JPS6352707B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原を検出するためのラテツクス試薬
及び該試薬を用いて行うラテツクス凝集反応の測
定方法に関する。 近時、体液中のホルモンや蛋白質等の微量の生
体成分を検出するために、ラテツクス試薬が一般
的に使用されるに至つた。このラテツクス試薬に
用いられるラテツクスとしては合成樹脂ラテツク
ス、とりわけ粒径が0.1ないし１ミクロンのもの
が一般に採用されている。これらラテツクス試薬
は測定対象の抗原、抗体に対応する抗体、抗原が
該ラテツクス表面に吸着されており、特異的な反
応である抗原、抗体反応によりラテツクスの凝集
が生じる様になされている。しかし、単に抗体
（又は抗原）をラテツクスの表面に吸着させただ
けでは抗原・抗体の特異的な反応以外の因子に起
因する非特異的凝集を起こすことが避けられず、
実用性のあるラテツクス試薬は得られない。なぜ
なら測定対象である体液中には各種の蛋白等が混
在し、これらの成分が非特異的にラテツクスへ吸
着し凝集を生ぜしめるためである。 この欠点を除くため、現在までに種々の工夫が
なされて報告されているが、その代表的方法は抗
原・抗体反応に関与しない不活性蛋白質を用いて
処理する方法である。例えば特公昭43−12741号
には微細な固体の担体に抗原又は抗体を吸着せし
めた免疫化学的測定試薬において、担体粒子が不
活性で抗原抗体反応に関与しない蛋白質で予め被
覆され、次いで抗体又は抗原で被覆されているこ
とを特徴とするラテツクス試薬の提案がなされて
いる。また特公昭49−11407号には微粒固体担体
表面に抗体を吸着せしめ、次いでこれを不活性な
蛋白質の0.1％以下の濃度の溶液で処理すること
が提案されている。これらの２つの発明において
は操作手順の差はあるが、抗原抗体の免疫化学的
反応に関与しない不活性蛋白質で処理することが
基本になつている。そして不活性蛋白質として
は、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、
ラクトアルブミン等のアルブミンがあげられてい
る。 しかしながらアルブミン処理を施したラテツク
ス試薬においては、正常ウサギ血清、正常モルモ
ツト血清中の蛋白質と著しい非特異反応を生じて
凝集する。また、アルブミンの性質に起因するラ
テツクス自己凝集もあるため測定感度は低い。当
然、ヒトのガンマグロブリン、ヒトのアルブミ
ン、ヒトのフイブリノーゲンとも非特異反応を起
こすため感度は低く、予め抗体を加えてインヒビ
ツシヨンテスト（一種の確認テスト）をしなけれ
ばならなくなることが多い。また、測定感度すな
わち検出下限濃度について、HBs抗原（Ｂ型肝
炎ウイルス表面抗原）検出用のラテツクス試薬を
例にとると、通常のアルブミン処理方法で製造し
たラテツクス試薬では、10μｇ（10^-5ｇ／c.c.）程
度以上のHBs抗原しか検出できないのが現状で
あり、さらに高感度のものが要望されている。 又、前記抗原・抗体反応にもとづくラテツクス
試薬の凝集現象を肉眼で判別して診断する以外に
ラテツクス試薬に検体を適用した際の吸光度の増
加を可視光、近赤外光、レーザーなどを用いて光
学的に読み取り、あらかじめ既知濃度の抗原又は
抗体を用いて作成しておいた標準曲線より測定対
象の抗原又は抗体を測定する方法が知られてお
り、例えば特開昭53−24015号、同54−108693号
などには近赤外光を用いる測定方法が開示されて
いるのであるが、この様な光学的測定方法におい
ても、前述の非特異反応による凝集や感度が低い
等の問題点が同様に存する。 本発明は上記の様な従来のラテツクス試薬及び
該試薬を用いた測定方法の欠点にかんがみ、非特
異的凝集がなく、かつ感度にすぐれたラテツクス
試薬及びラテツクス凝集反応の測定方法を提供す
ることを目的としてなされたものであり、その要
