JPS63501685A - 微生物、特にフランキア群微生物の培養方法および微生物接種物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 にフーンキア　の立　法および １隻鬼翌遣 本発明は、微生物の培養方法、および得られた微生物から出発する接種物の製造 方法に関する。

より詳しくは、本発明は園芸および林業（例、苗床におけるモクマオウ属（Ｃａ ｓｕａｒｉｎａ）　、ハンノキ、ヒッポファ工属（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ）および グミ属（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ）の接種された実生苗の生産）に必要な接種物の製 造に関する。

接種物として使用できる微生物として、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）群に属す る放線菌類〔窒素固定放線菌ｆｆ１（ａｃｔｉｎｏｒｈｉｚａｌ）植物との共生 菌〕およびリゾビウム属根粒菌（ｒｈｉｚｏｂｉａ）を挙げなければならない。

ある種の微生物、特にフランギア群の微生物は、常法により培養した場合にバイ オマスの産生量が非常に低いという特徴を有する。このバイオマスの産生が非常 に少ないことは、産業面および基礎研究の面のいずれからも重大な欠点となる。

したがって、本発明は、現在得られるものよりはるかに多量のバイオマスを産生 ずることを可能にする微生物の培養方法および接種物の製造方法を提供し、また 、例えば園芸家にとって必要な産業上の要件を満たすことができる方法を提供す るものである。

実際にその使用を考慮した場合、園芸もしくは林業に使用するための微生物接種 物は次のような条件を満たさなければならない： まず、関係する微生物の良好な保護を確保する、明確な坦体（ｓｕｐｐｏｒｔ） からなるものでなければならない；次に、貯蔵、輸送および使用が容易でなけれ ばならない；最後に、その適用時にホスト植物の感染サイトでその微生物を広く 分布させることができるものでなければならない。

より詳しくは、本発明は、微生物を高分子マトリックス中に閉じ込めてなる接種 物に関する。このような方法は既知であり、具体的には次の仏閣特許出願に記載 されている＝７７／１０，２５４；　７９／２８，９５６；　８１１０４．４７ ４；および８３１０２．８４７゜しかし、これらの方法はいずれも、上に列挙し た条件を完全に満たすことはできない。

この目的達成のために、本発明は２相培養を利用した微生物の培養方法を提供す る。この方法においては、ａ）微生物を固形普通培地（ｓｏｌｉｄ　ｎｕｔｒｉ ｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ）中で培養しく工程ａ）、 ｂ）培養後、微生物のコロニーが形成されたこの固形培地を複数の断片（ｆｒａ ｇｍ’ｅｎｔ）に分割しく工程ｂ）、そしてＣ）工程すで得られた断片を液体普 通培地に接種しく工程Ｃ）、この培地を２８〜３０℃で培養する。この工程は２ 相培養に相当する。

微生物の増殖後、この微生物を回収する。

この方法は、特に成長または増殖の遅い放線菌類、特にフランギア群に属するも のの生産に利用することができる。

本発明の方法は、ある種の微生物、特にフランギア群微生物の増殖が、液体培地 中よりも固体／液体界面においてずっと良好に行われるとの知見を利用したもの である。

すなわち、例えば寒天断片を用いた液体／固体２相培養では、フランギア群微生 物が示す接触胚性（ｔｈｉｇ＋５ｏｔｒｏｐｉｃ　ｎａｔｕｒｅ）　（この特性 は、既に指摘のあるようにある種の他の微生物でも認められる）によりこの微生 物の寒天断片の表面への付着が可能になるだけでなく、フランギア群微生物のこ の坦体中への侵入も可能になる。液体培地は微生物の発生に有利な固体／液体界 面の実現に寄与するだけでなく、栄養分貯蔵体ともなる。

本発明で使用する固形普通培地および液体普通培地は、実質的に同一の組成を有 していてもよく、また炭素、窒素、リンおよび微量元素ならびに培養する微生物 の増殖を確保するためのその他の元素を含有する既知の培地あるいは既知培地か ら誘導した培地から本質的になるものでよい。

