CN112358366A - 用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用，通过对采用采用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)按照特定质量比例混合，复配结合一定含量的牛粪、羊粪、菇渣、黄腐酸、葡萄酒渣制备的复合菌肥。本发明创造性的提出的能够用于防治梨火疫病的复合菌肥的技术方案，通过特定比例的菌种复配在形成稳定微生态并保障较高的活菌数的同时，不仅能够促进植株生长的并且具有显著的梨火疫病防治效果，在盐碱地均可适用，能够降低梨树感染梨火疫病的风险。

Description

用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料的研发技术领域。具体地，本发明涉及用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用的技术领域。
背景技术
梨火疫病的病原菌为Erwinia amylovora，属于肠杆菌科，欧文氏菌属，革兰氏阴性菌。病原菌寄主范围很广，并且侵染花、叶片、嫩梢、幼果、枝条和树干，引起花序枯死、枯枝、果实腐烂和整株死亡。梨火疫病菌传播途径十分广泛，苗木、风、雨、鸟类、昆虫及人为因素均可引起该病原菌的传播。病原菌一旦入侵，能在寄主植物上终身定殖，进而扩散蔓延，迅速流行，难以控制和根除，造成严重的经济损失。
现有的梨火疫病的防治以化学农药为主，虽然有一定防效，但易造成农药残留，危害人体健康，破坏生态平衡，且长期使用农药防治火疫病，极易使病原菌产生耐药性，增加了火疫病防治难度。生物防治利用微生物产生的次生代谢产物防治病害，可有效解决农药残留问题，不会使病原菌产生耐药性且对人体无害，也不会造成环境污染。研究表明，Pantoea agglomerans E352可通过产生聚酮地非西丁、二肽巴氏有效抑制梨火疫病菌的生长繁殖，但其不易在田间定殖，尤其在盐碱环境中更难以生存。
申请号为202010198265.2的专利中披露了2,4-二氧代咪唑啉类环己烷磺酰胺化合物进行梨火疫病防治的技术方案，李雪松在《梨火疫病的发生与防治》中披露了采用“发病前开始喷洒1∶2∶200倍式波尔多液或72％农用链霉素可溶性粉剂3000～4000倍液，1000万单位新植霉素4000倍液，14％络氨铜水剂350倍液，隔10～15d喷1次，连防3～4次。”进行梨火疫病的防治，梁慧敏等在《梨火疫病抑菌制剂的室内筛选》的研究中，披露了“内吸性抑菌制剂1.8％辛菌胺醋酸盐,有机类抑菌制剂3％噻霉酮(ME),3％噻霉酮(WP)和30％壬菌铜,植物源类型制剂80％乙蒜素以及微生物制剂荧光假单胞杆菌3000,是室内试验对梨火疫菌抑菌效果较好的制剂”。现有技术中，对于适用于盐碱地区，具有良好梨火疫病防治效果的复合菌肥未见报道。
发明内容
针对现有技术中在防治梨火疫病的方式多采用化学制剂，危害人体健康，破坏生态平衡，且长期使用极易产生耐药病原菌的技术现状，现有技术也尚未见有针对采用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)按照特定比例复配结合一定含量的牛粪、羊粪、黄腐酸、葡萄酒皮渣等组分制备的复合菌肥应用于防治梨火疫病病原菌的的报道。本发明旨在提供用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。同时，本发明创造性的提出的能够用于防治梨火疫病的复合菌肥的技术方案，通过特定比例的菌种复配在形成稳定微生态并保障较高的活菌数的同时，不仅能够保障植株正常生长的并且具有显著的梨火疫病防治效果，在盐碱地均可适用，能够提升抵御感染梨火疫病风险的能力。
本发明提供用于防治梨火疫病的复合菌肥，其中包含复合菌剂和复合物料，复合物料包含按照质量份数计牛粪25-50份、羊粪25-50份、菇渣10-30份、黄腐酸10-30份、葡萄酒渣5-15份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.6-1.4％进行接种。
优选的，复合物料包含按照质量份数计牛粪35份、羊粪35份、菇渣15份、黄腐酸10份、葡萄酒渣5份；复合菌剂按照复合物料质量百分比1％进行接种。
进一步的，本发明还提供了上述用于防治梨火疫病的复合菌肥的制备方法，具体的采用以下步骤制备获得：
(1)收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散。
(2)选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；
(3)将步骤(2)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL以上；
(4)将步骤(3)获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)菌剂按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂。
(5)将步骤(4)中制备获得的菌剂发酵混合液，按比例与步骤(1)中制备获得完全腐熟的牛羊粪物料及菇渣、黄腐酸、葡萄酒渣制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装。
本发明中，用于防治梨火疫病的复合菌肥中采用的复合菌剂由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)，复合菌剂按照质量比为(1-5):(2-1):1:1混合获得。
优选的，用于防治梨火疫病的复合菌肥中采用的复合菌剂由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)发酵液按照质量比为3:2:1:1混合获得。
本发明中，采用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)公众渠道获得。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)的培养基及扩大培养方法都是本领域普通技术人员通过公知常识获得。
进一步，本发明提供的上述用于防治梨火疫病的复合菌肥在防治梨火疫病中的应用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果:
本发明旨在提供用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用，以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)发酵液混合，创造性的提供用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法与应用，与现有技术相比，该菌肥在维持通过特定比例的菌种复配在形成稳定微生态并保障较高的活菌数的同时，不仅能够保障植株正常生长的并且具有显著的梨火疫病防治效果，在盐碱地均可适用，能够显著降低梨树感染梨火疫病的风险。
附图说明
图1所示为部分生防菌对梨火疫病原菌平板对峙拮抗效果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及的材料和设备：
本发明所采用的材料为：营养琼脂(NA)培养基、营养肉汤(NB)培养基、MRS培养基、琼脂粉等均为国产分析纯试剂。
本发明所采用的设备为：恒温摇床、培养皿、无菌操作台、牛津杯、PCR仪、水浴锅、高压灭菌锅、微波炉。
本发明中选用的所有材料、试剂及仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施。
