JPS63502664A - 退行関連抗原およびそれに関する方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

退行関連抗原に関する方法と組成 Ｇｅｏｒｇｅ　Ｃ．　Ｆａｒｅｅｄ Ａｒｕｐ　Ｓｅｎ Ｐｒａｄｉｐ　Ｇｈｏｓｈ−ＤａｓｔｉｄａｒＡｌｖｉｎ　Ｌｉｕ これは、１９８饋Ｐ３月７日に提出された出願番号第８３７，４９４号の一部継 続出願である。 （腎釦 本発明は崎に腫瘍に関連する抗原とその使用に関し、より具体的には、退行（リ グレッション）関連抗原（ＲＡＡ）、　ＲＡＡを含む調製剤，およびこのような 抗原と調整Ｗｌの使用に関する。 癌の診断および治療に対する１つのアプローチでは，腫瘍関連抗原に対する多ク ローン性抗体および単クローン性抗体の産生が関与する．報告されているほとん ど全ての症例において，腫瘍細胞成分に対する抗体を得るために使用された免疫 原は，完全な腫瘍細胞か。 あるい…影蒔細胞から得た膜タンパク質である。 この分野におけるこれまでの研究としては，腫瘍胎児ル東および血液型抗原の同 定（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，と控匹ζη虹１１９８　（１９８４））がある、これら は悪性腫瘍細胞によって発現され場合によっては，血流中に流入する．腫瘍細胞 に関連する抗原は．イムノブロンティング法によって同定することができる，　 ｎｕ　Ｂｏｉｓ等，　Ｊ．　（　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ）。 競，７（１９８３）。 特に、ヒトの乳癌細胞の表面と反応する単クローン性抗体は，転移癌病巣の股飄 宿面分を用いて産生しかつ特性を明らかにすることができる，　Ｓｃｈｌｏｍ’ ｉｌ，　Ｆ（Ｃａｎｃｅｒ）　５４（１１ｓｕｐｐ１．）、　２７７７−２７９ ４　（１９８４）　、　１個の単りローン性抗体器社　ヒト乳癌の（資）％およ びヒト結腸癌の８０％に見られる２２０．０００ダルトンから４００．０００ダ ルトンの高分子質量の糖タンパク原を認識する．この抗原は特に興味深いもので ある．なぜなら、この抗原は，肺，乳房。 結腸および卵巣等のほとんどのヒト癌の細胞表面に発現する一方，通常細胞の表 面には極Ｍしか存在しないからである，　Ｈｅｌｌｓｔｒｏ＋ｍ等，　−　”” （Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．）、　４６．　３９１７−３９２３（１９８６）　。 このように、卵巣．膵臓および脇息性腫瘍を含むその他のヒト癌細胞表面の腫瘍 関連抗原と反応する一部のその他の単クローン性抗体を得ることができる．巣之 三二ン性抗体航び・　に　るＵＣＬＡシンポジ　ム　％，　Ｒｅｉｓｆｅｌｄ等 編纂，　Ａｌａｎ　Ｒ，　Ｌｉｓｓ，　１ｎｃ．＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐｐ． 　３−７４　９７−１０９および１４９−１６４　（１９８５）を参照されたい 。 これまでに開示された基クローン性および多クローン性抗腫瘍細胞抗体は，腫瘍 特異抗体を産生するために選択された試験動物において免疫応答を引き出すこと ができるヒト腫瘍細胞抗原の決定基に対するものである．腫瘍が潜伏している患 者，また特異的ないしは非特異的な免疫刺激薬の処方を受けている患者が，これ らの抗原決定基に対する抗体を産生ずるかどうかは不明である．したがって、こ のような抗体が患者の腫瘍の退行の仲介に関連するか否かは明らかではない．動 物が産生じたこのような抗体を患者に受動輸送する試みでは乏しい成果しか得ら れていない，　Ｌｏｗｄｅ痔，　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｊ．　翫−、、　１４３，　 ８１０（１９８５）。 腫瘍の能動性免疫療法に対する臣加宋アプローチでは，２つの細菌細胞，ヱイ！ 丈素等の非特異刺激剤を用いる患者自身の免疫系の全体的な！ｌ緻を行う．同時 に．インターロイキン２のような生物学的反応変更因子を用いて，免疫系の活性 化を誘発し．腫瘍細胞の破壊を引き起こすこともできる，　Ｍｕｌ蒔．、ｙ．　 Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　、１，３５，　６４６　（１９８５）。 およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ等，　顕り匡しユムｊ惺．．　３１３．　１４８５　 （１９８５）　。 能動性特異免疫療法と呼ばれるアプローチでは，癌患者の免疫感作は，同種異系 の腫瘍細胞（別の患者の＆！１織病理学的に同様な腫瘍から採取した腫瘍細勉か ら得た調製斉］を用いて試みることができる．これは、特定の悪性細胞型に存在 する可能性がある独特の抗原構造に対して患者自身の免疫系を特異的に刺緻する もので，それによって腫瘍退行を誘発する可能性フクある．Ｌａｃｔ＋ｍａｎ等 ，４ＬＪ灯密仄り，　５４，　４１５−４１７，　（１９８５）および−ａｌｌ ａｃｋ等，手３Ｊｊ５μｍユツシ％，　７９１−８００　（１９８４）。能動性 特異免疫療法はさらに，自己（０頒腫瘍細胞（すなわち、同じ患者の職から得た 細（社）を皮肉あるいは皮下に全身的に注入することによって試みることができ る，　Ｌａｕｃｉｕｓ等，癌，、穀，２（ト）１　（１９７７）　。 自己腫瘍細胞系あるいは異種腫瘍細胞系の種々の二珂製斉Ｊが能動性特異免疫療 法に用いられてきた。　Ｋｅｙ等９　″″】　を療法（Ａｄｖ、　Ｔｍｍｕｎ、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ、）、１．１９５−２１９　（１９８５）、@Ｈ ｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ等、Ｊ、生　−り　’３　Ｍｏｄ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｒｅｓ　ｎｓｅ　Ｍａｄ、）、　１．−５７−６６　（１９W２）およ びＫａｎ−Ｍｉ　ｔｃｈｅｌ　１等、゛クローン　−４゛よびＰ　’　Ｅ　ｊｂ ＵＣＬＩＭｚ７．ｆｆ１２’＋ム会ＧＪ、上掲、　５２３−５３６゜これらのＥ Ｅ製斉］は、４的に１１．ｉ７Ｊ、機械的な破壊５あるいは凍結融解サイクルを 用いて２腫瘍細胞を成育不能とするよう処理されている。そのうえで、これ臼凋 製剤は、アジュバントと共に、あるいはアジュバントを用いずに、免疫原として 使用し、癌、邑者の免疫処Ｗを目的として種々の経路波向、皮下、筋肉あるいは リンパ管内）で投与する。これらのｇ思製斉１についてｉ；！、　Ｑ性が比較的 に少ないことが報告されており、多数の進行癌患者において有望なロー末反応力 得られている。 に表現型に大きな変化が起きることがある言［ｆ’ｌの予測効力を標叫ヒする試 薬あるいは試験はこれまで無かった。膜タンパク質ば完全な照射された細胞から 流出する可園主があり、また細胞溶解産物中のタンパク質はタンパク分解醒素に よって変質する可能性がある。 したがって、能動性特異免疫療法の試みに使用される個々の異なる調製弁］は、 同（装なプロセスならびに細胞型を使用するにもかかわらず、効能が異なる可能 情勢（ある、さらに、最適な臣λｌ果を得るために免疫感作投与量ならびに免疫 感作スケジュールを調整するのに必要な個々の患者の免疫応答をモニターする手 段は存在しない、これに加えて、治療を行う患者から適切ｆｄＷ寓が得られない ために自己腫瘍細胞系１済Ｊを用いることが実行不可能となることが頻繁に起き る。 多くのＵｊ物モモデルら得た結果は肺癌退行を誘起するだめの能動性特異免疫感 作に腫瘍細胞成分を使用すること力韻であることを示している（Ｘｅｙ等、ム止 吻芸的反応」〆。 ；−３３５９−３６５（１９８４）、および５ｒｉｖａｓｔａｖａ等、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａ白Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８３．R４０７ −３４１１．’　（１９８６））　、　３−メチルコラントレン等の多環芳香族 炭化水素によってマウス中に誘起系の宿主において免疫原性であり、それらの対 応するＭｆＵに対してのろｆＲです交をもたらし、同じあるいは異なる発癌物質 によって誘導された独立した腫瘍、またはウィルス起源の腫瘍に対しては移植免 疫をもたらさない。マウスの移植免疫は、まず腫瘍移植片の増殖した後囁影枳多 隨片を除去することによって、あるいは照射腫席Ｈ泡腫瘍細胞膜あるいは可溶化 したｔＸＸ調製斉合用いた免パ辞対簑こよって誘起させることができる。 自己腫瘍細胞ワクチンを用い曇諧東研究の結果は、Ｂ而等の強いアジュバントを 腫瘍細胞懸濁液をともに用いた場合には期祠鴫寸与てるものである。Ｈｏｏｖｅ ４．癌研究３封、１田１−１６７６　（１９８４）、アジュバントと共に、ある いはアジュバントを用いずに、同種異系細胞を異なる経路によって用いて免疫感 作を行った患者の一部には１大きな、しばしば劇的な臨床反応を示した。　Ｗｅ ｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ、　ム止吻宝的叉四」メ工、ｌ、　５７−６６　（１９８ ２）およびＭｉｔｃｈｅｌｌ、′クローン　Ａ′４゛よび声７、法に　するｔｌ ｃＬＡシンポジウム　囮３．　、ｉ；Ｊ、　４９５−５０４゜腫瘍細胞のある種 の東０釣な抗原成分は、ヒトにおいて感染防御／リグレフサー抗体を誘起するこ とが出来るであろう。 能動性特異免疫原法の後のヒト腫瘍退行に関連する抗体反応に関する知識が得ら れ、そしてこのような特異抗体の誘起に関与する細胞上成分を同定することが出 来るならば、癌免疫療法のための改良された能動性特異免疫原の開発が可能とな るはずである。したがって、下記のものを開発することが望まれる。　（ｉ）　 ｒｋｌ連する特異ｗｓｒｔｈ＜さらに濃縮された調製ＪＦＩ−（ｉｉ）よりすぐ れた細胞源を選択し、かつ異なる調製弁１を有効に標画ヒすることができるよう に調製剤中の免疫原を定量するための試薬。（ｉｉｉ）これらの免疫原に対する 患者の特異免疫応答をモニターするための検定方法、それによって、より良いＦ ’ｆｆｉ吉犀勿碍られるように医師力源法プロトコルを調整することが可能とな る。 （発明の要旨） 退行関連抗原は、能動性免疫感作が進行中でかつ腫瘍退行反応を示している患者 の体内に産生される退行関連抗体（ＲＡＡｂ）との反応性に基づいて、同定する ことが可能である。 本発明によるＲＡＡｂを検出する方法においては、退行状態にないと診断された 患者から第１の血清試料の採取を行い、さらにその概退行状態にあると診断され た後に患者から第２の血清試料の採取を行う、腫瘍性細胞のタンパク質抽出物を 各試料に暴露する。腫瘍性細胞成分と第２血清試料中の抗体とのあいだでは免疫 複合体が形成さねかつ第１血清試料中の抗体とはこのような複合体が形成されな い場合ｉ１第２μ才４中にＲＡＡｂが存在することを意味する。 本発明によるＲＡＭを精製する方法では、関連するＲＡＡを持つ（ＲＡＡｂとの 複合体形成によって判断する）腫瘍性細胞を８／勿戊分に破壊し、この？８液の 成分を画分に分離し、さらにＲＡＡｂとの免疫複合体形成によってＲＡＡを含有 する両分を同定する０本発明にしたがって精製および華離したＲＡＭの分子質量 は、還元ドデシ）Ｌ４？ｉ’Ａナトリウム（ＳＤり）ポリアクリルアミドゲル電 気泳動による定量に基づくと、約１９０００から踊ｏｏｏダルトンの範囲内、あ るい＋１′招８０００から約４５０００ダルトンの範囲内、あるｕ１９５０００ から約７１０００ダルトンの範囲内である。