JPS63502726A - 組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えヒト組織プラスミノーゲン 活性化因子組成物 発明の背景 本発明は組換えＤＮＡ技術を用いてミエローマ細胞にょシ生産されたヒト組織プ ラスミノーゲン活性化因子組成物に関する。より詳細には、本発明は動物細胞に よシ作られた他の活性化因子調製物に比べて均一性が改良された組織プラスミノ ーゲン活性化因子組成物の生産方法に関する。

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は細胞から分泌されて、血管系 を循環している。それは血液凝固系と動的平衡状態にある線維素溶解系の一成分 を構成する。

線維素溶解過程は酵素前駆体のプラスミノーゲンから生成されるタンパク負加水 分解酵素グラスミンが関与している。

プラスミノーゲンは組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプ トキナーゼを含めた各種の化合物によりプラスミンに転化され、“活性化２され る。

欧州特許公開第４１７６６号明細書は、正常組織から分離されたヒト組織プラス ミノーゲン活性化因子と免疫学的にもアミノ酸組成においても区別できないと記 されているｔＰＡを分泌するヒト黒色腫細胞株を開示している。この細胞株（Ｂ ｏｗｅ’ｓ黒色腫と呼ばれる）は当業者にヒ）　ｔＰＡをコードするｍＲＮＡの 培養可能な供給源およびタンパク質それ自体の供給源を提供した。これらの発明 は、　ｔＰＡの存在を確実に検出する検定法の開発と共に、ヒ）　ｔＰＡ遺伝子 のＤＮＡ配列の確立した方法による推定を可能にした。これらの方法は大きさに 基づいて分画化した黒色腫細胞株由来のｍ　ＲＮ　Ａから逆転写酵素にょシ作製 されたｅＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーション実験において使用 される放射性標識オリゴヌクレオチドプローブの作製を包含する。例えば、ペニ カ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）らの下記文献を参照されたい。組換えＤＮＡ技術の開発 に参加した人達は、通常ヒ）　ｔＰＡを生産しない細胞によるヒトｔＰＡのアミ ノ酸配列を有するタンパク質の発現を達成した。例えば、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨＯ）細胞によるｔＰＡ遺伝子の発現を開示している英国特許第２１ １９８０４Ａ号明細書（１９８３年１１月２３日発行）を参照されたい。

種々の培養可能な細胞株にょるヒ）　ｔＰＡのアミノ酸配列の発現は目下のとこ ろ当分野の技術の範囲内であるが、このタンパク質分子にそのフィブリン親和性 および酵素活性と深い係シをもつ２次および３次構造的特徴を付与するために、 このタンパク質の有意な翻訳後修飾を必要とすることは広く認められている。天 然タンパク質のアミノ酸配列から成るが、適当なコンホメーションをとらないタ ンパク質は酵素として不活性であるか、あるいはフィブリンに対する親和性が低 いか又は全くない。従って、一般にｔＰＡはその後のｉｎ　ｖｉｔｒｏ修飾を欠 く原核細胞や酵母では生産できないことが当分野で認められている。なぜなら、 これらの発現系はその分子を正確にグリコジル化したり、あるいは適当なジスル フィド結合を形取したりするのに必要な分子機構をもたないからである。

ＣＨＯ細胞によシ生産されたヒ）ｔＰＡ産物は現在臨床試験にかけられている。

一般に、このｔＰＡ産物は往々にして有意な末梢出血を起こしくこのことはフィ ブリンに対するその親和性がそれほど高くないことを示唆している）、また血管 内線維素溶解剤としてｉｎ　ｖｉｖｏ　で使用したとき期待はずれの活性レベル を示すことが判明した。これらの観察は、現在利用し得るヒト組換えｔＰＡ産物 が３次構造レベルで天然タンパク質と相違することを示唆している。

従って、これらの商業産物はアミノ酸配列において天然に生産されたヒ）　ｔＰ Ａと一致するが、この重要な面においてそれらは内因性ヒ）　ｔＰＡと同じ物質 ではない。

もしも組換え宿主細胞によシ生産されたｔＰＡの翻訳後修飾を改良するための手 段が見出されなければ、心筋梗塞、深部静脈血栓症、心臓発作、塞栓症、および 他の血管障害を治療するためのこの新薬の期待された利用が実現しないであろう 。

さらに、一般の人々がｔＰＡから利益を受ける前に、産業界では生産および精製 技術のスケールアップを図らなければならない。商業生産段階でのこの技術の開 発は多くの困難な技術的問題をもたらす。例えば、それらには、動物細胞が通常 血清を補給した培地でのみ高密度へ増殖し、しかも血清がｔＰＡ産物を加水分解 し、それと結合し、あるいはその活性および／または収量を低下させるタンパク 質を含有していることが含まれる。また、意図する高濃度ではｔＰＡが沈殿する 。

本発明の目的は、現在利用し得るｔＰＡ産物に比べて均一性が改良されたヒト組 織プラスミノーゲン活性化因子組成物を提供することである。他の目的は、天然 物質によく似たｔＰＡ産物を生産するために、組換えＤＮＡ技術を用いてヒトｔ ＰＡを生産する方法を提供することである。さらに他の目的は、培地からのｔＰ Ａの効率のよい精製方法を提供することである。

本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の詳細な記述ならびに請求の範囲 から当業者には明らかであるだろう。

発明の概要 今や、ミエローマ細胞はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の発現および翻訳 後修飾にとって理想的な細胞型であることが分かった。ｔＰＡ遺伝子を発現する 能力を与えるように考案されたベクターで形質転換されたミエローマ細胞は、ｔ ＰＡ活性を有しかつ他の既知の形質転換細胞型またはＢｏｗｅ’ｓ黒色腫細胞に より作られたｔＰＡ産物と比べて均一性が改良された、構造的に関連のあるタン パク質の混合物を生産することができる。さらに、ミエローマ細胞は１つの細胞 の種類として培養が比較的簡単であり、血清の補給なしで細胞外培地中にｔＰＡ ’ｉ分泌させるよう誘導することができる。また、イプシロンアミノカプロン酸 （ＥＡＣＡ）、好ましくはクエン酸緩衝液中のＥＡＣＡ　、は中性のｐＨ範囲で ヒトｔＰＡの溶解性を維持するために使用でき、さらにＥＡＣＡは発現された一 本鎖形の加水分解切断を阻止するのに有効であることが見出された。

１つの面において、本発明はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子組成物の生産 方法から成る。この方法は培養可能なミエローマ細胞株において、ヒ）　ｔＰＡ のコード配列から成るＤＮＡ　（第２図参照）またはその対立遺伝子変異型、同 じアミノ酸配列をコードする異なるＤＮＡまたはその対立遺伝子変異型、もしく は類似のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現させ、その後ｔＰＡ産物を 収集する各工程から成っている。Ｊ５５８Ｌ細胞（米国メリーランド州ロックビ ル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ 　Ｊ３２として寄託済み）ヲトランスフェクションすることにより作られたｔＰ Ａ発現用形質転換細胞が好適である。Ｊ５５８Ｌ５５８Ｌ細胞グロブリンＡのラ ムダ軽鎖を分泌するが、完全な免疫グロブリン全分泌しないネズミ・ミエローマ （骨髄腫）テある。

好適な面において、ｔＰＡを分泌するミエローマ細胞株＋儂ｔＰＡの収集に先立 って添加血清を含まない培地中に維持され、そして細胞は多孔質マイクロカプセ ル中で培養される。ＥＡＣＡは一本鎖ｔＰＡタンパク質の加水分解を阻止するた めに組織培養基中で使用されるう精製は高表面積ガラス上でおよび活性化因子の エピトープに対する結合抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を有するアフィ ニテイマトリックス上で培地中のタンパク質を分画化する工程を伴うプロトコー ルを使用して達成される。好ましくは、溶解性および高活性を維持するために、 活性化因子はＥＡＣＡ含有クエン酸イオン溶液を用いて固定化抗体マトリックス から溶出される。タンパク質溶液のｐＨが上昇するにつれて、ＥＡＣＡは溶解性 を維持する。この方法はクエン酸イオンとＥＡＣＡを含む生理学的に適合しうる 緩衝液中に溶解された高活性ｔＰＡ産物をもたらす。