实施例一：用于防治梨火疫病的复合菌肥
本发明提供用于防治梨火疫病的复合菌肥，其中包含复合菌剂和复合物料，复合菌肥包含按照质量份数计牛粪25-50份、羊粪25-50份、菇渣10-30份、黄腐酸10-30份、葡萄酒渣5-15份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.6-1.4％进行接种。
实施例二：用于防治梨火疫病的复合菌肥的制备
本发明还提供了上述用于防治梨火疫病的复合菌肥的制备方法，具体的采用以下步骤制备获得:
(1)收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散。
(2)选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；
(3)将步骤(2)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL以上；
(4)将步骤(3)获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)菌剂按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂。
(5)将步骤(4)中制备获得的菌剂发酵混合液，按比例与步骤(1)中制备获得完全腐熟的牛羊粪物料及菇渣、黄腐酸、葡萄酒渣制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装。
本发明中，用于防治梨火疫病的复合菌肥中采用的复合菌剂由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)，复合菌剂按照质量比为(1-5):(2-1):1:1混合获得。
实施例三：用于防治梨火疫病的复合菌肥
收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；将获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；将获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂按照1:1:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂；将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各25kg及菇渣10kg、黄腐酸30kg、葡萄酒渣10kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比0.6％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装。
实施例四：用于防治梨火疫病的复合菌肥
收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；将获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；将获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂按照2:2:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂；将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各30kg及菇渣20kg、黄腐酸25kg、葡萄酒渣8kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比0.8％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装。
实施例五：用于防治梨火疫病的复合菌肥
收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；将获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；将获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂按照3:2:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂；将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各35kg及菇渣15kg、黄腐酸10kg、葡萄酒渣5kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比1％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装。
实施例六：用于防治梨火疫病的复合菌肥
收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；将获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；将获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂按照4:2:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂；将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各40kg及菇渣25kg、黄腐酸15kg、葡萄酒渣6kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比1.2％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装。
实施例七：用于防治梨火疫病的复合菌肥
收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；将获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；将获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂按照5:2:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗的复合菌剂；将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各50kg及菇渣30kg、黄腐酸20kg、葡萄酒渣7kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比1.4％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装。
实施例八：用于防治梨火疫病的复合菌肥产品技术指标测定
根据农业部标准NY/T 798-2015复合微生物肥料中对于复合微生物肥料的要求，对本发明实施例三至实施例七中制备的复合菌肥产品分别编号1-5，进行相关技术指标测定，测定结果如表1及表2所示。
表1：用于防治梨火疫病的复合菌肥产品技术指标测定
项目 标准 1组 2组 3组 4组 5组
有效活菌数(cfu/.亿/g(mL) >0.20 1.8×10<sup>8</sup> 1.85×10<sup>8</sup> 2.0×10<sup>8</sup> 1.95×10<sup>8</sup> 1.9×10<sup>8</sup>