望ましくは、上記の分子質量を存す るこれらの退行関連抗原は、５０ＩＳＭＮａｓ　ＰＯａ　（ｐＨ７）におけるジ エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）等の陽イオン 交換樹脂、あるいは２００　ｍＭ　Ｎａ５ＰＯ＜　（ｐ）ｒ７）における〜くリ ンアガロース樹脂とは結合しない。さらに望ましくは、退行関連抗原は、還元Ｓ ＤＳ　ＰＡＧＥ分析と続く銀染色法によりて定量行タ旬ｊル京をも網羅する。 本発明に従って免疫療法をおこなうことが可ｈＬであり、子ね記は１本発明によ るＲＡＡ、本発明によるＲＡＡの１個あるいはそれ以上の分子種を含有する腫瘍 性細胞、あるいは前述の腫瘍性細胞から得た無細胞調製剤（たとえば、粒状調製 弁Ｉあるいは培養液に６連讃したタンパク質）をリンパ液または血液流体（すな わちリンパまたは自助中に、あるいは患者の組織（例えば、筋肉あるいは皮下注 射によって）に導入する。免疫療法に対する患者の反応は、新生物に関連する症 状ならびに徴候によって、および、患者のＲＡＡｂの循環レベルの測定によって モニターすることができる。 さらに本発明は、　ＲＡＭと特異な免疫反応性を示す単クローン性あるいは単− 特異性多クローン性抗体をも提供する１本発明による抗体は、基質に結合したＲ ＡＭをＲＡＡｂを含有する溶液と接触させ、さらにＲＡＡからＲＡＡｂを）招罰 することによって、　４ｆｆ製することができる。 本発明の１個あるいはそれ以上のＲＡＭに刻する単クローン性あるいは単−特異 性多クローン性抗体を投与して、直接的な抗体依存性腫瘍細胞障害（ＡＩＸ尤） あるいは補体依存性腫瘍細胞障害（■匡）を起こすことが可能である。あるいは 、このような抗体は、毒素あるいは化学療法削等の抗癌斉ｊ、あるいは細胞増殖 ならびに分化レギュレーター（例えば、Ｉし−１，ＴＧＦ−β、　ＴＮＦ、　Ｉ ＦＮ等）を含むがこれらに限定されるものではない生物活性成分と結合Ｃ面の簡 単な説明） 第１図器上　２人の免疫感作を施した患者（ｐｔ、１．　Ｐｔ、２）と、免空副 乍を施したウサギから採取した試料を、細ｂ３７５の粒状画分（レーン番号１） およびならし培地（レーン番号２）に対して試験した血ン則イムノプロットの略 図である。ＰＬ市＝茫全な照射された腫瘍細胞を用いたリンパ管内（■ル、）免 疫療法を受け、　Ｐｔ、２は皮下（Ｓ、Ｃ，）免疫感作を受け、さらにウサギ２ ０９には、細胞Ａ３７５　（ＩＮＧ−Ａ）の粒状画分を用いた皮下免疫感作をお こなった。 第２図は部分的な精製を行ったＡ３７５−　ＩＮＧ−Ａ抽出物の高性能液体クロ マトグラフィー（■ＰＬＣ）クロマトグラムおよび相応するＨＰＬＣブールのイ ムノプロット分析の略図である。 第３図番上　３人の異なる患者（Ａ、　Ｂ、　Ｃ）の退行関連抗体を、２つの異 なる黒色種細胞系統の初期（ＭＡＣ−１）と後期（ＭＭＣ−３）　ｍ代の細勲容 解産物から両分した抗原と反応させたイムノプロットの略図である。 熔細な説明） 本発明は、ヒト腫瘍細胞関連抗原の同定と、腫瘍細胞あるいは細胞抽出物を用い た能動性特異免疫療法を受けた患者内に産生されるこのような抗原に対する抗体 の特性の確定に関する０本書においてＲＡＡと呼ぶこれらの新規の抗原は、ヒト 血清から得られたＲＡＡｂを用いて、一群の新鮮なヒト腫瘍抽出物および培養し たヒト腫瘍細胞系統から検出した。 培養したヒト腫瘍細胞に関連する個々の抗原は、腫瘍細胞に対して、あるい

【刊 劇猛細胞から得た部分的に分画した！に痕に対してマウスあるいはその他の動物 に産生ずる多数の単クローン性抗体のスクリーニングによって同定することが出 来る。しかしながら、このような抗原に対するほとんどの抗体は、腫瘍の進行ま たは退行心ｎ司係しない可能性があり。 したがってそのような抗体によって検出された抗原は、能動性免疫原としての治 療効力を持つ可能性はまず無いものと届、われる、さらに、マウスあるいはその 他の動物において抗体反応をＬＪするヒト抗原決定基は、腫瘍に対するヒト免疫 サーベイランス則鼻を誘発させないかもしれない。 本発明においては，特異抗体は，患者自身の腫瘍（自廻りから得た細胞，あるい は組織病理学的に類似したタイプ（同種異系）の腫瘍由来細胞の樹立した培養の 細胞をリンパ管内に注入する能動性免疫感作の後に腫瘍退行を示している患者の 血ｌ肋・ら検出された．本発明の抗体は，ある種のヒト腫瘍細胞に関連するある 種の抗原に対する特異な反応性を有することを特徴とする．従って．これらの抗 体は，腫瘍細胞および組識中の特異抗原を同定するのに用いられている．本書に おいてＲＡＭと呼ぶこれらの票関連抗原は，そのサイズ，異なる悪性腫瘍の退行 を示す、Φ者のＲＡＡｂとの反応能力，およびヒトの異なる種類の癌から得た細 胞中のこれらの抗原の有無および／または相対的な多少に基づいてさらに細かく 分類することができる． 本発明によるＲＡＡｂは．照射された腫瘍細胞免疫原の投与に応答して誘導され ，かつ腫瘍塊の安定化あるいは退行に関係する抗体である．本発明によるＲＡＭ は，ヒト腫瘍細胞中に存在する抗原で，　ＲＡＡｂの産生を誘導するものと推測 され，そのためリンパ管内経路を介して投与された腫瘍細胞に反応して腫瘍退行 を示している患者の血清中の抗体によってＬ’２１ｌｉすることができるものを 含む．さらに本発明は，樹立したヒト腫瘍細胞系統，タンパク質および無細ｎｍ ｍ抽出物およびこのような細胞および＆［１織の膜あるいは培地から得られた調 製斉痔の前述のＲＡＭを含む調製？Ｊを得る方法に関する．　ＲＡＡに対する多 クローン性あるいは単クローン性抗体は，動物内で調製することが可能であり， 能動免疫性プロトコルを用いる治療も含めて，治療，診断，および治療の経過の モニタリングに用いることができる．〔；艮ｉ冫Ｉ冫リ１〕 免環治原後に評価可能な脛瘍゛′一をスしている生　の　」罪ら」ル夏に対Ｉ玉 特異抗体１（ａ）血圓欝望　原発性叫勤１ら身体の別の場所に腫瘍が進行した状 態（転移）にあることが記録されている悪性腫瘍の患者力〜，または明らかに原 発腫瘍塊が成長している患者から血清試料を採取する．次に，患者に，参照によ って本書に取り入れるＪｕｉｌｌａｒｄ等，Ｂｕｌ１　戸Ｂｕｌｌ．　Ｃａｎｃ ｅｒ　，　６６，　２１７　（１９７９）に記載されたリンパ管内免疫療法を行 う．前述の療法においては，患者自身の腫瘍から採取した腫瘍細胞，あるいは参 照によって本書に織り込まれているＪｕｉｌｌａｒｄ等，　ｌ，　４１．　２２ １５　（１９７８）およびーｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ等．ム止物エ的反応』競エ ．ｌＬ５７　（１９８２）岡ジ収されたように，当該患者と同じ種類の悪性腫瘍 から得た培養された腫瘍由来細胞の注入を用いる．免疫感作に用いる悪性細胞の 量および患者にによって，　Ｊｕｉｌｌａｒｄ等，　藻，　４１．　２２１５− ２２２５　（１９７Ｂ）を含む出版された幸皓書に記載されており１さらにＢｕ ｂｂｅｒｓ等，他旦二癌，　Ｊ６，　３３２−３３７　（１９８１）にも述べら れている．免疫を作に用いる悪性細胞はしばしば，癌患者から単離され垣句島に 由来する細胞として定義され，これら細胞は，対応する正常組織から得た細胞と は異なる核型を持つ可肥生があり．また染色体異常を有する可能竹過あり，さら にこれら細胞は，培地中で増殖すると．変化した代謝特性および成長特性を示す 可能竹フクある。これらの変化した成長特性にＬｔ　下記の一つ，あるいはそれ 以上のものが含まれる．（ａ）足場依存性増殖の喪失および豆即匹虹郭毀＋Ｂｅ ｎｊａｏ＋ｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．＋　５１０ −５２９＋　（１９８４）およびＳｅｌ戟D　単之三 −ン　ー　゛　−　に　ｔｌｃＬＡシンポジウムΔ音　．上掲．　３−２１　（ １９８５）を参照のこと． 上記のリンパ管内免疫療法を受けている患者の腫瘍退行状態は，いくつかの判定 基準を用いて腫瘍の状態を評価することによって決定する。この田ｉプロセスは ，容認された臨床モニタリング手１勤１ら成り，例えば，標準的な放射線医≠甥 刊範コンピュータ利用軸方向断層写真，磁気共鳴イメージング，癌の種々の免疫 学的標識の評価　（例えば，ｗ１ｉｊ特異単クローン性抗体によって検出される 新し《発見された抗原である癌胎児粗だの，腫瘍特異酵素およびホルモン受容体 の検出，ならびに癌患者の臨床管理に使用されているそ下記が観察された場合に は，部分的な腫瘍の退行と診断される．免疫療法を行う前に進行していた腫瘍の 安定化（すなわち，３ケ月の間に腫瘍の寸法に何らかの客観的な変化が検出され ないこと）．あるいは刃％を下回る腫瘍のサイズの縮小およびそれに伴う自蒐的 な改善あるいは現状維持．このような腫瘍増殖の安定化は，治療に用いた照射済 悪性細胞中の免疫原に対する遅発性過敏庁の発生と関連し．細胞調製，？Ｊの皮 下および皮内皮膚試験によって評価を行う． 成功した腫瘍退行反応は，腫瘍塊の客観的に測定可能な寸法の｛脈戒（すなわち 少なくとも５０％）によって定める．腫瘍塊は，腫瘍が身体表面の近くにあって 直接に触知可能な場合には直接測定によって．また，放射線学的測定によって， そして上記の判定基準を合わせて評価する． 血？Ｒ試料は，免疫療法を開始する前と，開始後の様々な時点において患者力・ ら採取する．１（ｂ）易ト脛瘍細腔曖Ａ〜　下記のヒト腫瘍細胞系統Ｌｔ　メリ ーランド州Ｒ蔦ｋｖｉｌｌｅに所在するＡｎｌ１！ｒｔｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ ｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｔｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手したものであり，　Ａ ＴＣＣの推■ 事項にしたがって増殖したところ，下記のセクシッン１（ｄ）に示すウェスター ンイムノフ゛ロソティング法を用いることによって，　ＲＡＭを発現することを 確認した，　Ａ３７Ｊ色腫細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＲＬ　１６１９）．　Ｌ ａＶｏ結腸腺癌細胞（＾ＴＣＣ　Ｎｏ、ＣＣＬ２２９）．　Ａ５４９肺腺癌細胞 （ＡＴＣＣ@Ｎｏ， ＣＬＬ１８５）　，およびＳＷ４８０結腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ ２２８）　．以後本書においては，　Ａ３７海胞に対する全ての言及は．上記の ようにＡ３７５ｍ胞のＩＮＧ−＾変異体を意味するものと理解すべきであり，こ の変異体は＋　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ，　）１ａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に所■■ るＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＨ＋　 １９８７年２月１２日にＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＲＬ　９３２Pとして寄 託された．さらに．本発明に述べる腫瘍細胞中にＲＡＡを検出する方法は。その 他の種々のヒト腫瘍由来細胞茅統にＲＡＡｓが存在していることを実証した．前 述の細胞系統としては，例えば，　ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆ ｏｒｎｉａ　ａｔ　Ｌｏｓ　ＡｎｇｅｌａｓのＧ．