このようにして得られた精製産物は次の特徴を有する：（ａ）　調製物中に含ま れる全活性タンパク質の９０％以上は一本鎖の高活性ヒ）　ｔＰＡである；（ｂ ）　ここに記載するようなポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたとき、ｔＰ Ａ組成物はそれぞれのグリコジル化レベルにより区別される２つのバンドに分離 され、主要量の低分子量バンドは全活性タンパク質の少なくとも約７０チ、一般 には約９０％以上を占める；（Ｃ）　この組成物はまた最初の３５アミノ末端残 基金欠く全長ヒ）　ｔＰＡタンパク質（“成熟型＃）の既知アミノ酸配列から成 るタンパク質を少なくとも約７０チ、好ましくは約９０％以上含有する。一般に 、残シの活性タンパク質の本質的に全部はそのアミノ末端にＧｌｙ　Ａｌａ　Ａ ｒｇ　）リペプチドを有する同一のアミノ酸配列から成る。

この組成物は治療上有効な線維素溶解作用を有する注射用組成物を提供するため に、クエン酸イオンとＥＡＣＡを含有する生理学的に適合しうる溶液中に高濃度 で溶解させることかできる。動物実験により、このようにして製造されたｔＰＡ はＣＨＯおよびＢｏｗｅ’ｓ黒色腫により生産された従来技術の物質と少なくと も同程度に活性であることが分かった。発色基質Ｓ−２２８８テスト系を使用す る　１ｎｖｉ　ｔｒｏ　試験では、ここに記載のｔＰＡが単量体フィブリンで活 性化されたときＶｍａｘの増加を示しくＫｍ　の減少を示さず）、こうして少な くとも高濃度の基質において、それが従来技術のｔＰＡよりも触媒としてより効 果的な調製物であると判明した。この新しいｔＰＡの薬物速度論的性質をさらに 解明するよう考案された霊長類動物に対する試験により、この差異が実際的な治 療効果をもつかどうか判定さｎるだろう。

本発明は以下の詳細な記述、請求の範囲および図面を参照することによりさらに 理解されるであろう。

詳細な記述 本発明は既知の公表された配列と同じであるか又は類似しているアミノ酸配列か ら成るが、そのグリコジル化パターンおよびタンパク質亜種の分布において現在 利用可能なｔＰＡ産物と相違している新規なヒト組織プラスミノーゲン活性化因 子組成物を提供する。本発明はミエローマ細胞が翻訳後かつ分泌前にｔＰＡタン パク質を修飾し得る細胞内環境を提供し、それにより改良された比較的均一な産 物をもたらすという発見に基づいている。動物実験およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ　試 験は、効力および治療効果の見地から、本発明のｔＰＡ組成物がＢｏｗｅ’ｓ黒 色腫ｔＰＡと類似しており、但しこの新しいｔＰＡがフィブリンの存在下でＶｍ ａｘの増加を示すのに対して、Ｂｏｗｅ’ｓまたはＣＨＯによシ生産されたｔＰ ＡはＶｍａｘ　の増加を示さないことを明らかにした。

図面を参照すると、第１図は一本鎖ｔＰＡタンパク質の２次元モデルを示す。各 アミノ酸についての標準的な一文字略号を開放円の中に示す。棒線はジスルフィ ド結合の推定位置を示す。三角形は重鎖と軽鎖の間の切断部位を示す。

記号Ｓｅｔ　、　Ａｓｐ　、　Ｈｉｓはプロテアーゼ活性部位であると考えられ る個所を規定している〔ニー（Ｎｙ）ら、Ｐｒｏｅ・Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ、　Ｖ、　８１．１９８４、ｐ、ｓ　３５８を参照〕。図示 したモデルでは、４つのアスパラギン残基１０．１２．１４および１６がグリコ ジル化されているように例示されている。最初の３５残基は成熟過程中にタンパ ク質から切断され、慣例によシー３５〜−１と番号が付けられるが、その際−１ 残基が成熟タンパク質の第１番目の残基（Ｓｅｔ＋１）に隣接する。

第１図に示したモデルは内因性ヒ）　ｔＰＡの正確なモデルではないかも知れな い。明らかなことは、ミエローマ細胞により作られたｔＰＡが黒色腫またはＣＨ Ｏ細胞において発現されたｔＰＡとは構造的に相違するということである。新規 ｔＰＡと従来技術物質との構造上の関係はまだ十分に解明されていないが、Ｂｏ ｗｅ’ｓ黒色腫から生産されたｔＰＡは２つの密接に関係のあるｔＰＡ種：すな わち、糖残基がグリコジル化部位１０および１６に結合したもの（約７０重量％ ）；および糖残基がグリコジル化部位１０．１２および１６に結合したもの（約 ３０重量％）から成ることが確立されている。Ｂｏｗｅ’ｓ黒色腫ｔＰＡではグ リコジル化部位１４に糖残基が全く見当らない。ミエロ・−マ細胞から作られた ｔＰＡのグリコジル化パターンはまだ分がっていない。しかしながら、２つのｔ ＰＡ種が一般にＢｏｗｅ’ｓ黒色腫細胞からのｔＰＡ種の７０：３０の比を越え る比率で生産される。本発明方法を使用する生産実験では、９０：１０より大き い比がしばしば得られ、その際主要分画は軽度にグリコジル化されていて、少量 分画よりも低分子量を有する。本組成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動分離 はしばしば低分子量形の明らかな単一バンドをもたらす。

第１図においてＢで表示したグルタミン−グルタミン酸結合は、未切断ｔＰＡ分 子の残部からシグナルペプチドを区別していると考えられる。Ｂｏｗｅ’ｓ細胞 培養物および他の天然源から分離したｔＰＡはプロ配列として切断される数個の 追加残基をもつもので、更なる切断が起こるに違いない。ミエローマ細胞中の酵 素はこのタンパク質のＮ末端を特異的に切断して、セリン（第１図のアミノ酸３ ６、成熟タンパク質の＋１）で始まるタンパク質亜種を優位量で生産させる。図 面のアミノ酸３３のグリシン（−３）で始まる比較的長いタンパク質もしばしば 少量生産される。一般には、全活性タンパク質の約７０％、好ましくは９０％以 上が短い方のタンパク質亜種である。

Ａｒｇ−１１ｅ　（アミノ酸２７５−２７６）の間の矢印は、このタンパク質の ジスルフィド結合された二本鎖形をもたらすエントゲロチアーゼによる攻撃に対 して開裂する切断部位を示す。培地および収集した産物中にイプシロンアミノカ プロン酸のようなプロテアーゼ阻害剤を添加すると、一本領の切断が妨げられ、 その結果本発明組成物中の活性タンパク質の９０％以上が一本鎖形となる。

本発明で使用する発現ベクターおよびミエローマ形質転換細胞を作製するための 組換えＤＮＡ技術はよく知られており、開発されている。それらはＤＮＡの配列 特異的切断を行って平滑末端または接着末端を作る種々の制限酵素、ＤＮＡＩＪ ガーゼ、平滑末端化ＤＮＡ分子への接着末端の酵素的付加を可能にする技術、ｃ ＤＮＡ合成技術、特定機能を有する遺伝子を単離するための合成プローブ、慣用 のトランスフェクション技術、および同様に慣用的なりＮＡクローニング／サブ クローニング技術の使用を伴う。プラスミドやウィルス（動物ウィルスおよびフ ァージを含む）のようないろいろなタイプのベクターが使用される。ベクターバ 一般に首尾よくトランスフェクションされた細胞に検出可能な表現型特性（細胞 集団のどの個体がベクターの組換えＤＮＡを首尾よく組込んだかを同定するため に使用される）を付与する種々のマーカー遺伝子を利用するであろう。ミエロー マ細胞株において使用するのに適したマーカーは、細胞によって通常発現されな い（または低レベルでのみ発現される）酵素をコードするＤＮＡから成り、その 酵素はトキシン含有培地での細胞の生存を可能にする。このような酵素の例には チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ａ ＰＲＴ）、およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ ）、これらはそれぞれＴＫ−１ＡＰＲＴ−１またはＨｐＲＴ−欠損細胞をヒボキ サンチン／アミノプテリン／チミジン培地中で生育させる；ジヒドロ葉醒還元酵 素（ＤＨＦＲ）、これはＤＨＦＲ−欠損細胞をメトトレキセートの存在下で生育 させる；大腸菌酵素キサンチン−グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ （ＸＧＰＲＴ、、、を遺伝子の産物）、これは正常細胞をミコフェノール酸の存 在下で生育させる；および原核生物酵素Ｔｎ　５ホスポトランスフエラーゼ、こ れは正常細胞をネオマイシンの存在下で生育させる；が含まれる。他の適当なマ ーカー遺伝子も本発明に従ってミエローマ細胞を形質転換するときに使用される ベクターにおいて有用であるだろう。従って、以下の例はすべての点で例示的で あることを理解すべきであり、本発明を具体化するｔＰＡ生産プロトコールの詳 細な記述および本発明全実施するための現在知られている最良の態様の記述を提 供する。