杂菌率,％ ≤30.0 1.0 0.7 0.3 0.5 0.6
水分,％ ≤30.0 30 30 30 30 30
pH 5.5-8.5 4.8 5.0 7.5 7.6 8.4
有效期(月) >6 10 10 12 10 9
表2：用于防治梨火疫病的复合菌肥产品无害化指标测定
项目 限量指标 1组 2组 3组 4组 5组
粪大肠菌群数.个/g(mL) ≤100 35 26 10 25 30
蛔虫卵死亡率.％ ≥95 98.0 99.8 100 99.7 98.9
砷(As)(以烘干基计),mg/kg ≤15 2.53 2.54 2.34 2.36 2.41
镉(Cd)(以烘干基计),mg/kg ≤3 0.78 0.79 0.8 0.80 0.79
铅(Pb)(以烘干基计),mg/kg ≤50 2.9 2.6 3.5 3.4 3.2
铬(Cr)(以烘干基计).mg/kg ≤150 0.51 0.52 0.50 0.51 0.51
汞(Hg)(以烘干基计),mg/kg ≤2 0.2 0.2 0.19 0.2 0.2
实施例九：复合菌肥抗菌效果测定
基于上述实施例一到八，选取实施例三至实施例七中制备获得的用于防治梨火疫病的复合菌肥产品，于温室内以盆栽杜梨苗(杜梨为香梨树砧木，极易感染梨火疫病)进行盆栽实验，土壤选用盐碱土壤。共设置6个处理，其中CK组为对照，不施用本发明提供的复合菌肥及菌剂发酵混合液，其余5组将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)以不同比例复配后施用，施用15天天之后再次在土壤接种复合菌剂，比例与肥料中使用比例一致。15天之后，采用病原菌Erwinia amylovorar培养液(4×107cfu/mL)进行喷叶处理，并严格保湿3天，之后观察发病情况。每个处理实验数量为15盆(每5盆为1个处理，共3次重复)。统计每盆杜梨苗枝条数，待枝条出现发病症状，逐一进行统计。病斑长度≤1/3枝条长度，计为1级，1/3枝条长度<病斑长度≤2/3枝条长度，计为3级，病斑长度>2/3枝条长度，计为5级。病情指数及防效计算公式如下：
Figure BDA0002803297950000141
Figure BDA0002803297950000142
实验过程中采取严格措施，防止病原菌扩散，实验完毕，土壤、枝条先进行高温灭菌，之后进行掩埋处理。各处理组枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)菌剂比例及各组防效如下：
表3：各组肥料中菌种比例、相应病情指数及防效
Figure BDA0002803297950000143
Figure BDA0002803297950000151
可见本发明所提供的是四种菌种构成的复合菌肥对于具有较好的抑制作用，其中枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)按照3∶2∶1∶1的质量比复配制备的复合菌肥具有最佳的防治效果。
基于上述实施例，可见本发明提供的实施例五中制备获得的用于防治梨火疫病的复合菌肥具有最佳防治效果，即选用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)菌剂按照3:2:1:1质量比进行复配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂，结合将制备获得完全腐熟的牛羊粪物料各35kg及菇渣15kg、黄腐酸10kg、葡萄酒渣5kg复配制备复合物料，选用占复合物料质量百分比1％的复合菌剂进行接种，翻拌均匀，包装制得的用于防治梨火疫病的复合菌肥具有防治最佳水平，其对于梨火疫病的防治病情指数较对照组显著降低52％以上。本发明提供的用于防治梨火疫病的复合菌肥及其制备方法对于梨火疫病防治领域具有广泛的开发价值。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (6)

1.用于防治梨火疫病的复合菌肥，其特征在于，所述的复合菌肥中包含复合菌剂和复合物料，复合物料包含按照质量份数计牛粪25-50份、羊粪25-50份、菇渣10-30份、黄腐酸10-30份、葡萄酒渣5-15份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.6-1.4％进行接种。
2.如权利要求1所述的用于防治梨火疫病的复合菌肥，其特征在于，所述的复合物料包含按照质量份数计牛粪35份、羊粪35份、菇渣15份、黄腐酸10份、葡萄酒渣5份；复合菌剂按照复合物料质量百分比1％进行接种。
3.根据权利要求1所述的用于防治梨火疫病的复合菌肥的制备方法，其特征在于，采用以下步骤制备获得：
(1)收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪(1:1)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米或更长进行发酵。发酵时间为40天以上至物料完全腐熟。由于物料发热会使水分不断蒸发，所以发酵过程中需要注意水分的补充，发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；
(2)选取低温保存的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)分别接种至NA培养基平板，季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)接种至PDA平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB(细菌)和PDB(酵母)培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；
(3)将步骤(2)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL；
(4)将步骤(3)获得的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)菌剂按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂；
(5)将步骤(4)中制备获得的菌剂发酵混合液，按比例与步骤(1)中制备获得完全腐熟的牛羊粪物料及菇渣、黄腐酸、葡萄酒渣制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装。
4.根据权利要求3所述的用于防治梨火疫病的复合菌肥的制备方法，其特征在于，所述的复合菌剂由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(P.Fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)复合菌剂按照质量比为(1-5):(2-1):1:1混合获得。
5.根据权利要求3所述的用于防治梨火疫病的复合菌肥，其特征在于，所述的复合菌剂由枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(P.Fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)复合菌剂按照质量比为3∶2∶1：1混合获得。
6.权利要求1至5任一项所述所述的用于防治梨火疫病的复合菌肥用于防治梨火疫病中的应用。
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