ましい。）痛 論のこと、マウスを免疫するのに他のプロトコールが朋いられ得るのは理解され るべきである。例えば、Ｓ　ＡＭ／ＤＭＳ　Ｏ／フロイントノ完全アジュバント 混合物によって上記のようにマウスを処理し、上記のように、ＰＢＳ中のＰＭＶ −ＸＹを４日間。 日に一度注射して、モして肺臓を採取し得る。 融合の一日前に、ミエローマ細胞を分割し、対数増殖期にあることを保証した。 融合の日に、動物を殺してＰ臓を摘出した。肺臓を無菌のＤＭＥＭあるいはＲＰ ＭＩ−１（ｚｔｏ　（後者が好ましい）ですすいで、それを肺細胞にわけた。ぐ 我々は、ここでは注射筒と針の潅流を用いてわけた。）１個の肺臓から回収され る細胞は、典型的にはｌＸｌ０”個である。 肺細胞をＤＭＥＭあるいはＲＰＭＩ　１６４０で３回洗浄した。 （後者が好ましい。）ミエローマ細胞もまた３回洗浄した。 肺細胞とミエローマ細胞とを計数し、肺細胞を７に対してミエローマ細胞を１の 割合で混合した。（一般的には１：］を用いる。）次に、１０００　ｒ　ｐ　ｍ 　（Ｍｉｓｔｒａｌ　３０００）で細胞を遠心し、上清をデカンテーションで除 いた。 １ｍｌのＰＥＧを加えて、穏やかに攪拌しながら１分間、融合を行った。（一般 的にはＰＥＧはｐＨ７に調整する。）２０ｍｌのＤＭＥＭ　（あるいは、好まし くはＲＰＭＩ　１６４０）で反応を停止し、前回と同様に混合物を遠心した。Ｄ ＭＥＭ（あるいは、好ましくはＲＰＭＩ　１６４０）をデカンテーションで取り 除き、融合細胞のベレットを１２ｍ１のＨＡＴ（ヒボキサンチン　アミノプテリ ン　チミジン）培地に、穏やかに再浮遊させ、２４ウエルプレートに細胞をまい た。 （ウェル当たり１ｒｎＸの細胞浮遊液）。（一般的にはＨＭＴ、ヒボキサンチン 　メトトレキセート　チミジンを用いる。）プレートを、７％ＣＯ２含有のイン キュベーター内で、−晩、インキュベートした。次の日、ウェルに１ｒｎｌのＨ ＡＴ　（あるいはＨＭＴ）培地を追加し、７〜１４日間そのままインキュベート した。ＨＡＴ　（ＨＭＴ）培地を取り除いて、１ｏ％ＦＣ３／ＤＭＥＭあるいは ＲＰＭＩに入れ換えた。（後者が好ましい。）コロニー形成が認められるまで、 プレートをインキュベートした。コロニーがより大きく広がってから、−７０℃ で凍結し、液体窒素で長期間保存した。 （１）ＥＬＩＳＡ　ア・１セイ 下記のように、ＥＬＩＳＡアッセイによって上清をスクリーニングした。０．０ ５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中のＰＭＶ−Ｘ／Ｙ　（２μｇ／ｍり１ ００μｌを加えて、４℃の加湿チャンバー内に１６〜１８時間（あるいは３７℃ のインキュベーター内に２〜４時間）置いて、９６ウエル　マイクロプレートを コートした。この炭酸−抗原溶液は、２〜３回プレートをブロックするのに用い 得る（次の使用まで一２０℃で保存し得る）。プレートを室温で３０分間インキ ュベートし、ウェル当たり１×１０５の精子細胞を加え、４℃の加湿チャンバー 内で一晩インキユベートした。　（抗原としては全細胞が好ましい。） ０．０２Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，２）中の０゜０５％Ｔｗｅｅｎ２ ０の２００μｌで、プレートを室温で３回洗浄した。ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅ ｅｎ中の３．０％ゼラチンの２００μｌで満たし、室温の加湿チャンバー内で３ ０分間インキ二ベートシ、そしてブロック溶液（ゼラチン−ＰＢＳ）を吸引除去 した。しかし、好ましくは、この工程を行わないで、そのかわり直ちに、正常動 物の上溝１００μｍ　（上記の免疫していないマウスあるいは培地由来の、陰性 コントロールとして）と免疫上清（希釈しないで）をプレートに加えて、３７° Ｃで１時間、加湿チャンバー内でインキユベートし、次に、上記のようにプレー ・トを洗浄した。次に、０．５％Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０で 適当に希釈した、パーオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ複合体の１００μ！