JPS6352705B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は診断用ラテツクス試薬の凝集反応測定
方法に関する。 粒径0.01〜1μのラテツクス粒子に抗原又は抗体
を感作させ、弱アルカリ性の緩衝液に分散させた
診断用ラテツクス試薬は、体液中のそれぞれ対応
する抗体又は抗原と特異的に反応し、可視的な凝
集反応を起こすので、リウマチ因子の検出や妊娠
診断等に広く用いられている。 このような抗原抗体反応に基づくラテツクス試
薬の凝集反応は、従来は、ラテツクス試薬をガラ
ス板上にて抗原又は抗体と反応させ、その凝集状
態を肉眼で観察することによつて半定量的に測定
されていた。しかし、近年、医学の進歩に伴つ
て、抗原抗体反応を定量的に、しかも非常な高感
度で測定することが要求されるに至り、ラテツク
ス試薬の凝集反応を光学的に検出して定量化する
方法が二、三提案されている（たとえば、特開昭
54−108693号）。 このラテツクス試薬の凝集反応を光学的に検出
するには、ラテツクス試薬が、目的とする抗原又
は抗体以外のものと反応して非特異的凝集を起こ
さないと共に、検出下限が極めて低く、高感度で
あることが要求される。しかし、従来知られてい
るラテツクス試薬は一般に非特異的凝集を起こし
やすく、また、感度も高くないので、ラテツクス
凝集反応の光学的検出には必らずしも適しない。
従つて、このようなラテツクス試薬の非特異的凝
集反応を防ぐために、抗体又は抗原をラテツクス
粒子に吸着させる前に、目的とする抗原抗体反応
を関与しない不活性なタンパク質でラテツクス粒
子を被覆することが提案されているが（特公昭43
−12741号）、この方法によれば、抗体又は抗原が
ラテツクス粒子に吸着し難く、結果として感度が
良好でない。このため、抗体又は抗原をラテツク
ス粒子に感作させた後、目的とする抗原抗体反応
に関与しない不活性なタンパク質で被覆する方法
も提案されているが（特公昭49−11407号）、やは
り感度が低い。さらに、いずれの方法において
も、非特異的凝集が十分に除去されてはいない。
たとえば、上記不活性タンパク質としては牛血清
アルブミン、卵白アルブミン、ラクトンアルブミ
ン等が用いられるが、アルブミン処理をしたラテ
ツクス試薬は正常ウサギ血清や正常モルモツト血
清中のタンパク質と著しい非特異的凝集反応をす
る。また、アルブミンの性質に起因するラテツク
ス自己凝集もあるため、測定感度が低い。従つ
て、当然にヒトガンマグロブリン、ヒトアルブミ
ン、ヒトフイブリノーゲンとも非特異的凝集を起
こすため、予め抗体を加えてインヒビシヨンテス
トをしなければならないことも多い。 本発明者らは上記に鑑み、ラテツクス試薬凝集
反応の光学的測定に用いるに適するラテツクス試
薬について鋭意研究した結果、非特異的凝集を抑
制し、検出下限の極めて低い高感度のラテツクス
試薬の製造方法を見出し、本発明に至つたもので
ある。 本発明の診断用ラテツクス試薬の凝集反応測定
方法は、ラテツクス粒子に抗体を感作させ、次い
でこの抗体感作ラテツクスを、上記と同じ抗体を
含む血清を含有する液中に分散させたのち該液か
ら分離することにより処理してなるラテツクス試
薬を、液体媒体中にて抗原と反応させ、この反応
混合物の吸光度の増加を光学的に測定することを
特徴とするものである。 本発明においては、ラテツクスとして種々の合
成樹脂ラテツクスが用いられるが、好ましくはス
チレンを構成単位とする単独重合体及び共重合体
が用いられ、具体例としてポリスチレン、スチレ
ン―ブタジエン共重合体等のラテツクスを挙げる
ことができる。ラテツクス粒子の大きさは0.05〜
1μが適当である。ラテツクスは通常、弱アルカ
リ性のリン酸緩衝液（PBS）のような緩衝液に
