JPS63502090A - 動植物由来物質の破砕と抽出法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ｔＵ針各郵− 動植物由来物質の破砕と抽出法 ！−１ 大集塊あるいは熱伝達が関係する物質移動および／又は物質移動と熱伝達の両方 を包含する分離工程（例えば抽出、濾過、乾燥、凍結乾燥など）において、供給 する物の物理的な形、すなわち粒子の大きさ、容量に対する表面積の比率、質量 に対する容積（比容積）などが通常その工程の効率に大きな影響をもつ。この効 率は溶媒やエネルギーをより少なく、工程の速度をより早く、収率をより高く、 そして多くの場合最終産物の品質をより高くするといったことで表わされる。例 えば、有機溶媒や超臨界液体（ＳＣＦ）による抽出において溶媒に曝される溶質 の面積が大きければ大きい程その工程の効率は高い。同様に凍結乾燥では熱の流 れや昇華の速度は工程に関わる物質の対象となる面積に直接比例している。

植物や動物体例え１ｆ組織や細胞等から目的とする物質を抽出するとき、抽出さ れる物体の粒子の大きさを出来るだけ小さくするのが重要である。なぜ小さいこ とが重要かというのに３つの理由がある：（１）小さな粒子サイズを得るための 行動または加工は細胞や小器官（オルガネラ）や細胞外成分を゛物理的に保護し 囲っている壁や膜や構造を破壊する。（２）抽出工程には抽出されるべき分子群 が溶媒にできるだけ露されることが必要である。（３）熱抽出においては分子群 は物理的に露出されていることが重要である。

膜の破壊と最大の露出は植物や動物体をその脆弱温度以下で処理することで得ら れる。この温度は力を加えたとき凍結した物体が小さな粒子に破壊される温度以 下のものとして定義している。

動物あるいは植物由来の物質すなわち組織、器官、細胞、オルガネラなどを水性 の溶媒、有機溶媒、ＳＣＦあるいは熱エネルギーを適用することによって抽出や リーチングのような分離工程のために調製するには、溶質（通常は細胞、プロト プラズム及びｌまたは膜の内容物）は抽出媒体に容易に利用され露出されるべき である。このことは細胞膜は破壊されるべきことを意味している。そのような動 物由来の溶質の容積に対する表面積の比が大きければ大きい程その工程は効率が よくなる。

動物由来の物質は本来もっている熱に対する感受性のために、そのような成分を 調製するには、生体分子の破壊温度以上の熱を使うことは避けねばならない。な ぜなら、望ましくない反応（例えば、蛋白変性５．リピドや炭水化物の分解、欲 しい生体分子の不活性化）や望ましくない生成物の生成（例えば、メイラード反 応産物、熱分解産物）が起こるだろうし、それがこんどは分離過程に悪影響をも たらすだろう、従って動物由来の物質を分離工程のため゛に調製するには出来る だけ最低の温度ですべきである。

他方、ある動物由来の物質はその物性的な性質から通常の温度では均質化できな いものがある１例えば、脂肪組織や、網は室温や冷蔵温度あるいは凍結温度では 均質化（粉砕）されない、これらの組織の高い可塑性が粉砕過程に適合しない。

これまでの方法では均質化を可能にするために動物の脂肪性組織に燐酸塩緩衝化 生理食塩水（ＰＢＳ）または水が「フィラー」として加えられている。いい換え れば１、媒体なしにはこの組織は単なる均質化によっては破砕されない。しかし 水性の層を加えることはあとでその系からそれを除くために遠心分離や凍結乾燥 のような時間のかかる、あるいはエネルギーを消費することが必要となる。

結論として、動植物由来の物質を分離工程のために調製するには、余分の溶液相 や物質を必要とせず、細胞膜や細胞壁を効果的に破壊し、分離用に使われる力Ｃ ｍ媒、ＳＣＦ、熱エネルギー、減圧等）に対して細胞内容物の表面積の露出を増 やし、損傷を与える熱処理を伴なわず、生体分子に適合し技術的に適用可能で経 済的にひき合う方法が必要とされる。

この発明の目的は抽出のために動植物成分を最適な粒子サイズで、かつ容積に対 する表面積の比及び質量に対する容積の比が最適な粒子に粉砕するためにその脆 弱温度以下の温度でその成分を迅速に調製することにある。

さらに本発明の目的は、リビド、炭水化物、蛋白に限定されず、これら生体成分 の構造や反応性に影響のない、あるいはほとんど影響しないその他のあらゆる生 体分子を含む動植物成分から目的とする物質を得るための改良法を提供するもの である。

又、本発明の別の目的は、目的とする物質を得るために脆弱温度以下で動物や植 物由来の物質を処理して抽出することさらにまた本発明の目的はその脆弱温度以 下の温度で破砕された物質に対して水性または有機溶媒や／或いは超臨界液体、 を使って乾燥、凍結乾燥、リーチング、および抽出といった分離する方法を適用 することである。

これらの発明の目的がいかに達せられるかは以下の明細から分るだろう。

先丘抜宜 凍結は組織を保存する技術として認められているが、以降の分離を改善するため に脆弱温度以下での粉砕あるいは破砕と結びつけて使用することはこれまで考え られていない。

アメリカ特許ＮＱ４，１４１，８８７は血漿から成分を分離する方法を明らかに している。血液凝固物を凍結沈降は一２２℃以下の温度を使うと粉砕なしに達せ られる。この沈降は蛋白分子の変性すなわち三次元構造の変化によってもたらさ れる。

例えばアメリカ特許Ｎα４，２９６，０９９（目的とする抽出物を得るのにウシ 胎児の皮組織を粉砕する）によって証明されているように、他の特許は抽出のた めの組織を準備するのに粉砕を使っている。アメリカ特許Ｎα４，３４９，５４ ０は植物体（なつめ果）を低温で湿式粉砕することを述べている。一方アメリカ 特許Ｎα４，４５５，２９８は軟体動物を乾燥し、目的とする脂質抽出物を得る ために粉砕することを述べている。

