CN111676178A - 弗兰克氏菌人参生防菌剂及对土壤的改良方法 - Google Patents
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Abstract
一种弗兰克氏菌人参生防菌剂及对土壤的改良方法，属于农业技术领域。本发明利用生防菌与培养基合成生防菌剂，从而解决人参根腐病和锈腐病的病害问题的弗兰克氏菌人参生防菌剂及对土壤的改良方法。本发明将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，培养基pH值调至6.8~7.2，高压灭菌锅温度调至120℃~125℃，灭菌时长为25 min；将生物炭粉充分混合均匀后，放入弗兰克氏菌发酵液，充分混合后制备成弗兰克氏菌生防菌剂。本发明采用生物防治手段，选用生防菌株制备成生防菌剂，有效抑制人参根腐病、锈腐病病害发生，杜绝农药对土壤的残留破坏问题，具有绿色安全无污染，高效等特点，促进农业可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域。
背景技术
弗兰克氏菌是与非豆科植物共生的固氮菌，属于放线菌类，与宿主植物形成共生固氮体系将大气中的植物不可吸收利用的分子态氮转化成可吸收利用的氨态氮，改善周围土壤的肥力，增强植物抗逆性，使用固氮菌可减少氮肥的施用并促进植物的生长来提高作物产量。植物可以通过根系分泌的物质改变土壤固氮微生物的种类及丰度，土壤固氮微生物通过改变土壤环境和提供养分矿化过程等方式影响植物的生长状态以及微生物群落的多样性。
人参作为重要的中药材品种，对人体健康具有多种药理作用，富含抗氧化剂、抗癌、抗肿瘤、抗炎活性。目前，人参根腐病、锈腐病是常见的两种植物病害，发病率均高达50%以上，长期连续轮作的种植方式为人参致病菌的繁衍和传播创造了有利条件，人参根系分泌物质的长期累积导致了大量植物病害，对人参作物及品质造成危害，致使微生物群落结构失衡。人参病害常用的防控措施是使用农药，虽具有时间短、见效快的特点，但对土壤造成大量农药残留和环境破坏，使致病菌产生抗药性后，大量的有毒物质在人参根内积累，从而降低人参质量。与此同时，栽参过程中土壤氮素消耗严重，常造成参后土壤养分失衡，影响人参产量和品质。
国内外采用生物防治的方法抑制作物病害已成为研究的重点和热点，具有绿色安全等特点。在自然环境中，长期存活在植物致病菌污染环境的微生物，通过微生物自身的生长繁殖和新陈代谢对致病菌产生抗性。将该类微生物制备成生防菌剂后，施加于作物土壤中抑制致病菌的生长，抑制植物病害的发生，从而降低土壤病害的发生机率，提高潜在有益菌类群的相对丰度，降低有害菌成分的丰度，有助于人参持续生产与发展。
发明内容
本发明利用生防菌与培养基合成生防菌剂，从而解决人参根腐病和锈腐病的病害问题的弗兰克氏菌人参生防菌剂及对土壤的改良方法。
本发明弗兰克氏菌生防菌剂：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉9.6 ~ 10.5，硝酸钾0.45 ~ 0.52，氯化钠0.16 ~ 0.24，磷酸氢二钾0.37 ~ 0.43，磷酸二氢钾0.08 ~ 0.13，硫酸镁0.18 ~ 0.24 ，硫酸亚铁0.004 ~0.006，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 60目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 40目，形成生物炭粉；取47 ~ 53份硅藻土、27 ~32份麦麸粉、18 ~ 22份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入100~120 mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2 × 107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
本发明制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂5~8份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂10 ~ 20份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺2 ~ 3份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水80 ~ 120 mL。
本发明具备以下优点：
1、本发明采用生物防治手段，选用生防菌株制备成生防菌剂，有效抑制人参根腐病、锈腐病病害发生，杜绝农药对土壤的残留破坏问题，具有绿色安全无污染，高效等特点，促进农业可持续发展。
2、本发明使用的拮抗菌（弗兰克氏菌）既能够共生固氮又兼具抗病抑病的功能，制备生防菌剂的方法操作简单，制备出的生防菌剂既有抑制根腐病、锈腐病的功能，又具有共生固氮功能。
3、本发明生防菌剂施加于病害土壤后30天，根腐病、锈腐病对人参植株的发病率和病情指数大幅度降低，相对防效分别达到78.72 %和69.15 %，生防菌剂对人参病害具有时间短、见效快的特点，以根腐病、锈腐病为靶标病害，有针对性的抑制病害发生。
4、本发明生防菌剂培养出的人参株高、根长、鲜重和干重的各方面指标均较好，人参健康且生长强壮。生防菌剂处理后，人参病害土壤的理化性质得到改良，土壤中微生物相对丰度发生变化，增加了土壤中细菌、放线菌的数量，降低了真菌的数量。
具体实施方式
本发明利用生防菌剂解决人参根腐病和锈腐病的病害问题，筛选出一株高效抑制两种人参致病菌的微生物拮抗菌株，经16S rRNA鉴定为弗兰克氏菌（弗兰克氏菌是与非豆科植物共生的固氮菌），研究生防菌剂的制备方法以及对栽参土壤固氮效果、生防效果，对人参长势和品质的影响。
本发明弗兰克氏菌生防菌剂：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉9.6 ~ 10.5，硝酸钾0.45 ~ 0.52，氯化钠0.16 ~ 0.24，磷酸氢二钾0.37 ~ 0.43，磷酸二氢钾0.08 ~ 0.13，硫酸镁0.18 ~ 0.24，硫酸亚铁0.004 ~0.006，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 60目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 40目，形成生物炭粉；取47 ~ 53份硅藻土、27 ~32份麦麸粉、18 ~ 22份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入100~120 mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2 × 107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