第２図はＡＴＧ開始コドンから始まってＴＧＡ翻訳停止シグナルで終る、文献か ら取った。天然ヒ）　ｔＰＡの全コード配列であると考えられるものを示す。こ の遺伝子はシグナルペプチド領域をコードする塩基を含むが、通常停止シグナル を越えて存在する３′非翻訳領域とポリＡ化部位を含まない。塩基には２０から １７１０までの番号がついている。このコード配列はここに請求したｔＰＡ金生 産すべくミエローマ細胞株にトランスフェクションされた発現ベクターを作製す るために使用されたものである。しかしながら、当業者は遺伝暗号の重複ゆえに 第２図に示したものとは異なるが、同一タンパク質配列をコードする別のＤＮＡ を構築し得ることを認めるであろう。この遺伝子の天然対立遺伝子変異型も個々 に存在しうる。また、コード配列への種々の挿入または欠失、塩基置換、もしく は付加が天然遺伝子によりコードされるタンパク質のようにミエローマ細胞内で 翻訳後修飾されるヒ）　ｔＰＡアミノ酸配列配列たらすこともあり得る。互いに 相違するが機能的に作用するアミノ酸配列を定める遺伝子から作られたこの種の タンノくり質はすべて本明細書において類似配列と呼ばれる。このような類似配 列はすべて均等物質として本発明の範囲内に含まれるものである。

第３ａ〜３ｄ図および第４図はそれぞれ本発明のｔＰＡ生産方法で使用する好適 なプラスミドベクターのヌクレオチド配列、ならびにそのプラスミドの制限地図 を示している。この好適なベクターは、ＥＭ、１−ｔＰＡ　と呼ばれ、７５３３ 塩基対から成るっそれはｔＰＡｔコードするｃＤＮＡからのｍ　ＲＮ　Ａの転写 を促進するエンノ・ンサー因子を含み〔ギリｘス（Ｇ１１ｌｉｅｓ　）ら、Ｃｅ １ｌ、１９８３および米国特許第４６６３２８１号を参照〕、そして係属中の米 国特許出願第８３７５９５号（１９８６年３月７日付）の記載に従ってエンノ・ ンサー機能を選択的に調節するー；クター構築原理を利用している。全長ｔＰＡ 　ＤＮＡの天然３′非翻訳領域はｍ　ＲＮ　Ａの安定性を高めるために切断され た。

第３図および第４図に示したベクター、および他＋７）！当な発現ベクターは細 胞株Ｊ　５５８　（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ　６　）、ｓ、２／　Ａｇ　１４　（ＡＴ ＣＣＣＲＬ　１５８１　）　、およびＰ３Ｘ６８−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣ ＣＲＩ、１５８０）のよう々ミエローマ細胞、好ましくはネズミ由来のミエロー マ細胞、をトランスフェクションするために、本発明に従って使用される。好適 なミエローマ細胞株はＪ　５５８　Ｌ（ＡＴＣＣＣＲＬ　９１３２、オイ（Ｏｉ ）ら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、Ｖ、８０．ｐ−８２５，１９８３ｇ参照〕である。

これらの細胞はＢａ１ｂ／Ｃマウスの循環系からのＢ細胞の悪性形質転換体から 成シ、骨髄組織から誘導される。ネズミまたはラット由来のミエローマ細胞の使 用はヒトミエローマ細胞よシも好適である。その理由はヒトウィルスによる組換 えｔＰＡの汚染の可能性が非常に少ないからである。

上記のタイプのミエローマ細胞は懸濁液中で、好ましくはＦ、　Ｌｉｍ　の米国 特許第４４０９３３１号（その記載内容は参照によシここに引用される）に記載 された方法に従ってマイクロカプセル内で、培養され得ることが見出された。精 製を容易にし且つｔＰＡ産物の分泌後の安定性を高めるために、細胞は無血清培 地中でイプシロンアミノカプロン酸の存在下に培養することが好ましい。細胞外 産物は培地を取り換えるとき毎日収集される。この方法にはウシまたはウマ血清 中にしばしば存在するタンパク質加水分解酵素、ｔＰＡ複合体形成剤、および他 の不活化因子夾雑物の影響を実質的に受けない産物をもたらす利点がある。好適 なＪ５５８Ｌ細胞は有意な量で免疫グロブリンＡのラムダ軽鎖を分泌するっこの タンパク質および他の夾雑タンパク質は以下で述べる単純な精製法を使ってｔＰ Ａ産物から簡単に分離することができる。本発明に従って精製されたｔＰＡ産物 は分泌されたときのこの分子の活性を保持している。

ｔＰＡはガラスを含めた多くの表面に付着することが観察さｎ、この理由のため にｔＰＡ生産生産グツトコール体を通してガラス器や他のガラス表面の使用が通 常回避される。しかしながら、いろいろな製造業者からビーズ形で市販されてい る１制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅｇｌａｓｓ　）　”とし て知られた材料のような高表面積ガラスは初期精製段階で使用できるっ　ｔＰＡ は適当なｐＨ条件下でガラスに結合するが、例えば、免疫グロブリンは低い非特 異的親和性しかも−たないので、制御細孔ガラスカラムを通過するか、又はその カラムから選択的に溶出されるだろう。

ｔＰＡに富む分画はトリス緩衝化食塩液のような適当な溶離剤で処理することに よりガラスから溶出できる。制御細孔ガラスによる分画化は収集培地からのｔＰ Ａ産物の４０〜５０倍の濃度増加および３０〜４０倍の精製をもたらす。

その後の精製段階は活性化因子のエピトープに対する固定化抗体（好ましくはモ ノクローナル抗体）を使用する慣用のアフイニテイクロマトグラフイーを包含す る。ｔＰＡはクエン酸イオン溶液を用いてｐＨ３で抗体マトリックスから溶出で きる。その後、ｔＰＡ含有分画は生理学的ｐＨへ中和する（　ＥＡＣＡはこのｐ ＨでのｔＰＡの沈殿を防ぐ）。

この溶液は９０％以上が一本領活性ヒ）ｔ’ＰＡから成るタンパク質含有物（一 般にはほんの少量の二本鎖物質を含む）を有する。この溶液はクエン酸緩衝液と ＥＡＣＡが静脈内注射での使用を認可されているので、そのままで治療上の使用 に適している。

本発明は以下の非限定的実施例からさらに理解されるで発現ベクター、ＥＭ、１ は次のフラグメントから構成されていｆ４：（ａ）ＳＶ４０エンハンサ−および 初期領域プロモーター、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、ＳＶ４０小型腫瘍抗原介在配列、 およびＶＳ４０転写終止シグナルならびにポリＡ化シグナルを含む　ｓｖ　２− ｇｐｔ　Ｃミュリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　）およびバーブ（Ｂｅｒｇ　）　、 ′５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖ、　２０９．１４２２〜１４２７．１９８０を参照〕由 来の２．２５　ｋｂ　Ｐｖｕ　１１−　ＢａｍＨＩフラグメン）　；　（ｂ）ア ンピシリナーゼ遺伝子および細菌の複製起点を含むｐＢＲ３２２由来のＺ　３　 ｋｂ　Ｐｖｕ　ＩＩ−Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメント〔サトクリフ（５ｕｔｃｌｉｆ ｆｅ　）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ、Ｖ、　７５．３７３７．１９７８を参照〕； （ｃ）免疫グロブリン重鎖エンハンサ−を含む０．３　ｋｂ　Ｐｖｕ　ｌｌ−Ｅ ｃｏＲＩフラグメント〔ギリエス（Ｇ１１ｌｉｅｓ　）ら、Ｃｅ１ｌ。

■、３３、ｐ、７１７〜７２８．１９８３を参照］；（ｄ）メタロチオネインＩ プロモーターを含む０．２５　ｋｂ　Ｓａｃ　Ｉ−Ｂｇｌ　ｎフラグメント〔プ リンスター（Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ　）ら、Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖ、　２９６．３９〜４２．１９８２を参照〕；および（ｅ）ポリＡ化シグナル を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の３′非翻訳領域（ＵＴ）からの０．４ 　ｋｂ　Ａｖａ　Ｉｆ　−Ｈａｅ　［１フラグメント〔マックス（ＭａｘＪら、 Ｊ、　Ｂｉ゛ｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖ、　２５６．５１１６〜５１２０．１ ９８１　を参照〕。免疫グロブリン軽鎖プロモーター、ＴＡＴＡＡ配列、転写開 始部位、および最初の２２ヌクレオチドを含む０．２６　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　− ＢｓｔＮＩフラグメントはその後ＩｇＨエンハンサーセグメントの一端に位置す るＳａｌ　１　部位に平滑末端連結したつこのプロモーター配列は免疫グロブリ ン重鎮エンハンサ−による大腸菌ｇｐｔ遺伝子転写の増強を遮断するために加え た。これらのフラグメントは公知の方法論に従って一連の反応により一緒に連結 させた〔例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラークローニン グ：　実ｈｉマニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２を参照さ れたい〕。