これらの資料のどれも、目的物質を得るのに脆弱温度以下で動物や植物体を破壊 したり、破壊と破砕をするような脆弱温度とそのような方法について教示してい ない。

日　な記　と ■、動　の　の　弱温度以下での粉砕 Ａ、予備凍結処理 動植物の組織、器官、細胞を得るときには全て清潔な状態で実施される１例えば 、それらを直ちに低温（０℃）に冷却される。この処理は好しくない微生物の生 育、酵素活性。

自己消化による化学反応等を防ぎ、あるいは著しく減殺する。

脆弱温度に凍結する直前に大きな組織は比較的小片（例えば１〜５ｇ）に切断さ れる。このことは組織の凍結速度を改善し後の凍結粉砕ステップの間の操作を容 易にするだろう。

予備処理時間を最短にする試みがなされるべきであり、組織も遅れなく凍結され るべきである。

Ｂ、凍結処理 このステップは目的とする組織の小片を凍結し、その温度を破壊されない、粘稠 なねばりつく物質（例えば脂肪組織）を著しく脆弱な壊れやすい物質に変える経 験的に臨界の「脆弱温度」にまで下げることによっている。

脆弱温度はまず組織の種類や組成（水、リピド、蛋白、炭水化物、無機質など） に左右され、それ故その熱特性に関係している。水の結晶化速度（すなわち核形 成と結晶の成長）は結晶の大きさに影響を与えよう。結晶化速度が遅ければ、細 胞外の水の結晶が大きくなり、それが細胞膜の破壊をもたらすだろうが、そのよ うな効果は凍結−溶解のくりかえし操作でも凍結粉砕による細胞破壊に比べれば 無視できる効果にすぎない、しかし組繊細胞の物理的構造を生きている状態のま まに保つことが望ましい、このことは他の要因が等しければ出来るだけ迅速な凍 結速度がとられるべきである。凍結工程と並んで、組織の最初の容積の増加があ る。０℃の純水は同温度で氷に変わったとき約９％膨らむ６大抵の組織も凍結で 膨らむが純水よりは程度が少ない。

凍結には様々な方法で行われる。例えば、１、空気凍結　ａ）噴霧凍結 ｂ）流動床凍結 ２、平板凍結 ３、液体浸漬凍結 ４、冷凍剤凍結（冷凍剤が状態の変化をうける）ａ）液体窒素（ＬＮ、）、　− １９６℃（７７Ｋ）ｂ）昇華性ＣＯ，（ドライアイス）、−７９℃（１９４Ｋ） Ｃ）　ＣＣＱ、Ｆ２Ｃ寒剤−１２）、　−３０℃（２４３Ｋ）上記のあらゆる方 法の中でＬＮ２による凍結は以下の理由で最も好ましい方法である。

一液体窒素は安全で無毒性で不燃性の食品、薬品、その他の産業界で普遍的に使 われている冷凍剤である。

−凍結速度は著しく早いから、細胞の物理的構造が保たれ（細胞内に小さな結晶 ）、脱水損失は無視できる。酸素も沸騰している冷開から除かれる。従って組織 に対する凍結による損傷は極小の範囲である。

一低額の設備投資、単純な設備、最、少のスペースでの高い生産性、連続運転や 多様の生産スケールに対応可能性がある。

液体窒素の唯一の欠点は比較的運転コストが高くなることである。

Ｃ１凍結粉砕処理 組織の破砕片を得るには、ウォリング・ブレンダーのような大きさを減少させる 装置に移される。そして好しい時間、例えば２２．ＯＯＯｒｐｍで数分間、ホモ ゲナイス（粉砕）される。より大きな規模では摩擦と衝撃による粉砕を行うロー ルミルが使われる。粉砕工程中、脆弱温度以下に組織を保つことが重要である。

脆弱温度以下の粉砕は必要な小粒径を得るのに必要である。この目的のためにも し必要ならＬＮ２の所要量をサイズを小さくする装置にしばしば添加され、その 際作業学生じる窒素蒸気を排出させる。

この工程を終えると著しく細かな自由に流れる（くっつかない）凍結粉砕組織（ 「組織粉末」）が得られる。得られた粉は細かな分離できない粒子とともに明ら かに粒状のがたまりを含んでいる。

表面積の著しい増加（容積に対する表面積の比）と並行して、密度の減少が伴う 。例えば網の粉の密度は０．４４（±５％）ｇ／−で網から抽出されたリピドの 密度の約半分である。

■０組織　末の凍結　け 得られた凍結粉砕組織粉は著しく細かいけれど矢きさに関して均質でない。従っ て１粒子径範囲に均一性が以下の工程に必要ならば組織粉末は脆弱温度以下で篩 分けられる。