本发明制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂5~8份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂10 ~ 20份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺2 ~ 3份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水80 ~ 120 mL。
实施例1
本发明弗兰克氏菌生防菌剂：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉9.6，硝酸钾0.45，氯化钠0.16，磷酸氢二钾0.37，磷酸二氢钾0.08，硫酸镁0.18 ，硫酸亚铁0.004，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28 ~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至20目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至20目，形成生物炭粉；取47份硅藻土、27份麦麸粉、18份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入100mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2 ×107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500 mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
本发明制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂5份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂10份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺2份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水80mL。
实施例2
本发明弗兰克氏菌生防菌剂：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉10.5，硝酸钾0.52，氯化钠0.24，磷酸氢二钾0.43，磷酸二氢钾0.13，硫酸镁0.24，硫酸亚铁0.006，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28 ~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至60目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至40目，形成生物炭粉；取53份硅藻土、32份麦麸粉、22份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入120 mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2 ×107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500 mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
本发明制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂8份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂20份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺3份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水120mL。
实施例3
本发明弗兰克氏菌生防菌剂：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉10.0，硝酸钾0.50，氯化钠0.20，磷酸氢二钾0.40，磷酸二氢钾0.10，硫酸镁0.20，硫酸亚铁0.005，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28 ~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至40目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至30目，形成生物炭粉；取50份硅藻土、30份麦麸粉、20份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入110 mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2× 107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500 mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
本发明制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂6份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂15份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺2.5份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水100mL。
下面结合具体实例进行进一步阐述说明：
实例1：
优化弗兰克氏菌发酵液最适浓度。
表1 弗兰克氏菌发酵液不同浓度对致病菌菌丝生长影响
表2 弗兰克氏菌发酵液不同浓度对致病菌孢子萌发的影响