ｔＰＡのｃ　Ｄ　Ｎ　’Ａは標準技法により作製した（マニアチスらの上記文献 参照）。Ｂｏｗｅ’ｓ細胞培養物から分離したポＩＪＡ”ＲＮＡは逆転写酵素に よる第−鎖合成のためにオリゴ（ｄＴ）を付加し、第二鎖合成のためにＲＮａｓ ｅＨおよ０ＤＮＡポリメラーゼＩで二ツクトランスレーションヲ行い〔ガプラー （Ｇｕｂｌｅｒ　）　＆ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ　）、Ｇｅｎｅ　、　Ｖ、　 ２５．２６３．１９８３を参照〕、ＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル化し、Ｅｃｏ 　ＲＩリンカ−へ連結し、そしてラムダファージベクターｇｔ１０のＥｃｏＲ１ 部位に挿入した。ファージプラークは放射性標識したオリゴヌクレオチドｔＰＡ 特異的プローブを用いてスクリーニングし、これらのプローブの塩基配列はｔＰ Ａ　ｃＤＮＡの発表されたＤＮＡ配列から決定した（ペニカら、Ｎａｔｕｒｅ、 　Ｖ、　３０１、ｐ、２１４〜２３１．１９８３年１月を参照）。全コード領域 および約８００塩基対の３’ＵＴ領域を含むｔＰＡクローンはヌクレオチド塩基 配列決定にょシ固定・確認した。

ｔＰＡ　ｃＤＮＡの非常に長い３’ＵＴはメツセンジャーＲＮＡを不安定にする ことが分かった。従って、３’　Ｕ　Ｔ領域の大部分は翻訳停止部位の３４ヌク レオチド下流に位置する５ａｕ３Ａ　部位で切断することによシ除去した。末端 切断した３’ＵＴをもつｔＰＡ　ｃＤＮＡを含む１．７ｋｂ　フラグメントはＸ ｈｏｌ　リンカ−へ連結させた。

その後、ｔＰＡ　ｃＤＮＡフラグメントは、ＥＭ、１　ベクター中に存在する唯 一のＸｈｏ　１　部位に挿入して組換えプラスミド、ＥＭ、１−ｔＰＡを作った 。ベクターｐＥＭ、１−ｔｐＡの模式図を第４図に示す。このベクターの完全な ヌクレオチド配列は第３Ａ−３Ｄ図に示す。

ｔＰＡ含有プラスミドはプロトプラスト融合法にょシＪ５５８Ｌ　ミエローマ細 胞にトランスフェクションした（ギリエスらの上記文献参照）。プラスミドを保 有し、それ故にｇｐｔ遺伝子を保有する細胞は、ミコフェノール酸を含む培地中 で培養することによシ選択した。ｐ　ＥＭ　ｐ　１−ｔＰＡ　ｉ保有する耐性コ ロニーはサブクローニングして、ｔＰＡ発現についてスクリーニングした。ｔＰ Ａの合成おょび培地への分泌は、ｔＰＡがプラスミノーゲンをプラスミンへ転化 し、その後プラスミンが発色性トリペプチド５２２５１を分解する検定法を用い て調べた（ペニカらの上記文献参照）。血清はｔＰＡとプラスミンの両方の阻害 剤を含むことが知られているので〔；シン（Ｃｏ１１ｅｎ　）およびリネン（Ｌ ｉｊｎｅｎ　）、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＯｎｃｏｌｏ ｇｙ　／　Ｊ（ｅｍａｔｏｌＯｇｙｗ　ｖ、４，２４９〜３０１，１９８６を参 照〕、形質転換細胞は検定前に無血清培地で４８時間培養した。活性は世界保健 機関（Ｗｏｒｌｄ　ＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　）により供給され た標品に基づいて国際単位（ＩＵ）で測定し、そしてアメリカン・ダイアグノス テイクス社製のｔＰＡ標品によシ確認した。

、ＥＭ、１−ｔＰＡによシ得られた１６個の形質転換細胞が培地中のｔＰＡ活性 について検定された。１６個のうち７個が陽性であり、活性は１０００〜６００ ０ＩＵ／−の範囲であった。

細胞培養 指定した形質転換Ｊ５５８Ｌ細胞のクローンは、実験室規模でのｔＰＡ生産を伴 う次の実験のために選択した。このクローンの種培養物は１０％ウシ胎児血清（ ハゼルトン）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび２ｒｎＭグルタミンを補 給したダルベツコ修飾イーグル培地（ギブコ社、カタログ≠３２０−１９６５　 ）中で増殖させた。

約Ｉ　Ｘ　１０６細胞／−の密度での約６　Ｘ　１０９個の生存細胞（トリパン ブルー排除により測定した生存率９０チ）は１、２５　Ｋ　ｒｐｍで１５分間遠 心した。上清を除き、細胞は２５ＴＩ単位／ｌｎ１．のアプロチニン（プロテア ーゼ阻害剤）をさらに補給した上記の修飾ダルベツコ培地（但し血清不含）中に 再懸濁した。約Ｉ　Ｘ　１０’細胞／−の生存細胞密度を有する細胞悲濁液の１ ５００１ｎｔ７リコートをベルコ・マイクロキャリアー・スピナーフラスコ中に 分配した。これらの培養物を３７℃で３日間培養し、遠心し、−緒に合わせ、そ して０．０１％界面活性剤（ツイーン８０）および５ｍＭＥＤＴＡの濃度にした 。

これらの培養物がｔＰＡ’ｉ生産することは、プラスチック製ピペットで１−の 試料を抽出することによシ調べた。

ｔＰＡの存在についてのＥＬＩＳＡによる半定量分析およびｔＰＡ活性について の検定により、これらの培養物が主に（９５％以上）一本鎖構造のｔＰＡを生産 することを確かめた。

大規模生産のために、リム（Ｌｉｍ）の方法（米国特許第４４０９３３１号を参 照）に従って細胞培地をカプセル封入し、そして常用量の２倍のアミノ酸を含み 且つＣａＣｌ２濃度の低下した培地（ＥＭＡ）中で培養した。

カプセル内で十分に増殖させたサブクローンは単離し、上記のようなスピナーフ ラスコ中で培養し、その後実験室規模のｔＰＡ生産実験用の種培養物として使用 した。細胞培養物は１．６％アルギン酸ナトリウムと混合し、球形にし、ＣａＣ １□溶液に加えて細胞を保有するゲルボールを形成させたつこれらは２５’Ｉ’ Ｉ単位／−のアプロチニンを含む塩化ナトリウム溶液中に懸濁した。アルギン酸 カルシウムゲルボールは食塩水中で３回洗い、ボＩＪ　Ｌ　ＩＪレシン水溶液（ ０，９チ塩化ナトリウム中７５０■／ｌ）中に６分懸濁してゲルボールのまわり にヒドロゲル膜を沈着させた。カプセルを沈降させ、上清を吸引除去し、次いで カプセルを０．６％ＮａＣ１および０．２％Ｃａ　Ｃ１２を含む水溶液中の２％ ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ８，４）６０−で洗浄した。３分後、カプセル全０．３％ Ｃａ　Ｃ１ｚ中で３分、次に生理食塩液中で３分洗浄し、その後０．９％ＮａＣ １洗浄液中のＰＬ、Ｌの４００ｗｑ／を溶液を５分間使用して、ポリしりシン（ 平均分子量約６２０００ダルトン）で２回目の被覆を行った。その後、カプセル は沈降させ、上清を吸引除去し、食塩液で洗い、そして食塩液中の０．１５　’ ％アルギン酸ナトリウム（低粘度）溶液中で４分間処理した。その後カプセルは 食塩液で１回以上、０．９１ＮａＣ１中の５５ｍＭクエン酸ナトリウムで２回（ １０分、６分）洗浄してカプセル内部を再液化した。これらの細胞含有カプセル はその後食塩液、ＥＭＡ培地、５％血清およびイプシロンアミノカプロン酸を補 給したＥＭＡ培地中で洗い、そして血清、イプシロンアミノカプロン酸、２ｍＭ Ｌグルタミンおよび１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む培地で再度洗浄した。