固形培地の調製は寒天を使用して行うことができるが、固形培地を得るのに他の 成分を使用してもよい。

工程ａはペトリ皿型の容器内で実施できる。培養後、この固形培地を適当な手段 により複数の断片に分割し、次いで液体普通培地中に分散させる。増殖が終了し たら、得られた微生物を遠心分離のような既知の手法により回収する。

さらに、この普通培地への活性炭の添加により、特にこの添加を固形培地に対し て行う場合（工程ａで）、バイオマスの生産量を著しく増大させることができる ことが認められた。

最終製品の接種物の品質をさらに改善するには、本発明における培養を次のよう に実施することが好ましい：ａ）培養する微生物を高分子マトリックス中に閉じ 込め（包括し）　、 ｂ）工程ａの終了時に得られた、内部に微生物が包括されているマトリックスを 、この微生物の増殖が可能な培地中で、このマトリックスの内部にコロニーが生 成するまで培養し、そして Ｃ）工程すで得られた内部に微生物のコロニーが包括されている高分子マトリッ クスを脱水する。

使用しうる高分子マトリックスは当業者に公知であり、上述した特許文献にも開 示されている。このような高分子マトリックスの具体例としてアルギン酸カルシ ウムビーズがあり、これは微生物接種物の製造に特によく通している。

高分子マトリックス内に包括された微生物を、その微生物の増殖が可能な培地中 で培養すると、該高分子マトリックスの内部でその微生物の増殖を続けることが できることは公知である。その場合、この微生物が高分子マトリックス内で微小 コロニー（ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｉｅｓ）を形成することができ、これは多くの 利点をもたらすことがここに判明した。まず、高密度の接種物が得られる。また 、微小コロニーの微細構造は、製造された接種物の貯蔵中にその接種物を保護す る利点がある。

貯蔵のために、高分子マトリックスを分割せずに脱水することが好ましい、すな わち、アルギン酸カルシウムビーズを製造した場合、このビーズは断片に分割せ ず、そのまま脱水する。

好適態様にあっては、高分子マトリックス内に包括される微生物は上述した方法 により得られる。フランキアのような微生物を含有する断片（例、寒天断片）を 、高分子マトリックス（例、アルギン酸カルシウム）中に混入する。

最後に、既に脱水された微生物接種物を現場で利用しなければならない場合、こ れをゲル状となるまで緩衝液（例、リン酸緩衝液）により再水和する。このゲル は土壌中での微生物の分配に特に効果的である。

上記方法により、脱水後に困難なく貯蔵および輸送することができ、多量のバイ オマスを形成し、ゲル状態で非常に容易に分布させることができる接種物を得る ことが可能となる。