この目的のために積み重ねたステンレススチール製の標準篩が使われる。（第１ 表；ＡＯＡＣ１９８４年版）１　標準試　篩の公称寸法（アメリカ規格品）凶」 死！己俺　公称の篩目幅　公称の針金径ｂ　Ｌ　−ｂ １２．５　＋ｎｍ　／２ｘｎ、　０．５００　２．６７１１．２　ａｍ　’／、 ６ｉｎ、　０．４３８　２．４５９．５　ｒｒｔｎ　３／。ｉｎ、　０．３７５ 　２．２７８、Ｏｒｒｒｎ　”／、Ｇｉｎ、　０．３１２　２．０７６．７　ａ ｎ　０．２６５ｉｎ、　０．２６５　１．８７ｂ　ｘ　、ｂ ６．３　ｍｍ　八ｘｎ、０．２５０　１．８２５．６　ｍＮα３”／、　０．２ ２３　１．６８４．７５　ｒｒｔｎ　Ｎα４　０．１８７　１．５４４．００　 ｒｒｎ　Ｎａ５、　０．１５７　１．３７３．３５　ｍｎ　Ｎｎ６’　０．１３ ２　１．２３２．８０　ｍｍ　Ｎ＋１７　０．１１１　１．１０２．３８　匝　 Ｎα８　０．０９３７　１．００第１表（つづき） 篩の名称　公称の篩目幅　公称の針金径２．０ＯｒｒｎＮ［１１００，０７８７ ０，９００１，７Ｏｎ＋ｍ　Ｎａ１２　０．０６６１　０．８１０１．４０＋＋ ｏ　Ｎ（１１４０，０５５５０，７２５１，１８ｍｍ　Ｎａ１６　０．０４６９ 　０．６５０１．００１１１１１　Ｎ（１１８０，０３９４０，５８０７１０ｐ 　ｍ　Ｎｎ２５　０．０２７８　０．４５０６００　μｍ　当３０　０．０２３ ４　０．３９０５００　μｍ　Ｎａ３５　０．０１９７　０．３４０４２５　μ ｍ　Ｎａ４０　０．０１６５　０．２’Ｊ０３５５　μｍ　Ｎａ４５　０．０１ ３９　０．２４７３００　μｍ　Ｎａｎｏ　Ｏ，０１１７０，２１５２５０ｐ　 ｍ　ＮＣＬ６０　０．００９８　０．１８０２１２　ｐ　ｍ　＆７０　０．００ ８３　０．１５２１８０　μｍ　Ｎａｎｏ　Ｏ，００７００，１３１１５０μｍ 　Ｎ（１１０００，００５９’　０．１１０１２５　μｍ　＆１２Ｑ　Ｏ，００ ４９０，０９１１，０６１ｔ　ｍ　ｍ１４０　０．００４１　０．０７６９０　 μｍ　Ｎｃｉ１７０．　０．００３５　０．０６４７５　μｍ　Ｎ（１２０００ ，００２９０，０５３６３μｍ　Ｎｎ２３０　０．００２５　０．０４４５３　 μｍ　Ｎａ２７０　０．００２１　０．０３７ａ：これらの規格の名称はスイス ・ジュネーブの国際規格機関で奨めている試験篩装置に対する値に対応している 。

ｂ：これらの篩は標準系列にはないが一般によく使われるものなので含められて いる。

ｃ：　１０００μｍ　＝　１　ｒａｎ この研究では次の篩の組合せが使われた。

監１号　開口部のサイズ ５　４．００ｍｎ １６　１．１８ｍｍ ３０　６００μＩ ５０　３００μｍ １００　１５０　ｕ　ｍ ２３０　６３　ｔｔ　ｍ ４００　：１μｍ 最も篩目の大きな篩を上にこまかな篩を下に積み重ね、全体をＬＮ２の温度に下 げるために最上篩からＬＮ２を注下する。

このときに適当な量の凍結粉砕した組織粉末を第−篩にのせ、全体に数分間均一 な振動をかける（シェーカー）。組織粉末を凍結篩別工程中時々ＬＮ２を加える ことによって脆弱温度以下に保つことが大切である。

凍結篩別を終えたら、均−且つ均質な組織粉末が個々の篩の上から得られ、それ は個々にあるいは目的とする粒径の粒子を混合して使われる。大きすぎる粒子は さらに凍結粉砕のために再回収される。粒径の分布は各々の篩にのっている物質 を秤ることでわかる。

均一な組織粉末はさらに通常の凍結温度で（例えば−１８℃＝０７）加工され、 運搬され保存される。しかしながら通常の凍結温度でさえも、特に凍結粉砕によ って生じた広大な表面積のために、いくらかの化学変化、例えば不飽和脂質の酸 化、蛋白の不溶化あるいは不安定化、色素、ビタミン、その他の生体分子の分解 などがゆっくり起こるだろう。冷凍庫温度を下げることは上記の反応の速度を減 少させる。

従って長期間の保存のためには、最終的な組織粉末は一４０℃で、真空あるいは 不活性ガス下で、暗所に（光触媒反応の可能性を避けるため）保管することがす すめられている。

予備的な評価では、上記の条件で２ケ月間保管されたいろいろな組織粉末はその 製品に何の物理的変化（テクスチュア、色、におい等）を示さなかった。

均一な凍結粉砕産物を使うためには、この組織粉末を必要に応じて融解する。液 体でない組織を融解することは同じ温度差で行って比較した場合には凍結時より も元々ゆっくりである（氷と水の熱特性が異なるため）。ここで組織粉末は化学 的或いは物理的（そしてわずかな微生物的あるいは酵素的）な手段による損傷を うける。この考え方ではこの技術に通じた者は融解工程が注意深く考えねばなら ないことを認識している。

■、　と　１　の　へ １、　この方法は一直線に進められ、複雑なところがなく効果的で迅速、損失が 少なく清潔である。均質化のために媒体を加えてないので余分なステップ（例え ば遠心分離）を媒体を除くために使う必要がない。この方法は技術的に適用でき る。

２、非常に低温での機械的処理であるために微生物や酵素活性あるいはその他の 望ましくない熱で触媒される化学反応等の逆効果や障害はない。従って組織が「 物理的に」粉末にされる間、その「生化学的及び化学的な」構成は保たれたまま である。この方法は生体分子に適合している。