を 各々のウェルに加え、３７°Ｃの加湿チャンバー内で１時間インキュベートし、 前回と同じようにプレートを洗浄した。ＴＭＢ　（３，３＋　、５．　５１　テ トラメチルベンザジン）／Ｈ２Ｏ２のｌ：２混合物の１００μｍを各々のウェル に加え、そのプレートを室温で６０分間インキュベートした。肉眼で発色を確認 するか、Ｂｅｃｌｖａｎ　Ｂｉｏｍｅｋ　１０００　ｒｏｂｏｔｉｃ　ａｒｍを 用いて６６０ｎｍで吸光度を確認した。 これらのアッセイでは、間接ＥＬＩＳＡでの陰性試料に対する高度に陽性な試料 の吸光度の読みの割合は、少なくとも５：１であるべきだと考えた。さらに、陰 性コントロールの平均よりも３標準偏差大きい全てのウェルを陽性とした。 陽性の細胞株を１ウエル当たり１細胞および３細胞に限外希釈してクローン化し た。各々のウェルを、ウェルの内容物をさらに大きいウェルに移し、最終的には フラスコに移して拡大した。１５０ｃｍ２のサイズのフラスコまで拡大して終上 記で行ったＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイで陽性であったハイブリドーマから得たモノ クローナル抗体について、本発明のＸＸ−３ＡおよびＹ−３ＡＭタンパク質に対 しての結合活゛性を分析した。　ＳＯ３／ＰＡＧＥタンパク質のバンドのあるニ トロセルロースシートを、上記のように、洗浄液（２０ｍＭＴ　ｒ　１５−ＨＣ ｌ　（ｐＨ８，２）、２０ｍＭ　アジ化ナトリウム、０．９％　ＮａＣｌおよび ０．　１％　ＢＳＡ）で３回（１回の洗浄当たり５分）洗浄した。　（ここでは 、０．８％　ＮａＣ１，，０，０２％　Ｎ２ＰＯ４，０，１４４％　Ｎａ２ＰＯ ａ・Ｈ２Ｏ，１０ｍＭ　アジ化ナトリウム、および０．１％　ＢＳＡｏ）次に、 ４．９％増量して最終的には５％濃度のＢＳＡ洗浄液でインキユベートし、そし て４５分間振盪してブロックした。あるいは、４℃で一晩ブロックした。前回と 同様に３回洗浄した後、ＮＣプロットをミニプロッターに移した。 次に、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）をニトロセルロースに付与した。２５μ ｇトランスプロット用に、ｍＡｂ上清を、１％正常血清あるいは全ヤギ血清を添 加した洗浄液で１０倍に希釈した。希釈したｍＡｂ上清の１３０μｍを２回ピペ ッティングして装置に入れた。陰性コントロールとして、２つの希釈洗浄液のレ ーンを用いた。陽性コントロールとして、９０％越える全精子と結合する抗体を 用いた。プロットをｍＡｂ、あるいは陽性および陰性のコントロールとともに３ ０分間インキコベートし、次に、結合していない抗体全てを除去するために数回 洗浄した。 洗浄後、１３０μｍのＡｕｒｏｐｒｏｂｅ　ＢＬ十染色液（Ｊａｎｓｅｅｎ）を 全てのレーンに加えて、少なくとも２．５時間インキュベートした（さらに５時 間のインキュベーションも可能である）。 真空装置で洗浄液を除きながら、レーンを洗浄液で数回（１洗浄当たり３分）洗 浄した。プロットを滅菌済みの皿に移し、蒸留水で再度洗浄して、Ｉｎｔｅｎｓ ｅ　Ｉｆ銀染色液（Ｊａｎｓｅｅｎ）　（約７０ｍ１）とともに１０分間インキ コベートした。蒸留水で３回（１回当たり５分間）すすいだ。　（ここでは、１ ５〜４０分間すすぐ。）陰性コントロールよりも染色濃度が濃い場合に、得られ たものは陽性である。実施例４で同定したＳＡＭタンパク質に対応する分子量の 位置に、これらのモノクローナル抗体が１−Ｄゲルに結合しているのを確認した 。 及敷乳り立　１東立数支 本発明のポリクローナルあるいはモノクローナル抗体は、改変精液による授精か ら生じた雄あるいは雌の子の割合を増すために哺乳類の精液を改変するのに有用 である。上記のように、本発明のＸ−あるいはＹ−３ＡＭタンパク質に結合する 抗体は、精液試料とインキュベートされると、Ｘ精子およびＹ精子にそれぞれ結 合する。抗体と結合した精子は、不活化され、すなわち運動性が妨害されて卵の 受精に非効果的になる。確実に効果的にするには、抗体の調製物は、好ましくは 、用いられる種と同じ哺乳類橿の精液から生産される。しかし、他の動物の精液 による性選択交差反応が生じるのが期待され得る。従って、我々の抗体調製物は 、動物の１種を越える種の精子の改変に有用である。 