JPS63501475A - 液体、特に組織培養増殖用培地へ泡立たせず気体を送入する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 液体、特に組織培養増殖用培地へ泡立たせず気体を送入する装置及び方法 本発明の特許Ｐ　３４　３０　９２４．１をより発展させたものに関する。

特許Ｐ　３４　３０　９２４．１公報に記載された方法は、同公報に記載された 適宜所望のプラスチック材料から作られた多孔質もしくはミクロ細孔性中空メン プラン（膜）フィラメントを有する装置によってもしその中空メンプランフィラ メントが疎水性であればその方法を有利に遂行できることが明らかになった。

この目的のための１本発明によれば請求の範囲第１項の前文で特徴づけられた装 置は１本又はそれ以上の疎水性多孔質中空メンプランフィラメントから形成され たメンプランケージを具備していることを特徴とする。

メンプランケージの振子運動とは一方向の運動、直線的振子運動、円形振子運動 １円形振動運動及びそれら運動の組合わせと理解すべきである。１つの回転軸の まわりの１方向の回転運動（逆方向への運動なし）はその運動に伴ってせん新作 用が生じるため有用ではない。

本発明において具備された疎水性の多孔質もしくはミクロ細孔性中空メンプラン フィラメントを用いると気体送入はメンプランの細孔のために効果的に行われる 。メンプランの細孔には気体が入っており、気体／液体の相境界はほぼ細孔の中 て中空メンプランフィラメントの外側平面近くに存在し、かつ液体培地（■ｅｄ ｉｕｍ）が中空メンプランフィラメントの中へ入らないようになっている。相境 界の位置は中空メンプランフィラメント中の外圧に対する圧力を適切に選ぶこと により調整することができる。

液体、特に組織培養増殖用培地へ気体を泡立たせずに送入する装置は気体の供給 及び排出系に加えて細胞を含まない培地の交換系を原則として有するリアクター において用いられる。例えば、バイオリアクター中で動物細胞を培養する場合、 細胞を含まないで培地を交換することは細胞数がｌＸｌＯ７個／ｍ１以上の濃度 になると問題となる。

培地を細胞を含まないて連続的に交換するため、例えば、攪拌機シャフトに紡績 フィルターをとりつけることが提案されている：デベロップメント・オブ・バイ オロジカル・スタンダード、６０（１９８５）２２９〜２３６゜組織培養液が攪 拌された結果生じる欠点に関しては特許Ｐ　３４　３０　９２４．１を参照する ことができる。ミクロ担体培養用としてフィルター単位及び／又は沈降経路をも つ外部循環系も提案されている：アニュアル・レポート・オブ・ファーメンティ ジョン・プロセス、６　（１９８３）３５〜７４、しかし、外部循環系に関して 、細胞懸濁液が連続的にポンプ循環される結果として高ぜん断力が生じ、その結 果、細胞が大いに損傷される。平坦なメンプランは閉塞され易く、液体を定常速 度で処理する方法として満足すべきものではない。

このような現状の技術の問題点を克服するために本発明による装置はさらに１本 又はそれ以上の親木性多孔質中空メンプランフィラメントを備えることができる 。これらの親水性多孔質中空メンプランフィラメントは疎水性多孔質中空メンプ ランフィラメントとともにメンプランケージを形成する。

ポリプロピレン、例えばＤＥ−Ａ−３１０７８７４にょるポリプロピレンで作ら れた中空メンプランフィラメントの使用は有利であることが分っている。ポリプ ロピレンで作られた多孔質及びミクロ細孔性中空メンプランフィラメントはそれ 自体疎水性である。

しかし、これらの中空メンプランフィラメントは有機溶媒で湿潤し、次いで水で 湿潤することにより親水性化することができる。この親木性化は乾燥によって逆 転させることができる。従って、メンプランケージは一部未処理で一部適切な方 法で親水化されたポリプロピレン中空メンプランフィラメントから形成すること ができる。