Ｊｕｉｌｌａｒｄ博士が保有 して■■ ある種の細胞系統，すなわち，　６９−２あるいは圓ＲＯ　８２−１．　ＣＡＬ −２７およびＣＡＬ−３３　（Ｊ；４平上皮ｉ．６９−３あるいはＣＡＬ−２お よびＦＲ０８４−１ωｌｉｆｉ９＠），　ＢＲ０８１−１およびＲｌ＋０８１− １（腎細胞癌）およびＳ囮８４−１およびｌＩＲ０８４４（前立腺圓，１００Ｐ ３，　ＣＲＯ８１−６．　ＣＲＯ８１−８Ｃ月捉粉，　ｌ’ｌＲＯ８１−１，y ０８ ４−１　侭＋ｍ混粉，旧．関１ｈ１４。１２０．渭８。Ｃ冊８１−５。ｗ８ｘ− ３，　ＥＲＯ８］−１．　ｗＲｏｇｉ−ｘ　（黒回ｉ１）　，　ＤＲＯ８Ｌ４， 袖０８２−１，　ＡＲＯ８１４（甲｝灯鉄ｐがある．これらの細胞系統は．それ ぞれの腫瘍から採取した組織検体を用いて従来の技法によ，て樹立したものであ り，その後に標仲泊タなヒト細ｆ，Ｅ培養条件の下で幾つかの継｛υ君養を行っ たと、一ろ，観察可能な細胞学的変化を示さずに５０あるいはそれ以上の継｛｛ Ｊｆｆｌφ辱られた．各々の細胞培養試料を，微生物培養，細胞学あるいしガに 子顕微鏡検査によってウィルスある醤鱈腹ｔ物による汚染について評価したとこ ろ．ヱイコ１コレ９グ葺虹去士玉については確認できる微生物が存在しないこと がわかった（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ＋　ＣａＩＩ＋ｄｅｎに所在するＣｏｒｉｅ ｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって聯淀を受けた）． 咄乳類細胞系統がマイコプラズマに感染すると細胞代謝および機能が変化するこ とが知られているｅ　Ｖａｎ　Ｄｉｇｇｅｌｅｎ等．゛・己　″（ＥＸ．Ｃｅｌ ｌＲｅｓ．）．　１０６，　１９１　（１９７７）ｌおよびＶａｎ　Ｄｉｇｇｅ ｌｅｎ等．癌研ｚ．　，Ｂ　２６８０　（１９７７）．さらに，マイコプラズマ は咄乳類細胞のＩＪ−Ｘの存在する疑いがあるので，この泄物がＲＡＡの産生に ．Ｌヒオリニスゲノムに暗号が取り入れられる形で，あ私１話茜主ヒト腫瘍細胞 中のＲＡＭの発現を誘起する形で，関与する可能性があるから、試験して決定す る価値がある．ＩＮＧＥＮＥにおいて．転移卵巣腺癌を患いかつ鼠径リンパ節も 関連した６市種の白人女性から２つの細胞系統を樹立した。第１の細胞系統ＩＮ Ｇ　６９−１眺鼠径リンパ節の１グラムの外科的生検検体から樹立した．無菌は さみを用いて検体を細分し，ガーゼのメッシュを通した後，コラゲナーゼと共に ３７ｔにおいて１時間培養し．次にトリブシンと共に３７℃においてさらに３０ 分間培養した．腫瘍細胞懸濁物を細胞培地ですずぎ，　ＲＰＭＩ　１６４０培地 ０」ので平板培養し，箱代培養をおこなって，この患者の能動性免疫感作を行う のに１分な数の細胞を得た（Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ等．ム生吻７的叉ウーヒ ζ．　１．　５７−６６　（１９８２）　）　ＩＮＧ　６９−１が樹立してから 約９カ月後に．この患者は腹部転移卯菓川島塊のク甘４摘出を受け．　ＩＮＧ　 ６９−１１紺生検体から得た正常細胞あるいは悪性細胞をリン酸緩衝溶液によっ て２度すすぎ，次に論等＊　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃ＋。（ １１Ｓ＾），　８０．　１２４６−１２５０　（１９ａ３）の狙頓に従って・イ Iニ／性 界面゛活性剤および非イオン１生界面活性剤の混合物を用いて，あるいは細目蛎 効・らタンパク質を優先的に抽出する非イオン性界面課昔ｎ揖Ｊｉ液〔１０閑門 １・リス塩酸，ｐＨ　７．５．　１　ｍＭＥＤＴＡ、　２．５０ＩＭ　ＥＧＴＡ 、　１０　＋１１Ｍ　ＮａＭｏＯ４，１２１１ＩＭモノチオグリセロール、１０ ％り刃セロール。 ４０１ｔｇ／ｖａ！ｌロイペプチン（Ｓｉｇ＋ａａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）お謔■O．２％ トリトンＸ４００　）のみを用いて抽出した。不溶性物質は１０．ＯＯＯＸｇの 遠氾４嘱ｉによって除去し、上澄み液のみを残した。１０〜２０μｇの細胞タン パク質を含む上澄み液アリコートに対し、基本的にＬａｅｍ＋ｎｌｉ、　Ｎａｔ ｕｒｅ　２２７．６８０−６８５　（１９７０）に記載されたｑｌｌｆ１４こよ つて還元ドデシＪ　ｌ茄狡ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ）を行った。 １（ｄ）イムノプロンティング、　個りのＲＡＡの検出は、ウェスタンイムノブ ロッティング手法によって行う、この方法においては、患者の抗体ＲＡＡｂが特 異抗原を検出するプローブとして働く、腫瘍退行を示している一群の患者の抗体 を用いて１種々の正常細胞および腫瘍細胞から得たタンパク質のスクリーニング によって、腫瘍の退行が起きている患者の体内にＲＡＡｂによって検出される抗 原の分子特性を同定することが可能となる。これらの抗原は、腫瘍退行と関連す る抗体であるＲＡＡｂの産生を誘起するということになる。 イムノプロフチイングーｆ４１［＋よ、ここに参照によって本書に織り込まれて いるＴｏｗｂｉｎ等。 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃ４　（ＩＩｓＡ）、７６、４３５０ 　（１９７９）に記載された下記のステフブからなる。 典型的なウェスタンイムノブロンティング手順において器上全細胞タンパク質抽 出物あるいは細胞上画分に還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミトゲ ＪＬｔｉ〜永劫（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行う、タンパク質は、それはＲＡＭであ るかもしれないが、電気溶離によってニトロセルロースフィルターに移され、そ の後に前述のフィルターは適切に希釈した試験血清あるいは抗体調製弁１と共に 培養される。フィルターを抗体とともに培養し、それらはＲＡＡｂを含むが、入 念に洗浄した後、フィルターはス　フィロコ・カスアウレウス（Ｓｔａ　ｈ　１ ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　の１＋″５で標識したタンパク質Ａ（それは抗 体分子のＦｃｊｉ域に特異的に結合する）とともに培養し、結合しないタンパク ｉＡを除去するために洗浄し。 オートラジオグラフィーを行うためにＸ−＆ｉフィルムに暴露する。各放射性バ ンドは、試験血清を用いて、イムノブロンティングを実施した。全ての患者＋１ 彼等自身の腫瘍から樹立された細胞系統を用いて、そして他の患者の関連［がら 樹立されたその他の培養細胞を用いて、リンパ管内免疫療法を受けた０分子質量 が約７０．０００ダルトンから４３，０００ダルトンの抗原は、これら３人の患 者の免疫後血清を用いることによって、卵巣由来悪性細胞か卵巣から得たものを 含めて種々の正常なヒト組織あるいは培養細胞抽出物内の抗原種とは反応しなか った。 患者Ａ　ｆｆ１ｌＪＬｌの免疫後血清および腹水を用いたイムノプロンティング 研究の結果山によって検出される適合抗原が存在することを示した。第１図番上 　２人の免疫感作を受けた患者（Ｐｔ−１およびＰｔ−２）およびＡ３７５（Ｉ ＮＧ−Ａ）細胞から得た粒子画分を用いた免疫感作を行ったラビフト（１２０９ ）の１　：　１００（）倍希釈血清を用いたイムノプロットを示す、全ての血清 はＡ３７５−　ＩＮＧ−Ａ細胞の粒子画分（ラベル１のレーン）あるいはならし 培地（ラベル２のレーン）に対して試験した。この試験の免疫複合物形成パター ン４１腫瘍が退行しつつある患者の血清に典型的に観察されるものを示している 。このイムノプロットデータから、約４３　ｋｄであると暫定的に同定された抗 原種ｉｔ分子質量Ａｉ　ｋｄから４０　ｋｄ　（’３８　ｋｄ　Ｊ　４ＨＩＯお よび４３ｋｄから４５　ｋｄ　（’４３　ｋｄ　Ｊ　坑ワの少なくとも２つのも のを含むことが明らかとなった。上記の分子質量は高分解能を持つ５ＤＳ−ＰＡ ＧＥシステムによって得られたものである。これらの抗原種は双方とも、主要な ｍｉ適合抗原（ｌ（ＬＡ−ＡＢＣ）とは大きく異なっているように思われる。相 違点は、還】３ＤＳ−ＰＡＧＥ中における前述の抗原種の移動度は、エンドグリ コシダーゼＨおよびＦによる処理を、　ＨＬＡ−ＡＢＣの炭水化物成分がこれら の酵素によって分解されるＱＭＫバンドの（止閣を確認するためにＨＬＡ−ＡＢ Ｃに特異な単クローン性抗体を用いるこれらの抗原のイムノプロットによって見 ることが出来る）条件において受けても。 ２つの別々の前立腺癌から樹立された２つの照射済培養細胞５Ｒ０８４−１およ びＨＲＯ８４−１のリンパ管注入を受けた転移前立腺癌患者＋！、ＨＲＯ８４− １細胞系列を得た前立腺腫瘍のもとの細胞懸濁物中の３８ｋｄおよび４３　ｋｄ 抗原と反応する抗体を産生じた。これら四に票も５ＲＯ８４−１培養細胞のなか に検出された。この患者の免疫療法に伴って、免疫感作の開始後の最初の２週間 のあいだに血清酸性ホスファターゼレベルの測定（勧＠１的に低下した。 ４３　ｋｄおよび７０　ｋｄ抗原種も、役人かの、患者の免疫後血清によって、 ある種の新鮮な腫瘍抽出物中に検出された。これらの研究に用いた削出出物は、 非ホジキンリンパ腫および乳癌から得られた。転移腎臓癌患者の血清試料を１同 種異系腎臓癌細胞系統の混合物を用いてリンパ管内免疫感作を行う前と後に採取 した。この患者の免疫前血清は、４３ｋｄ抗原領域において、試験した２つの抽 出物のいずれともほとんど反応しなかった。これとは対照的に、この患者の免疫 後血清シ九　リンパ腫抽出物中の特異的な４３　ｋｄバンドと反応した。これに 加えて、ヒト偏平上皮細胞癌培養物（６９−２）を用いて免疫感作させたイヌも 、ヒトカボジ肉腫抽出物の６８ｋｄから７０　ｋｄ範囲の特異的な１ル双と反応 する抗体を産生した。 患者およびイヌの免疫前血清は、カボジ肉腫抽出物とは反応しなかった。 基本的に上記の手法を用いることによって、多数の腫瘍退行を示す患者から得た 血清試料中の抗体は、免疫感作に用いた腫瘍細胞調製物をも含む様々な腫瘍細胞 のなかに、見かけ分子質量が約田、０００ダルトン、約４３，０００ダルトンｑ １己を参照のこと）、および約加、０００ダルトンの３つの主なＲＡＡの分子グ ループの一つあるいはそれ以上のものを検出した。 免疫療法の開始前に採取した血清中の抗体は、これらの３つのＲＡＡのいずれも 検出することが出来なかった。 さらにこれらの新規な）ル原の特性を明らかにするために、ヒト腫瘍細胞から得 た細胞粒状画分を開始材料としてこれらを部分的に精製した。　１１３７５ｊ％ 色種細胞のＩＮＧ−Ａ変異体の抽出、硫安分画、およびＲＡＡｂをセファロース に結合して行うアフィニティークロマトグラフィーの後に、　３８　ｋｄ、　４ ３　ｋｄおよび７０　ｋｄ抗原は、高性能液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ） を用いたアセトニトリルグラディエンド（連続的に組成を変えて、クロマトグラ フィーに用いるｔ幕■ω中で共に？容揺することが分かった。第２図は、これら の抗原種の溶離をシ８逆相ＨＰＬＣカラムからの１つの主要なピークとして示す 、　にのピークは６番としてラベルを付けている。ブール１から９までの抗原種 のイムノプロット分析をカラムプロフィールの下方に示すが、対応するレーンは 付番して、付番したＨＰＬＣブールとの対応を示す、）ＲＡＭのおおよそのサイ ズは専ら、還ｘ、ｂＤｓ−ＰＡＧＥにおける。