我々が記載する方法のいずれにおいても、ＳＡＭタンパク質の免疫原性フラグメ ントあるいはＳＡＭタンパク質と交差反応する抗体を引き起こす他のタンパク質 は、免疫化に有用であることは明かである。 ＳＡＭタンパク質に対して生じた抗体（精子１００万個当たり１００〜５００ｕ ｇ）をウシ精液に加えた。精液は回収して液体窒素で凍結するか、あるいは新鮮 射精し得る。抗体は好ましくは、抗体の活性を維持したまま、精子に対して非毒 性であり、そして精子に対する抗体の結合を指令する性質を有するように形成さ れた生理学的に受容可能なキャリヤー中に存在した。例えば、生理学的に授容可 能なｐＨおよび塩濃度の無菌の緩衝液キャリヤーを用いた。キャリヤーのｐＨは ６．４から８．４で、リン酸緩衝液を含有する。このような調製物の単位用量は 、例えば、精液の人工受精用量で、ＸあるいはＹを生じる精子を、選択的にすべ て非活性化するのに十分な抗体を含有するべきである。抗体は凍結乾燥で最もよ く保存される。 好ましくは、抗体を精液試料とともに、３７℃で１５〜６０分間インキコベート する。インキュベージコンの後、混合物を直接人工受精（Ａ、Ｉ）に用いるか、 あるいは標準法に従って、後の使用のために液体窒素で凍結する。抗体は、精液 試料のプロセッシングのコースの間の任意のときに加え得る。 重要な工程は次に示す＝＜１）精子に結合するために抗体を適切なときに与える ；および（２）精子に対する抗体の割合を、抗体が過剰になるように設定する。 モノクローナルあるいはポリクローナル抗体のいずれかを用いるときも、重要な 因子はインキュベージコンの時間、および精子に対する抗体の割合である。１つ の実施態様において、例えば、雌哺乳類の腟内に精液および抗体調製物（好まし くは前もって精液と混合して）を同時に導入するように、インキュベージコンは インビボで行われる。あるいは、抗体は、インビトロ受精ではベトリ皿に加えら れる。 人工受精の好ましい実施態様において、モノクローナル抗体は、モノクローナル 抗体が過剰になるような（すなわち、精子と結合していない）割合で新鮮射精さ れた精液と混合される。次に、新鮮精液とモノクローナル抗体とを合わせたもの を、冷凍保存剤と混合してストロ−内に通常の形態（工業的に標準な形態）でパ ッケイジする。このストロ−は、人工受精するウシに通常の方法で用いられる。 ＩＬＬＬ！−に紡ム　るモノクローナル我々は、下記の好ましい様式でモノクロ ーナル抗体を全精子に結合した。３７°Ｃの温浴中で抗体上清を解凍し、前述の ダルベツコ／ＰＢＳ、■ｏｅｅｈｓｔ染料、およびＢＳＡを組み合わせたもので 希釈した。全精子試料を、最終濃度が１２ｍｌあたり４８０Ｘ１０’精子細胞に なるように標識溶液で希釈した。 ｌ×１０１！ｌの細胞にモノクローナル抗体（約２００μｌの上清）を加えて、 室温で１時間インキュベートした。細胞を１００×ｇで５分間遠心し、上溝を除 去して、Ｒ−紅原素に結合させた、アフィニティー精製した抗マウス抗体のｌ： ２０希釈液２００μＩ中に、細胞を再浮遊させた。２度目の遠心の後、上清を除 去して、１０％の中性緩衝化ホルマリン溶液に、細胞混合物を再浮遊させた。 Ｋ血匹工主　ＳＡＭタンパク　の（の仁ＳＡＭタンパク質はまた、インビボで子 の性に影響を及ぼすのに有用である。１つの例を示す方法において、雌哺乳類を ＳＡＭタンパク質調製物で免疫する。免疫化は、ポリクローナル抗体を生じさせ るために行われ、このポリクローナル抗体は、雌哺乳類の生殖器内液に存在し、 精液が腟に導入されたときにＸＸ−３ＡあるいはＹ−３ＡＭに選択的に結合する 。免疫化には、前述のように、性特異的な抗体を生産する免疫部位を伴っている 。次に、動物は自然に交配させられる。 さらに、このタンパク質は、まさに記述したように　Ｘ−およびＹ−８ＡＭタン パク質で雌を免疫することによって受精能力を減少させるのに有用である。 本発明のＳＡＭタンパク質は、さらに、試料中の抗ＳＡＭ抗体の存在を検出する のに有用である。血清試料中の抗体の存在は、非受精能力あるいはある種の性の 子を生産する異常な素質を説明し得るかもしれない。基質としてＰＭＶよりもＳ ＡＭタンパク質を用いて、実施例８のようなＥＬＩＳＡアッセイを行って試料を テストし得るかもしれない。 