もし液体培地が親水性中空メンプランフィラメントによって交互にリアクターへ 導入及びリアクターから排出されると、それにより中空メンプランフィラメント は有利な方法で洗浄される。

以下に本発明を６種の図面及び４種の例により詳細に説明する。

第１図〜３図は例１〜３による３種の発酵を示し。

第４図は例１〜３に用いた装置を模式的に示し、第５図及び第６図は本発明によ る疎水性多孔質中空メンプランフィラメントを有するメンプランケージを備えた りアクタ−を示す。

第５図に示す概要構造において、本発明による装置１ｏは非磁性容器１２とその 上に配備し、適宜締めつけ及び密封（図示せず）された蓋１４からなる。気体導 入ライン１６及び気体排出ライン１８は蓋１４を貫通している。

容器１２には形が中空円筒状のメンプラン保持体２２を有するメンプランケージ ２０が配置されており、メンプラン保持体２２の上には中空メンプランフィラメ ント２４が螺線状に巻かれている。メンプランケージ２０は容器１２中の液体２ ６の中に完全に浸漬されており、その上端部は弾力性の管２８及び３０により柔 軟にとりつけられている。管２８は気体導入ライン１６及び巻きつけられた中空 メンプランフィラメントと連結されており、一方、管３０は巻きつけられた中空 メンプランフィラメントの他の一端及び気体排出ライン１８に連結されている。

メンプランケージ２０の下部には容器１２の外側に位置した磁石装置３４によっ て作動させることのできる磁芯３２がメンプラン保持体２２に回転しないような やり方で取りつけられている。ａ１芯３２によってメンプランケージ２０に振子 運動を刊年するため磁石装置３４はある装置（図示せず）により直線方向に前後 動させることができる。この直線運動はメンプランケージ２０が懸吊点を通過す る直線のまわりを振子のように動くような方向にしむけられる。

メンプランケージ２０の下部には容器１２の外側に位置した磁石装置３４によっ て作動させることのできる磁芯３２がメンプラン保持体２２に回転しないような やり方で取りつけられている。磁芯３２によってメンプランケージ２０に円形振 子運動を付与するため磁石装置３４はある装置（図示せず）によって回転させる ことができる、この円形振子運動によってメンプランケージはその対称軸のまわ りを自動回転することなく円形運動する。

これらの運動のほかに、メンプランケージの直線振子運動と重ねるため管２８と ３０の弾力性の結果としてメンプランケージの対称軸に対しである特定の角度で 直線運動を生じさせるようにすることもできる。このような運動要素を加えるこ とによりだ円形又は円形振子運動が可能となる。さらにまた、対応して動かされ る磁石装置３４の代りにメンプランケージの所望の振子運動又は回転振子運動を 対応して配置し作動させる電磁石によって与えることも可能である。

気体送入速度は円形振子の振動数及び／又は円形運動の直径を変えることにより 調節することができる。以下に示す実施態様の場合１円形運動の直径を対応して 変えることは蓋１６中の気体導入ライン１６と気体排出ライン１８の間隔を変え るという簡単な方法で行うことができる０例えば、この間隔を小さくすることに よってメンプランケージの休止点（すなわちメンプランケージに何の運動も加え られず、メンプランケージが容器１２中で静止して懸吊している位置）からの振 れは対応して減少させることができる。