検出された各ＲＡＭの相対的な移 動度に基づくものであり、比較対照としたのは、　Ｍａｒｙｌａｎｄ州Ｂｅｔｈ ｅｓｄａに所在するＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ　Ｉｎｃ、、あるいはＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州Ｎｅｗｔｏｎ　Ｃｅ 獅狽窒■■■ 在するＤｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されている染色された 分子質量サイズマーカーである０分子質量を田、０００ダルトン（６８ｋｄ）と 定めた一つ（７）ＲＡＭは、　６５，０００から７１，０００ダルトンのサイズ 範囲内で移動した。別のＲＡＭは、　４１．００（ロ）箋ら４５，０００ダルト ンの範囲内のサイズが約４３，０００ダルトン（４３ｋｄ）の単一タンパク質バ ンドからなるか、あるいは、イムノプロットに見ることが出来る２つの検出可能 なバンドを持つ二重項からなることが多い、第３の種Ｌ；１．１９，０００から ２３，０００ダルトンの範囲内の分子質ＩＮ０．０００ダルトン（２０ｋｄ）の 抗原である。 ＲＡＡは通常は、様々なヒト悪性臘２例幻りロ巣癌、甲状腺癌、悪性黒色腫、前 立腺癌。 上皮性癌、偏平上皮癌およびある種のその他のものの退行を示す患者の血清の２ ００倍から加（ト）倍の希釈液を用いて、ヒトｍ織および細胞抽出物から得た１ ｏがら加μｇの全タンパク質調製物に検出された。 第１表ｃ−を診断された転移癌がリンパ管内免疫療法を受けた後に評価可能な退 行を示している５人の患者の血清について得られた結果を要約したものである。 ５人の患者のそれぞれからＧＭｆＭ’に）採取した血清試料之一つあるいはそれ 以上の腫瘍組織抽出物改字記号を付したもの）ある＆　ｔ　ｔｌｌ々なヒト腫瘍 の樹立した初代細胞培養の抽出物にイムノブロンティングを行うのに用いた。各 患者の血清試料によって試験した試料は各患者番号の下に挙げである。初代細胞 懸濁液あるいは樹立した培養細胞の−ｓ

【上　リンパ管内免疫療法に使用されて おり、したがってそれらが腫瘍の退行をＷする能力も試験された。 これら（７）ＰＪｔ、第２コラムに明らかになったＩＬＩ状態として下記のよう に要約されている＊Ｒｇ”：細胞系統がＩＬＩ患者に腫瘍退行を誘起したことを 示す、Ｒｇ−：細胞系統がＩＬＩ患者に腫瘍退行を誘起出来なかったことを示す 、ＮＴ：細胞系統が試験されなかったことを示す、この表において説明した３つ のＲＡＭのそれぞれについて、「＋Ｊは、２０マイクログラム以下の全細胞タン パク質中に存在する抗原と反応する血清抗体を用いた標準イムノブロンティング イにおいて容易に検出された信号を示す、これらの研究のすべてにおいて。 診断の確定した。患者の血清の魚信以上の希釈７色が用いられた。 第１表において【上患者１１は悪性黒色ｌを患っており、患者＃２は卵巣癌があ る。患者超は食道の偏平上皮癌を１色っており、　、’１ｚ−１ｆ１４は前立腓 癌である。そして１色者６は甲状腺癌である。 第１表 腫瘍細胞系統中のＲＡＡ分布 細胞系統、または　退行を誘起　４３　ｋｄ　６８　ｋｄ　２０　ｋｄ胚湯抽出 物−ｍ−丈灸能カー　−弘虹一　−臥り一一顕虹一患者１１ 抽出物Ｆ　ＮＴ　＋　＋　− 忌引２ 抽出物ＯＮＴ　−＋　− ＰＲＯ８１−２Ｒｇ’　＋−− Ａ３７５　Ｒｇ”　＋　＋　＋ 患部３ 抽出物Ｌ　ＮＴ　−＋　− ５ＲＯ８２−３ＮＴ　−＋　− 患者Ｉ４ 抽出物Ｐ　ＮＴ’　＋　＋　− ５ＲＯ８４−Ｉ　Ｒｇ’　＋　＋　− 患者＃５（Ｊｉｉす ＡＲＯ８１−Ｉ　Ｒｇ”　＋−− ＤＲＯ８２−Ｉ　Ｒｇ”　＋−− 第１表に示した患者全員において、免疫療法前の血清を用いて実施されたイムノ ブロンティング分析は、各ＲＡＭのいずれかと反応する抗体の存在を検出するこ とが出来なかった。 評価を行った幾つかのその他の症例においては、悪性黒色Ｉの患者２人を除いて 、免疫療法前の血清を用いて実施されたイムノプロッティング分析の結果番上約 ６８　ｋｄ、約４３　ｋｄ、あるい４′！Ｐｆ２０　ｋｄの放射性バンドを明ら かにすることが出来ず、療法を受ける前の癌患者のほとんどは本発明のＲＡＡに 対する抗体を持たないことを示唆している。リンパ管内免疫療法を受ける前の黒 色ｌ患者２人において３８ｋｄおよび４３　ｋｄ　ＲＡＡに対する抗体が検出さ れたことは、既に知られている黒色Ｊい（ときおり自発的な退行を行い、さらに 能動性免疫感作なしに前述の抗体を産生ずる患者の能力によって前述の退行を媒 介する能力が働いたことを示しているとも考えられる。 第１表に示したＲＡＡの分子質量決定は、高さ７．５　ｃｓの１０％５ＤＳ−ポ リアクリルアミド分解能ゲルを用いるｒミニＪ　５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いておこ なわれた。「ミニＪ　５ＤＳ−ＰＡＧＥを分子質量標準を用いて較正した結果、 　ＲＡＭの推定基本サイズは、　６８，０００ダルトン、　４３，０００ダルト ン。 および２０，０００ダルトンであったが、これらのゲルにおいては４３，０００ ダルトン近くの二重項はしばしば分解能方寵坊）った、もっと長い（１４ｃｓ　 ）　１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルＧ１図で用いたもの）の高分解能を 用いて、さらに精密な分子質量推定がなされた。分子量が１２　ｋｄおよび９５ ｋｄのあいだの中間域分子量マーカーを用いて較正された前述のゲルは、大きな ＲＡＭの分子質量の推定値は６８，０００ダルトンではなく７０．０００ダルト ンであることを示し、さらに４３，０００ダルトン二重項をはっきりと２つの！ ！　４３，０００ダルトン（４３ｋｄ）および３８，０００ダルトン（３８ｋｄ ）に分解した。この高い分解能を持つ５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いた結巣第１表にお いて患者Ｎｏ、　１．　Ｎｏ、　誌よびＮ０９４について確認された４３　ｋｄ 　ＲＡＡは大量の３８ｋｄ　ＲＡＡを含むことが示された。 のちのと憤でいた。幾つかの異なるタイプの悪性腫瘍を患っている反応を示さな い多くのずれとも反応しなかった。 患者から採取した血清を用いてＲＡＭを含む腫瘍細胞抽出物のイムノブロンティ ングを行う簡単な方法は１本発明の実験結果が実証しているように、腫瘍細胞関 連抗体に対する特異的な免疫反応に関して、免疫療法プロトコルの成功をモニタ ーすることを可能とするものである。モニタリングは、　ＲＡＡｂ力ｉｆ　（Ｔ ｉ己のように標準イムノプロット手順においてＲＡＭを検出することができる最 大血清希釈度として定義される）およびＲＡＡｂ特異性自清試料によって認識さ れる特異抗原の見掛けの分子ｉｔとして定義される）を調べることによって実施 できる。 の抗体は下記の通りである。 １（ｒ）　数の患者における抗　少のスクリーニング、５０Å以上の癌患者が、 上記の手順にしたがって、自己ヒト腫瘍細胞および同種異系ヒト腫瘍細胞の混合 物のリンパ管内投与によるン勿蓑を受けた。第２表龍癌のタイプ、投与された細 胞系統、免疫療法後の患者の血清によって検出された２ｍ　および患者の臨床効 果についての、患者の詳細なデー認されており、第２表に示されている。 第２表の記号の意味は　〔＋−靭　０−安定５−一進行、そして？−不明〕であ る。 照射法腫瘍細胞１０’個の皮肉注射を行ったａ　２４時間後および４９時間後に 遅延性過敏症皮膚試験を行った。Ｓ−小僚結および紅斑の直径＝５〜１０ｍｍ） 、Ｍ−中間語および紅斑の直径：１０〜２５ａｕｓ）、Ｎ−陰性、腫瘍の名称は 下記の通り、ｏｖ−卵巣＋Ｓｑ−偏平上皮細胞。 ＥＮＴ　−頭部および頚部、　ｐａｎ−膵臓、　ＡｄＬｕ−肺の腺癌、　ｍｅｌ −黒色Ｈ，ｔｈｙ−甲状線、抗原は、それらのキロダルトン数に対応する数字で 示す、抗原数字に文字’ＣＪが続く場合第１人 び免疫反応の要約 並」 患者腫瘍　細胞系統　抗原　反応　皮膚試験３２　ｏｖ　６９−２６９−１１Ｔ ３　ＭＣＦ−５６９−１３８，４３，７００２１Ｓｑ　６９−２ＣＡＬ−３３３ ８，４３，７００２３Ｓｑ　６９−２Ａ３７５　３８．４３，７０　０５６　Ｓ ｑ　６９−２１００Ｐ３Ｃａ１２７ＲＴＨ７０ｃ　−Ｓ２８　Ｓｑ　６９−２　 −　Ｓ １４　ＥＮＴ　６９−２ＣＡＬ−２７１００Ｐ３　？　？１５　ＥＮＴ　６９− ２ＣＡＬ−２７１００Ｐ３　６８．７０　？１６　ＥＮＴ　６９−２ＣＡＬ−２ ７１００Ｐ３　４３　？１７　ＬＵＮ［；　６９−２ＣＲ０８１−６１００Ｐ３ ＣＲＯ−８１−８−１８Ｇａ５ｔ　６９−２　Ａ３７５１Ｈ１７１９Ｍ２ＯＢｒ ｅａ　６９−２　Ａ３７５１ｍ１９６４　３８．４３．７０　＋４０　Ｌｕｎｇ 　６９−２　ＲＴＨ１７１７Ａ３７５４６　Ｌｕｎｇ　６９−２　Ａ３７５　？ １９　Ｐａｎ　６９−２　Ａ３７５　ＲＲＯ８１−４−Ｓ５７　ＡｄＬｕ　６９ −２　Ｍ−６ＣＲＯ８１−６０Ｎ！Ｍ粍揖醇　抗原　反応　火酔Ｗ ２２　Ｓｑ　Ａ３７５　ＭＲＯ８１−Ｉ　ＭＲＯ８４−１３８，４３，７０，４ ３ｃ　ＯＡ２．３　Ｓｑ　Ａ３７５６９−２　３８．４３．７０　０１　Ｍｅｔ 　Ａ３７５ＣＲＯ８１−５３８，４３＋　Ｓ２　ｈｌ　Ａ３７５ＣＲ０８１−５ １’１１４ＷＲＯ８１−１１８，４１，４３，７０＋　Ｓ２９　Ｔｈｙ　Ａ３７ ５　ＤＲＯ８１−１誓ＲＯ８２−Ｉ　ＲＴＨ１７２２３８，４３，７０−Ｍｌｏ 　Ｍｅｌ　Ａ３７５ＣＲＯ８１−５ＲＴｌ＋　３８．４３．７０　０　Ｓ１８　 Ｇａ５Ｌ　Ａ３７５６９−２　ＲＴＨ１７１９Ａ２０　Ｂｒｅａ　Ａ３７５６９ −２　ＲＴＨ９６４３８，４３，７０＋４０　Ｌｕｎｇ　Ａ３７５　ＲＴＨ１７ １７６９−２４６Ｌｕｎｇ　Ａ３７５　ＷＯ６９−２？１．９　Ｐａｎ　Ａ３７ ５６９−２　ＲＲＯ８１−４−Ｓ５８　Ｍｅｌ　Ａ３７５　ＣＲＯ８１−５ＲＴ ＨＯＳ四■ズ 慧腫瘍圏蜀醍　抗原　反応　冴吐囚 ２４Ｓｑ　１００ｐ３　４３　＋　ｓ ５６　Ｓｑｕ　１００Ｐ３６９−２Ｃａ１２７ＲＴ）Ｉ　６８ｃ　−Ｓ１４　Ｅ ＮＴ　６９−２　ＣＡＬ−２７１００Ｐ３　？　？１５　ＥＮＴ　６９−２ＣＡ Ｌ−２７１００Ｐ３　６８，７０　？１６　ＥＮＴ　６９−２ＣＡＬ２７１００ Ｐ３　４３　？１７　Ｌｕｎｇ　６９−２　ＣＲＯ８１−６１００Ｐ３　ＣＲＯ ８１−８−Ｌｕ ９煮腫瘍粍簸鴻　抗原　反応　火紐勘 ２　Ｍｅｌ　Ａ３７５ＣＲ０８１−５Ｍ１４ＷＲＯ８１−１１８，３８，４３， ＴＯ＋　Ｓ３　Ｍｅｌ　Ａ１４Ｍ７Ａ２０ＣＲＯ８１−５ＲＲＯ８１−３４３ｃ 　＋　Ｎ８　Ｍｅｔ　Ｍ−７８？ｒ７Ｍ１４Ｍ２０　０　Ｎ４７　Ｍｅｌ　Ａ１ ４ＣＲＯ８１−５Ｒ′ＴＨ−１５１３４３，４３ｃ　−Ｎ２７　Ｍｅｌ　ＥＲＯ ８１−１Ａ１４　０６　Ｍｅｌ　？ｒＮ１１４Ｍ２０　−　ＳＡＬ３３ 思煮腫廉担胞系統　抗原　反応　皮膚試稙２１　ｓｑ　６９−２ＣＡＬ３３　３ ８．４３．６８　０ＣＩ？０８１−５ 患者腫瘍粍顛献　朋　反応　良畦駐 １　恥Ｉ　Ａ３７５ＣＲＯ８１−５３８，４３＋　Ｓ２　Ｍｅｌ　Ａ３７５ＣＲ ０８１−５Ｍ１４ＷＲＯ８１−１３８，４３，６８，１８＋　Ｓ３　Ｍｅｔ　Ａ １４Ｍ７Ａ２０ＣＩ？０８１−５ＲＲＯ８１−３４３ｃ　＋　Ｎ４　Ｍｅｔ　Ｃ ＲＯ８１−５Ａ１４　０？　＋１ｅｌ　１′Ｉ−７？１−１４　ＣＲＯ８１−５ ＋９　Ｍｅｌ　Ｍ−７Ｍ−１４ＣＲＯ８１−５ＷＲＯ８２−１？１０　Ｍｅｔ　 Ａ３７５ＣＲＯ８１−５ＲＴＨ３Ｂ、４３．６８０　Ｓ４２　Ｍｅｌ　ＣＲＯ８ １−５Ｍ−１４ＲＴ）ｌ　１７４６　０　Ｓ５８　Ｍｅｌ　Ａ３７５　ＣＲＯ８ １−５ＲＴＨＯＳ４７　Ｍｅｌ　Ａ１４ＣＲＯ８１−５ＲＴＨ１５１３４３，４ ３ｃ　−Ｎには、同定された抗原の局在化部位は細胞形質である（例えば、　７ ０ｃ）、抗原数字に文字’ｎＪが続く場合には、同定された抗原の局在化ｔＡ釘 よ核である（例えば、　４３ｎ）、数値のみが示される場合にはく例えば、４３ ）、抗原はｍ細胞膜に局在化される。