人コ魚土りに３［の　の 本発明の抗体調製物は、雄あるいは鱈子の割合を増すような精液の改変の他に、 他の目的のために有用である。例えば、本発明の性特異的抗体は、混合物からＳ ＡＭタンパク質を多量に抽出するためのアフィニティーカラムに有用である。物 質とＳＡＭタンパク質とが脂質の微小部分に含まれている場合、そのタンパク質 に結合しているこれらの物質も、豊富ニなり得る。幼胚移植産業において、受精 卵中に移るかあるいは見いだされる、これらのＳＡＭタンパク質は、ＳＡＭタン パク質に対して作製された標識抗体を用いて同定され得、これによって胚が性別 される。受精卵に結合したＳＡＭ抗原は、母系に移るので、母体の体液を標識抗 ＳＡＭタンパク質抗体とともにインキュベートするか、あるいはＳＡＭタンパク 質またはその決定基を用いて、出生前の性の決定あるいは妊娠の決定が可能とな る。 本発明の抗体調製物は、さらに、Ｘ染色体あるいはＹ染色体のいずれかに結合し ている原形質膜タンパク質を同定するのに用い得る。もう一つの使用では、この 抗体は、選択的にＹ精イあるいはＸ精子に結合する抗体を生じ得る抗原性を示す 、精子のではないポリペプチドあるいはタンパク質を同定するのに有用である。 関連使用においては、それらのポリペプチドあるいはタンパク質を単離するのに 有用である。もう一つの関連使用は、この抗体調製物に結合するタンパク質の微 小部分に結合しているポリペプチドあるいはタンパク質を単離するための、Ｙ− ３ＡＭタンパク質あるいはＸＸ−８Ａタンパク質に対する抗体の使用である。 爽立匠上土　ｆｆｉ止笠止層１ 髭！明のＳＡＭタンパク質は、さらに、子が特定の性染色体関連形質の遺伝子を 有する確率を増すかあるいは減少するのに有用である。性染色体関連形質とは、 雄と雌とで異なる遺伝パターンを示すＸ染色体あるはＹ染色体上の遺伝子によっ て決定あるいは制御される遺伝的特性である。例えば、ヒトでは、色盲および血 友病が、Ｘ染色体関連形質である。 我々はすでに、特定の性染色体を有する精子に結合する抗体を生産するためにど のようにＳＡＭタンパク質を用いるのか記載した。これらの抗体は、さらに、そ れらが有する性染色体に対応した精子を不活性にするので、特定の性染色体関連 形質の遺伝子を有する精子の不活化に有用である。例えば、特定のＸ染色体関連 形質の遺伝子を、子が有する確率を減少さすことを望む場合には、その精液試料 をＸＸ−３Ａタンパク質に結合する抗体とインキュベートする。これは望ましく ない遺伝子を有するＸ精子を不活化する。あるいは、子が、Ｘ染色体関連形質の 特定の遺伝子を有する確率を増すには、精液試料をＹ　−Ｓ　Ａ、　Ｍタンパク 質に結合する抗体とインキユベートする。これは、所望の遺伝子を有するＸ精子 が生育できるように、Ｙ精子を不活化する。同様に、対応する方法が、Ｙ染色体 関連形質の遺伝子に対しても用いられる。 これまでに本発明の多くの実施態様を記述してきたが、当業者が、本発明の方法 および組成物を用いる他の実施態様を提供するために、我々の方法を改変し得る ことは明白である。 それ故に、本発明の範囲は、実施例によって示された特定の実施態様よりも、こ こに添付する請求項によって限定されるべきである。 土−」Ｌ−拠 斐−］Ｌ−果 木−］Ｌ」１−１ ３．６８７，８０６ ３．６９２，８９７ ３．９０６，９２９ ４．０Ｂ３，９５７ ４．０Ｅ１５，２０５ ４、工９１，７４９ ４．４４８，７６７ ４　、６５１０　、２５８ ４．７２２．８Ｂ７ ４．７６９，３１９ ４、フ７０，９９２ ４．４７＋、ａフ５ ユヱノ」しｉ几 １．１４８．０８２ 旦匹二り丘ｌユＬ顎 ＷＯＥ１４１０１２６５ 吹回ｇ九皿 補正帯の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）１、特許出願の 表示 ＰＣＴ／１Ｊｓ８９１０２０６９ ２、発明の名称 性関連膜タンパク質および子が所望の性を有する確率を増大させるための方法 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　アリシナ　８５２２４チャンドラ−、スィート７、ノー ス　サン　マルコブレイス　３４９８ 名称　サイトガム、インコーホレイテッド４、代理人 住所　〒５４０大阪府大阪市中央区域見−下目２番２７号５、補正帯の提出年月 日 １９９０年９月１２日 ６、添付書類の目録 （１）補正帯の写しく翻訳文）　１通 補正請求項 １９９０年９月１２日（１２，０９，９０）付で国際事務局に受領された、当初 の請求項２．