本発明のその他の利点および特徴は、以下の実施例により実証することができよ う。

これらの実施例で使用した培地は、下記組成のものであった： １　、　艶閃隻廼（ラロンデ（Ｌａｌｏｎｄｅ）及びカルバ−）　（Ｃａｌｖｅ ｒｔ）Ｋ２ＨＰＯ４０，３ｇ ＮａＨ２ＰＯ４０，２ｇ ＭｇＳＯｎ　７ＨｚＯＯ，２ｇ ＭＣＩ　０．２　ｇ 酵母エキス　０．５ｇ ペプトン　５．０ｇ クエン酸第二鉄（１χ溶液）　１　＋ｍｌ微量元素溶液１　１　蒙ｌ レシチン　５　■ 蒸留水　１　！ ＰＨ６，８に調整 傘微量元素溶液（ｇ／　Ｉ！　） Ｈ３ＢＯ３：　１．５　；　ＭｎＳＯ４７ＨｉＯ：　０．８　；ＺｎＳＯ４７Ｈ ＊Ｏ：　０．６　ＨＣｕ５Ｏａ　７ＨｚＯ：　０．１　；（ＮＨａ）ｔ、Ｍｏｔ ｏｉ４４ＨｚＯ：　０．２　；　Ｃｏ５０ａ　ＩＨｚＯ：　０．０１　＊２、紐 飢批厄土皿箪炭〔ジェム（Ｄｉｅｓ）及びドマーゲス（Ｄｏｎ＋ｍｅｒｇｕｅｓ ）＋　１９８５）上記のＱｍｏｄ培地に１５０　ｖａｇ＃！の割合で活性炭を添 加したもの ３．１Ｊ」す１池（ムリ−（Ｍｕｒｒｙ）　ら、　１９８４）１−凪一一　−１ し」１− ＫｔＨＰＯａ　Ｏ，５９１ｇ Ｋｎ！ｐｏ４　０．９５２　ｇ ＮＨａｃｌ　０．２６７　ｇ ＭｇＳ０４７ＨｚＯＯ，０９５ｇ ＣａＣｌｚ　２ＨｚＯＯ，０１０ｇ ＦｅＮａ−ＥＤＴ八　〇、０１０　ｇ ピルビン酸ナトリウム　１．１ｇ 微量元素溶液”　１　ｍｌ ビタミン溶液５１１ＩＩｌｌ 蒸留水　１２ ＰＨ６，３に調整 傘微量元素溶液（ｇ／　Ｉ！、　） ＨＪＯｓ　：　２．８６：　ＭｎＣ１ｚ　４ＨｚＯ：　２．２７；ＺｎＳＯ４７ Ｈ２Ｏ：　０．２２；　Ｃｕ５Ｏａ　５ＨｚＯ：　０．０８；ＮａＪｏＯａ　２ ＴｏＯ：　０．０２５；　Ｃｏ５０ａ　７ＴｏＯ：　０．００１゜傘傘ビタミン 溶液（ｍｇ／　ｊ！　） チアミンＨＣＩ：　１０；ニコチン酸：５０；ピリドキシンＨＣＩ：　５０；ビ オチン：　２２５゜葉酸：　１０；パントテン酸カルシウム：１０；リボフラビ ン：１０゜ ４、ヱ旦Ｙ暗地（酵母エキス−マンニトール）−一底一一分一一　−盪一皮− ＫＪＰＯ４０，５ｇ ＭｇＳＯａ　７ＨｚＯＯ，２ｇ ＮａＣｌ　０．１　ｇ 酵母エキス（ジフコ社製）　１．０　ｇマンニトール　１０．０　ｇ 蒸留水　１２ ５、変性ヱ旦ｙ隻地 ｈＨＰｏ、を０．１ｇ＃！の濃度で使用した以外は上記４と同一組成。

図面の説明： 第１図は、培地への活性炭の添加がフランキアの増殖に及ぼす効果を示す。

ｌ　ａ：　Ｑｍｏｄ培地単独の場合； １ｂ＝同一培地に活性炭（０，０１％）を添加した場合；ベトリ皿上に見える黒 っぽいスポット　（矢印）はフランキアのコロニーである（この倍率では活性炭 粉末は見えない）。

第２図は、内部にフランキアのコロニーを有するアルギン酸塩ビーズを示す。

２ａ：３個のビーズの図面（真の直径：約５ｍ）；２ｂ＝１個のビーズの拡大図 、フランキアのコロニー（各コロニーの真の直径＝１００〜２００１Ｉ１１）は 境界がぼやけた黒っぽい円形スポットとして見え、一部のコロニーの周囲には黒 っぽいスポットの集団（クラスター）が認められる。これはビーズ内部でのフラ ンキアの増殖中に生成した胞子前である。

