JPS63501243A - 細胞癒合を測定するための装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １）癒Ａ　１　るための　および方゛ 日の 本発明は、（蛋白質または多糖類のような）高分子または（原始細胞または成熟 細胞のような）細胞相互間または（生物或いは無生物の）原質または表面との（ 吸着、接合、接着、結合または分離のような）相互作用または上述の任意の組合 わせにおける相互作用に含まれる力のような細胞癒合もしくは着生を測定する装 置および方法に関する。

日　の　１　景 生物学的状況においては、程度の差こそあれ、分子、細胞および原質間には吸引 力が働き、分子および／または細胞は原質に対し成るいは相互に結合する傾向が 存在する。このような力は、望ましい状況であれ望ましくない状況であれ非常に 多様な状況において有効に作用する。

このような作用は、次ぎのような３つの主たる領域に分類するこができよう。

Ｕ環１ 湖、河或いは海に存在する岩類、ボート或いは船或いは海中油田設備のような他 の水中構造物上にはスライム層が生ずる。このような層の直接的作用、例えば、 水中での船体抵抗の抗力増加のような作用は別にしても、生物学的汚染で、層の 下側の表面の腐食のような別の問題が生ずる。

１−五里分Ｉ 歯に対する歯垢の形成は日常的な現象であり、骨のような表面に対する組繊細胞 の付着が存在することは明らかである。

同様にして、傷から出血した場合、血液中の血小板の傷口への付着も通常の治癒 過程の一部であるが、血球の血管壁に対する癒合または相互癒合では血栓の形成 が生じ、それに伴なう問題が生ずる。

傷を受けた組織に炎症が生ずると、白血球が血管壁に付着し壁を貫通し、隣接の 組織に炎症を発生せしめる。

更に、正常および病患組繊細胞は、この癒合挙動において異り、分子生化学レベ ルにおいては、（単科抗体を含め）抗原−抗体反応における結合作用は、特に研 究並びに免疫や免疫反応の理解の上で興味深い対象となっている。

旦＝工１１じ五野 表面に対する細胞の付着は熱交換器、冷却塔その他のプロセス設備並びにパイプ 管路における汚染と言う費用の掛かる産業上の問題を生ぜしめ、特に、パイプ管 路においては、生物層に起因して摩擦が高くなるためにパイプの流量容積が減少 する。醸造装置および生物化学反応装置においては、壁における生物層の成長で 清浄上の問題並びにその他の問題を生ぜしめ、他方、プローブやセンサが被覆さ れた場合にはシステムの制御が複雑になったり故障する。

逆に、表面付着は、反応装置における細胞の固定方法として用いられる。その最 も良く知られている例が、廃水処理で用いられる摘出ろ過器である。また、生物 細胞の表面上への固定は、ワクチンの製造等において実用化段階に入っている。

予想されるところであるが、細胞、分子および原質間における相互作用の遍在は 、見掛は上非常に異っている状況間に共通の原因が存在することを意味する。一 般に、一時的な付着は物理化学的プロセスであり、それに続いて二次的な生物学 的安定化が生起する。しかしながら、この基本的メカニズムは、非常に特殊化さ れた接着もしくは癒合認識メカニズムより捕捉して個々の状況に対し非常に特殊 化することができる。与えられた問題を解決する特殊なキーは有効な類推である 。

良−來一茨−ｌ 細胞癒合もしくは着生を測定するための方法は、１９８０年Ｅｌｌｉｓ　Ｈｏｒ ｗｏｏｄ社にょ゛り発行されたＢｅｒｋｅｌｅｙ他編集のｒＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　５ｕｒｆａｃｅｓＪのＨｏＷ、Ｆｏｗｌｅｒ　および Ａ、Ｊ、ＭａｃＫａｙの論文に報告されている。この論文に記載されている全て の方法には一般的方法として限界があり、どの方法も広い用途に適用することは できず、特定の状況にしか適していないと言う性質のものである。異った系間に は共通の基礎が存在する筈であるから、普遍的な適用が可能な方法が望ましい。