カプセルは１−当たり２．２５Ｘ１０６個の細胞を含んでいた。カプセル１００ −は３リツトルのスピナーフラスコ中で培地１．５ｔを用いて培養した。カプセ ル化培養物は５チ血清、２ｍＭＬグルタミン、５ｍＭＥＡＣＡおよび１０ｍＭＨ ＥＰＥＳ　を補給したＥＭＡ培地中に１３日間懸濁させた。

カプセル内の細胞密度が約１０７細胞／ｄより大きくなったとき、カプセルを無 血清滅菌培地で洗い、次いで１〜／ゴウ７血清アルブミン、２０μＭフルクトー ス第二鉄、１ｐｙ／ｍｔずつのりメール酸とオレイン酸、５ｍＭＥＡＣＡおよび Ｌ２ｐｆ／−エタノールアミンを補給したＥＭＡ培地から成る無血清培地中に懸 濁した。カプセル化培養物はこの培地中でさらに１２〜３０日間維持した。培地 容量の約２／／３を毎日取り換えた。無血清培地に変える前に、細胞密度は２． ８Ｘ１０’細胞／−カプセルに達した。細胞の３９．７％が生存しており、生存 細胞密度は約１．１１Ｘ１０’細胞／−であった。無血清培地に変えた後、２日 間は増殖が遅かったが、その後６日間以上増殖し始め、そして６．７５Ｘ１０’ 全細胞／−の高細胞密度に達した。このときの生存率は４８．３チであり、全生 存細胞密度は３．２６Ｘ１０７細胞／−であった。生存細胞のカウント数がピー クに達した後培養物が死滅するまでに約３日以上かかった。最後の３日間の培養 中に生存細胞のカウント数は降下するが、カプセル１１ｎｔ当たシの細胞の総数 を約ｌＸｌ０’に到達させるのに十分な生存細胞がまだ存在していた。

培地の試料は１５日目に開始して２５日目まで採取し、ｔＰＡ生産を証明するた めに活性検定およびＥＬＩＳＡによシ検定した。

培地中のｔＰＡは、初めにカラムに充填した高表面積ガラスマトリックス（制御 細孔ガラス、シグマＰＧ−１０００−２００）　にそれをさらすことにより精製 した。カラムは１００ｍＭＮａＯＨ４Ａで洗い、次いで１００ｍＭ　ＨＣｌ４１ と脱イオン水４ｔで洗った。その後、カラムに培養物からの無血清培地を装填し た。血清含有培地も使用できるが、それはカラム容量を非常に減少させる。培地 は６μ７シールクリーンフイルターを通して濾過し、そして２５５ｃｍ／時の流 速でＣＰＧカラムに装填した。カラムは２００ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，３ ）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０１　％界面活性剤（ツイーン８０）、５ｍＭ 　ＥＡＣＡおよび５００ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液４ｔで洗った。この段階では 弱く結合したタンパク質、例えばアプロチニンやｔＰＡ産生クローンから分泌さ れたＩｇＡ軽鎖、が溶出される。

ｔＰＡは５００ｍＭ）リスＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０１ ％ツイーン８０．５ｍＭＥＡＣＡ　および１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝： ｒＬ４ｔで溶出される。この段階では結合ｔＰＡが溶出さｎ、他のタンノリ質と 混じり合った約５０％ｔＰＡを含む分画が得られる。

その後カラムば１００　ｍＭ　ＮａＯＨ４１１次に１００　ｍＭＨＣ１４ｔで洗 浄して、再循環用の残りのタン／くり質をすべて溶出する。

前記方法はｔＰＡ濃度の４０〜５０倍増加および３０〜４０倍の精製をもたらす 。精製効率は出発培地に含まれるウシ血清アルブミンおよび他のタン、＋り質の 量に左右される。この分離操作では一般に７０％以上のｔＰＡが回収される。

この粗製物質はその後さらにアフイニテイクロマトグラフィーで精製した。この 段階のために、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ　）の方法を使用して、ヒ）ｔＰＡ産物のエピトープに特異的なモノクローナ ル抗体を分泌するハイブリドーマを作った。Ｂａ１ｂ／Ｃマウスをアメリカン・ ダイアグノステイクス社製のヒトｔＰＡで免疫感作した。ゼロ８目に、完全フロ インドアジュバント中の物質１０μりを腹腔内（ＩＰ）注射した。１４〜１５日 後に、不完全フロインドアジュバント中の追加のｔＰＡ　１０μりを２次免疫と してさらにＩＰ注射し、そして２１日８にマウス血清はＥＬＩＳＡで抗ｔＰＡ活 性についてスクリーニングした。１／１０００以上の希釈率で測定した５０％力 価が陽性読み取りとして採用された。

陽性動物はリン酸緩衝溶液中のｔＰＡ１０μりをＩＰ注射して追加免疫し、３日 後に殺した。それらの膵臓をふるいに強制的に通して単細胞懸濁液を調製した。

そのＢ細胞と５ＰＶＯミエローマとは４：１の比で一緒に８濁させた。

融合は４５％ポリエチレングリコール（１０００ダルトン）を用いて実施した。

クローンの選択はＨＡＴ培地中で７日間行い、その後生き残ったクローンを１０ ％ウシ胎児血清含有ＨＴダルベツコ最少必須培地中で増殖させた。融合頻度は１ 〜３　Ｘ　１０−’であった。ｔＰＡ抗体を分泌するクロテンはその後、二本鎖 および一本領ｔＰＡ種の両方と反応するがウロキナーゼや血清ｔＰＡ阻害剤と複 合体を形成したｔＰＡとは反応しない抗体を分泌するハイブリドーマについてさ らにスクリーニングした。こうして、選ばれたノ・イブリドーマはその酵素活性 に関与しないｔＰＡのエピトープに対するモノクローナル抗体を生産した。

抗体ゲルカラムはコーン（Ｋｏｈｎ）　およびウィルチェック（Ｗｉ　１　ｃｈ ｅｋ　）の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、　Ｖ、１０７、ｐ、ｓ７Ｂ〜８Ｂ４．１９８２　’ｉ参照）に従っ て、臭化シアン活性化セファロース（ファーマシア社製）にｔＰＡモノクローナ ル抗体を固定化することによシ作った。ゲルは１シアノ転移”試薬としてトリエ チルアミンを使用して６０チアセトン中−１５〜−２０℃で臭化シアンによシ活 性化する。その後、活性化ゲルを水（４℃）に移し、抗体を加えて塩化ナトリウ ム含有炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，３）中に感温するっ室温で２時間混合し た後、未置換基を炭酸塩緩衝液中でエタノールアミンによシ遮断する。通常、ゲ ル１−当たり５〜１０■の抗体が固定化される。

抗ｔＰＡセファロースは直径’１．６　ｃｒｎ、高さ４ｍのカラムに充填し、０ ．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、ＩＭＮａＣｌ　、２０　ｍＭ　イプ シロンアミノカプロン酸、および０．０１％ツイーン８０で平衡化した。イプシ ロンアミノカプロン酸は、抗体がグロテアーゼ（グロテアーゼ阻害剤の不在下で はｔＰＡの収率を減する恐れがある）で汚染されているので使用されるっ制御細 孔ガラス段階からの部分精製ｔＰＡ産物は５００　ｍｌのトリス、１．５　Ｍ　 ＮａＣ１、ＥＤＴＡおよび界面活性剤を含む。そのｐＨを７に調整し、それをカ ラムに加える。その後、カラムを２倍カラム容量のクエン酸緩衝液で洗い、次い で２０ｍＭイプシロンアミノカプロン酸および０．０１％ツイーン８０を補充し た０、１５Ｍクエン酸（ｐＩ（３，０）でｔＰＡを溶出する。代表的な溶出プロ フィールを第５図に示す。ｔＰＡを収集して、その溶液のｐＩ（を７に調整する 。これらの溶出容量の全タンパク質含量の９５％以上はヒ）　ｔＰＡである。