旨はスチレンとスチレンに対し10重量％以下のス
チレンスルホン酸塩とを、超微粒子状無水珪酸の
存在下に乳化剤を用いることなく、過硫酸塩を開
始剤として水中で共重合せしめたのちアルカリ性
で加熱することにより用意したラテツクスに抗体
が感作せしめられ、次いで上記と同じ抗体を含む
血清を含有する液中に分散されたのち該液から分
離されることにより処理されてなることを特徴と
するラテツクス試薬及びスチレンとスチレンに対
し10重量％以下のスチレンスルホン酸塩とを、超
微粒子状無水珪酸の存在下に乳化剤を用いること
なく、過硫酸塩を開始剤として水中で共重合せし
めたのちアルカリ性で加熱することにより用意し
たラテツクスに抗体が感作せしめられ、次いで該
抗体を含む血清で処理されてなるラテツクス試薬
を抗原抗体反応の光学的測定に用いることを特徴
とするラテツクス凝集反応の測定方法に存する。 本発明で用いられるスチレンスルホン酸塩とし
ては、スチレンスルホン酸ナトリウム、スチレン
スルホン酸カリウム、スチレンスルホン酸リチウ
ム、スチレンスルホン酸アンモニウム等があげら
れる。これらのスチレンスルホン酸塩のスチレン
に対する使用割合は10重量％以下とされるが、好
ましくは0.0001％から10％、より好ましくは
0.001％から５％の範囲である。 又、本発明における超微粒子状無水珪酸とは、
粒径が約50ｍμ以下の極めて微少な粒子になされ
た無水珪酸を意味し、通常５〜50ｍμのものが用
いられ、例えばアエロジル（商品名、日本アエロ
ジル(株)社製）が好適に用いられる。また、該超微
粒子状無水珪酸を水中に分散させたコロイド溶
液、例えばスノーテツクス（商品名、日産化学工
業(株)社製）も好適に用いられる。そしてこの超微
粒子状無水珪酸の使用量はスチレンに対して0.01
〜10重量％の割合とするのがよいが、0.05〜５重
量％とくに0.08〜２重量％とするのが好ましい。 又、上記コロイド溶液として用いる場合は、無
水珪酸含有量が35重量％以下、酸化ナトリウム含
有量0.6重量％以下、粘度が10センチポイズ以下
にしてPH８〜10のものを用いるのが好ましい。 又、本発明において開始剤として用いられる過
硫酸塩としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カ
リウム、過硫酸ナトリウム等があげられる。これ
らの過硫酸塩のモノマー全体に対する割合は0.01
ないし１重量％の範囲が好ましい。 スチレンとスチレンスルホン酸塩との共重合を
行うには水が仕込まれた反応器内にスチレン、ス
チレンスルホン酸塩、超微粒子状無水珪酸及び開
始剤を加えて撹拌しながら加熱すればよく、その
際の重合反応温度は通常50〜100℃、好ましくは
60〜85℃の範囲とするのがよい。 又、重合反応に要する時間はモノマー組成、モ
ノマー濃度、開始剤濃度等の条件により変わるが
通常５〜50時間の範囲である。又、本発明におい
てはラテツクス製造において一般に使用される乳
化剤は使用されない。 以上によつて平均粒径が0.05〜２ミクロンのラ
テツクスが得られるが、本発明の一つの特徴はラ
テツクス粒子の粒径がよく揃つている点にあり、
上記によつて粒径のバラ付きを変動係数（粒径の
標準偏差／平均粒径）で表わして0.05以下の単分
散ラテツクスを得ることができる。次に上記によ
り得られたラテツクスをアルカリ性の条件下で加
熱するがこの際の加熱温度は通常50〜100℃好ま
しくは60〜85℃とするのがよく、又加熱時間は15
〜100時間とするのがよい。そして上記加熱は、
反応系をアルカリ性にして行われるのであるが、
その際の反応系のPHは7.5〜12.5とくに８〜11.5の
範囲の保たれるのがよい。又、上記の如く反応系
をアルカリ性に保つには反応系を酸素のない状態
にすることによつて行うことが出来、より具体的
には重合反応器の内部を不活性ガス、例えば窒素