「細胞系統Ｊは、ｆｉ’！Ｍ乍に使用され たヒト腫瘍細胞系統である。細胞系統１ま１文字および数字コードを付してあり 、新鮮な自己由来腫瘍生検体から調製された細胞Ｗ４釦よＲＴＨのみ、あるいは 臨床反応が評価出来なかったことを意味する数字力殖りＲ′ＴＨが付しである　 、少数の患者は、　７０　ｋｄ種との反応に加えて、　６８　ｋｄ膜抗原の反応 性を示す、この６８ｋｄ種については、腫瘍退行とは直接の関連はまだ確認され ていない。 第２表に示したように、腫瘍が進行した患者の大半は、主にＡ３７５１％色腫細 胞および６９−２細胞（食道の偏平上句）の抽出物に存在する３８　ｋｄ、　４ ３　ｋｄおよび７０　ｋｄ膜抗原対する抗体反応を誘起することが出来なかった 。 リンパ管内免疫療法（比り後の典型的な免疫反応において１分子量が約７０　ｋ ｄおよび４３意な免疫反応性は観察されなかった。これらの抗原は、ウェスタン イムノプロットによつ膜抗原に対する抗体を産生じた。しかしながら、幾つかの 症例においては、良好ｆｔＤｒａＪ叉応をこれら抗体の出現と相関させることが 出来なかった。 第２表に示すように、その他の細胞とともにＡ３７５＄ｊｌｌ胞の処方を受けた 患者１２人のうちの８人は療法に反応した。患者２人においては腫瘍は進行し、 他の２人においてはＨ？Ｊｆｆｌ応汗を芝することが出来なかった。陽性反応を 示した８人のうち、７人は分子量が約３８ｋｄ。 ４３　ｋｄおよび７０　ｋｄの粒子状抗原に対する抗体を産生じた０反応を示さ なかった者あるいは状態がはっきりと６錠できない者は誰も膜抗原に対する抗体 を産生じなかった。 １５人の患者は、その他の細胞とともに６９−策胞を用いた治療を受けた。これ らの患者のうち、５人だけ力％％（生の臨床反応を示し、５人は治療に反応せず 、さらに残りの５人の患者については臨床状態を確認することができなかった。 ５人の陽性反応を示した者のうちの４人１上３８　ｋｄ、　４３　ｋｄおよび７ ０　ｋｄの膜抗原に対する抗体を産生した。その他の患者の大半ｔｆｌｌ預京に 対する抗体を産生しなかった。 １（ｇ）抗住反ｔａにａ開μＷ　リンパ管内免疫療法を受けた父大以上の患者か ら得たＲＡＡｂの特異性および力価の決定は１本発明のＲＡＭの一つあるいはそ れ以上のものに対する抗体の産生と腫瘍の退行ないしは安定化との相関をモニタ ーするのに役立った。 第３表および第４表ＬＬ第２表に示した患者のＲＡＡｂ　肪退行抗体）の増大と 臨床的に評価可能な退行ないしゆ安定化の関連を示すデータを要約したものであ る。 第１表 同種異系及び／又は自発性腫瘍細胞を用いたＩＩＪを受ける１色者のＲＡＡｂと 臨床反応践回鮒返応　患者数　塑諜塵 退行　安定化　進行 強く広範である　１０　４　６　０ 僅かで狭い　１５　３　３　９ 陰性　２５　３　９　１３ 第Ａ表 あるいはそれ以上のものを用いたＩＬＩを受ける１色者のＲＡＡｂと臨床反応抗 体反応　患者数　臨困仄応 退行　安定化　進行　不明 −ＡＡ　１３　５　５　２　１ 励ＡＡ無　１７１　６６４ 後の継代の後に混合した。４℃においてボックー−エルベージエムホモジナイザ ーを用いて磯波的な溶解産物を調製し、熔解産物は既知のｔ皺の腫瘍細胞当量に 希釈した（すなわち細胞の解離の前の完全な細胞の数に相当する溶解産物の量１ 通常は１ミリリツトル当たり１０７〜１０”細胞当量である）。 溶解産物ワクチンの第１のパンチはＭＭＣ−１と呼ばれ、広範な黒色腫がある最 初の８人の患者のン護に使用された。ある試験の結果によると、このＨＡＣ−１ 細胞はアイ２１−浅ぐｖｂｍによって汚染されていたようである。培養黒色腫の もっと後の継代のものを用いて非常に似通った仕方で調製した別のバンチ！ｆｌ ＡＣ−３と呼ばれ１本研究の残りの患者の治療に使用された１ＭＡＣ−３はヱ歪 ユズ旦メヱ旦土丈二各によっては汚染されていないように２、われる、黒色種細 胞溶解産物Ｌｔ、　ＤＥＴＯＸ　”　（Ｍｏｎｔａｎａ州＋　Ｈａｍｉｌｔｏｎ に所在するＲｉｂｉ免疫化学研究（１ｍｍｕｎｏｃｂｅＩＩＲｅｓｅａｒｃｈ） ＋　Ｉｎｃ、から入手した主にモノフォスフオリル脂貢Ａからなる解毒画分マイ コバクテリア）と呼ばれる試験的なアジュバントとともに患者に皮下投与された 。このアジュバントは免膀テＩ贈左市功＜あることが知られており、したがって 。 黒色腫患者に見られ台！芯は、能動性免疫感作プロセスに加えて、少なくとも部 分的にはアジュバント効果＜ｕｓ；ｓｓによるものかもしれない。 ＭＭＣ−１を処方した患者（色者１１から絽まで、結果は第５表に示す）および ＭＭＣ−３を処方した患者適者Ｉ９から１１５まで）から得た免疫後血清を用い てイムノブロア）研究をおこない、３つの異なる抗原調製物のスクリーニングを した。各抽出物の下に、各患者血清によって検出された抗原の分子質量をキロダ ルトンで示す、臨床反応は下記のように示す。 十−広範な退行、〇−安定化または部分的な退行、−一進行、？−評価不能。 下記の第５表に示すように９ＭＡＣ−１を投与された８人の患者のうちの６大Ｌ ！、主にあｋｄ、　４３　ｋｄおよび７０　ｋｄ　ＲＡＡに対する抗体を産生し 、これらの患者のうちの２人は［退行を示した。さらに別の患者（＋１５）は、 その後にインターロイキン２による治療を受けた時点で退行を示した。　ＭＡＣ −３で免疫感作を受けた患者は誰も、　ＲＡＡの何れかと反応する抗体を産生じ なかったが、但し患者１１．０およびＩｌｌには単一の抗原バンドに対する微か な反応が見られた。このような弱い反応性は、これらの患者の免疫感作前の血清 によっても検出可能であることに注意されたい、数人の患者にみられた良好な臨 床反応はアジュバントによるものである可能性がある。なぜなら、これらの反応 は禰に免疫療法の開始から数日後あるいは数週間後に見られたからである。この 期間は特異ＲＡＭの産生に通常必要な期間よりも短い。 第旦表 患部２じの９性 患者Ｎｏ、　Ａ３７５膜ＭＡＣ−３抽出物　ＭＡＣ−１抽出物　Ｅｌｆｆｌ応１ 　４１．４３，６８．７０　−　４１．４３．７５．７０　＋２　３８．４１， ４３．７０　−　３８．４１．４３　＋４　４３．６５．７８　−　６０（微力 ）　−５３８，４１，４３，６８，７０−羽、４１，４３，５５．７５　＋６　 ３６．３８，４１，４３，６８，７０　３８，４１，４３．８０　？７　４３微 か　−− ８２６，２８，３８，４１，４３，６８，７０−３８，４１，４３，８０？１０ 　４５（勅１）−一 １１−　−４３（勘））？ １２−１５−−　？ 第３図し上　３人の異なるＩＬＩ患者慄２表の反応者のなががら選択した）のＲ ＡＡｂをＭＭＣ−１あるいはＭＭＣ−３抽出物中の抗原と反応させた３つのイム ノプロットを示す、各抗血清に観察された主な反応性！ｔ　ＭＡＣ−１の３８ｋ ｄおよび４３　ｋｄ　ＲＡＡとのものだけであった。 左側の分子ｉｉ（Ｍｌｌ）マーカーｃａｔ抗血清Ａを用いたウェスタンプロット に使用された。抗血清ＢおよびＣを用いた２つのウェスタンプロン）（ＭＡＣ− ３，ＭＭＣ−１）は、右側のもの（Ｃの近く）を副基準とする。 これらの結果番九患者Ｎ０８２の免疫後血清中の抗体の、　ＩＮＧ−Ａ細胞の４ ３　ｋｄ、　３８　ｋｄおよび７０　ｋｄのＲＡＡとの反応性を示す第１図と比 較することができる。この患者４社ＭＡＣ−１溶解産物調製物による皮下免疫感 作に臨床反応を示した。 ＭＭＣ−１溶解産物を調製するのに用いたプロトコルにしたがってＩＮＧ−Ａ細 胞溶解産物を調製すると、　ＲＡＡはｌｏ、ｏｏｏ　ｘ　ｇ、　１シ分の遠＋１ ．．咲剣によってペレットとして得られた不溶性画分に局在化される。可溶性上 澄みは、イムツブロフト分析によるとＲＡＭが存在しない。 〔実施例２〕 」称凱杜鷹盟− ２（ａ）　５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるサイズ、　本発明の 個々のＲＡＡは。 サイズおよび免疫学的な特性に基づき、互いに３】すすることが出来るだけでな く、腫瘍および腫瘍から得た細胞に関連するその他の抗原とも区別することが出 来る。癌胎児性！（ＣＥＡ）はＲＡＡのいずれよりもずっと大きく、既存のマウ ス単クローン性抗体と同じものであると考えられる幾つかの抗原決定基もそうで ある。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＩＩＣＧ）は２つのサブユニットから成り 、これらサブユニットはいずれも運、ｙａＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムに記録され るＲＡＭと区別することが出来る（）ＩｃＧのβサブユニットはサイズが３５　 ｋｄであり。 そのαサブニー’−７トはサイズが１６　ｋｄである（Ｐｉｅｒｃｅ等＋　他ム 」虹、ＢＩＯＣｈｅｍ、＋　５０＋　４６５−４９５　（１９８１））　）　。 マウス単クローン性抗体によって同定される腫瘍特異抗原が急増している。現在 得られる情報によると、これらの抗原は本発明のＲＡＭとは、サイズあるいは正 常な細胞成分との関係に基づいて区メリすることができる　ローン　−　””　 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｉｄｉｅｓ」匡匹肌姐ｒＴｈ弘即ムＲｅ１ｓ ｆｅｌｄ　騙＋上掲）、単りローン性抗体番上膀胱癌において９２ｋｄ、　２３ 　ｋｄおよび１７　ｋｄの抗原を検出している。　Ｂｅｎ−Ａ１５ｓａ等、　Ｂ ｒ、　Ｊ、Ｔ’ｒ　５２．６５−７２（１９８５）、　Ｌかしながら、これらの 単クローン性抗体は、黒色腫細胞体重に説明した１９ｋｄおよび２３　ｋｄ　Ｒ ＡＡの主な産生（支）とは反応しない。 ヒト白血病細胞系統（Ｔ）ＩＰ−１）の４３　ｋｄ表面タンパク質に特異的な単 クローン性抗体は。 正常な細胞にみられる中間フィラメントビメンチンと交差反応する。　Ｈｅｒｍ ａｎ等、　Ｊ、　Ｃｅｌ！２）〕、さらにヒト乳癌の膜には高分子量の糖タンパ ク質（２２０ｋｄから４００　ｋｄ）および９０Ｍクンバク質が見つかった〔５ ｃｈｌＯＩ１１等、　Ｃａｎｃｅｒ、　５４．２７７７−２７９４　（１９８４ ））　、肉腫特異７０ｋｄ坑原は８本発明の６８ｋｄから７０　ｋｄ　ＲＡＡと は異なるものと思われ、相違点は肉１ｆ７０　ｋｄ膜抗が本発明の６８　ｋｄ− ７０ｋｄにおいて癌細胞系統中に検出出来ないことである（Ｆａｉｔ等。 癌研究、　４４．５７５２−５７５６．　（１９８４）　）。 ｓｓ、−ノｙ用いるＩＮＧ−Ａ　（Ａ３７５）　の蓋　−ベノ　％、Ａ３７５Ｊ 旧胞を１００　ｍペトリ皿の中で７０％の集密度に増殖させ、１０＋ｍｉ＋の無 血清ＲＰＭＩ培地を用いて培養し、次に３ｐｉ（Ｄ”Ｓ−メチオニン（１１４８ Ｃｉ／ｒ＋ｍｏ１．１１ｌＣｉ１０．０７７　ｍｊりを含む新鮮メチオニン欠損 培地（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州、　Ｂｏｓｔｏｎに所在するＮＥＮ　Ｒｅ ５ａａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて培養した。細胞および培地は　２％ Ｓ−メチオニンへの暴露の１１１＆”Ｌ　２時間、４．５時間、２２１寺間、お よび四時間後に収穫した。 ２ｓＳ−メチオニンラベルを付けたＡ３７繁胞の抽出物を１反応を示している患 者から得たタンパク質−Ａセファロース結合１ｇＧによって処理することにより 、抗原を免疫沈降させた。 抗原は、免疫沈降した抗原の５ＤＳ−ＰＡＧＥの後にオートラジオグラフィーに よって視覚化した［Ｓｅｎ等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ白＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ ＵＳへ）、　８０．