同定データ 一般に、精製ｔＰＡ組成物の９０％以上は、還元性ゲル上での分離によシ示され るように、−重鎖ｔＰＡ種から成る。

精製産物はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた 。その実験結果を第６図に示す。

この方法はレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）の方法（Ｎａｔｕｒｅ　、　２２−７． ６８０〜６８５．１９７０を参照）に従って還元条件下に１０％ゲル上で行った 。レーン１．２および９にはファーマシア社製の低分子量標品を負荷した。レー ン３〜８にはそれぞれ種々のｔＰＡ組成物５．０μ２を負荷した。レーン３およ び８は本発明のｔＰＡ組成物を含んでいた。レーン４および７はＣＨＯ細胞での 発現によシ作られた別々の供給源からのｔＰＡを含んでいた。レーン５および６ はＢｏｗｅ’ｓ黒色腫からのｔＰＡ組成物の２通りの試料を含んでいた。

ＣＨＯｔＰＡは黒色腫ｔＰＡまたはミエローマｔＰＡよりも遅く泳動するっＣＨ ＯおよびＢｏｗｅ’３物質は双方とも２つの別々のバンドとして泳動し、このこ とはグリコジル化の差異による分子量の不均一性を示している。上方のバンドは ３つのＮ−結合グリコシル化部位をもっｔＰＡの形のためであると考えられ、下 方のバンドは２つのＮ−結合グリコシル化部位をもつ形のためであると考えられ る。本発明のミエローマｔＰＡはＢｏｗｅ’ｓ黒色腫ｔＰＡと本質的に同じ泳動 度を有し、このことはそのグリコジル化が恐らく゛天然’　ｔＰＡのグリコジル 化とよく似ており、ＣＨＯ由来物質とは似ていないことを示している。

アプライド・バイオシステムズ４７０および４７７Ａ気相シークエンサーによる ミエローマｔＰＡのＮ末端アミノ酸配列決定は２つのｔＰＡ種の存在を示し、一 方はＳｅｒ＋１で出発し、そして他方はＳｅｔ＋１形の前にＧＬＹ　ＡＬＡ　Ａ ＲＧの配列を有する（Ｎ末端分析中に得られた第１配列対第２配列の比から測定 ン。Ｂｏｗｅ’ｓ黒色腫ｔＰＡでは２つの形体の比が１：１でちる〔ワシン（Ｗ ａｌｌｅｎ　）ら、Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２、ｐ、６８１〜６８６．１９８３を参照〕。

上記のようにして得られたｔＰＡ組成物は、他のｔＰＡ組成物および他の線維素 溶解調製物に対する血管内線維素溶解剤としてのその効力を評価するために、確 立されたプロトコールを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定および動物実験で十分に試 験した。

１組のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験において、本発明の主として一本鎖の組換えｔＰＡ 組成物（ＤＰＡ）の比活性を、いくつかの異なる源からのＢｏｗｅ’３黒色腫に より生産されたｔＰＡ：すなわち、アメリカン・ダイアグノスティックス社製の 一本鎖および二本鎖ｔＰＡ種、バイオスコツト社製の二本鎖ｔＰＡ種（ＢＳｄｃ 　）、および−重鎖ｔＰＡ種、と比較した。

異なるｔＰＡ種の線維素溶解作用は、ヒト血漿中の成分（プラスミノーゲンを含 む）を活性化して１２５Ｉ−フィブリノーゲン標識血塊を溶解するそれらの能力 を測定することにより調べた。血栓溶解度は血漿中に血塊がら放出された放射能 の量からめた。線維素原（フィブリノーゲン）溶解作用は、ｔＰＡにさらした後 の血漿中に残存する（それ故に凝血に利用される）　１２５Ｉの量を測定するこ とにより調べた。これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験は試験範囲内での用量関連効果 （ｄｏｓｅｒｅｌａｔｅｄ　ｅｆｆｅｃｔ　）を立証した。しかしながら、種々 のｔＰＡの溶解作用には有意な差が観察されなかった。

また、標準ｔ　ＰＡ　（Ｂｏｗｅ’ｓ黒色腫から生産されたｔＰＡ。

アメリカン・ダイアグノスティックス社製）に対するＤＰＡの直接および間接ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ活性検定を実施した。間接検定は発色性基質Ｓ−２２５１を必要 とし、直接検定は基質Ｓ−２２８８−ｉ必要とする。これらの試験方法は公知で ある（例えば、゛組織プラスミノーゲン活性化因子の活性検定の現状”　Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ａ７、Ｖｏｌ、４３４を参照）。間接検定 においては、Ｓ−２２５１がプラスミンにより切断されたときのその発色を測定 することにより、被験試料の活性を調べる。プラスミンはフィブリノーゲンの存 在下でプラスミノーゲンがｔＰＡにより切断されたときに形成される。直接検定 においては、ｔＰＡをプラスミンで切断して二本鎖亜種を形成し、プラスミンを 不活性化し、そしてその反応混合物にＳ−２２８８を添加する。２本領ｔＰＡＦ ｉ基質に直接作用する。活性は色の強さに比例する。

両方法では、Ｋｍ以上の基質濃度を使用した。

間接検定において、ＤＰＡはフィブリノーゲンの存在下で標準ｔＰＡ（約１０’ 単位／１Ｉｖ）の約２倍の活性を示し、直接検定でばＤＰＡと標準ｔＰＡの両方 の活性が本質的に同じであった。

別の試験において、ＤＰＡの活性はＳ−２２８８を使用する直接試験変法により 検定した。マドレックスｐｄ　１０２ビーズ（アミコン）にフィブリン単量体を 被覆した。ビーズは直径が１〜２ミクロンであり、Ｎヒドロキシスクシンイミド カルボキシレートエステル基およびタンパク質の遊離アミン基と共有結合する遊 離カルボキシル基を含むポリアクリロニトリルから成る。フィブリノーゲンをビ ーズに結合させた後、そのフィブリノーゲンをフィブリン単量体へトロンビンに より転化した。この試薬はその後直接活性検定で使用する。これらの実験はＤＰ Ａのフィブリンへの飽和可能な特異的結合を立証した。ＤＰＡはＫｍとしての一 般的反応速度定数約０．３３　ｍＭ”−’およびｋｃａｔ＝３．５１ｓ−’でフ ィブリン単量体の不在下にＳ−２２８８を加水分解した。

可溶性フィブリン単量体（１，５ｍＭグリコシループロリル−アルギニル−プロ リンの存在下でフィブリノーゲンから形成された６７μｆ／’ｒｎｔ）の存在下 では、酵素活性が有意に増大し、Ｋｍは約０．３４　ｍＭ”−”で比較的一定で あったが、ｋｃａｔ＝９．０２　ｓ−”であった。これらの実験結果は第７図に グラフで示す。フィブリン単量体によシ誘発されたこの活性増加は、ＣＨＯ由来 ｔＰＡおよびＢｏｗｅ’ｓ　ｔＰＡの場合（フィブリンによシ誘発される活性化 がｋｃａｔの有意な増加なしにＫｍの減少を伴う）と相違している。天然ｔＰＡ に関しては、フィブリンの存在下での活性増強がフィブリン結合ｔＰＡのプラス ミノーゲンに対する親和性の増加により引き起こされ、触媒の反応速度定数の変 更によるものでＤＰＡのｋｃａｔが増加したという観察は、過剰の基質を用いた 間接試験においてフィブリノーゲンの存在下でＤＰＡ活性が天然物質と比べて増 加したという観察と結び付けて考えると、ＤＰＡが異なる薬物反応速度論的行動 によって特徴づけられ、フィブリンの存在下でＶｍａｘを増加させることを示唆 している。

１群のｉｎ　ＶｉＶｏ　実験により、ＤＰＡの血栓溶解作用および半減期を、Ｂ Ｓｄｃ　およびウサギウロキナーゼ（ＵＫ）のそれらと比較した。異なる活性化 因子溶液を加えたウサギ由来の血漿試料は、希釈血塊溶解時間検定によりそれら の線維素溶解作用について調べた。ＤＰＡで処理したウサギ由来の血漿はｉｎ　 ｖｉｔｒｏ血塊を２４時間のインキュベーション期間内で完全に溶解したが、Ｂ ＳｄｃまたはＵＫで処理したウサギ由来の血漿は溶解しなかった。ＤＰＡの半減 期はＢＳｄｃ　のそれに匹敵するものであったが、類似の定常状態濃度でＵＫの 半減期よシも短かった。

血液凝固系に対するこれらの血栓溶解剤の効果は、外因性経路の凝固因子■、Ｘ 、■、■およびＩの異常を検出するプロトロンビン時間（ＰＴ）、および血漿の 内因性経路の凝固因子■、■、ｘ、ｎ、プレカリクレイン、およびキニノーゲン （ならびに■、■、ＸおよびＩ）の欠乏を評価する部分トロンボプラスチン時間 （ＰＴＴ）を測定することにより調べた。ＤＰＡまたはＢＳｄｃ処理血漿と対照 の間には有意な差がなかった。しかしながら、ＵＫ処理血漿ではＰＴの延長が見 られた。