この胞子前（矢印）はフランキアの典型的な構造物である。

ｍよ一フランキア　に　るある　の゛　の２　±立子　での２１立　法 培養は下記の３工程で実施する： 工■ｌ：フランキアをペトリ皿（１０ｃｍ）内で寒天培地により２〜３週間培養 する。このために、４０’Ｃで融解した１、５％普通寒天培地１０　ｍｌの内部 に、フランキアの培養株のホモジナイズにより得たフランキア懸濁液１ｍｌを接 種する。３０°Ｃで２〜３週間培養すると、フランキアのコロニーが寒天に現れ る（１皿に５００〜２０００個のコロニー）、フランキアのコロニーが蔓延して いるこれらの各寒天プレートを、滅菌条件下でベトリ皿から取り出し、水５０ｍ １と棒磁石が入っているるフラスコの中に入れる。

工程ｊノこのフラスコ内の寒天プレートを細分化して寒天微粒とする。各寒天微 粒子は、フランキアのコロニーもしくはコロニー断片を含有している。

工■且：上述のようにして得た断片の懸濁液を使用して、液体普通培地５０　ｍ Ｉに対してフランキア断片懸濁液１０　ｍｌの割合で液体普通培地を接種する。

その後、３０゛Ｃでの培養を２〜３週間続ける。普通培地（寒天培地および液体 培地）の組成は、使用したフランキアの菌株に応じて変える。この培地は、Ｑｍ ｏｄ培地かＢＡＰ培地のいずれかでよい。この工程Ｃは２相培養を行うものであ る。

′られたフランキアバイオマスの フランキアは糸状（線状）微生物であるので、細菌の場合の如く菌体数としてバ イオマスを定量することはできない。

定量はタンパク質重量（本例ではこの解決法を採用）または乾燥物重量のいずれ かで表すことになる。

遠心分離により普通培地を除去した後、遠心分離残渣（ペレット）を蒸留本釣３ ０　ｍｌを入れた試験管に加え、微粒中の寒天を溶かすためにこの試験管を沸騰 水中に２分間入れる。

次に試験管の内容物をすべて約２００　ｍｌの沸騰蒸留水中に投入し、溶けた寒 天を希釈して、ミリボア（Ｍｉｌｏｐｏｒｅ）フィルターによる濾過もしくは遠 心分離のいずれかにより寒天を除去する。培養物を蒸留水で数回洗浄した後、ロ ウリ−（Ｌｏｗｒｙ）らの方法（１９５１）によりタンパク質の定量を行うため に培養物を回収する。

゛　土立士による′　法と２１立士による　Ｕ法との　へこの二つの方法を比較 するには、本発明法において推奨したのと同様の操作過程により液体培地での培 養を行うことが必要であった。

第１表にこの二つの場合の操作過程をまとめて示す。

モクマオウ（Ｃａｓｕａｒｉｎａ　ｅ　ｕｉｓｅｔｉｆｏｌｉａ）　ＯＲ５０２ １００１のフラン土１１１１視１驚 第２表に示した結果が明らかに示すように、同一の接種物から出発し、同一の培 養期間を採用した場合に、本発明の方法でははるかに多量のバイオマス（２０倍 ）を得ることができる。

別の３　頚のフランキア　の立 本発明の方法の信頬性をチェックするために、この実験を別の下記３種類のフラ ンキア菌株を使用してその年の異なる時期に繰り返して実施した。使用菌株は次 の通りである：ＯＲ３０２２６０２：アロカジュアリナ・ストリフタ（Ａｌ　１ ｏｃａｓｕａｒｉｎａｓｔｒｉｃｔａ）のフランキア ＯＲＳ　０６０５０１　：コレチア・スピノサ（Ｃｏｌｌｅｔｉａ　５ｐｉｎｏ ｓａ）のフランキア ＯＲ５１４０１０２：ヒッポファ工・ラムノイデス（Ｈ４ｐｐｏｐｈａｅｒｈａ ｍｎｏｉｄｅｓ）のフランキア 第３表に示した結果から、従来の培養法に比べた本発明の培養法によるフランキ アバイオマス生産の改善が確認される。

この改善の大きさは、先に行った上記の試験より今回の試験の方が小さい、これ には次のようにいくつかの理由が考えられる： 培養期間を６週間ではなく４週間に短縮したこと、および最初の接種物における 各種フランキア構造物（栄養菌糸、胞子前）の生理的状態および存在量が変動し たこと。