１２４６−１２５０　（１９８３）の手頃による〕、ならし 培地および細胞抽出物からタンパク質−Ａセファロース丁Ｈに結合した免疫前１ ｇＧによって免疫沈降されたタンパク質を対照として用いた０分子量Ａ＜３８　 ｋｄおよび４３　ｋｄ付近の二重項を含めて数多くのバンドが、細胞抽出物とＲ ＡＡｂとの免疫沈降レーンに現れた。これとは対照的に、　ＲＡＡｂを用いたな らし培地の免疫沈降は＋　３８　ｋｄ　ｉＪ域に１つのバンドを示した。 ４．５時間におけるこのバンドの出現は、４．５時間におけるならし培地の３８ ｋｄタンパク質種の出現と同時であった。この実験は、３８ｋｄ抗Ｗｊｒ＜Ａ３ １５−　ＩＮＧＡ細胞によって分泌されることを実証するものである。 朋ｒｌｎ牡、、、、ｉ　１４１７−１４２３　（１９７３）　、　ＲＡＡを単離 するための典型的な手順においては１回転瓶中で増殖しているＡ３７５１１１１ １ｆｉを、前述した非イオン界面活性剤およびイオン系界面活性剤を含む抽出緩 卸伎ですすぎ１次に前述の抽出緩ｊ腋に暴露する。°前述の界面活性剤は細隠） らのタンパク質あるいは全細胞タンパク質を可τ割ヒする能力がある。高速遠氾 扮剤（１０，０００ｘｇ、４℃）の後、可溶性上澄枳社従来のクロマトグラフィ ー手頃およびアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、退行関連抗原と反 応する固定化された抗原を含む樹脂、あるいはこれらの抗原と高いアフィニティ ーを示すレクチン）を用いてさらに精製を行う。 回ｌａ！Ｌ中で増殖した約１０’個のＡ３７５細胞を標準リン酸緩面叡夜（ＰＢ Ｓ）で二度すすぎ、つぎに室温で５分間にわたって、少１（５０ｍｌ）の０．２ ％トリトンＸ−１００で抽出をおこなった言捨良を除去し、残滓を遠ノシ分離（ １０，０００ｘｇ、４℃）によってペレットにした。 ＲＡＡを含む上澄みを、患者旺血清力）ら得た免疫グロブリンを含む抗体アフィ ニティーカラムに通した。前述の血清は、供給業者ＣＣｏｎｎｅｃｔｊｃｕｔ州 Ｍｅｒｉｄｅｎに所在するＡＩＩＦ　Ｌａｂｐｒｏｄｕｃｔｓ）の使用説明書に 従って’ＺｅＬａｃｈｒｏ＋ｍ　”メンブランフィルタ−上でｔＥされたＲＡＡ ｂを含む、供給業者（Ｃａｌ　ｊｆｏｒｎｉａ州、　Ｒ４ｃｈ＋５ｏｎｄに所在 するＢｉｏ−Ｒａｄ）の使用説明書に従って。 免疫グロブリン１０ミリグラムがＡｆｆｉ−ｇｅｌ　１０　”レジンに結合され た。結合されなかったタンパク質は、　０．０２％トリトンＸ−１００、２５ｍ Ｍ　）リス塩酸ｐＨ７−５＋　および０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを用いて洗った。そ ののちにカラムを蒸留水で洗浄した。結合したＲＡＡは、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１， ０，１％ＮＰ４０Ｔ″（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ州Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓに所在するＳｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）＋　０．５％デキシコーノＬI 塩ナナトリウム０．１％ドデシＭ、’ａナトリウム、　２５　ｍＭ　トリス塩酸 、　ｐＨ７，５，１％アプロチニンを用いて溶離した。溶離液は０．０１　Ｍ重 炭酸アンモニウムに対して透析を行い、凍結し、凍結乾燥した。 凍結乾燥粉末を０．０５％トリフルオロ酢酸中に懸濁し＋　４　ａ＋ｇ全タンパ ク質を高性能液体クロマトグラフィー　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ ｔｓ）用の標瓶−８カラムに入れた。ピーク■通過）からビーク１０に向かう＆ ９ＪＯから１００％のア七トニトリルグラデイエントを用いて溶離を行った。各 ピークの試料を凍結乾燥し、第１表の患者Ｉ２の比！後血清（１：１０００希釈 助を用いるイムノブロッティングによって分析した。クーマシーブル−ｔＭ！５ ＤＳ−ＰＡＧＥによって。 第２図に示すように、ビーク６中の検出可能なタンパク質の４０％ＩＬｂ’＋（ ４３ｋｄおよび７０ｋｄサイズの種であることが明らかとなった。 精製の進Ｊ胆よ、イムノブロンティング手法を用いて特異な６８から７０　ｋｄ 、　３８　ｋｄおよび４３ｋｄ退行関連抗原の位置をモ盟忍することによってモ ニターした。生卒物の純度は、タンパク質濃度の測定、およびＲＡＭ’を含む特 定画分中の全タンパク質パターンを開始材料のパターンと比較することによって おこなう、様々な試料の全タンパク質パターンは、　５Ｏ３−ＰＡＧＥをクーマ シーブルータンパク質染料によって染色するか、あるいは全タンパク質の表示感 度を高めるためにｉｍ法によって５ＯＳ−ＰＡＧＥを染色することによってモニ ターした。この全体的な体系を用いてＡ３７５細胞系統の４３　ｋｄおよび７０ 　ｋｄ膜抗を精製するのに成功しており、ヒト卵巣および偏平上皮癌細胞系統か らの同様な精製にも有効であることが明らかとなっている。この全体的な体系は 、　Ａ３７５ｔ（ｉｆ胞からの２０　ｋｄ膜抗の精製、およびＲＡＭ’を発現す る全てのその他の細胞系統およびＭｉ織抽出物からのＲＡＭ’の精製をも可能の するものと期待される。 〔カ刷列３〕 助ＡＪイ■ン咄２彫匹■世■ ３（ａ）ｌ　百′　ゴー　のＲＡＡ　および　η１゛のｔ　Ｔ＼の量。電−含水 重量６グラムの培養腫瘍細胞を、電動テフロンＴＭホモジナイザー中で５回均質 化を行って、約４倍量のＬ緩衝液（５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび５　ｍＭ　ＥＧＴＡ を含む刃−リン酸ナトリウム（ｐＨ７，２））に溶離した。細胞溶解産物を３， ０ＯＯＸｇでＷ分間に渡って遠心分離して？ｆｔｆＨにした。上澄みを残し、ペ レットは３倍量のし緩衝液に均質化によって懸濁させた。この懸濁液を再び３， ０ＯＯＸｇでｍ分間に渡って遠心分離した。上澄みを残し、ペレットをもう一度 ３倍量のＬ緩衝液に再懸濁させ、上記のように遠ノらａによって清澄にした。こ れら３つの上澄みを一つにまとめ、１００，０００　ｘ　ｇで１時間にわたって 遠心分離した。 ペレットとなった粒子状調製物を、電動ホモジナイザーに５度通すことによって 、５０％スクロースを付加したし緩衝液に再懸濁させた。懸濁液の試料１０ミリ リツトルを、５０％。 ４０％、３０％、および２０％スクロースの不達ｍ（ある４０　ｃａｌ、　ＶＴ ｉ５０遠心分離管（Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ州１ｒｖｉｎｅに所在するＢｅｃｋ ＩＩＩａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕａｅｎｔｓ）の底部に層状に入れた。管をシールし、 　ＶＴｉ５０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｒ＋Ｌｓ）の中で２ 時間に渡って４５．００Ｏｒ−で回転させたＣ■連をゆっくりと行い、ブレーキ は掛けなかった）。 粒子状物質ＲＡＡが約４０％スクロースにバンド状になった。このバンドを直接 吸収によって収穫し、１（１＋Ｍリン酸塩緩衝液、　ｐｉ　７．２によって５倍 に希釈し、　１００．０００　Ｘｇで１時間に渡って遠ＩＣ４１を行った。抗原 を含むペレットとなった粒子状物質を３ｉの１０１リン酸塩緩衝液、　ＰＨ７， ２中に均質化によって再懸濁させ、−２０℃で凍結貯蔵した。典型的な調製プロ トコルにおいて＋　１１６　ｗａｇの全タンパク質が最終粒子状物質ペレット中 に存在した。 含ｙｋｆｊ１６　ｇの細胞から開始した精製の様々な過程において、約１９０■ のタンパク質力嗅棄された。 ３（ｂ）立−のな゛し量立１１゛のＲＡＡ′−゛、れた−゛−１の　リ。　細胞 粒子状画分中の２０　ｋｄ、　３８　ｋｄ、　４３　ｋｄおよび７０　ｋｄ　Ｒ ＡＡの局在化にかんがみて、これらの抗原のいずれかが、培養腫瘍細胞から得た 触清培地中に回収出来ない力祷釦けを行うことは有意義である。予備的なイムノ プロット実験によると、　Ａ３７５ｔａ胞あるいは６９−２ｔｌＥｌ胞の集密培 養力・ら得た無血清「ならし」培地はＲＡＡを含み、　３８　ｋｄ膜抗が豊富で ある。第１図の２番のレーンはＩＮＧ−Ａ　（Ａ３７５）細胞培養力）らのなら し培地ＲＡＭタンパク質を含んだ。 Ａ３７５および６９−策胞によって培地に分泌された３８　ｋｄ膜抗の精製は下 記のようにしてなされた。培地２Ｉ！を４８時間にわたって３刈０１個のＡ３７ 束胞によってならし、　１０，０ＯＯＸｇで１３田間にわたって遠ｒｃｅｉＭを 行い、　０．４５μＮａ１ｇｅｎｅ　フィルター（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ州Ｒｏｃｈ ｅｓ　Ｌｅｒに所在するＮａｌｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ、）で濾過した。　Ａｍ１ｃ ｏｎ　ＹＭＩＯフィルター（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州Ｄａｎｖｅｒ■ 所在の八ｌｌｌ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）を用いて濾液を５Ｑｔａｌｌに濃縮し、 ２ｆｆｉのＡ緩衝液（１０ｍＭ　ＮａＰＯ。 （ｐｌ（７，４））に対して透析を行い、　１０，０ＯＯＸ　ｇで２明引司に渡 って遠心分離を行った。遠心分離過程から生じた上澄みを、Ａ緩衝液で平衡させ たＤＥＡＥ−セファセルカラム（ＳｗｅｄｅｎのＬｌｐｐｓａｌａに所在するＰ ｈａｒｍａｃｉａ）に通した０次にカラムをＡ緩衝液７５ｓｊ！で洗浄し、結合 しなかった物質を除去した。３８ｋｄ抗原はカラムに結合せず、未結合画分中に 回収された。 未結合画分はＡＩＩ＋１ｃｏｎ　ＹＭＩＯフィルターで濃縮し、容量を１０■ｌ とした。 濃縮されたＤＥＡＥｉｉ製抗原を、Ａｉｄ街液で平衡した〜（リン−アガロース （Ｍｉｓｓｏｕｒｉ州Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓに所在するＳｉｇ＋ａａ　Ｃｈｗｉｃ ａｌ　Ｃｏｎ＋ｐａｎｙ）カラム（２ｍｌ）に通した。その後にカラムをＡｉｌ 街液中（７）５０　ｍＭ、　１００　ｍＭ、　２００　ｍＭ、および５００　ｍ Ｍ　ＮａＣ１各２０ｍｆｆ１テすすいだ、３８ｋｄ抗原は主に２００　＋ｏＭ　 ＮａＣ１によるすすぎ液中に溶離したが、少量は１００−および５０　ｎＭのす すぎ液中にも？Ｗａした−　２００　ｄ容帷液はＡｍ１ｃｏｎ　ＹＭＩＯフィル ターによって１ｍｌに濃縮し、Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムに通して、３０％〜印％ の線形アセトニトリルグラデイエントで溶離した。３８ｋｄ抗原は、約５０％ア セトニトリルで溶離した。　３３　ｋｄ　ＲＡＡに対する非常によく似たンぶ姥 特竹幼（、Ｃ４逆相１−ＩＰＬＣカラムを用いて得られた。３８ｋｄ物質を還元 ５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析とそ献続く銀染色法によって分析した結果、３８ｋｄ物質 は％％以上純粋であること力扮かった。上記の手順による典型的な調製において は、　４８１割司にわたって３Ｘ１０”個のＡ３７５細胞によってならしがなさ れた２１の培地中に存在する約３００　ｔａｇの全開始タンパク質から。 