３０．得られる凍結粉砕、凍結篩別された組織は自由に流れる粉体で実験室や工 場での取扱い（例えば、秤量、運搬、混合、注入等）は非常に容易である。。

４、　その著しい均一性のために得られる組織粉末が分析的あるいは調製的な研 究開発の比較研究に信頼できる一般素材として使われる。

５、安全な組織の均質化法としての凍、結粉砕、凍結篩別法と安全な抽出法とし ての水抽出やＳＣＦ抽出あるいは温和な熱処理法を結合させることによって化粧 品、医薬品、あるいは食品を作ることは健康上の権威者に容認されよう。消費者 の容認と市場性は明らかに大きい。

６、　この方法は容積に対する表面積の比率の著しい増加をもたらすので、これ に続く分離工程でより高い収率をもたらすだろう、従ってこの方法は全体の生産 コスト（時間、薬品、エネルギー、その他の資源）を減らし、それ故、経済的に 引き合うことになる。

去ｍ 下記で説明された一般的なプロトコールに従って凍結粉砕をブタの網について行 い桃色をした「絹粉末」を得た。凍結篩別で絹粉末の最も均一な両分は１５０か ら６００μｍの範囲にあると思われた。

去１１μ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの脳に凍結粉砕を適用し 、白色の「石粉末」を得た。凍結篩別で脳の粉末の最もよい均一画分は３００μ ｍから１．１８ｎｗｎの範囲にあると思われた。

スｍ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの膵臓に凍結粉砕を行い 、白色の「膵粉末」を得た。凍結篩別で膵粉末の最もよい均一画分は１５０μｍ から１．１８ｎａの範囲にあると思われた。

去１１１ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタのをすいに凍結粉砕を行 い、白色の「をすい粉末」を得た。凍結篩別でをずい粉末の最もよい均一画分は １５０μｍから６００μｍの範囲にあるようであった。

１創１ 上記モ説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの肝臓に凍結粉砕を適用 し、「肝粉末」を得た。凍結篩別をすると肝粉末の最も均一な両分は３００μｍ から１．１８ｎｙｎの範囲にみられた。

去１漕胆 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの腎臓に凍結粉砕を適用 し、「腎粉末」を得た。凍結篩別で腎粉末の最もよい均一画分は３００μｍから １．１８ｎｗｎの範囲にみられた。

去１ｊμ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの牌に凍結粉砕を適用し 、「牌粉末」を得た。凍結篩別では牌粉末の最もよい均一画分は３００μｍから １．１８ｎａの範囲にみられた。

実開■ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの血液に凍結粉砕を適用 し「血液粉末」を得た。凍結篩別では血液粉末の最もよい均一画分は１５０から ３００μｍの範囲にみられた。

夫１■ 上記で説明された一般的なプロトコールに従って、ブタの皮下脂肪組織（ＰＳＡ Ｔ）を凍結粉砕してｒＰｓＡＴ粉末」を得た。凍結篩別でＰＳＡＴの最もよい均 一画分は１５０μｍと１．１８＋ｎｍの範囲にみられた。

去１１よヒ岨 上記で説明された一般的プロトコールがあらゆる動物組織。

器官、細胞から「粉末」を調製するのに使われる。例えば、中枢神経系の組織や 器官（脳、をすい、ずい液、付属器）；末梢神経系の組織や器官（頭蓋神経、を ずい神経など）；心筋や循環器の組織や器官（心臓、動脈、静脈）；循環組織や 器官（血液、赤血球、白血球、血小板、血しよう）；リンパ系の組織と器官（リ ンパ節、牌、胸腺）；呼吸器系の組織と器官（上方呼吸管、肺）；消化器系の組 織と器官（口、歯、舌、唾液腺、咽頭、食道、腹膜、胃、小腸、大腸、肝、胆の う、膵を含む）；骨格組織と器官（中軸骨格、付属骨格、骨髄）、筋（平滑筋、 骨格筋）、内皮と上皮の組織；膜、網、軟骨組織（ｖｌ、靭帯、関節）；感覚器 官（眼、耳、鼻、舌）；内分泌あるいはその他の分泌組織（甲状腺、副甲状腺、 下垂体、副腎腺）；尿管組織と器官（腎、尿管、膀胱、尿道）生殖器官と組織（ 精のう、卵巣など）：皮下や内器官に含まれるような脂肪組織や糞０、尿、汗、 精液、乳、等のような生体滲出物などが使われる。各々の場合で目的とする粉末 の物理的、物性的特性が最適になるような工程条件が選ばれた。

失胤孤Ｕ 絹粉末のクロロホルム／メタノール抽雌５００ｇの均質なブタの絹粉末を室温に 温め、１０倍量のクロロホルム／メタノール（２：１．ｖ／ｖ）でガラス製の混 合器で抽出した（２２．０００ｒｐｍ、３０秒間）。溶媒抽出物を遠心分離（２ ，ＯＯＯｒｐｍ、２０分間）して、ロータリーエバポレータで乾固まで、すなわ ち溶媒の凝縮が起らずまた溶媒のにおいも存在しなくなるまで蒸発させた（減圧 で、３７℃で）。白色のクロロホルム／メタノール画分（ＣＭＦｒ）が３８８ｇ 得られた（収率７７．６％）　、ＣＭＦｒはさらしこヘキサン／エタノール分画 にかけられる。

末五Ｍ田 末の　ヘキサン ５００ｇの均質なブタの絹粉末を室温に温ため、ガラス製の混合器の中で１０倍 量のヘキサンで抽出した。（２２，０００ｒｐ＋ｎ、３０秒間）。得られた桃色 の溶液を２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。

遠心分離を室温で行うと桃色をした固体層の沈澱のみがペレットとして得られる 。しかし、もし遠心分離を冷蔵温度（例えば５℃）で行うとヘキサンの可溶化力 が減少し、リピッドの白色層も蛋白性の桃色をしたペレットの上に沈澱するだろ う。

しかしこの層はヘキサンを室温または３７℃に温めれば容易に溶液になる。ヘキ サン抽出物を減圧３７℃でロータリエバポレータにかけた。ブタ網粉末の直接ヘ キサン抽出物の全回収率は３６１．５ｇ（すなわち７２．３％）であった。