】じし表 従来法　２　５５ ２　１立　法　２　１２０５ （１）　寒天培地で３週問および２相培地で３週間。

使用した普通培地：　Ｑｍｏｄ培地 （１）寒天培地で２週問および２相培地で２週間。

フ【方１秒【２ニー［１Ｉｌｏｄ立土への２　の添　がフランキア　０Ｒ５０２ １００１のコロニー３に　ぼすグ Ｑｍｏｄ培地１０　ｍｌを入れた１８　Ｘ　１８０鵬の寸法の試験管内で、菌株 ０Ｒ５０２１００１を培養する。培養は３０°Ｃで行い、培養期間はそれぞれ３ 週間、１ケ月および２ケ月とする。この培養期間経過後、各試験管は５０〜７０ μｇのフランキアタンパク質を含有している。

各培養物を傾斜により取り出し、新たなＱｍｏｄ培地２０　ｍｌを加え、この混 合物を棒磁石を使用し、滅菌条件下で１時間ホモジナイズする。得られた懸濁液 の２種類の希釈液（１０−’および１０−　”）を日製し、各希釈懸濁液０．５ 　ｍｌヲ２０　ｍｌ（ＺＩＱｍｏｄ寒天培地（メルク製品番号２１８６の活性炭 を１５０ｍｇ／　ｌの量で添加したもの、および無添加のもの）中に混入するこ とににより２系列のペトリ皿を接種する。こうして接種したベトリ皿を３０°Ｃ で３週間培養する。生成したコロニーの数を双眼顕微鏡で計数し、結果を接種物 ｌ１１１に対するコロニー数として示す。

第４表は、培地に活性炭を添加すると観察されたフランキアコロニー数が増大す ることをはっきりと示しており、この増大は培養期間が２ケ月の培養物の場合に 特に顕著である。

この第一の結果は、活性炭が２ケ月間培養した培養物中に蓄積した胞子型構造物 （第１図）の発生を促進することを示している。一方、顕微鏡観察では、新たに 生成した菌糸が、Ｑｍｏｄ培地単独の場合より、活性炭を加えたＱｍｏｄ培地に おいてより分岐することが示される。この後者の結果は、活性炭が菌糸の成長・ 増殖を促進することを証明するものである。

３週間培養　１．０００　３，４００ １ケ月培養　８　、２００　２６６　、０００２　ケ　１立　４，２００　９４ ０．０００災施阻主−アルギン−ビーズ　でのフーンキアの１００　ｍｌのＱｍ ｏｄ培地に１０ａ＋１のフランキアＯＲ５０２１００１の菌体懸濁液を接種する 。４週間培養した後、フランキアのバイオマスを含有する培養物を得る。タンパ ク質定量法（ロウリーら、　１９５１）により測定したバイオマスの量は２４０ μｇまでの範囲内である。この培養物を傾斜により取り出し、同量（１００ｍｌ ）の新たな液体Ｑｍｏｄ培地中に移し、この混合物を棒磁石により１時間ホモジ ナイズする。次いで、アルギニン塩によるフランキアの包括処理を実施する。こ のために、４％のアルギン酸塩５１７０（サチアルギン（Ｓａｔｉａｌｇｉｎｅ ）　Ｓ　１７０　、仏画ペリジ７８］４０、アンバス・ラテクール６所在のソシ エテ・ブルドン・ドウ・プロデュイ・シミーク・工・ファルマシューテイク製） を含有する滅菌液体Ｑｎ＋ｏｄ培地１００ｍ１を添加する。こうして、２％のア ルギン酸塩を含有するＱｍｏｄ培地中にフランキアコロニーの断片を含有する合 計２００　ｍｌの懸濁液が得られる。