又はヘリウム等で置換することによつて実現出来
る。 上記により得られるラテツクスは乳化剤を全く
含まないにも拘らず極めて安定であつて、粒径も
非常によく揃つているものであり、遊離の乳化剤
を含むラテツクスに見られるラテツクス試薬とし
て用いられた際の遊離乳化剤の存在に起因する非
特異的凝集反応を全く生じることのないものであ
る。 本発明のラテツクス試薬は上記により得られた
ラテツクスに抗体が感作せしめられ、次いで上記
と同じ抗体を含む血清を含有する液中に分散され
たのち該液から分離されることにより処理された
ものであるが、このラテツクスに抗体を感作させ
る方法は特に限定されることはなく、従来より知
られている方法を適宜に採用することができる。
例えば、ラテツクス粒子と抗体をPHが約７〜8.6
の緩衝液、生理食塩水、水等の適宜の水性溶剤
中、約20〜37℃の温度で適宜時間接触させる。こ
の際、必要ならば撹拌したり、振とうしたりす
る。こうして得た感作ラテツクスは、更に必要な
らば、水性溶剤で洗滌したり、或いは遠心分離に
より、ラテツクス粒子に吸着されていない抗体が
除去される。次に上記により感作させたラテツク
スを上記と同じ抗体を含む血清を含有する液中に
分散したのち該液から分離することにより処理す
るには、該感作ラテツクスを上記の抗体を含む血
清を至適濃度で含有する緩衝液中に加えて短時間
懸濁撹拌して、余剰の血清を除去したのち、緩衝
液に好ましくは0.5〜３重量％濃度にラテツクス
を再懸濁することにより行うことが出来る。そし
て、上記血清を含有する緩衝液における該血清の
濃度は0.1〜20重量％であり、従つて抗体の濃度
は１〜100μｇ／c.c.程度であることが好ましい。
また該処理の際の温度及び時間は抗体感作の場合
と同様でよい。 かくして本発明のラテツクス試薬が調製され
る。本発明のラテツクス試薬は、抗体感作したラ
テツクスを抗体・抗原反応に関与しない不活性タ
ンパク質で処理した従来のラテツクス試薬とは異
なり、前述の如く特定の方法によつて用意したラ
テツクスに抗体が感作せしめられ、次いで上記と
同じ抗体を含む血清を含有する液中に分散された
のち該液から分離されることにより処理されてな
るものであるので、これを抗原抗体反応にもとづ
く凝集反応の測定に用いることによつてラテツク
ス試薬の非特異的凝集反応をよく除去すると共
に、測定感度を飛躍的に高め得たのであり、後述
する実施例にも示されている様に、凝集反応の測
定において極めて低濃度の抗原に対しても正確な
診断を下すことが可能になつたのである。 例えばHBs抗原（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）
検出用のラテツクス試薬を例にとると、従来のア
ルブミン処理方法で製造したラテツクス試薬では
10μｇ（10^-5ｇ／c.c.）程度以上のHBs抗原しか検
出できないのに対し、本発明にもとづいて製造し
たラテツクス試薬では10nｇ（10^-8ｇ／c.c.）程度
の抗原量まで検出できることが判明しており、こ
の場合は実に1000倍も感度が高いことになる。 又、本発明のラテツクス試薬は抗原抗体反応の
光学的測定に用いられて好適なるものであり、こ
の測定方法によれば、安定性にすぐれて非特異的
凝集がなく、しかも感度の著しく高いラテツクス
試薬を用いて測定を行うので、極めて高い感度で
検体中の抗原を正確に検出することが可能となる
のである。 以下本発明の実施例について説明する。 実施例 １ スチレン91ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム
0.66ｇ、無水珪酸の超微粒子（平均粒径約30ｍ
μ）0.06ｇを水中に分散せしめたコロイド溶液
0.20ｇ、過硫酸カリウム0.05ｇ、イオン交換水
450ｇを反応容器に仕込み、容器を窒素ガスで置
換し、反応温度70℃で24時間共重合した。共重合