第５図に示す実施態様は特に少量の液相に設計されている。液量が３０文又はそ れ以上の液へ気体を泡立たせず送入する場合には、第６図に示すように、気体の 供給及び排出用の柔軟管２８．３０による懸吊を可撓性又は旋回自在な関節接続 部材（３８）を用いる適切な懸吊系３６に替えることが有利であり、メンプラン ケージはより大きなサイズとなり偏心軸４０により動かされる。関節接続部材３ ８は１例えば、同じ長さの２本又はそれ以上の引張ワイヤーから構成することが できるが、これらは互いに距離をおいて一端は蓋１４に旋回自在に取りつけられ 、他端は偏心軸４０を取りかこむ誘導板４２に蝶番どめされており、それらの対 称軸はメンプランケージ２０のそれと一致する。この誘導板４２は引張リング４ ６の穴に接続した引張りング支持棒４４によって固定化され、１本又は複数の中 空メンプランフィラメントと共に相当して大型化したメンプランケージを形成す る。メンプランケージ２０に円形振子運動を付与するため、容器１２中へ駆動軸 ４８が挿入設置され、ｖＲ節自在な偏心軸４０により誘導板４２の上又は中に挿 入されている。駆動軸４８は好ましくは蓋１４又は容器１２の底から容器の対称 軸領域内へ挿入される。駆動軸４８が容器１２の蓋１４を通って挿入される場合 、誘導板４２はメンプランケージ２０の上方に配置するのが有利で、軸４８は中 空円筒状のメンプランケージ２０をつきぬけ容器１２の下半部に達し、その下端 に攪拌機５０を取りつけられる。この攪拌機５０は液面が低く液面上が純粋な空 気相となっているいわゆる初期培養相中での培養物の第１次生長段階中の液の緩 慢な運動を効果的に行うことができる。

上述の装置はまた通常の発酵器の附属装置として適しており、既存のシステムに 対する理想的な付加装置となる。

例１ 第５図に略図として示した装置の効率を試験するために、気孔容積７５％で気孔 サイズ０．３ｇｍの７キユレル（ＡｃｃｕｒｅｌＲ）型式ＰＸ　１９０／１／２ ／８３６６から作られた疎水性中空メンプランフィラメント２４を巻きつけたメ ンプランケージ２０を作製した。中空メンプランフィラメント２４の長さは１２ １　ｃｍ、メンプランの外部表面積は９８．７ｃｒｎ”であった、中空メンプラ ンフィラメントへの気体送入ははじめ外気圧に対し３０ｍｍ水柱の与圧下で純酸 素を用いた。有利に用いられるメンプラン物質は特にミクロ細孔性のポリプロピ レン、例えばアキュレルである。

メンプランケージは１．３文の蒸留水中に浸漬し、容器の下に配置された回転自 在の磁石によって中心から２．５ｃｍの振れで１分間６０回の円形振子運動で動 かされた。

この装置を用いた測定によって温度２５℃においてメンプラン表面からの酸素気 泡の発生なしで５６ｍｇ０２／（文、ｈ）の酸素移送速度ＯＴＨに達し得ること が示された。これは酸素流量比Ｑｏ２として０．５７ｍｇＯ２／　（ｃｒｎ’、 ｈ）に相当する。同じｒｔ置を用いて表面を動かさない場合、０．２２ｍｇＯ２ ／　（ｃｍ″、ｈ）の酸素流量Ｑｏ２が測定された。

上述の装置は、例えば、ｍ維芽細胞の培養、例えば比酸素要求量ｑｏ　が０　、 ０５ｍｍｏｌＯ／　（１０９細胞、ｈ）すなわち１．６ｍｇｏ２／　（１０細胞 、ｈ）である人間の二倍体色皮細胞の培養に適している。この装置を用いれば３ ．５Ｘ１０１０細胞／皇の供給が可能との計算になる。

以下にこの方法及び装置のもう１つの使用例を述べる。細胞数Ａが４．５Ｘ１０ ’細胞／皇で初期酸素要求量ｑｏ　が４　、３ｍｇ０２／（ｌＯ細胞、ｈ）であ る人間の一次白血球を用いる細胞培養を若干の工程適応化添加剤を含有する培Ｊ ＩＬ＋ＲＰＭＩ１６４０中で３７６Ｃにおいて外気圧に対し３０ｍｍ水柱の酸素 与圧下で円形振子運動６０回／分を用いて行った。泡立を生じない気体送入で酸 素移送速度ＯＴＲ３８ｍｇＯ□／（１，ｈ）が達成された。この速度は所要の速 度１８．５ｍｇ０□／（１，ｈ）を超過するものである。