この懸濁液を、滅菌ＣａＣ１ｚ水溶液（１％）を入れた容器（棒磁石により連続 的に撹拌）中に無菌条件下で滴下する。

このような条件下で、ＣａＣ１ｚ　７ｎ液中において２０〜３０分間撹拌後にビ ーズが生成する。このビーズを直ちに滅菌蒸留水で１０回すすぐ。

このビーズを５０　ｍｌの液体Ｑｍｏｄ培地を入れたフラスコに移しくフラスコ １個当たりビーズ約２０　＋ｍｌ）　、培養を３０°Ｃで４週間行う、この期間 経過後、顕微鏡による観察では、外因微生物汚染が全くない多数のフランキアコ ロニー（ビーズ１個に２０〜４０のコロニー）が各ビーズ内部に発生してし）る こと力く認められる。これらのコロニーは、大きさはさまざまであるが、フラン キアに典型的な形態および放射成長ノずターンに関しては完全に同一である。多 くのコロニーが胞子嚢を生成するが、これもフランキアに典型的である　（第２ 図）。

災旌斑土−アルギン　−ビーズ　での１ゾビウムのアルビジア・レベツク（Ａｌ ｂｉｚｚｉａ　１ｅｂｂｅｃｋ）から分離したりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ＋ ｍ）菌株Ａ１６を、慣用のＹＥＭ培地中で培養する。４日間の培養後、培養液１ ｍｌを取り出し、変性ＹＥＭ培地１００　ｍｌ中に導入する。この培地はリン酸 塩濃度が低く、アルギン酸塩５１７０（サチアルギン５１７０、仏画ペリジ７８ １４０、アンパス・ラテクール６所在のソシェテ・ブルドン・ドウ・プロデュイ ・シミーク・工・ファルマシューティク製）を含有する。実施例３の操作を実施 することによりビーズが得られる。包括処理されたりゾビウムの菌体を含有する これらのビーズの２種類のバッチを次のようにして調製する：第一のバッチは、 アルギン酸塩を含有しない変性ＹＥＭ液体普通培地を入れたフラスコ内に浸漬す る；第二のバッチは、同じ条件下で培養するが、ただし上記の普通培地を存在さ せない。

４８時間後、通常の寒天ＹＥＭ培地中で数えたりゾビウムの菌体数は、第一のバ ッチでは１７５　ｘ　１０’／ビーズがら２８０　Ｘ　１０Ｓ／ビーズに増大す るのに対し、第二のバッチではりゾビウムの菌体数は一定にとどまることが認め られる。この結果は、フランキアの場合と同様に、アルギン酸塩ビーズの内部で のりゾビウムの増殖は、これらのビーズを適当な液体普通培地中で培養すること が必要であることを示している。

叉旌拠ニー　シたアルギン　ａビーズの共性微生物を含有する予め脱水したアル ギン酸塩ビーズを、下記組成のリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）に浸漬する：ＫＨ ｚＰＯ，：　４．２９　ｇ；　ＫＪＰＯａ：　４．３４　ｇ：水１　ｊ２　（ｑ 、ｓ、）。

４〜６時間後、脱水ビーズは脱水前の最初の形状および稠度（コンシスチンシー ）を再獲得する。破砕によりゲルの形態の接種物を得ることは非常に容易である 。リン酸緩衝液によるこの処理は、ビーズ内に予め包括処理された微生物および 包括処理後に発生した微生物を放出および分配することを可能にする意味で不可 欠な操作である。

叉施五ｌ−菫ｌ■援榎 本発明の方法により得られた接種物の品質を検査するために、モクマオウでのフ ランキア接種物（フランキア菌株０ＲＳ０２１００１）の感染力およびベシキュ ラー・アーバスキュラー内根菌型真菌（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌ ａｒ　ｅｎｄｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｕｓ）〔グロムス・モッセア エ（Ｇｌｏｍｕｓ鞘ｏｓｓｅａｅ）　）接種物の感染力を試験する。