加えて分散させ、抗体を溶解した緩衝液に上記ラ
テツクスを加えて混合し、抗体を感作させる。感
作温度は25〜45℃、好ましくは30〜37℃であり、
感作時間は数分乃至数時間である。普通、１時間
以内で十分である。次に、このようにして抗体を
感作したラテツクスを遠心分離して未吸着の抗体
を除く。このようなラテツクスへの抗体の感作方
法は既によく知られており、本発明においては、
上に例として挙げた方法に何ら限定されるもので
はない。 次に、上記抗体を含む血清、すなわち抗血清を
至適濃度で含有する緩衝液中に上記抗体感作ラテ
ツクスを加え、短時間懸濁撹拌して抗血清処理
し、余剰の抗血清を除去した後、緩衝液に0.5〜
３重量％濃度に再懸濁して、本発明で用いるのに
適するラテツクス試薬を得ることができる。本発
明において用いる抗血清の緩衝液は、通常、抗血
清を0.1〜20重量％濃度で含有し、従つて、抗体
を１〜1000μｇ／c.c.程度の濃度で含有する。な
お、抗体感作ラテツクスを抗血清処理する際の温
度及び時間は、ラテツクスの抗体感作の場合と同
様でよい。 上記の方法で得たラテツクス試薬は、抗体感作
したラテツクスを前記した目的とする抗体抗原反
応に関与しない不活性タンパク質で処理する方法
と異なり、感作した抗体を含む血清にて処理する
ものであり、これによつて、驚くべきことに、ラ
テツクス試薬の非特異的凝集反応をよく除去する
と共に、測定感度を飛躍的に高め得たのであり、
後述する実施例にも示すように、極めて低濃度の
抗原に対しても、そのラテツクス試薬の凝集反応
を光学的に定量的に測定することが可能となつた
のである。 たとえば、HBs抗原（Ｂ型肝炎ウイルス表面
抗原）検出用ラテツクス試薬の場合、前記した従
来方法に従つてアルブミン処理したラテツクス試
薬では、10μｇ／c.c.（10^-5ｇ／c.c.）程度以上の抗
原しか検出できないが、本発明に従つて得たラテ
ツクス試薬によれば10nｇ／c.c.（10^-8ｇ／c.c.）程
度の抗原を検出することができ、実に1000倍も感
度が高い。 本発明の方法は、上記のようにして調製したラ
テツクス試薬を抗原と液体媒体中にて反応させ、
抗原抗体反応に基づく特異的凝集反応を反応混合
物の吸光度の増加によつて定量的に検出するので
ある。液体媒体としては通常水が用いられるが、
水混和性有機溶剤であつてもよい。光学的測定に
用いる光源としては、たとえば可視光、近赤外光
領域の波長の光やレーザーを挙げることができ
る。 反応混合物の光学的測定は次のようにして行な
う。すなわち、好ましくは回転子を備えたセル中
にラテツクス試薬と抗原とを加え、撹拌しつつ、
吸光度を経時的に記録する。吸光度は、抗原抗体
反応の開始直後には一般的に不安定であるが、数
秒乃至数分後には安定となり、吸光度は時間に対
して直線的に増加する。このように抗原抗体反応
が安定した進行状態を示すときに、吸光度の時間
に対する増加率を測定することにより、正確で再
現性の高い結果を得ることができる。従つて、予
め既知濃度の抗原を用いて得た吸光度の増加率と
比較することにより、測定対象中の抗原濃度を正
確に知ることができるのである。 以下に本発明の実施例を挙げる。 実施例 １ (a) 抗HBs抗体感作ラテツクス（抗HBsラテツ
クス）試薬の調製 平均粒径0.47μのポリスチレンラテツクスを固
型分２％となるようにPH7.4のPBSに分散させた。
別に、モルモツトの産生したHBsモノスペシフ
イツク抗体（抗原を固定したセフアローズ4Bの
カラムに２回通液したアフイニテイークロマトグ
ラフイーによる精製品）を上記と同様のPBSに
40μｇ／c.c.の濃度に溶解し、この溶液１容と前記
ラテツクス１容とを混合した後、37℃の温度で２