終了後、反応容器の内部を空気で置換し、ラテツ
クスのPHを8.5に調節し70℃で24時間加熱を続け
た。このようにして得られたラテツクスの平均粒
径は0.45ミクロン、粒径のバラ付きは変動係数で
表わして0.03であつた。 本ラテツクスをPH7.4のリン酸緩衝液に分散さ
せ固型分２％としたもの１容と、モルモツトの産
生したHBsモノスペシフイツク抗体（セフアロ
ーズ4Bに固定した抗原のカラムに２回通液した
アフイニテイークロマトグラフイーによる精製
品）を同じくリン酸緩衝液中に40μｇ／c.c.の濃度
に溶解したもの１容とを混合し、37℃で２時間イ
ンキユベートして本ラテツクスに抗体を結合させ
た。次にこの感作ラテツクスを15000rpm、15分
間で遠心分離し、未吸着の抗体を除去した。この
上清中の抗体価はPHA（受身赤血球凝集反応）に
より測定されたが、少くとも99.5％以上の抗体は
本ラテツクスに吸着していた。 次いで、この沈降した感作ラテツクスに、
HBs抗原で免疫されたモルモツトの抗血清から
抗ヒト蛋白抗体をカラムで吸収済のモルモツト抗
血清を0.1〜５％加えたリン酸緩衝液１容を加え、
感作ラテツクスをよく分散させ、37℃で10分間撹
拌した。このモルモツト抗血清を含むリン酸緩衝
液中、抗HBs抗体は約１〜50μｇ／c.c.含まれてい
た。 その後、12000回転で遠心分離し上清を捨て、
沈降した処理後の感作ラテツクスをPH７のリン酸
緩衝液に再分散してラテツクス試薬の調製を終了
した。このようにして調製したラテツクス試薬を
用い、種々の濃度のHBs抗原を含むヒト血清に
対する凝集の強さを測定したところ次表の結果を
得た。

【表】 次にリバーセイア（HBs抗原検出EIAキツト、
山之内製薬）を用いて、血清中HBs抗原が0.4n
ｇ／c.c.以下であることの判明している1000人の正
常人血清について同様のテストをした。1000検体
中偽陽性はわずか１件であつた。また、HBs抗
体を含有する100人の偽陽性は一件もなかつた。 比較例 １ 実施例１におけるHBs抗体含有モルモツト血
清による処理を正常モルモツト血清による処理に
変える他は、実施例１と全く同様にして調製した
抗HBs抗体感作ラテツクスを用いて同じ試験を
したところ次表の結果を得た。

【表】 また、実施例と同様の1000検体の正常人血清に
ついて偽陽性は９件、また抗体を含有する100人
の血清との反応では４件の偽陽性があつた。すな
わち本法では非特異反応はそれほどでもないが、
検出感度が実施例１に比し約1000分の１となる。 実施例 ２ 実施例１で用意したラテツクスに家兎の産生し
たアルフアーフエトプロテインの抗体（アフイニ
テイークロマトグラフイーにより精製したモノス
ペシフイツク抗体）を感作し、人血清中のアルフ
アーフエトプロテインとの凝集反応を調べた。ラ
テツクス試薬の調製法は実施例１と同様であり、
家兎の抗血清１％を含有するリン酸緩衝液で処理
をした。結果を次表に示す。

【表】 また、正常人の血清1000検体中の偽陽性は２例
にすぎなかつた。 比較例 ２ アルフアーフエトプロテインの抗体をラテツク
スに感作した実施例２と同じ感作ラテツクスを牛
血清アルブミン１％を含有するリン酸緩衝液で洗
浄し、ラテツクス試薬を調製した。 人血清中のアルフアーフエトプロテインとの凝
集反応は次表の通りであつた。

【表】 実施例２に比し1000分の１しか検出感度を有し
ないことが明らかである。また、正常人の血清
1000検体中の偽陽性は130件にものぼつた。すな
わち、アルブミン処理では非特異凝集の反応がき
わめて著しい。 実施例 ３ (1) 抗HBs抗体感作ラテツクス（抗HBsラテツ
クス）試薬の調製 実施例１と同様にして、HBs抗体が感作され
該抗体を含む血清で処理されたラテツクス試薬を
調製した。 (2) ラテツクス凝集反応の光学的測定 上記(1)で調製した抗HBsラテツクス試薬0.5c.c.