フーンキア　ＯＲ５０２１００１ まず、表面を滅菌した種子（ｆＡ硫酸に１分間浸漬後、滅菌蒸留水ですすいだも の）の発芽によりモクマオウ　（木麻黄）の苗木を得る。発芽後４週の苗木を、 滅菌土壌を入れたプラスチックポット（直径７ｃｍ、高さ７Ｃ１１）に１ポツト に苗木１本の割合で移植し、毎日滅菌水を散水する。移植時の苗木に接種するた めに、次のようにして接種物を調製する：脱水ビーズ１２０ｇを上記のリン酸緩 衝液中で再膨潤させ；そして破砕後、得られたゲルを滅菌砂と混ぜ、１２個のポ ットに添加する。その添加量は、接種したポット１個に対して脱水ビーズ１０■ に相当する量である。

次の２種類の接種物のバッチを使用する：第一のバッチは２週間だけ貯蔵してお いたもの（接種物Ｎα１）であり、第二のバッチは実験室温度で１年間貯蔵して おいたもの（接種物ＮＣＬ２）である、接種したポットと同時に、一連の未接種 の対照用のポットももちろん用意した。２ケ月のｉｈ：焙後、この苗木の空中部 の乾燥重量（一定重量になるまで乾燥後の重量）、根粒が着生した苗木の本数、 および苗木１本当たりの根粒の数を測定した（第５表）。

対照　８０　０／１２　０ 接種物阻１　２２０　１２／１２　３〜８走２１７０　１２１２　３〜５ 接種ＮＣＬｌ：脱水状態で実験室温度に２週間貯蔵したビーズ接種Ｎα２：脱水 状態で実験室温度に１年間貯蔵したビーズ久三人五二ｉＩ丸ヱエ グロモス・モッセアエの構造物（自由菌糸もしくは核内菌糸、ならびに胞子）を 、ジェムら（１９８１）およびガンリー（Ｇａｎｒｙ）　ら（１９８２）に記載 の方法に従ってアルギン酸塩ビーズ中に包括処理する。７日目のビグナ・ウンギ クラタ（Ｖｉｇｎａ　ｕｎｇｕｉｃｏｌａｔａ）の苗木を、滅菌土壌を入れた土 器製ポット　（直径１５ｃｍ、高さ２０Ｃ１）に移植した。苗木５木からなる第 一〇バッチには、グロモス・モッセアエ構造物を含有する脱水ビーズを使用した 以外は上記と同様の方法で調製したゲルと砂との混合物からなる接種物を接種し た。これらのビーズは実験室温度で１年間貯蔵したものであった。各接種ポット には脱水ビーズ３０　ｍｇに相当する量を添加した。苗木５本からなる第二のバ ッチは、未接種の苗木から構成した。