時間加温振とうし、ラテツクス粒子に抗体を感作
させた。この感作ラテツクスを15分間、
15000rpmで遠心分離し、未吸着の抗体を除去し
て、感作ラテツクスを分離した。尚、上清中の抗
体価は受身赤血球凝集反応法（PHA法）にて測
定したところ、少なくとも99.5％の抗体がラテツ
クス粒子に吸着されたことが判つた。 次に、HBs抗原で免疫されたモルモツトの抗
血清をアフイニテイクロマトグラフにより処理し
て、抗ヒトタンパク抗体を除き、こうして得たモ
ルモツトの抗血清を0.1〜0.5重量％濃度になるよ
うにPBSを加えた。この抗血清を含むPBS1容
（このPBSには抗HBs抗体が約１〜50μｇ／c.c.含
まれている。）に上で得た抗体感作ラテツクス粒
子を分散させ、37℃で10分間加温振とうした。こ
のようにして抗血清処理した感作ラテツクスを
12000rpmで遠心分離し、沈降したラテツクス粒
子をPH７のPBSに再分散させ、ラテツクス試薬
（固型分２重量％）を得た。 (b) ラテツクス凝集反応の測定 上記抗HBsラテツクス試薬0.5c.c.を小試験管に
採り、これにPBS0.5c.c.を加え、さらに第１表に
示す各種濃度のHBs抗原溶液１c.c.を加えて20秒
間振とう、混合した後、回転子を備えたアクリル
樹脂製セル（光路長１cm）に入れた。直ちに
200rpmで撹拌しつつ、950nmにおける吸光度を
(株)日立製作所100―10型分光光度計を用いて経時

【表】 的に記録した。記録開始後のなるべく早い時期に
おいて、直線的に増加する吸光度から吸光度増加
率（ABS／分）を求めた。結果を第１表に示す。 比較例 １ 感作ラテツクスを正常モルモツト血清で処理し
た以外は、実施例１と全く同様にして、抗HBs
ラテツクス試薬を調製し、抗原抗体反応を測定し
たが、5μｇ／c.c.以上の抗原量しか測定できず、
しかも非特異的凝集も起こつた。 実施例 ２ (a) 抗α―フエトプロテイン（α―FP）抗体感
作ラテツクス（抗α―FPラテツクス）試薬の
調製 実施例１と同じポリスチレンラテツクスに、実
施例１と同様にして、家兎の産出したα―フエト
プロテイン（α―FP）のモノスペシフイツク抗
体を感作した後、家兎の抗血清１重量％を含む
PBSで処理した。 (b) ラテツクス凝集反応の測定 上記抗α―FPラテツクス試薬を用い、650nm
の可視光を用いた以外は実施例１と全く同様にし
て第２表の結果を得た。

【表】 比較例 ２ 実施例２で得た抗α―FP抗体感作ラテツクス
を牛血清アルブミン（BSA）１重量％を含有す
るPBSで処理してラテツクス試薬を得た。この
試薬を用いて実施例２と全く同様にして、抗原抗
体反応を測定したが、7μｇ／c.c.以上の抗原量し
か検出できず、しかも非特異的凝集も起こつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ラテツクス粒子に抗体を感作させ、次いでこ
   の抗体感作ラテツクスを、上記と同じ抗体を含む
   血清を含有する液中に分散させたのち該液から分
   離することにより処理してなるラテツクス試薬
   を、液体媒体中にて抗原と反応させ、この反応混
   合物の吸光度の増加を光学的に測定することを特
   徴とする診断用ラテツクス試薬の凝集反応測定方
   法。 ２ 反応混合物に可視光乃至近赤外光領域の波長
   の光を照射することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の診断用ラテツクス試薬の凝集反応測
   定方法。 ３ ラテツクスがポリスチレン系ラテツクスであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の診断用ラテツクス試薬の凝集反応測定
   方法。