血液の線維素原溶解パラメーターは、これらの血栓溶解剤の注入中と注入後に調 べた。ｔＰＡ処理処理上対照と比較してフィブリノーゲンやプラスミノーゲンの 濃度に有意な差が観察されなかったが、ＵＫ処理では両因子の減少が起こった。

ＤＰＡ処理ウサギでの抗プラスミンレベルは注入中に対照の６２％に減少し、Ｂ Ｓｄｃ　のそれは対照の４６％に減少したが、これらのレベルは注入後すぐに対 照レベルに戻った。ＵＫ処理ウサギでの抗プラスミンレベルは注入中および注入 後に対照の１％に低下した。

これらの結果は、ＵＫがｔＰＡと対照的に長期の全身的な線維素溶解作用を有し 、ＤＰＡがその増強された血栓溶解作用（８釈面貌溶解時間検定により測定）お よびα−２抗プラスミン濃度に対するその影響の少なさゆえにＢｏｗｅ’ｓ黒色 腫由来のｔＰＡよりも臨床的価値が大きいことを示唆している。

ＤＰＡの血栓溶解作用をストレプトキナーゼ（ＳＴＲ）のそれと比較するための 別の実験が、冠状動脈血栓症の　１ｎｖｉｖｏ　（イヌ）モデルを用いて行われ た。これらの実験では、電気分解刺激によシ冠状動脈梗塞を発生させた。動脈の 再潅流を達成するのに要する時間は、中または低用量のＤＰＡもしくはＳＴＲで の処理に比べて高用量のＤＰＡで処理したイヌにおいて減少したが、それらの差 は統計学的に有意でなかった。しかしながら、高用量ＤＰＡ処理の場合は、血栓 が薬物注入後３時間残存せず、しかも再血栓の発生率が低かった。さらに、ＤＰ Ａの血栓溶解作用は試験したどの濃度においても５ＴＲＪ：ｐ大きく（血栓の大 きさを測定）、この作用は用量に依存して現れた。ＰＴ％ＰＴＴおよびフィブリ ノーゲン分析は本質的に上記のように行って、静脈内ＤＰＡが循環性の血液凝固 因子に対してどのような作用を及ぼすかを調べた。測定可能なフィブリン／フィ ブリノーゲン分解産物（ＦＳＰ）Ｕフィブリン／フィブリノーゲンの加水分解を 反映するものであった。

ＰＴ、ＰＴＴ、ＦＳＰ　およびフィブリノーゲンレベルは高用量のＤＰＡ薬物の 注入中および注入後に有意に異常でちった。さらに、フィブリン／フィブリノー ゲン分解産物（ＦＳＰ）の増加と付随してフィブリノーゲンの血漿濃度の低下が 観察された。中間用量では、これらの測定値は注入の間中異常であったが、注入 後はぼ正常値に回復した。

ＳＴＲ投与後に出血を伴う全身的線維素溶解の従来の報告にもかかわらず、本実 験では血液凝固パラメーターの重大な変化は何も検出されなかった。ＰＴおよび ＰＴＴは注入中および注入後の両方において対照に匹敵し、そして中程度のＦＳ Ｐ増加と共に血漿フィブリノーゲン濃度のわずかな減少が観察されたにすぎなか った。

第２のモデル（イヌ）では、ガンマ源を含む面貌をチャンドラ−ループ（Ｃｈａ ｎｄｌｅｒ　１ｏｏｐ　）中で作った。次いでその面貌を体外ループに移し、そ の後頚動脈に組み入れた。

ＩＶ注射したＤＰＡ　（一本領および二本鎖亜徨の両方）の血栓溶解作用は、ル ープ中のカウント数の消失（面貌溶解）を監視することにより、ＵＫの血栓溶解 作用と比較した。

結果は、一本領ＤＰＡが０．１４η／陽で処理したとき同じ濃度の二不鎖ＤＰＡ よシも１．２倍優れた溶解を与えることを示した。

ウサギの静脈血栓を伴う第３のモデルでは１２５ニーフイブリノーゲン、血液お よびトロンビンから頚静脈中に血栓を形成させた。血栓溶解は血中に放出された アイソトープを測定することにより調べた。次第に増加する用量のＤＰＡが面貌 を溶解する能力は、Ｂｏｗｅ’ｓ黒色腫由来のｔＰＡ（同一モデルを使用する別 の実験で測定）と比較した。このモデル実験において、ＤＰＡは試験したあらゆ る濃度でＢｏｗｅ’ｓ黒色腫由来のｔＰＡよりも優れた血栓溶解作用を有してい た。これらの結果は、ＤＰＡが他のｉｎ　ｖｉｖｏモデルよりもある種のｉｎ　 ｖｉｖｏ　モデルにおいてより大きな臨床的価値を有することを示唆している。

さらに、テキサス大学のヘルス・サイエンス・センター（Ｈｅａｌｔｈ　５ｃｉ ｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　）で、マウス　ミエローマ細胞由来（ＤＰＡ）；チャ イニーズハムスター卵巣細胞由来（ＣＨＯｔｐＡ）：およびＢｏｗｅ’ｓ黒色腫 細胞由来（Ｂｏｗｅ’５ｔＰＡ）の組織プラスミノーゲン活性化因子の効力を比 較する一連の実験を行った。これらの研究はコレン（Ｃｏ１１ｅｎ）によって開 示されたウサギ頚静脈面貌モデル、およびテキサス大学の実験室で開発されたポ ーラス注入（ｂｏｌｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　）　を採用するこのモデルの変法 を使用して行った。ＤＰＡは一本鎖ｔＰＡのパーセントに応じて２つの種類に分 割した（Ｄ−１は約６０チの一本鎖を含み、Ｄ−Ｉｆは９０チ以上の一本鎖を含 んでいた）。ＣＨＯｔＰＡは約７５チが一本鎖でｓｂ、Ｂｏｗｅ’ａ　ｔ　Ｐ　 Ａは約９０％が一本鎖であった。

頚静脈面貌はコレンによって開示されたように作り、クランプを取り外す前に３ ０分間熟成させた。組織プラスミノーゲン活性化因子は一定速度のボンダで４時 間にわたり反対側の静脈に注入した。用量は２０ｒ＋７！のキャリアー緩衝液（ ０，０１％ツイーン８０を含む０．３　Ｍ　ＮａＣ１）中に希釈した。２−をポ ーラス注入として与え、残シの１８ｍ１を４時間にわたって投与した。血漿およ び血清試料は０．１．ｏ。

３．０および４．５時間目に採取した。血清試料はアプロチニン溶液中に収集し 、そしてフィブリノーゲン分解産物測定用に使用した。４．５時間目に面貌を取 り出し、そして血栓溶解度を面貌中に初めに組み込んだ放射能と静脈区域に残存 する放射能の差として算定した。結果にもとの放射能のパーセントで表した。

血漿試料は標準トロンビン時間、およびウロキナーゼで活性化した後のプラスミ ノーゲンレベルについて分析した。

この血清試料もまたフィブリノーゲン分解産物測定のために使用した。

別の組の実験が同じ面貌形成技術を使用して行われたが、但し用量を５分間にわ たる２−のポーラス注入で投与した。

これらの実験では、血漿および血清試料を０．０５．１．０および２．０時間目 に採取し、そして２．５時間目に面域を取シ出した。

面貌溶解測定実験の結果を、４時間注入実験については表Ｉに、そしてポーラス 注入実験については表■に示す。

試料はすべて良好な面貌溶解を示し、連続注入により投与したときの試料間には 有意な差がなかった。ポーラス注入によるＢｏｗｅ’ｓ　ｔＰＡ処理ウサギはＣ ＨＯまたはＤＰＡよりも活性が劣っていたが、この観察は一匹の動物に基づく０ ．５０　２７　２４　２１　ＮＤ Ｏ，２５２７３３３１ＮＤ Ｏ，１２５５１３６３７，３２ ０，０６３ＮＤ　７８　ＮＤ　ＮＤ １平均して１群２または３匹の被験動物表■ ポーラス注入後の組織プラスミノー ゲン活性化因子による面貌溶解１ ＣＨＯ２０ Ｂｏｗｅ’ｓ　７１ １用量０．１２５■／ｋｆ ２１群につき１または２匹の被験動物 フィブリノーゲン分解産物はウェルカム・ダイアグノスティックス社から購入し たラテックス粒子法を用いて測定した。この試験は０．５■／ｋｙ用量からの試 料に対してのみ行った。これらの試料は、診断用キットによシ提供された標準陽 性対照と比べたとき、測定可能なフィブリノーゲン分解産物を全く示さなかった 。フィブリノーゲン分解産物は最も高い用量の場合にも見られなかったので、そ れより低い用量の場合にも陰性であると結論づけた。