由表1可知，弗兰克氏菌发酵液对人参根腐和锈腐病致病菌菌丝的生长均有一定的抑制效果，当发酵液浓度在2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1内，抑制效果较好，当浓度为2×107CFU·mL-1时抑制效果最佳。
由表2可知，弗兰克氏菌发酵液浓度在2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1内，孢子个数减少，浓度为2×107CFU·mL-1时，根腐病致病菌孢子萌发率为13.0%，抑制率达到87.0%，锈腐病致病菌孢子萌发率仅为21.4%，抑制率可高达78.6%。
实例2：
生防菌剂对人参根腐病和锈腐病的温室盆栽防效试验。
选取健康生长强壮大小均等的人参盆栽苗，种植在带菌起参1年土壤中，每个盆栽种植6个人参植株，该试验设置4个处理，每个处理均等量添加，处理1：添加生防菌剂；处理2：添加化学药剂多菌灵1000倍液；处理3：添加无菌水；处理4：不添加作为空白对照。处理后移入人工温室大棚中，每天早晚各浇水一次。
表3 添加生防菌剂30 d后对人参根腐病和锈腐病的温室防控效果
由表3可知，带有根腐病致病菌土壤培养的人参苗经生防菌剂处理后，发病率和病情指数大幅度降低，相对防效达到78.72 %，人参植株发育生长正常；添加化学药剂多菌1000倍液对根腐病的相对防效为63.19 %，低于生防菌剂；添加无菌水处理人参植株几乎全部发病，病情指数52.67；不添加处理病情指数为60.89，生长发育受到影响，根部腐烂，整个萎蔫枯萎。
带有锈腐病致病菌土壤培养的人参苗经生防菌剂处理后，发病率和病情指数均降低，相对防效达到69.15 %，人参植株发育生长正常；添加化学药剂多菌灵1000倍液对锈腐病的防效为73.00 %，低于生防菌剂；添加无菌水处理人参植株全部发病，病情指数56.75；不添加处理病情指数为63.71，根部出现铁锈色病斑，根部扩展腐烂死亡。
弗兰克氏菌生防菌剂对人参根腐病和锈腐病的处理显著促进了人参的株高和根长生长，鲜重和干重均高于其它3种处理。表明生防菌剂对人参根腐病和锈腐病具有更好的防治效果。
实例3：
生防菌剂添加60 d后，土壤理化性质比较，土壤中微生物菌群相对丰度比较。
表4 生防菌剂施加前后对土壤理化性质的影响
表5 生防菌剂施加前后对土壤微生物菌落数的影响
由表4可知，生防菌剂添加60d后，土壤pH、有机质、速效磷、碱解氮、速效钾均发生变化。起参0年土、起参1年土、起参2年土的土壤pH分别升高1.0、0.82、0.78个单位；有机质分别增加2.0、6.9、4.3个单位；速效磷含量分别增加3.2、2.1、2.0个单位；碱解氮含量分别增加17.6、17.4、14.1个单位；速效钾含量分别增加47.9、42.2、35.5个单位。
土壤微生物菌群逐渐丰富，土壤中真菌菌落数量明显减少，细菌和放线菌菌落数量明显增加。说明弗兰克氏菌生防菌剂不仅能够改良人参病害土壤的理化性质，还能丰富土壤微生物的菌落数量，抑制致病菌的生长萌发，从而减轻人参病害的发生。
Claims (2)
1.一种弗兰克氏菌人参生防菌剂，其特征在于：
a、弗兰克氏菌发酵液制备：将弗兰克氏菌接入装有100 mL的液体培养基中，液体培养基配制，单位份：可溶性淀粉9.6 ~ 10.5，硝酸钾0.45 ~ 0.52，氯化钠0.16 ~ 0.24，磷酸氢二钾0.37 ~ 0.43，磷酸二氢钾0.08 ~ 0.13，硫酸镁0.18 ~ 0.24 ，硫酸亚铁0.004 ~0.006，全部溶解于500 mL蒸馏水中，充分搅拌后，将液体培养基pH值调至6.8 ~ 7.2，高压灭菌锅温度调至120℃ ~ 125 ℃，灭菌时长为25 min；使用恒温振荡器振荡培养，温度为28~ 30 ℃，转速为150 ~ 160 r/min，培养72 h后制备成弗兰克氏菌发酵液，血球计数板调整发酵液浓度为2×105CFU·mL-1 ~ 2×107CFU·mL-1；
b、生防菌剂制备：将麦麸经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 60目，形成麦麸粉；将生物炭经过破碎机破碎后，优选过筛至20 ~ 40目，形成生物炭粉；取47 ~ 53份硅藻土、27 ~32份麦麸粉、18 ~ 22份生物炭粉充分混合均匀后，放入500 mL三角瓶中，加入100~120 mL浓度为2 × 105CFU·mL-1 ~ 2 × 107CFU·mL-1的弗兰克氏菌发酵液，充分混合后在500mL三角瓶中静置避光3个月，保持温度在25℃ ~ 28℃，制备成弗兰克氏菌生防菌剂。
2.根据权利要求1所述的弗兰克氏菌人参生防菌剂，其特征在于：制备的弗兰克氏菌生防菌剂对土壤的改良方法：取生防菌剂5~8份平铺在直径为15 cm，高16 cm培养盆底部，再取生防菌剂10 ~ 20份与带有人参根腐病、锈腐病致病菌的土壤2 kg充分混合，装入培养盆中，在土壤表面平铺2 ~ 3份生防菌剂，由上到下浇灌蒸馏水80 ~ 120 mL。
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| EP0248832A1 (fr) * | 1985-12-04 | 1987-12-16 | Orstom | Procede de culture de microorganismes, notamment du groupe des frankia et preparation d'inoculums bacteriens. |
| CN107759362A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-03-06 | 吉林万通集团盛泰生物工程股份有限公司 | 一种防止人参重茬的复合微生物肥料及其制备方法 |
| CN108409417A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-08-17 | 中科国思生物科技研究（广州）有限公司 | 一种弗兰克氏菌制备的微生物肥料 |
| CN108531428A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-14 | 中科国思生物科技研究（广州）有限公司 | 一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法 |
| CN108617696A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-10-09 | 广西青又青生物肥业有限公司 | 一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂及其制备方法和用其制备的柑橘黄龙病专用生物制剂 |
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