２２．２７．２９．３０゜３２および３３が補正され、他の請求項 は変更されていない（７頁）。 １文旦更皿 １、　１％を越えるＤＮＡ含有量の差がある生精子細胞を選別する方法であって 、該方法が、 （１）レーザー励起に応答して、細胞中のＤＮＡｆｉの割合に応じて蛍光を放つ 色素により生精子細胞を染色する工程；および、 （２）該生精子細胞を、フローサイトメトリーによりそれらの蛍光に従って、Ｘ 染色体を有する精子細胞およびＹ染色体を有する精子細胞に富化された亜集団に 選別する工程で、該フローサイトメーターが、 （ａ）信号対ノイズの比が少な（とも１００：　１であり、（ｂ）各細胞へのレ ーザー出力が少なくとも９０ｍＷであり、 （ｅ）ＰＭＴ量子効率が少なくとも８％であり、そして、（ｄ）該精子細胞を同 じ向きに合わせ得る；工程を包含する、方法。 ２、信号対ノイズ比が少なくとも１０００：　１であり、各細胞へのレーザー出 力が少なくとも１６０ｍＷであり、そしてＰＭＴｆｉ子効率が少なくとも２０％ である、請求項１に記載の方法。 ３、少なくとも６８％のＸ精子を含有する、Ｘ精子の富化された生存並集団。 ４、少なくとも７２％Ｙ精子を含有する、Ｙ精子の富化された生存並集団。 ５、請求項１あるいは２の方法に従って選別された、請求項３あるいは４のいず れかに記載の生存並集団。 ６、Ｘ富化された精子原形質膜小胞。 ７、Ｙ富化された精子原形質膜小胞。 ８、ウシ由来である、請求項６あるいは７に記載の小胞。 ９、イヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからなる群より選択される種由来であ る、請求項６あるいは７に記載の小胞。 １０、ヒト由来である、請求項６あるいは７に記載の小胞。 １１、前記小胞が少なくとも８０％の頭部原形質膜を有する、請求項６あるいは ７に記載の小胞。 １２、Ｘ富化された非膜性精子成分。 １３、Ｙ富化された非膜性精子成分。 １４、ウシ由来である、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １５、イヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからなる群より選択される橿由来で ある、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １６、ヒト由来である、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １７、精製されたＸ性関連膜タンパク質。 １８．実質的に純粋なＸ性関連膜タンパク質。 １９、下記の分子量およびｐＩを有するタンパク質からなる群より選択される、 請求項１８に記載のタンパク質：（１，）　２０．９．５．７４； （２）　２６．３．７．５８７ （３）　２７．８．６．０Ｂ； （４）　４４．１．６．９０； （５）　５２．５．５．３３； （６）　５Ｂ、０．５．９９７ （７）　５９．４．６．５９； （８）　５９．５．６．８１７ （９）　６２．１．７．２３； （１０）　６２．５．５．５４； （１１）　６２．７．６．８５； （１２）　６２．８．６．６４； （１３）　６３．９．５．８３７ （１４）　６８．２．５．９５；　ｂｙｌ）：’（１５）　７Ｂ、６．７．１４ ゜ ２０、精製されたＹ性関連膜タンパク質。 ２１、実質的に純粋なＹ性関連膜タンパク質。 ２２、下記の分子量およびｐＩを有するタンパク質からなる群より選択される、 請求項２１に記載のタンパク質：（１）　９．６，６．５８； （２）　１９．９，５．６７； （］）　２９．０，６．６７； （４）　３６．５，７．１６； （５）　４Ｌｌ、６．２１； （６）　５５．５，６．８２； （７）　５５．９，５．２５； （８）　５１３．０．　８．６７； （９）　６２．９，６．３４；　および゛（１０）７０．３，５．