本発明は他の特定の態様に具体化しうる。

浄書（内容に変更なし） 浄シーイ、ｉ”４行に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ｔｇｏ　１７Ｑ ＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴ　ＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡ　ＡＡＡＡ ＡＣＧＣＡＧ　ＡＴＧＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＣ ＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧ　ＣＧＴＧＧｙｅｃｃｃ　ａ＋＝ ｙａ〒ｉｔ＊ｒρ　〒〒ｒ−−−−−−|− ＦＩＧ、　３Ａ−２ ＦＩＧ、　３Ｂ−１ ＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧ　ＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴ　ＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴ　ＣＡＴ ＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡ　ＣＧＡＴＣＡＡＧＧb ＦＩＧ、　３Ｂ−２ ４２１０４２：：’：＋　４２：０　４２４０　４２５０　４２６０ＧＧＣＡＡ ＡＡＴＧＣＣＧＣＡ＾＾ＡＡＡＧ　ＧＧ＾＾丁＾＾Ｇ［ｉＧ　ＣＧＡＣＡＣＧＧ ＡＡ　ＡＴＧＴＴＧ＾＾Ｔ＾　ＣＴＣ＾Ｔ＾ＣＴbＴ ＦＩＧ、　３Ｇ−１ ５２９０５：ＳＯＯ！’５１０　ＦＳ３２０　５！：０　５！４０ＧＴＣＡＣＡ ＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧ　ＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡ　ＡＡＧＡＴＣＣＧＧＧ 　ＧＣＣＣＡＣＴＣＡＴ　ＡＡＡＴＣロＡＧＴs ６１！、（＋　６１４０　６１５０　６１６０　６１７（＋　６１Ｂ。

Ｇ丁ＴＴＡＣＧＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡ ＣＧＡＴ　ＧＴＡＴＴＴＴＴＣＧ　ＣＴＣＡＴＧＴＧＡＡＦＩＧ、　３Ｃ−２ 図面の簡単な説明 第１図は全長ヒ）　ｔＰＡタンパク質の２次元的模式図であり、そのジスルフィ ド結合、そのグリコジル化部位およびそのアミノ酸配列（アミノ酸は標準略号で 示す）であると考えられるものを示す。残基−１〜−３５は成熟タンパク質から 切断されるシグナルペプチドおよび可変性のプロ配列を構成している。

第２図はそのシグナルペプチド領域およびその開始シグナルと停止シグナルを含 むが、その３′非翻訳領域を除外したヒ）　ｔＰＡ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。

第３Ａ〜３Ｄ図は本発明に従ってｔＰＡを製造するのに適した発現ベクターであ るプラスミドｐＥＭ、１−ｔＰＡ　ｔＤ全Ｄ　Ｎ　Ａ配列を示す。

第４図はプラスミドｐ　Ｅ　Ｍ　ｐ　１−ｔ　Ｐ　Ａ　の模式図である。

第５図は本発明の高活性ヒ）　ｔＰＡ組成物のアフイニテイクロマトグラフイー 溶出パターンを示す光学密度対分画番号のグラフである。

第６図は本発明ｔＰＡ組成物の例示的ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離の写 真複製である。そして第７図はフィブリン単量体の存在下および不在下（開放円 ）におけるプラスミノーゲン活性化速度（光学密度単位７分）の逆数対プラスミ ノーゲン濃度（Ｓ−２２８８の濃度により測定）の逆数のグラフであるわ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 手続補正書防痴 昭和６３年　７月２１日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１５６９ ２、発明の名称 組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子組成物３、補正をする者 事件との関係　出　願人 住所 名　称　デイモン・バイオチック・インコーホレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　昭和６３年　７月１９日　（発送旧）６、補正の対象 （１）出願人の代表音名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文 （３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文（４）図面の翻 訳文 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１５６９ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／１５ＡＪ２１０　Ｐａｒｔ　 工ｒ。

Ｋｅｙｗａｒｄｓ　ｃｏｎｔｉｎｕｄ＋１″Ｉ″＋＋ａｈｅ＋ｖｌ　Ａｏｌｌｉ ｅＭｌｉｅ′Ｎａｐ、〒、　、ｑ、　、　、　、　、　、　、　。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子組成物を生産する方法であつて、 培養可能なミエローマ細胞株において、第２図に示す遺伝子のＤＮＡ、その対立 遺伝子変異型、および同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡから選択されるＤ ＮＡを発現させ、そして 該細胞株からヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を収集する、 各工程から成る上記方法。
2. ２．上記ＤＮＡをＪ５５８Ｌ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ９１３２）中で発現させる 工程を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記細胞株の代謝を維持するために使用した培地から該活性化因子を収集し 、上記方法がさらに、上記培地中のタンパク質をガラス上で、および該活性化因 子のエピトープに対する抗体を結合させたアフイニテイクロマトグラフイーマト リツクス上で分画化する工程を含む方法を用いて、該活性化因子を精製する、追 加工程を含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．クエン酸イオン溶液を用いて上記マトリックスから該活性化因子を溶出する 工程を含む、請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．培地中に懸濁した多孔質マイクロカプセル内て該ミエローマ細胞株を培養す る工程を含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
6. ６．上記培地は血清を含まない、請求の範囲第３項記載の方法。
7. ７．上記ミエローマ細胞株はＥＡＣＡ含有培地中に置かれる、請求の範囲第１項 または第２項に記載の方法。
8. ８．上記組成物を、その溶解性を維持するために、ＥＡＣＡの溶液中に置く追加 工程を含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
9. ９．組織プラスミノーゲン活性化因子および他のタンパク質を含む水溶液を、該 活性化因子のエピトープに対する抗体を固定化させたマトリックスと接触させて 、該活性化因子を上記抗体に優先的に結合させ、該マトリックスを洗浄し、そし て該活性化因子をクエン酸イオン溶液で溶出する、各工程から成る組織プラスミ ノーゲン活性化因子の精製方法。
10. １０．該マトリックスから、９０重量％以上が該活性化因子から成る全タンパク 質含有物を有する溶出分画を収集する工程を含む、請求の範囲第９項記載の方法 。
11. １１．上記水溶液中のタンパク質を該マトリックスとの接触に先立つてガラス上 で分画化する追加工程を含む、請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．該活性化因子の溶解性を維持するために、溶出された活性化因子をＥＡＣ Ａ水溶液中に置く追加工程を含む、請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．ミエローマ細胞中で第２図のＤＮＡ、その対立遺伝子変異型、または同一 アミノ酸配列をコードするＤＮＡから発現されたタンパク質類の混合物から成り 、以下の特徴： （ａ）精製した組成物を還元条件下てＳＤＳポリアクリルアミドグル電気泳動に かけるとき、第６図に示すような一対のバンドをもたらすグリコシル化パターン ；（ｂ）該組成物中の活性タンパク質の全重量の９０％以上を占める一本鎖タン パク質含有物； を有する、ｉｎ　ｖｉｖｏ線維素溶解作用をもつヒト組織プラスミノーゲン活性 化因子組成物。
14. １４．第１図に示すアミノ酸配列を有するが、最初の３５アミノ末端アミノ酸残 基を欠失している第１タンパク質であつて、該組成物の活性タンパク質の全重量 の少なくとも約７０％以上を占める該第１タンパク質を含有することをさらに特 徴とする、請求の範囲第１３項記載の組成物。
15. １５．第１図に示すアミノ酸配列を有するが、最初の３２アミノ末端アミノ酸残 基を久失している第２タンパク質を含むことをさらに特徴とする、請求の範囲第 １４項記載の組成物。
16. １６．発色性基質Ｓ−２２８８の加水分解により測定して、フイブリンの不在下 でのｋ　ｃａｔに比べてフイブリン単量体の存在下てのｋ　ｃａｔの増加により さらに特徴づけられる、請求の範囲第１３項記載の組成物。
17. １７．生理学的に適合しうるクエン酸イオン溶液中に置かれる、請求の範囲第１ ３項または第１４項記載の組成物。
18. １８．生理学的に適合しうるＥＡＣＡ溶液中に置かれる、請求の範囲第１３項ま たは第１４項記載の組成物。