を小試験管にとり、これにリン酸緩衝液0.5c.c.を
加え、さらに下記第１表に示す濃度のHBs抗原
溶液１c.c.を加えて20秒間振とうして混合したの
ち、回転子を備えたアクリル樹脂製のセル（光路
長１cm）に入れ、直ちに毎分200回転の速さで撹
拌しつつ吸光度の時間変化の記録を行う。測定波
長は950nmを用いた。次にこの吸光度の時間変化
の記録図上において、記録開始後のなるべく早い
時期で近似的に直線である部分に沿つて直線を引
き、その直線の傾きを計算したものが、下記第１
表の「速さ」の欄の数字であり、吸光度の変化を
ABS／minで示してある。 同表に示される如く、HBs抗原濃度が極めて
低い場合についても吸光度変化による測定が可能
であつた。

【表】 比較例 ３ 実施例３におけるHBs抗体含有モルモツト血
清による処理を正常モルモツト血清による処理に
変えた他は実施例３と全く同様にして調製した抗
HBsラテツクス試薬を用い、抗原抗体反応を光
学的に測定したところ、5μｇ／c.c.の抗原量以上
しか検出できず、しかも非特異凝集が起つた。 実施例 ４ (1) 抗α―フエトプロテイン（α―FP）抗体感
作ラテツクス（抗α―FPラテツクス）試薬の
調製 実施例１と同じラテツクスに家兎の産生したα
―FPの抗体（アフイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製したモノスペシフイツク抗体）を感
作した。ラテツクス試薬調製法は実施例１と同様
であり家兎の抗血清１％含有のリン酸緩衝液で処
理した。 (2) ラテツクス凝集反応の光学的測定 上記(1)で調製した抗α―FPラテツクス試薬を
用い、650nmの可視光を用いる他は実施例３と同
様にして第２表の結果を得た。

【表】

【表】 比較例 ４ 実施例４におけるα―FP抗体含有家兎血清に
よる処理を牛血清アルブミンによる処理に変える
他は家施例４と全く同様にして調製した抗α―
FPラテツクス試薬を用い、抗原抗体反応を光学
的に測定したところ、7μｇ／c.c.の抗原量以上し
か検出できず、しかも非特異凝集が起こつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スチレンとスチレンに対し10重量％以下のス
   チレンスルホン酸塩とを、超微粒子状無水珪酸の
   存在下に乳化剤を用いることなく、過硫酸塩を開
   始剤として水中で共重合せしめたのちアルカリ性
   で加熱することにより用意したラテツクスに抗体
   が感作せしめられ、次いで上記と同じ抗体を含む
   血清を含有する液中に分散されたのち該液から分
   離されることにより処理されてなることを特徴と
   するラテツクス試薬。 ２ スチレンとスチレンに対し10重量％以下のス
   チレンスルホン酸塩とを、超微粒子状無水珪酸の
   存在下に乳化剤を用いることなく、過硫酸塩を開
   始剤として水中で共重合せしめたのちアルカリ性
   で加熱することにより用意したラテツクスに抗体
   が感作せしめられ、次いで上記と同じ抗体を含む
   血清を含有する液中に分散されたのち該液から分
   離されることにより処理されてなるラテツクス試
   薬を抗原抗体反応の光学的測定に用いることを特
   徴とするラテツクス凝集反応の測定方法。