失庭且互 網　末の　臨　Ｃ０ １９０５，４ｇの均質なブタの絹粉末を４回の試験バッチで超臨界ＣＯ□を使っ て抽出した。供給比３００（１Ωｂ／ｗｉｎ）の溶媒が使われた。全部で１２の 抽出画分が各テストから収集された。抽出器は３７℃、３５００ｐｓｉｇに保た れ、第１分離器は４０℃、１５００ｐｓｉｇ、第２分離器は２９〜３０℃で約１ １０００ｐｓｉに保たれ、そこに抽出物が集められた。第２分離器からの溶媒は 約１５００ｐｓｉｇでノックアウト槽に供給され、それから回収された。抽出器 中の残渣は添加量の８〜１７％の範囲にあった。５Ｃ−ＣＯ□はクロロホルム／ メタノール（従来の均質化に実用された）よりも多い添加材料の約８３〜９２％ を抽出することがわかったのは興味深かった。この　。

ことは抽出の前に凍結粉砕することが正に効果的であることを示唆していよう。

失に桝靭 の　な　熱 網またはその他の脂肪組織からリピドを加熱して抽出するためには、次のことが 必要である。（１）脂質を溶かすあるいは液状化すること、（２）溶かしたリピ ドを組織から分離することそして（３）残渣から得られた油または脂肪を炉し別 けることである。上記のステップは全て以下のように「１ステツプ」として結合 された。すなわち１０００ｇの均質なブタの絹粉末を２つのステンレススチール 製の１５０μｌ１ｌ（９１００）の篩に入れた。

この篩を３８μｍ（＃　４００）篩と集合皿の上に重ねた。これを緩和な加熱（ ７０℃）をする炉の中に置いた。絹粉末をゆっくりと融解するとき、リピドはゆ っくり溶は一方蛋白成分は変性した。

この結果絹粉末の粉状の構造の収縮が起こり最後に破裂をもたらした。しかしな がら溶解したリピドは１５０μｍｔ＃を容易に通過し、３８μ臆篩上に油滴とな って落下し、そこで濾過され小さな残渣粒子と分離され、そして最後に透明な油 が集合皿に集められた。熱抽出の全時間は３時間でその間時々攪拌を行った。全 収率は７ｏ９．ｓｇ（すなわち７３．６％）であった。この収率は上あ篩上に残 った油状物質を圧搾したものは含んでいないことは注目される。

実施例２７から３０までを考えると、網の「粉末」が使われる（従来の細胞破壊 法よりもむしろ）と、原料の処理や取扱いがそれに続くあらゆるタイプの抽出を より容易にするばかりでなく、上記の例の全てでリピドの回収率が従来の細胞破 壊法（すなわちＰＢＳによる）よりも高くなることは興味深い。組織を処理する のに凍結粉砕と凍結篩別にとってより良い品質とより高い収率が明らかに大きな 訴求を与える。

寒胤態廷 １００ｇの均質なブタの脳粉末を実施例２７と同様にクロロホルム／メタノール 混液で抽出した。蒸発の終り近くに、泡立ちが生じ（おそらくホスフオリピドが 高濃度になったｈめ）、そこで減圧度をおとして蒸発を続けた。脳のＣＭＦｒは 蒸発用フラスコから機械的に取り出されるかまたは水で取り出され、その水分は その後凍結乾燥で除かれる。ＣＭＦｒの全回収量は７．３ｇ（すなわち７．３％ ）であった。

尖嵐ｍ ３１．２ｇの均質なブタの膵粉末を実施例２７と同様にしてクロロホルム／メタ ノール混液で抽出した。ＣＭＦｒの全回収量に３．８ｇ（すなわち１２．２％） であった。

失凰璽Ｕ ７９．７ｇの均質なブタのをすい粉末を実施例２７と同様にしてクロロホルムｌ メタノール混液で抽出した。ＣＭＦｒの全回収量は８．５ｇ（すなわち１０．７ ％）であった。

寒胤五旦 １００ｇの均質なブタの肝粉末を実施例２７と同様にしてクロロホルムｌメタノ ール混液で抽出した。遠心分離の際に粒子が上清になお懸濁していた。それらを グラスウールのフィルターで除き、透明な黄色の液を得た。ＣＭＦｒの全回収量 は８．７ｇ（８゜７％）であった。

失胤匠競 １００ｇの均質なブタの腎粉末を実施例３４と同様にしてクロロホルム／メタノ ール混液で抽出した。　ＣＭＦｒの全回収量は９．５ｇ（９，５％）であった。

失庭且坦 １００ｇの均質なブタの牌粉末を実施例２７と同様にしてクロロホルムｌメタノ ール混液で抽出した。全回収量は９．０ｇ（９，０％）であった。

去】Ｕ４程 ４００ｇの均質なブタの血液粉末を実施例３４と同様にしてクロロホルム／メタ ノール混液で抽出したが２回濾過をした。全回収量３．８ｇ（すなわち０．９５ ％）であった。

失り豊川 ５００ｇの均質なブタの皮下脂肪組織（ＰＳＡＴ）粉末を実施例２８と同様にし てヘキサンで直接抽出した。全回収量は４１４．６ｇ　（すなわち８２．９％） であった。

夾厳涯坦 温度の函数としているいろのクラスの網リビドを得るために、３００ｇのブタの 絹粉末を実施例３０にのべられているように積み重ねた篩に入れた。冷却した（ −４０℃）絹粉末を入れた篩この初期ステップをした後、炉の温度を１０℃きざ みで増加させた。各１０℃増加に対する時間を１０分間としたが試料は１時間か ら１．５時間目的とする温度で加熱されるようにした。各画分の回収量は以下の とおりである。