酸素移送速度を所要の１９．５ｍｇ０２／　（ｕ−ｈ）まで低下するために円形 振子運動の振動数を単に低下させた。

所要とされる酸素供給量の制御はまた流入気体の気体濃度を変えることによって 行うことができる。上述の装置において、例えば１０％空気飽和の制御参照値は 、必要に応じ純粋な酸素を混合させた空気をＩＮｕ／ｈで連続的に流しメンプラ ンを通じて移送するという方法で維持した。酸素の混合は２点位コントローラー で制御された磁石バルブによって行い培地中の空気飽和の実際値は酸素電極を用 いて測定した。

細胞培養技術における慣例である緩衝剤−〇〇□平衡によるｐＨ調整は、流入気 体に所要量のＣＯ２を混合することにより行うことができる。

本発明による方法及び本発明による装置はミクロ担体培養の気泡なし気体送入に 適しており、有利に用いられる。

例２〜４ 疎水性及び親木性中空メンプランフィラメント用として選ばれた管はミクロ細孔 性疎水性ポリプロピレン（アキュレル１．エンカ社）であり、次のような特性値 を有していた；　Ｄｉ＝１．８８ｍｍ、水柱＝０．４ｍｍ、孔サイズ０．３ｐｍ 、外部表面積８１．７ｃｒｎ’／　ｍ　、親水化するため、１本の管を７０％エ タノールで１時間処理し１次いでアルコールがなくなるまで純水（ミリ−Ｑ）を 用いてフラッシングした。

２種の管は１．５１スケールのマウス−マウスのバイプリドーマの３回発酵に使 用した。この目的のため、第５図に示すようにはじめ疎水性管状コイルを次いで （湿潤状の）親水性管状コイルを第５図に示す磁力駆動振子スターテ−２０の上 にのせた。気体送入及び培地交換用それぞれの管の長さは第１図〜第３図に見ら れる。結果が示すように気体送入管と培地交換管の長さの比率は細胞濃度的２Ｘ １０７細胞／ｍｌ用として３〜４ｍ／文対１ｎ／４が有利である。蒸気滅菌中に 疎水性管、親水性管のどちらもその性質を変えなかった。

連続工程は次の通りである。新鮮な培地（栄養素）の供給は計量ポンプ２により 自由に行った。親水性管を通じての細胞を含有しない培地のくみ上げ停止のため 、細孔の閉塞の可能性を考慮し、また管の融通性を考慮して循環系３を設置した 。外部ポンプ４によって培地は親水性管を通じて循環させた。もう１つのポンプ ５により、この循環系３から相当する排出量を除去することができた。このよう にして、細孔の流量の管内部流量に対する比率が大きくなりすぎないようにする ため排出量は循環量の半分以下であった。測定結果では、親水性管を通して除去 される液は少なくとも１５０ｄ／ｈ（＝実用容積の３倍／ｄ）が可能であること が示された０発酵時間は細胞濃度水準を種々変えて１３５，２４０及び５００時 間であった。これらの時間を通じて親水性管の効率の減損は見られず、その結果 、再水洗及び再生処理は必要なかった。

３種の発酵の結果は第１〜３図に示す。

ｊｌＪは細胞をそのまま残したバッチ培養（例２）とそれに統〈連続培養におけ る挙動を示す、バッチ培養の生存細胞濃度は約１．５Ｘ１０８細胞数／ｍ！であ った。細胞残留によって、この例において生存細胞濃度を約２．５Ｘ１０’細胞 数／ｍｌにすることができた。死亡細胞が高率であり、連続発酵（ｔＦ＝２３５ 時間）の開始におけるそれらの妨害効果の結果として均一な高細胞濃度を達成す ることは可能でなかった。