７７゜ ２３、哺乳動物のＸ性関連膜（Ｘ−３ＡＭ）タンパク質に結合する抗体であって 、哺乳動物のＹ性関連膜タンパク質に結合するか、Ｈ−Ｙ抗原に結合するか、あ るいは精子原形質膜の性特異的でない成分に結合する抗体を、本質的に含有しな い抗体。 ２４、＃乳動物のＹ性関連膜（Ｙ−３ＡＭ）タンパク質に結合する抗体であって 、哺乳動物のＸ性関連膜タンパク質に結合するか、Ｈ−Ｙ抗原に結合するか、あ るいは精子原形質膜の性特異的でない成分に結合する抗体を、本質的に含有しな い抗体。 ２５゜前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２３あるいは２４に記載 の抗体。 ２６、前記ＸＸ−３Ａタンパク質がウシ由来である、請求項２３あるいは２４に 記載の抗体。 ２７゜前記ＸＸ−３Ａタンパク質がイヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからな る群より選択される種由来である、請求項２３あるいは２４に記載の抗体。 ２８、前記ＸＸ−３Ａタンパク質が、ヒト由来である、請求項２３あるいは２４ に記載の抗体。 ２９、請求項２３に記載の抗体により実質的に不活化された、生存Ｙ精子および Ｘ精子を含有する、Ｙ精子につい−ご富化された哺乳動物の精液試料。 ３０、請求項２４に記載の抗体により実質的に不活化された、生存Ｘ精子および Ｙ精子を含有する、Ｘ精子について富化された哺乳動物の精液試料。 ３１、条件に、過剰の抗体とともに、少なくとも１５分間の、ｐ　Ｈ６，４〜ｐ Ｈ８，４のリン酸緩衝液中、３７℃でのインキュベーションが含まれる、請求項 ２９あるいは３０に記載の精液試料。 ３２、請求項２９に記載の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する 、哺乳動物の子を雄性にする確率を増す方法。 ３３、請求項３０に記載の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する 、哺乳動物の子を雌性にする確率を増す方法。 ３４、雌の哺乳動物をＹ−３ＡＭタンパク質で免疫する工程を包含する、哺乳動 物の子を雌性にする確率を増す方法。 ３５、雌の哺乳動物をＸＸ−３Ａタンパク質で免疫する工程を包含する、哺乳動 物の子を雄性にする確率を増す方法。 ３６、雌をＸおよびＹ　−Ｓ　Ａ　Ｍタンパク質の両方で免疫する工程を包含す る、雌の哺乳動物の受精能力を減じる方法。 ３７、前記哺乳動物がウシである、請求項３２から３６のいずれかに記載の方法 。 ３８、前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジおよびブタからなる群より選 択される、請求項３２から３６のいずれかに記載の方法。 ３９、前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３２から３６のいずれかに記載の方 法。 ４０、、請求項２９の精液試料および凍結保存剤を含むストロ−を含有する、人 工受精キット。 ４１、請求項３０の精液試料および凍結保存剤を含むストロ−を含有する、人工 受精キット。 ４２、前記精液試料がウシ由来である、請求項４０あるいは４１に記載のキット 。 ４３．３ＡＭタンパク質に結合する抗体を試料中に検出する方法であって、該方 法が、 （ａ）試料にＳＡＭタンパク質を接触させて混合物をつく　リ　； （ｂ）該混合物を、免疫グロブリン分子に結合する検出可能な抗１体に接触させ る；工程を包含する、方法。 ４４、哺乳動物の子が、特定のＹ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を増すか 、あるいは哺乳動物の子が、特定のＸ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を減 じる、請求項２９の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する、方法 。 ４５、＠乳動物の子が、特定のＸ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を増すか 、あるいは哺乳動物の子が、特定のＹ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を減 じる、請求項３０の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する、方法 。 