−温　℃　回収率％ 残渣（篩の最上に残る）　１２．５ 損失（水を含む）　２１．９ 殆んどのリピドが５０℃の炉温度で回収されていることがわかる。

ヌ】１１徂 植物組織に対する脆弱温度と凍結粉砕を基本的に理解するために、我々は上記で 説明した一般的プロトコールに従って、室温と液体窒素温度（すなわち２分間凍 結粉砕する）で２つの７゜Ｏｇの穀皮つき大豆試料を粉砕した。得られた「大豆 粉」はＬＮ。

温度で５分間凍結篩別にかけた０粒子径の分布百分比は各節の上にのった物質を 秤って計算した。

粒　室゛ １．１８μｍ　１７，３０　５．９０ ６００　ｐ　ｍ　３９．１０　４０．８０３００μｍ　３７．９０　４５．６０ １５０μｍ　４，６０　６．８０ ６３μｍ　Ｏ，９３０，６９ 凍結粉砕がより小さなサイズの粒子を産することは明らかである。このことはフ レーク状の、あるいは室温で粉砕した大豆粉を同じように処理した場合に比べて 油の回収量を改善することができる。得られる凍結粉砕した大豆粉（６００μｍ 篩からおちた）２５０ｇを室温で１５倍量のヘキサンで抽出した。得られる曇っ た液を２０分間２０００ｒｐｍで遠沈した。遠沈によって°　透明な黄色の上清 液が得られ、それを減圧で３７℃でロータリーエバポレーターで蒸留した。全回 収量はｚ４．３ｇ（すなわち、９．７％）であった。

この技術に通じた者はここに述べられた方法の適用性はその他あらゆる抽出工程 にわたることを認識するだろう。組織の凍結処理とこの処理された組織を凍結粉 砕することは、目的とする抽出物の量及び質を改善するに適した形での非常に小 さい径の粒子と真人な表面積をもった物質を提供している。

ここに述べられた方法を使って抽出される物質はアシルグリセロール、ホスホグ リセリド、スフィンゴリピド、ガングリオシド、ワックスのような複合脂質、テ ルペン、色素、ステロイド、及びそのアルコール（ステロール）、プロスタグラ ンディン等のような単純脂質などを含むがそれに限定はされない・グリコリピド 、リボプロピイン、膜の超分子構造の複合体、それらの代謝中間体、異化であろ うと同化であろうとこれらの分子の代謝産物やリビドと同様に行動する分子は上 記の実施例に示されたと同様のやり方で得られる。極性、非極性及び両親媒性の 生体分子が同様に得られる。

さらに次のような分子がこの発明の方法によって得られる。

例えば、アミノ酸含有物質（非タンパク性のアミノ酸を含む）オリゴペプチド、 ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、タンパク、酵素、抗体、及びこれらの画分 や成分、及び代謝中間体や代謝産物などが得られる。温度、溶媒、ＳＣＦ、その 他の反応パラメーターの選択は抽出される物質によっているいろであるが、゛こ の技術に通じた者はどんな試薬や条件を使うかを決めることができよう。

単糖類、二糖類、寡糖類、多糖類を含む糖類は糖タンパクと同様にこの方法で抽 出される。ここでもまた代謝中間体や代謝産物も得ることができる。

プリンやピリミジンを含む分子であるヌクレオチド群や核酸塩基、ヌクレオシド （リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド）、核酸、及び核酸と蛋白の超 分子的複合体、ウィルス等やそれらの代謝中間体や代謝産物も得ることができる 。

さらに、上記に掲げた群のどれにも属さない物質も得られる。これには脂溶性あ るいは水溶性のビタミン、香料１着香料、その異化及び同化による中間体あるい は最終産物なども含まれる。

この方法は目的とする産物を得ることだけに使われると考えるべきでない。毒物 、アレルゲンなどのような望ましくない物質がこの発明によって試料から取除か れる。ここでこの技術に通じる者はこの方法が望ましくない物質を除くのに必要 な生物学的な精製方法として適用されることに気付くだろう。

動物由来の成分を凍結粉砕し凍結篩別する処理において目的する成分にまた１次 のような試料の処理法の１つあるいはそれ以上の組合せで処理することができよ う。す°なわち、１）圧砕、粉砕、高圧及び低圧圧搾１、フレーク化、超音波、 凍結−融解処理、乳化、均質化、濾過、高速混合、遠心分離１機械的な分離５マ イクロウエーブ処理を含む熱処理等を含む物理的処理。