約３０μｇの３８ｋｄ抗原調製物が得られた。 この′：ｆ′４１１１ｔを用いて１分泌された３８　ｋｄ　ＲＡＡのかなりの精 製がなされた。　ＨＰＬＣによって精製された抗原は、プロセスの各段階におい て達成される精製度を示す第７表をみれば分るように、除去されたその他の汚染 タンパク質の量に基で′と、ならし培地の１０．００ヴ自の精製にあたる、第７ 表においてＬｔ、用語１倍精製」は汚染タンパク質の除去に基づく精製の程度を 意味する。 第旦表 Ａ３７濁胞のならし培地からの３８ｋｄ抗原の精製ステフッ″１１０．　容量　 全タンパク質　タンパク質　倍精製ｍｌ　ｄ　−」Ｌ−−（概数Ｌ １　ならし培地　１５００　０．１５　２２５　１２　濃縮されたＤＥＡＥ通過 量　１０　０．１９　１．９　１１０３〜くリンアガロース （２００ｍＭ塩を郁■め　１　０．１７８　０．１７８　１１００４ＨＰＬＣＣ ８カラム。 アセトニトリＪＬ７を容雁夜　１　０．０２０　０．０２　羽（３）〔実施例４ 〕 ＲＡＡに　る　、の　に　る串　モニ　１ング４（ａ）Ｉンハ　：　の′に　の ′−六　生　のＲＡＡｂ　のモニ　１ング。 免疫療法を受けている患者の血清試料を、上記のように、　ＲＡＡを含む様々な ヒト腫瘍細胞抽出物のイムノブロッティングを用いて、試験する。各患者の血清 試料の様々な希釈液の特定のサイズのＲＡＡの一つあるいはそれ以上のものを検 出する能力を評価する。 転移卵巣癌患者の療法を開始した後の様々な時点において採取した血清中のＲＡ Ａｂを定量した。免疫療法の開始から約６週間後に□−人の患者の血清Ｄｉ　４ ３　ｋｄ　ＲＡＡに対するＲＡＡｂ力価が約１　二２０００であった。３力月後 にはこの力価は１：５０００に達した８種々のその他の悪性腫瘍のリンパ管内免 疫療法の後に腫瘍が退行し始めた時点で、一つないしはもっと多くのＲＡＡに対 する同様な実証可能なＲＡＡｂ力価の上昇が、患者に観察された。 ここにＲＡＡｂ力価の定量のために示したアッセイは、免疫療法中の患者に対す る薬剤の効果をモニターするのに使用することも可能である。ある甲状腺癌患者 について得られた結果がこのことの例証となる。その患者は、リンパ管内免疫療 法後に腫瘍の退行を示したが。 その後に息切れの症状の療法として大量のプレドニソンを投与された．このよう なステロイド療法は免疫系統を抑制することが知られている．大量プレドニソン 投与療法を開始してから５日以内に，　７０　ｋｄ　ＲＡＡに対する検出可能な ＲＡＡｂ力価が全く無《なった．同じ患者において，それ以前は１：２０００の 力価が横出されていた．このように，　ＲＡＡｂ力価がブレドニソンなどの免剋 ＃ｍＪによって抑制される点で，　ＲＡＡｂの形成は抗原に対する能動性免疫反 応の通常の経過をたどるように思われる．４（ｂ）’ンハ　，、゛　の串　のＲ ＡＡｂのＲＡＡ　のモニ　ｌング．　本発明による手法は，免疫療法に対する反 応の評価に有用である．それは単にＲＡＡｂＯ力価を測定するのにとどまらず， 　ＲＡＡｂが向けられるＲＡＭの異なる分子種を決定するのにも役立つ．ある患 者の結果が実証するように．免疫療法の経過において．異なる反応性が生じる． この患者の最初の反応性は４３　ｋｄ抗原に対するものであったが，　ＲＡＡｂ が出現するとその後にこの４３ｋｄ種だけでな＜３８ｋｄおよび７８　ｋｄ　Ｒ ＡＡとも反応した，　ＲＡＡｂの検出は．この患者においては，卵巣腺癌の肺転 移の完全な退行と相関する．同様に，第２の患者において１４３ｋｄおよび７０ 　ｋｄのＲＡＡに対するＲＡＡｂの検出は，甲状腺癌の肺転移のサイズの評価可 能な減少および患者の幸福怒，スタミナおよび食欲の大きな改善と同時であった ．〔実施例５〕 にお１　ヒＲＡＡに・　るーの ５（ａ）　サギによる　クローン　一　の＝。′．　下記のように本発明の精製 ＲＡ＾の注入してウサギを免疫惑作させることによって，抗血清を特異的に製造 することが可能である．第１の接種は，膜あるいは可溶性ＲＡＡ　（可溶性膜あ るいはならし培地から精製したもの）と．アジュバントとして，不完全フロイン トアジュバント，あるいはミョウバン吸着テタヌストキシンを含む．続く接種は ，　ＲＡＭおよび不完全フロイントアジュバントと含んでもよい．動物を放血し て血清を採取する．多クローン性抗体は．当技術で知られている在来手法によっ て血清から単離することができる．　ハンドプーク（Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅ ｘ　ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　）　Ｖｏｌ．　３，　Ｗｅｉｒ　Ｗ ．　Ａ　３．１からＡ　４．１．　Ｂｌａｃｋｗｅ撃戟@Ｓｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９　７Ｂ）．′Ａ＠としては．　Ａ ｆｆｉ−ｇｅｌ　１０　”（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に結合した純■■ ＲＡＭを含むアフィニティーカラムを供給業者の使用説明書にしたがって１飛ｌ することも出来る．このアフィニティーカラムを用いて従来羽頓によって高特異 性多クローン性抗体を調製することができる．　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏ＋ ａａｔｏｇｒａｐｈＶｔ　４１−４４および９２−９５，　ＳｗｅｄｅｎのＩｌ ｐ垂■ ａｌａ所在のＰｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ．　３８　ｋｄ，　４３　ｋｄおよび７ ０　ｋｄヒトＩＩＡＡに特異な高力価（すなわち，ｂ１０，０００を上回るもの ）ウサギ抗血清が，第１図に示すように．ウサギ２０９の血清から製造された． ５（ｂ）”７ｏ　二７ガ厄本　本発明による単クローン性抗体は，　Ｋｏｈｌｅ ｒ等，　Ｎａｔｕｒｅ，２５６．　４９５　（１９７５）の−ｆ−ｌ頭に従って ，前述の手頃で用いる抗原として実施例４のＲＡＡ　ｆｆｌ製物を代替して製造 することが出来る，　Ｋｏｈｌｅｒ等は参照によって本書に織り込む．基本的に は．単クローン性抗体は，ウサギ免疫惑作について上述したように，　ＲＡＡの 免疫形成に必要な投与量をマウスに注射することによって製造する．免空對乍し た動物から肺臓を除去し，ポリエチレングリコールなどのｆｕｓｏｇｅｎを用い て．牌臓細胞を骨ＷＪＩＩＭ細胞に融合する．単クローン性抗体を産生ずるハイ ブリドーマ細胞を，たとえば｝ＩＡＴ培地などの選択培地によって選択する．　 ＲＡＭに特異な単クローン性抗体は．前述のハイブリドーマを培養した培地から クロマトグラフィーによって単離することができる，　Ｂｒｏｗｎ等，ムー蝕匹 四し．匪１８０−１８５　（１９８１）．〔実施例６〕 ゛′−“　、に　るーの ６（ａ）退行関連坑原Φ精製．　適切なマトリックス，たとえば．セファロース ７′″あるいはＡｆｆｉ−ｇｅｌ”に結合したＲＡＡｂを用いたアフィニティー ク口マトグラフィーによって，ヒト腫瘍細胞抽出物からのＲＡＭの精製度の高い 調製物を製造することができる．実施例２（ｂ）は．精製ステップの一つとして ＲＡＡｂアフィニティークロマトグラフィーを用い．紹花細胞からＲＡ＾を単離 するのに成功した例を示している．６（ｂ）　・　、のためのＲＡＡＩ．リ．　 高力価ヒトおよびウサギＲＡＡｂ（実施例１および５）は新鮮な腫瘍からの抽出 物中の特異抗原と反応するので，これらの抗体ハ患者自身の腫瘍あるいしオ旬裏 細胞系，ｌ）らＲ＾Ａを単離するための強力な手段となる．腫瘍ないしは腫瘍細 胞系統のダラム量の抽出物は，得られる場合には，　Ｓｅｎ等，ｋ匹一顕旦一ｋ 回一とｈ隻鋳し　園，　１２４６−１２５０，　（１９８３）に記載された細胞 容解緩而良中で調製し，次に．高力価ウキザあるいはヒトＲａＡｂ　（ｔｆｉ製 されたＩｇＧ画分）に結合したセファロースのアフィニティー力ラムに通す前に 希釈してもよい．特異的に結合したタンパク質は，解離緩衝液によってカラムか ら溶離し，既知のＲＡＡｂを用いたイムノフ゛ロンティングによって特性を把握 することが出来る．そして，　ＲＡＡｂの一つあるいはそれ以上のものと陽性の 反応を示す聡は療法の一環として患者を能動的に免疫感作させるのに用いること が出来る．６　（Ｃ）　日によ　て、に　めて゛入・゛と゛　る゛　．　抗癌剤 を実於散リ６に説明した種類の一つのＲＡＡに対する単クローン性抗体（すなわ ち，単クローン性ＲＡＡｂ）　圏ｉずることができる．このような抗体を媒介と する薬削１ル姶システムについては，ここに参照することによって本書に織り込 まれたＲｏｄｗｅｌ１等，？ム３．８８９−８９４　（１９８５）で｝対士され ている．ひとつの抗癌斉ｊに結合したＲＡＭに対して特異な単クローン性抗体を 患者の体液億液，リンパ液，あるいはその他の適切な液５例七日嗣賞享ωに導入 することによって．前述の薬斉Ｊを，単クローン性ＲＡＡｂが特異なＲＡＭを発 現する腫瘍細胞に選択的に供給することが可能となる．腫瘍細胞に抗癌剤がこの ように結合することは．腫瘍細胞の生存に悪影響を優先的に及ぼすものと考えら れる． 放射性同位体（たとえば　１１３１，　？●Ｙ，■Ｉｎ）ある囚お１会属（たと えば．アルブミン被覆磁鉄鉱，　ＦｅｉＯＪに結合した高力価多クローン性また は単クローン性ＲＡＡｂを用いる悪性腫瘍の診断用生体内イメージングは，結合 ＲＡＡｂｉ患者に投与した後に放射性同位体あるいは磁気共鳴スキ中ニングを用 いることによって達成することができるしｕｔｅｒｂｕｒ＋　Ｐ．Ｃ．＋４７− ５７＋　ｉｎ　Ｗ゜−　”（Ａｃｃｏｍ　！ｉｓｈ＋ＩＩｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１９８５．　Ｆｏｒｔ獅■窒pｎ扁，　Ｊ．Ｂ． 　Ｌ ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．＋　１９８６＋　およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ等．　 ｐｐ．４７３−４８７，　ｉｎ　里之三二Ｚ性抗体股よび癌治遼，　Ｒｅｉｓｆ ｅｌｄ　ａｎｄ　Ｓｅｌｌ　ｋｌＸ．　Ａ．Ｒ．　Ｌｉｓｓ＋　Ｉｎｃ．，　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８５）　ａ〔実施例７〕 １８・　としての六　董　゜るための　ＲＡＡの　モー゛ルシスームでの９匹の 白色雄二エージランドウサギの足に皮下免疫感作をおこなった．３匹にＩ！．実 施例３に述べたように６９４細胞から９された膜を用いた．別の３匹には．実施 例３に述べたようにＡ３７Ｓ細胞から調製された膜を用いた．さらに残りの３匹 には．実施例３に述べたようにならし培地のＤＥＡＧ−セファセル通過画分をウ サギ１匹あたり（全部で３四１５０μｇを用いた．同じタイプの未処置のウサギ ５匹を対照として用いた．免疫惑作したウサギ１１　ｍを接種する前に．２度に わたって追加免疫を行った．次に全ウサギにウサギ偏平上皮癌の同量（１匹当た り５Ｘ１０’個の成育可能な細胞を接種した．腫瘍が対照ウサギに生じ．急速に 進行し，４週間から６週間以内に対照ウサギは死亡した．免疫感作を受けた全ウ サギｃｔｔ小さな腫瘍が生じたが，広範な腫瘍壊死が見ら札全ウサギは少なくと も２カ月間生存した．免疫感作を行った９匹のウサギのうちの６匹においてｉ１ 　３カ月以内に腫瘍は完全に退行した（３匹の免疫感作を行ったウサギの各グル ープについて．１匹力９蕩退行を示さなかった）．免疫怒作を受けたウサギの抗 体反応はイムノプロッティングによって検出したが，この反応ば実施例１および ２の反応を示した患者に見られたものと非常によ《似ており，さらに．