国際調査報告 □・“・・・パ・・・・・ム剛”””’　ＰＣＴ／ＩＪｓ８９１０２０６９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１％を越えるＤＮＡ含有量の差がある生精子細胞を選別する方法であって、 該方法が、 （１）レーザー励起に応答して、細胞中のＤＮＡ量の割合に応じて蛍光を放つ色 素により生精子細胞を染色する工程；および、 （２）該生精子細胞を、フローサイトメトリーによりそれらの蛍光に従って、Ｘ 染色体を有する精子細胞およびＹ染色体を有する精子細胞に富化された亜集団に 選別する工程で、該フローサイトメーターが、 （ａ）信号対ノイズ比が少なくとも１００：１であり、（ｂ）各細胞へのレーザ ー出力が少なくとも９０ｍＷであり、 （ｃ）ＰＭＴ量子効率が少なくとも８％であり、そして、（ｄ）該精子細胞を同 ヒ向きに合わせ得る；工程を包含する方法。 ２．信号対ノイズ比が少なくとも１０００：１であり、各細胞へのレーザー出力 が少なくとも１６０ｍＷであり、そしてＰＭＴ量子効率が少なくとも２０％であ る、請求項１に記載の方法。 ３．少なくとも６８％のＸ精子を含有し、そして実質的にＹ精子に結合する抗体 を含有しない、Ｘ精子の富化された生存亜集団。 ４．少なくとも７２％Ｙ精子を含有し、そして実質的にＸ精子に結合する抗体を 含有しない、Ｙ精子の富化された生存亜集団。 ５．請求項１あるいは２の方法に従って選別された、請求項３あるいは４のいず れかに記載の生存亜集団。 ６．Ｘ富化された精子原形質膜小胞。 ７．Ｙ富化された精子原形質膜小胞。 ８．ウシ由来である、請求項６あるいは７に記載の小胞。 ９．イヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからなる群より選択される種由来であ る、請求項６あるいは７に記載の小胞。 １０．ヒト由来である、請求項６あるいは７に記載の小胞。 １１．前記小胞が少なくとも８０％の頭部原形質膜を有する、請求項６あるいは ７に記載の小胞。 １２．Ｘ富化された非膜性の精子成分。 １３．Ｙ富化された非膜性の精子成分。 １４．ウシ由来である、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １５．イヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからなる群より選択される種由来で ある、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １６．ヒト由来である、請求項１２あるいは１３に記載の成分。 １７．精製されたＸ性関連膜タンパク質。 １８．実質的に純粋なＸ性関連膜タンパク質。 １９．下記の分子量およびｐＩを有するタンパク質からなる群より選択される、 請求項１ ８に記載のタンパク質： 　（１）２０．９，５．７４； 　（２）２６．３，７．５８； 　（３）２７．８，６．０８； 　（４）４４．１，６．９０； 　（５）５２．５，５．３３； 　（６）５８．０，５．９９； 　（７）５９．４，６．５９； 　（８）５９．５，６．８１； 　（９）６２．１，７．２３； （１０）６２．５，５．５４； （１１）６２．７，６．８５； （１２）６２．８，６．６４； （１３）６３．９，５．８３； （１４）６８．２，５．９５；および （１５）７８．６，７．１４。 ２０．精製されたＹ性関連膜タンパク質。 ２１．実質的に純粋なＹ性関連膜タンパク質。 ２２．下記の分子量およびｐＩを有するタンパク質からなる群より選択される、 請求項２１に記載のタンパク質：　（１）　９．６，６．５８； 　（２）１９．９，５．６７； 　（３）２９．０，６．６７； 　（４）３６．５，７．１６； 　（５）４１．１，６．２１； 　（６）５５．５，６．８２； 　（７）５５．９，５．２５； 　（８）５８．０，８．６７； 　（９）６２．９，６．３４；および （１０）７０．３，５．７７。 ２３．