２）無機または有機酸、塩基、溶媒、表面活性剤、着色剤、イオン化する放射線 照射などを含む化学的処理。

３）　エンドジーナスまたはエキソジーナスによる酵素処理を含む酵素的処理。

試料は凍結粉砕に先立って例えば、組織粉末の調製後に必ずしも処理される必要 はないが通常は処理されよう。

超臨界液体抽出は以下の第２表に掲げたものを含む多くの様々な気体で実施でき よう。

第２表 記号　臨　温　℃　臨　ａｔｍ １）ヘリウム　Ｈｅ　−２６７，９２，２６２）ネオン　Ｎｅ　−２２８，７２ ７，９第２表（つづき） 記号　１温　℃　圧ａｔｎ＋ ３）アルゴン　Ａｒ　−１２２，３４８，０４）クリプトン　Ｋｒ　−６３，８ ５４，３５）キセノン　Ｘｅ　１６．６　５８．０ｂ）その他 ６）窒素　Ｎ２−１４７．０　３３．５７）水素　Ｈ２−２３９，９１２，８ ８）酸素　０２−１１８．４　５０．１９）オゾン　０．　１２．０　５５．０ １０）弗素　Ｆ、　−１２９５５ Ｂ）無機化合物（−例） ｌ）アンモニア　ＮＨ，１３２，５１１２，５２）三弗化ホウ素　ＢＦ３−１２ ．２６　４９．２３）二酸化炭素　ＣＯ□　３１．０　？２．９４）−酸化炭素 　Ｃｏ　−１４０３４，５５）塩化水素　ＨＣＩ　５１．４　８２．１６）硫化 水素　Ｈ２Ｓ　１００．４　８８．９７）酸化窒素　Ｎｏ　−９３６４ ８）二酸化窒素　Ｎｏ２１５７．８　１００９）酸化二窒素　Ｎ２０　３６．５ 　７１．７１０）シラン　５ＩＨ４−３−４６４７，８１１）塩化三弗化シラン 　５ｉＣＩＦ、　３４．５　３４．２１２）四弗化珪素　５ｉＦ４−１４　３６ ．７第２表（つづき） 記号　１温　℃　陽圧ａｔｍ １３）二酸化硫黄　３０．　１５７．８　７７．７１４）六弗化硫黄　ＳＦ、　 ４５．６　３７．１１５）水　Ｈ，０３７４，１２１８，３Ｃ）有機化合物（− 例） ａ）アルカン １）メタン　ＣＨ４−８２，１４５，８２）エタン　Ｃ２Ｈ，３２，２４８，２ ３）プロパン　Ｃ，Ｈ，９６，８４２ ４）　ｎ−ブタン　Ｃ４Ｈ□。　１５２　３７．５５）イソブタン　Ｃ，Ｈ□。

　１３４．７　３５．９ｂ）アルケン ６）　ニーｒンＣｘチレン）Ｃ２Ｈ４９，９５０，５７）プロペン（プロピレン ）　Ｃ３ＨＧ９１．９　４５．５８）　ｎ−ブテン　Ｃ，Ｈ，１４６３９，７Ｃ ）アルキン ９）エチン（アセチレン）　Ｃ２Ｈ２３５，５６１，６ｄ）アルキルハライド １０）−弗化メタン　ＣＨ，Ｆ　４４．６　５８１２）四弗化メタン　ＣＦ、　 −４５，７４１，４１３）−塩化二弗化メタン　ＣＨＣＩＦ、　９６　４８．５ 第２表（つづき） 記号　１温（℃　陽圧ａｔｍ １４）−塩化三弗化メタン　ＣＣＩＦ、　２８．８　３８．２１５）二塩化二弗 化メタンＣＣｌ２Ｆ、　１１１，５　３９．６１６）−臭化三弗化メタンＣＢｒ Ｆ、　６７　５０．３１７）−弗化エタンＣ２Ｈ，Ｆ　１０２．２　４９．６１ ８）六弗化エタンＣＪｓ　２４．３ １９）塩化三弗化エタン０２ＣＩＦ、８゜２０）パーフルオロブタン　Ｃ４Ｆ□ 。　１１３．２　２３２１１１−シフ／Ｌ／オロエチレン（ｌ（Ｆ　３０．１　 −使用されている用語や表現は説明のために使われており、限定のためのもので なく、またここに示された特徴に当たるもの、あるいはその一部に当たるものを 排除するような用語や表現を用いる意向はないので様々な修正が本発明の目的の 中で可能であることが認識されるべきである。

（以下余白） 国際調査報告

Claims (88)