第６表は、グロモス・モッセアエの接種物が、１年間の貯蔵後でも、本実施例で 使用した用量で完全に有効（感染性）であることを示している。

対照　０１５　Ｏ Ｎα１　５　５　８６ 接種物Ｎα１：脱水状態で１年間貯蔵したビーズ感染頻度　：全検査数に対する 感染した根部（３ｍｍ）数の割合 会４Ｌ幼跋 ジェムら（ＤＩＥＭ　Ｈ，Ｇ、　ａｎｄ　Ｙ、Ｒ，ＤＯＭＭＥＲＧＵＥＳ）（１ ９８５）：カスアリナ・ジュングニアナ（Ｃａｓｕａｒｉｎａ　ｊｕｎｇｈｕｈ ｎｉａｎａ）の根粒がら単離したフランキア菌株ＯＲ５０２１００１による分化 再生トルロース（ｔｏｒｕ　１ｏｓｅ）菌糸の試験管内生成、プラント・アンド ・ソイル（Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　５ｏｉｌ）　８７：　１７−２９゜ラロンデら （ＬＡＬＯＮＤＥ　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｅ、　ＣＡＬＶＥＲＴ）（１９７９）： アルナス（Ａｉｎｕｓ）スピーシーズ用の感染性接種物としてのフランキア菌糸 および胞子の形成。温帯森の管理における共生窒素固定（Ｓｙｍｂｉｏｊｔｉｃ 　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｊｎ　ｔｈｅ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ 　ｏｆ　Ｔｅ＋ｗｐｅｒａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｓ）（Ｊ、Ｃ，Ｇｏｒｄｏｎ、　 Ｃ，Ｔ、　Ｗｈｅｅｌｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、Ａ、　ＰｅｒｒＶＷＡ）、　９５−１ １０頁掲載、〔コーバリス森林研究所（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、　Ｆｏｒｅｓｔ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））ロウリーら（ＬＯＷＲＹ　Ｏ，Ｈ ，、Ｎ、Ｊ、　ＲＯ５ＥＢＲＯＵＧＨ，Ａ、Ｌ、　ＦＡＲＲａｎｄＲ，Ｊ、　Ｒ ＡＮＤＡＬＬ）　（１９５１）　：フォリン・フェノール試薬によるタンパク質 測定、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、）　１９３：　２６５−２７５゜ムリーら（ＭＵＲＲＹ　Ｍ、Ａ、、 　Ｍ、Ｓ、　ＦＯＮＴＡＩＮＥ　ａｎｄ　Ｊ、Ｇ、　ＴＯＲＲＥＹ）（１９８４ ）：バッチ培養で増殖させたフランキア・スピーシーズ１（ＦＰＡｒ１３におけ る増殖速度論およびニトロゲナーゼ誘導。

プラント・アンド・フィル、　１８：　６１−７８゜ＩＧｊ −一―−−−〜−−−−ｍ　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００４１）−ユ１．−ａ２−１ １ｍＰｃＴ／ＦＲ８６１００４１７ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡ ＴＩＯＮＡＬ’５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）微生物を固形普通培地で培養し（工程ａ）、ｂ）培養後、微生物のコロ ニーが形成されたこの固形培地を断片に分割し（工程ｂ）、および ｃ）工程ｂで得られた断片を液体普通培地に接種して（工程ｃ）、微生物を培養 後、これを回収する、という２相培養法による微生物の培養方法。
2. ２．培養する微生物が遅成長性放線菌、特にフランキア群に属する放線菌である 、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．工程ａで使用する固形普通培地が寒天を含有するものである、請求の範囲第 １項に記載の方法。
4. ４．普通培地に活性炭を添加する、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．順に下記ａ）〜ｃ）の工程： ａ）微生物を高分子マトリックス内に閉じ込める包括処理工程、 ｂ）工程ａ終了後に得られた微生物が包括された高分子マトリックスを、この微 生物の増殖が可能な培地中で、前記マトリックス内にコロニーが生成するまで培 養する工程、および 。）工程ｂで得られた、微生物のコロニーが包括されている高分子マトリックス を脱水する工程、からなる、微生物接種物の製造方法。
6. ６．高分子マトリックスが断片の形態である、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．使用する高分子材料がアルギン酸カルシウムである、請求の範囲第５項およ び第６項のいずれかに記載の微生物接種物の製造方法。
8. ８．前記微生物が、植物と共生する微生物である、請求の範囲第５項もしくは第 ７項のいずれかに記載の微生物接種物の製造方法。
9. ９．微生物がフランキア群もしくはリゾビウム群に属するものである、請求の範 囲第８項に記載の微生物接種物の製造方法。
10. １０．得られた高分子マトリックスがビーズまたは粒状形態のものである、請求 の範囲第６項ないし第９項のいずれかに記載の微生物接種物の製造方法。
11. １１．前記接種物の製造に使用した微生物が、請求の範囲第１項ないし第４項の いずれかに記載の２相培養方法により得られたものである、請求の範囲第５項な いし第１０項のいずれかに記載の微生物接種物の製造方法。
12. １２．請求の範囲第５項ないし第１１項のいずれかに記載の方法により得られた 微生物培養物。
13. １３．使用前に、高分子マトリックスをゲルが得られるまで緩衝液により再水和 する、請求の範囲第１２項に記載の微生物接種物の適用。