哺乳動物のＸ性関連膜（Ｘ−ＳＡＭ）タンパク質に結合する抗体であって 、哺乳動物のＹ性関連膜タンパク質に結合するか、Ｈ−Ｙ抗原に結合するか、あ るいは精子原形質膜の性特異的でない成分に結合する抗体を、本質的に含有しな い、抗体。 ２４．哺乳動物のＹ性関連膜（Ｙ−ＳＡＭ）タンパク質に結合する抗体であって 、哺乳動物のＸ性関連膜タンパク質に結合するか、Ｈ−Ｙ抗原に結合するか、あ るいは精子原形質膜の性特異的でない成分に結合する抗体を、本質的に含有しな い、抗体。 ２５．前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２３あるいは２４に記載 の抗体。 ２６．前記Ｘ−ＳＡＭタンパク質がウシ由来である、請求項２３あるいは２４に 記載の抗体。 ２７．前記Ｘ−ＳＡＭタンパク質がイヌ、ネコ、ウマ、ブタおよびヒツジからな る群より選択される種由来である、請求項２３あるいは２４に記載の抗体。 ２８．前記Ｘ−ＳＡＭタンパク質が、ヒト由来である、請求項２３あるいは２４ に記載の抗体。 ２９．請求項２３に記載の抗体により実質的に不活化された、生存Ｙ精子および Ｘ精子を含有する、Ｙ精子について富化された哺乳動物の精液試料。 ３０．請求項２４に記載の抗体により実質的に不活化された、生存Ｘ精子および Ｙ精子を含有する、Ｘ精子について富化された哺乳動物の精液試料。 ３１．前記不活化する条件に、過剰の抗体とともに、少なくとも１５分間の、ｐ Ｈ６．４〜ｐＨ８、４のリン酸緩衝液中、３７℃でのインキュべーションが含ま れる、請求項２９あるいは３０に記載の精液試料。 ３２．請求項２９に記載の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する 、哺乳動物の子を雄性にする確率を増す方法。 ３３．請求項３０に記載の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する 、哺乳動物の子を雌性にする確率を増す方法。 ３４．雌の哺乳動物をＹ−ＳＡＭタンパク質で免疫する工程を包含する、哺乳動 物の子を雌性にする確率を増す方法。 ３５．雌の哺乳動物をＸ−ＳＡＭタンパク質で免疫する工程を包含する、哺乳動 物の子を雄性にする確率を増す方法。 ３６．雌をＸおよびＹ−ＳＡＭタンパク質の両方で免疫する工程を包含する、雌 の哺乳動物の受精能力を減じる方法。 ３７．前記哺乳動物がウシ種である、請求項３２から３６のいずれかに記載の方 法。 ３８．前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジおよびブタからなる群より選 択される、請求項３２から３６のいずれかに記載の方法。 ３９．前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３２から３６のいずれかに記載の方 法。 ４０．請求項２９の精液試料および凍結保存剤を含むストローを含有する、人工 受精キット。 ４１．請求項３０の精液試料および凍結保存剤を含むストローを含有する、人工 受精キット。 ４２．前記精液試料がウシ由来である、請求項４０あるいは４１に記載のキット 。 ４３．ＳＡＭタンパク質に結合する抗体を試料中に検出する方法であって、該方 法が、 （ａ）試料にＳＡＭタンパク質を接触させて混合物をつくり； （ｂ）該混合物を、免疫グロブリン分子に結合する検出可能な抗体に接触させる ；工程を包含する、方法。 ４４．哺乳動物の子が、特定のＹ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を増すか 、あるいは哺乳動物の子が、特定のＸ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を減 じる、請求項２９の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する、方法 。 ４５．哺乳動物の子が、特定のＸ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を増すか 、あるいは哺乳動物の子が、特定のＹ染色体関連形質の遺伝子を有する確率を減 じる、請求項３０の精液試料由来の精子を卵に受精させる工程を包含する、方法 。