ｍは同じ細胞系を用いる第２回の発酵結果を示す、この試験において高細胞濃度 （生存細胞濃度８×１０５細胞数／ｍｌ）の培養が得られ、連続操作は２４時間 後に開始された。２４０時間の期間内に細胞量の３６％を１回除去しただけで７ ．２Ｘ１０６細胞数／摺の生存細胞濃度が得られた。細胞への酸素供給はますま す不確実になった。

ｍには、同じ細胞系を用いる第３回の発酵（例４）の結果を示す、この回の培養 は低細胞濃度（生存細胞濃度３．５Ｘ１０５）で行われたが、連続工程が直ちに 開始された。わずか１２０時間後に１．５ＸＩＯ７細胞数／細胞数化存細胞濃度 が達成された。この細胞濃度でも酸素（２，８ｍ管）の供給はなお保証された。

３回の発酵結果は約２Ｘ１０７細胞数／ｍｌの供給に相当する管１ｍ、１時間あ たり少なくとも１００ｍ１の培質が除去できることを明らかに示している。管の 効率に関する問題（閉塞、機能低下）は何らなかった。

第２図 発酵２ 細胞系　：　ＦＩＢにＷ３Ｂ 培　地　ｚＧＩグ（イス二′２′）、Ｆ１２（ハム）ｌ：１ｍ加物　：　２−グ ルタミン、　８．２５１Ｌｇ／ｕゲンタマイシン血清　：４％（Ｖ／Ｖ）　ＦＣ Ｓ リアクター：　容積＝１．５文、実用容積：１．２文気体送入　：　２ｍ　疎水 性ポリプロピレン管培地交換　：　２ｍ　親木性ポリプロピレン管第３図 発酵３ 細胞系　：　ＦＩＢＩ［）［１ｌｌｉ 培　＃！：ＤＭＥ）Ｉ（イスコカ、Ｆ−１２（ハム）ｌ：！添加物　：　２−グ ルタミン、１２５１Ｌｇ／交ゲシタマイシン血清　：１％（Ｖ／Ｖ）　Ｆ（Ｓ リアクター：　容積：　１．５Ｌ実用容積：１．２文気体送入　：　２．８ｍ　 疎水性ポリプロピレン管培地交換　：　１ｍ　親水性ポリプロピレン管第５図 第６図 −国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．液体、特に組織培養増殖用培地に、振子方式で動かされるメンブランケージ によって付与された浸漬メンブランシートを通す気体交換により泡立たせず気体 を選入する装置においてメンブランケージが１木又は２本以上の疎水性多孔質中 空メンブランフィラメントを有することを特徴とする装置。
2. ２．中空メンプランフィラメントの配列が概略円筒の表面を描く形であることを 特徴とする請求の範囲第１項記載の装置。
3. ３．メンブランケージがさらに１本または２本以上の親水性多孔質中空メンブラ ンフィラメントを具備することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の 装置。
4. ４．疎水性中空メンプランフィラメントが多孔質ポリプロピレン中空メンブラン フィラメントであり、 親水性中空メンブランフィラメントが多孔質ポリプロピレン中空メンプランフイ ラメントの有機溶媒での湿潤とそれに続く水での湿潤により得られるポリプロピ レン多孔質中空メンプランフィラメントである ことを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の装置。
5. ５．数本の疎水性多孔質中空メンブランフィラメント及び／又は数本の親水性多 孔質中空メンブランフィラメントからなり、各フィラメントがそれぞれ別個に流 体を流すことができることを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の 装置。
6. ６．液体、特に組織培養増殖用培地へ泡立たせず気体を送入する方法において、 それが上記請求の範囲のいずれか１項による装置によって行われることを特徴と する方法。
7. ７．断続的に培地がリアクターへ導入され、かつ培地が親水性多孔質中空メンプ ランフィラメントを通じてリアクターから除去されろことを特徴とする請求の範 囲第６項記載の方法。