ヒト黒色 騰および乳癌およびウサギ偏平上皮癌の新鮮抽出物中のＲＡ＾と反応した． 〔実施例８〕 モニ　ー　るためのＲＡ＾の ＲＡ＾　の『ドートプロート』イムノアーセイ＊　１．５　ｃａＸｌ，５　ＣＩ １角の方眼を０．４５ミクロン孔サイズニトロセルロース濾祇（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ州Ｋｅｅｎｅに所在するＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ＋Ｉ ｎｃ．）に描く．濾紙を蒸留水中で５分間にわたってすすぎ，風乾する．未知Ｉ のＲＡＡを含むと考えられる試験抽出物の試料２０μｋを同容量の０．０５Ｍ｝ リス塩酸（ｐ８　７．４）　０．２８　Ｍ　ＮａＣｌ．　１．４％トリトｙｘ− ｔｏｏ，および０．２　％　ＳＩｓと混合し，５分間にわたッテ１００℃に加熱 した．試料は１０，０００Ｘｇで遠心分離し，上澄みをミクロとベントでニトロ セルロース濾紙の方眼の中に移した．濾紙を乾燥し，次に１０％酢酸および５％ イソプロバノールを含む溶媒中で常時攪拌しながらｂ分間のあいだ定着した．次 に，水中で何度かすすいだ．その後，濾紙を実施例１に記載したイムノプロンテ ィング手法によって処理したが，但し，放射性ヨウ素で処理したスタフィ口コフ カスタンパク質Ａを加えて行う培養に代えて，ヤギ抗ヒト抗体をセイヨウワサビ 過酸化物に共役（１：２０００）　Ｌたものととともに培養した．イムノプロッ ト手順によるこの１時間の培養およびすすぎの後に，ニトロセルロースの各方眼 を切取り，マルチウェルプレート（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州Ｃａｏ＋ｂｒ ｉｄｇｅに所在する　ＣｏｓＬａｒ）の個々のウエルに入れた．各ウェルに染色 液を加えた．染包勿よ，　０．６　ｔａｇ／ｍｌの。．フエニレンジアミンジヒ ドロクロライドを含む０．５ｍｊ！のリン酸１１ｋＵＦｍｆｆＬＣｐＨ　７）に １μｌの３０％過駿化水素を加えたものである．濾紙方眼を含ｔｉｍｆｌを暗部 で３粉にわたって培養し，１ウェルあたり０．５　ａｌｌ　４　Ｎ　ＨｚＳＯａ を添加することによって色形成を停止させる．つぎに４９Ｏｎｍにおける吸光度 を分光洸ｐ＝＋で測定する。このアッセイは、　Ａ３７５膜の量を次第に増し７ てニトロセルロース濾紙にｔｉｌｉＴする場合には、　ＲＡＭの線形定量を行う ことができる。 本発明は望ましい実施例の形で説明したが、当業者には変更および改良が可能で あろう。 −仔りを挙げると、退行関連抗原の検出には、その他の甑りな免疾マｖ］方法、 たとえばラジオイムノアッセイ、免疫世翫およびＥＬＩＳＡも適切であろう。 さらに１本発明のＲＡＡはさらに特性を定めることも可能であると思われる。例 えば、そのアミノ酸配列の決定、存在するならばタンパク質成分の共有修飾、存 在するならばグリコタンパク質成分のオリゴ糧措造の決定、あるいは存在する場 合には関連脂薫分の脂買組成などである。さらに、　ＲＡＭのポリペプチド部分 のアミノｍｌＪを得ることも可能であると思われ、それからｃＤＮＡあるいはＤ ＮＡ　ｕｌＪを得ることも可能であろう、さらに本発明の抗原を周知の組み換え 体ＤＮＡ手法を用いて製造することも可能であろう、さらに、　ＲＡＡのフラグ メントおよびＲＡＡの共役類似体およびＦ’ＪＬ体あるいはそれらのフラグメン トも予想される。したがって、細胞系統から単離されようとあるいは直接にＩ昏 細胞から単離されようと、また天然に産生されようと組み換えによって得られよ うと、　Ｉ？ＡＡ　、あるいはＲＡＡＯ類（具体、誘導体または共役体と同し構 造を持とうとＲＡＭ、あるいはＲＡＭの類似体、誘導体または共役体のフラグメ ントの構造を持とうとあるいはここに開示したＲＡＡのフラグメントの構造を持 とうと、全てのＲＡＡ　ＵＦｄ製物は全て本発明の範囲内にある。 したがって、添付した請求の範囲は、請求する本発明の範囲内に入るそのような 全ての同等な変更！嗣子を包含するものとする。 ＰＣＴ出願者用ガイド−第１巻Ｈ寸属表Ｍ３付属表Ｍ３ 国で出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０　Ｏ３３４１も友１℃Ｔ／ＲＯ／１３ ４　（１９８１４’、　ＩＪ’ｌ）第１図 ０１、アセトニトリル ２つのワクチン溶解産物の比較 反応者の血清 第３図 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記のステップからなる退行関連抗体の存在を検出するための方法。 退行状態にないものと診断された患者から第１の血清試料を採取し，患者が退行 状態にあることを診断した後に第２の試料を採取すること，腫瘍性細胞の成分を 第１および第２の試料に別々に暴露すること，上記成分と第１血清試料中の抗体 との免疫複合物が存在しないことを確認すること，そして 第２の試料中の抗体と前記の成分との免疫複合物が存在することを検出すること ２．下記のステップからなる免疫療法に対する患者の反応を調べ新生物に関連す る徴候をモニターする方法。 愚者体内の退行関連抗体の循環レベルを測定すること３．下記のステップからな る退行関連抗原を同定する方法。 腫瘍性細胞の成分を退行関連抗体に暴露すること，および少なくとも１つの抗体 と前記の成分との免疫複合物の存在を確認すること４．下記のステップからなる 退行関連抗原の精製方法。 退行状態にないものと診断された患者から第１の血清試料を採取し，患者が退行 状態にあることを診断した後に第２の試料を採取すること，腫瘍性細胞を破壊し て溶液の抗原性成分とすること，前記溶液の画分をクロマトグラフィーによって 画分に分離すること，そして画分の成分と第２の試料中の退行関連抗原に対する 抗体との免疫複合物の存在によって退行関連抗原を含む画分を確認すること５． さらに下記のステップからなる、請求の範囲第４項記載の方法。 腫瘍性細胞の成分を各試料に暴露すること，前記の成分と第１血清試料中の抗体 との免疫複合体形成が存在しないことを確認すること，および 抗体前記の成分との免疫複合物の存在を検出すること６．還元ＳＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量が下記ｉ、ｉｉ、ｉｉｉの範 囲にある退行関連抗原グループから選択され、精製かつ単離された抗原 ｉ約１９，０００ダルトンから約２３，０００ダルトンｉｉ約３９，０００ダル トンから約４５，０００ダルトンｉｉｉ約６５，０００ダルトンから約７１，０ ００ダルトン７．前記抗原が５０ｍＭＮａ３ＰＯ４（ｐＨ７）において陽イオン 交換樹脂に結合せず，また２００ｍＭＮａ３ＰＯ４（ｐＨ７）においてヘパリン アガロース樹脂に結合しない、請求の範囲第６項記載の精製かつ単離された抗原 。 ８．請求の範囲第６項記載の一つの抗原を免疫抗原として必要な量を患者に注射 するステップからなる免疫療法を実施する方法。 ９．前記抗原が請求の範囲第７項記載の抗原である、請求の範囲第８項記載の免 疫療法を実施する方法。 １０．体液中の退行関連抗原のレベルを決定するステップからなる、腫瘍転移を モニタリングする方法。 １１．請求の範囲第６項記載の抗原と特異な免疫反応を示す単クローン性あるい は単一特異性多クローン性抗体。 １２．下記ａ，ｂのステップからなる、請求の範囲第１１項記載の抗体を精製す る方法。 ａ請求の範囲第６項記載のような基質結合抗原を請求の範囲第１１項記載の抗体 を含む溶液に接触させること ｂ前記の抗体を前記の抗原から溶離すること１３．下記ａ，ｂのステップからな る腫瘍治療のための藥剤供給方法。 ａ薬剤を請求の範囲第１１項記載の抗体に結合することｂ結合薬剤を患者の体液 に導入すること１４．下記ａ，ｂのステップからなる癌患者の免疫療法に有用な 抗原を精製する方法。 ａ請求の範囲第１１項記載の基質結合抗体を請求の範囲第６項記載の抗原を含む 液夜に接触させること ｂ前記抗原を前記抗体から溶離すること１５．下記のステップからなる腫瘍の免 疫療法。 退行状態にないものと診断された患者から第１の血清試料を採取し，患者が退行 状態にあることを診断した後に第２の試料を採取すること，腫瘍性細胞の成分を 第１および第２の試料に別々に暴露すること，前記成分と第１血清試料中の抗体 との免疫複合物が存在しないことを確認すること，抗体と前記成分との免疫複合 物が存在することを確認すること，そして腫瘍性細胞，あるいはその膜画分ある いはそれから単離された退行関連抗原を患者のリンパ液あるいは血液に導入する こと１６．下記のステップからなる退行関連抗原の精製方法。 還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した分子量が約３８ｋ ｄの退行関連抗原を分泌する細胞系統を用いて培地をならすこと，ならし培地中 に存在するタンパク質を濃縮すること，前記の濃縮されたタンパク質の画分をク ロマトグラフィーによって分離すること，２８０ｎｍにおけるかなりの吸光度を 示す画分を濃縮すること，前記の濃縮された画分をＣ■カラムに通し，０．１％ トリフルオロ酢酸中で０〜８０％アセトニトリルグラディエントで溶離すること ，さらに約５０％アセトニトリルで溶離する画分を保持すること１７．精製され かつ単離された退行関連抗原。 １８．前記抗原が，下記の退行関連抗原グループから選択された、請求の範囲第 １７項記載の抗原。 還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量が下記 １、ｉｉ、ｉｉｉの範囲にある退行関連抗原。 ｉ約１９，０００ダルトンから約２３，０００グルトンｉｉ約３８，０００ダノ レトンから約４５，０００タルトンｉｉｉ約６５，０００ダルトンから約７１， ０００ダルトン１９．前記抗原が５０ｍＭＮａ３ＰＯ４（ｐＨ７）において陽イ オン交換樹脂に結合せず，また２００ｍＭＮａ３ＰＯ４（ｐＨ７）においてヘパ リンアガロース樹脂に結合しない、請求の範囲第１８項記載の精製かつ単離され た抗原。 ２０．前記抗原が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後に銀染色法によって測定すると ころによって９５％に等しいかそれ以上の純度である請求の範囲第１９項記載の 抗原。 ２１．前記抗原がマイコプラズマヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｒｈ ｉｎｉｓ）内のＤＮＡによって暗号を定められた、請求の範囲第２０項記載の抗 原。 ２２．前記抗原がマイコプラズマヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｒｈ ｉｎｉｓ）と関連する哺乳類細胞系統内のＤＮＡによって暗号を定められた、請 求の範囲第２０項記載の抗原。 ２３．精製かつ単離された退行関連抗原，および薬学的に許容できる希釈剤，ア ジユバントあるいは担体からなる免疫療法薬。 ２４．前記の退行関連抗原が下記の退行関連抗原である、請求の範囲第２３項記 載の免疫療法薬。 還元ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量が下記 ｉ、ｉｉ、ｉｉｉの範囲にある退行関連抗原グループから選択され、精製されか つ単離された抗原 ｉ約１９，０００ダルトンから約２３，０００ダルトンｉｉ約３８，０００ダノ レトンから約４５，０００タルトンｉｉｉ約６５，０００ダルトンから約７１， ０００ダルトン２５．前記の退行関連抗原が請求の範囲第１９項記載の退行関連 抗原である、請求の範囲第２３項記載の免疫療法薬。