【特許請求の範囲】
1. １．動物あるいは植物由来の組織材料を脆弱温度にまで凍結し、その凍結した組 織材料をその脆弱温度を超えない温度で粉末にまで凍結粉砕し、得られる均一な 組織粉末を分離工程にかけることを含む動植物由来の組織材料から目的とする物 質を得る方法。
2. ２．その材料が動物の組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．その材料が植物の組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．その材料が細胞を含む請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．その材料が滲出物を含む請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．その材料が器官を含む請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．その材料が体内の器官を含む請求の範囲第２項記載の方法。
8. ８．その材料が神経組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
9. ９．その材料が筋肉組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
10. １０．その材料が脂肪組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
11. １１．その材料が軟骨組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
12. １２．その材料が腺組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
13. １３．その材料が上皮組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
14. １４．その材料が内皮組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
15. １５．その材料が心筋組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
16. １６．その材料が血管組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
17. １７．その材料が循環組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
18. １８．その材料がリンパ組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
19. １９．その材料が呼吸器組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
20. ２０．その材料が消化器組織を含む請求の範囲第２項記載の方法。
21. ２１．その材料が骨格組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．その材料が感覚器組織を否む請求の範囲第１項記載の方法。
23. ２３．その材料が泌尿器組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
24. ２４．その材料が生殖器組織を含む請求の範囲第１項記載の方法。
25. ２５．その粉末がその脆弱温度を超えない温度で凍結篩別される請求の範囲第１ 項記載の方法。
26. ２６．その分離工程が抽出を含む請求の範囲第１項記載の方法。
27. ２７．その分離工程が浸出を含む請求の範囲第１項記載の方法。
28. ２８．その抽出が水性溶媒を使った抽出を含む請求の範囲第２６項記載の方法。
29. ２９．その抽出が有機溶媒を使った抽出を含む請求の範囲第２６項記載の方法。
30. ３０．その抽出が超臨界液体を使った抽出を含む請求の範囲第２６項記載の方法 。
31. ３１．その抽出が熱処理を含む請求の範囲第２６項記載の方法。
32. ３２．その分離工程が乾燥を含む請求の範囲第１項記載の方法。
33. ３３．その分離工程が凍結乾燥を含む請求の範囲第１項記載の方法。
34. ３４．凍結が空気凍結によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
35. ３５．凍結が噴霧凍結によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
36. ３６．凍結が流動床凍結によつで達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
37. ３７．凍結が平板凍結によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
38. ３８．凍結が液体浸漬凍結によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
39. ３９．凍結が寒剤凍結によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
40. ４０．凍結が液体窒素によって達せられる請求の範囲第１項記載の方法。
41. ４１．凍結がドライアイスによって達せられる請求の範囲第１項記載の方法
42. ４２．凍結がジクロロジフルオロメタンによって達せられる請求の範囲第１項記 載の方法。
43. ４３．その凍結篩別が一枚の篩で達せられる請求の範囲第２５項記載の方法。
44. ４４．その凍結篩別が複数の篩で達せられる請求の範囲第２５項記載の方法。
45. ４５．その抽出が緩衝液での抽出を含む請求の範囲第２８項記載の方法。
46. ４６．その抽出が燐酸塩緩衝化された食塩水での抽出を含む請求の範囲第２８項 記載の方法。
47. ４７．その有機溶媒がヘキサンである請求の範囲第２９項記載の方法。
48. ４８．その有機溶媒がジメチルスルホキサイドである請求の範囲第２９項記載の 方法。
49. ４９．その有機溶媒がメタノールである請求の範囲第２９項記載の方法。
50. ５０．その有機溶媒が酢酸である請求の範囲第２９項記載の方法。
51. ５１．その有機溶媒がエタノールである請求の範囲第２９項記載の方法。
52. ５２．その有機溶媒がアセトニトリルである請求の範囲第２９項記載の方法。
53. ５３．その有機溶媒がクロロホルムである請求の範囲第２９項記載の方法。
54. ５４．その有機溶媒がプロピレングリコールである請求の範囲第２９項記載の方 法。
55. ５５．その有機溶媒がプロパノールである請求の範囲第２９項記載の方法。
56. ５６．その有機溶媒がエチルエーテルである請求の範囲第２９項記載の方法。
57. ５７．その有機溶媒が複数の有機溶媒である請求の範囲第２９項記載の方法。
58. ５８．その超臨界液体がＣＯ２である請求の範囲第３０項記載の方法。
59. ５９．その超臨界液体が元素の気体である請求の範囲第３０項記載の方法。
60. ６０．その超臨界液体がアルカンガスである請求の範囲第３０項記載の方法。
61. ６１．その超臨界液体がアルケンガスである請求の範囲第３０項記載の方法。
62. ６２．その超臨界液体がアルキンガスである請求の範囲第３０項記載の方法。
63. ６３．その超臨界液体がハロゲンを含んでいる請求の範囲第３０項記載の方法。
64. ６４．その超臨界液体にさらに変性剤（Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）または調整剤（エン トレーナ）を加えることを含む請求の範囲第３０項記載の方法。
65. ６５．その熱エネルギーがレーザービームによって供給される請求の範囲第３１ 項記載の方法。
66. ６６．その熱エネルギーが赤外線照射によって供給される請求の範囲第３１項記 載の方法。
67. ６７．その熱エネルギーがマイクロウェーブによって供給される請求の範囲第３ １項記載の方法。
68. ６８．その材料が脂質を含む分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
69. ６９．その材料がアミノ酸を含む分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
70. ７０．その材料が糖残基を含む分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
71. ７１．その材料がヌクレオチドを含む分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
72. ７２．その材料がアシルグリセロール、ホスホグリセリド、スフイノゴリピド、 ガンダリオシド、ワックス、複合脂質分の異化及び同化の中間体及び産物を含む 複合脂質から成る請求の範囲第６９項記載の方法。
73. ７３．その脂質を含む分子がテルペン、色素、ステロイド、ステロール、プロス タグランディン、等の単純脂質とその単純脂質の同化及び異化の中間体と産物を 含む請求の範囲第６９項記載の方法。
74. ７４．その脂質を含む分子がグリコリピド、リボプロティン、細胞膜の超分子構 造複合体、及びその脂質含有分子の同化または異化の中間体および産物を含む請 求の範囲第６９項記載の方法。
75. ７５．そのアミノ酸を含む分子がペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホ ルモン、蛋白、酵素、抗体、分子中のアミノ酸含有部分、及びそのアミノ酸含有 分子の同化または異化による中間体及び産物を含む請求の範囲第７０項記載の方 法。
76. ７６．その糖残基含有分子が単糖類、二糖類、寡糖類、多糖類、糖蛋白、及びそ れら分子の同化または異化による中間体と産物を含んでいる請求の範囲第７１項 記載の方法。
77. ７７．そのヌクレオチドを含む分子がヌクレオシド、核酸、蛋白・核酸複合体、 ウィルス、ヌクレオチド含有生物及びそれらの分子の同化または異化による中間 体と産物を含んでいる請求の範囲第７２項記載の方法。
78. ７８．その材料がビタミン及びそれらの同化または異化による中間体と産物を含 んでいる請求の範囲第１項記載の方法。
79. ７９．その材料が香料や着香剤、及びそれら成分の同化または異化による中間体 と産物を含んでいる請求範囲第１項記載の方法。
80. ８０．その材料が望ましくない成分を含んでいる請求範囲第１項記載の方法。
81. ８１．その材料が毒物を含んでいる請求範囲第１項記載の方法。
82. ８２．その材料がアレルゲンを含んでいる請求範囲第１項記載の方法。
83. ８３．その粗織が物理的処理によっても処理される請求範囲第１項記載の方法。
84. ８４．その組織が科学的処理によっても処理される請求範囲第１項記載の方法。
85. ８５．その組織が酵素的な処理によっても処理される請求範囲第１項記載の方法 。
86. ８６．その分離が非酸化性の雰囲気で抽出されることを含む請求範囲第１項記載 の方法。
87. ８７．その分離が遠心力によって抽出されることを含む請求範囲第１項記載の方 法。
88. ８８．その分離が溶媒抽出、加熱抽出、加速的な力による抽出から成る群の少く とも２つの組合せによって抽出することを含む請求範囲第１項記載の方法。