Ｌ、Ｈ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌｉｍｌｔｅｄ社で製作され供給されてい るり、Ｈ，Ｆｏｗｌｅｒ細胞癒合測定モジュールにおいては、放射状流れ室が使 用されている。この装置によれば、上に述べたような制限の内の幾つかのものは 克服されるが、全ての状況、特に（微生物と比較して成長が遅い）成熟細胞の研 究および極く僅かな原料しか通常入手できない医学的研究においては理想的な装 置ではない。

日　の 本発明の１つの様相によれば、原質に対する細胞の着生を測定する方法において 、 （１）原質に対する着生を測定すべき細胞の懸濁物を含む流体を、少なくとも内 壁表面の一部が前記原質から形成されるかまたは該原質で被覆されている測定室 の入口から出口に向い通流する間、第１の速度から第２の速度に加速し、 （２）測定室に向う流速（前記第１の速度）を測定し、（３）前記測定室におけ る前記表面上に細胞が沈着している距離を測定室内の成る固定の点から測定室の 出口に向う方向に測定し、該測定距離もしくは長さを原質に対する細胞の着生の 尺度とする段階を含む方法が提案される。

本発明の他の様相によれば、原質に対するセルの着生度を測定するための装置に おいて、 （１）入口および出口と、流体が通流する際に該流体を加速するように適応され た内部断面を有する測定室と、（２）癒合を測定すべき細胞を懸濁状態で保有す る流体を、測定室を含む閉回路を等して循環せしめるためのポンプ手段と、 （３）前記室内への流体の流速を監視するための流体の流速測定手段とを備え、 前記測定室の内壁面の少なくとも一部分を前記原質から形成するかまたは該原質 で被覆する装置が提案される。

所与の流速に対し、細胞の癒合（着生）もしくは係数は、流体の通過中内壁を形 成する試験材料または内壁に被覆された試験材料に細胞が付着する距離（室内の 成る固定点から出口に向って測定した距離）に比例する。

本発明の別の様相によれば、原質に対する細胞の着生を測定する方法において、 （１）流体を、少なくとも内壁表面の一部が上記原質から形成されるかまたは該 原質で被覆されている測定室の入口から出口に向い通流する間第１の速度から第 ２の速度に加速し、 （２）測定室に向う流速（前記第１の速度）を測定し、（３）或時間経過後、流 体の通過後測定室内の上記表面上に細胞が残存している距離を測定室における固 定の点から測定室の出口に向う方向に測定し、この測定距離を原質に対する細胞 の着生の尺度とする段階を含む方法が提案される。

本発明の更に他の様相によれば、　所与に物質に対するセルの着生度を測定する ための装置において、（１）入口および出口と、流体が通流する際に該流体を加 速するように適応された内部断面を有する測定室と、（２）癒合を測定すべき細 胞を懸濁状態で保有する流体を、測定室を含む閉回路を通して循環せしめるため のポンプ手段と、 （３）上記室内への流体の流速を監視するための流体流速測定手段とを備え、 上記測定室の内壁面の少なくとも一部分は上記原質から形成されるかまたは該原 質で被覆されたいる装置が提案される。

所与の流量にたいし細胞の癒合度もしくは係数は、流体が通過した後に内壁表面 上に細胞が存在する距離（室内の固定点から出口に向って計った距離）に比例す る。

上記閉回路に細胞または液体を導入するための入口手段を設けるのが有利である 。

また、閉回路の内容を排出することができる排出手段を設けるのが好ましい。

測定室は矩形の断面を有し、室の対向する対をなす平行な内面の一方または両方 を試験細胞の癒合を測定すべき物質から形成するかまたは該物質で被覆し、そし て細胞の層を、流体の流れを誘起する前に該表面に塗布するか、或いは上述のよ うに、細胞の懸濁物を含む液体を室を介してポンプ送りするのが有利である。

対向する平行な内面の対の内の一方の対をなす面は、１ｍｍないし２ｍｍ台のギ ャップで離間するのが好ましい。

室の断面の幅が、２０ｍｍＸ　１ｍｍ台のスリットから３ｍｍＸ１ｍｍ台の出口 スリットに減少するように室の側壁が出口に向い収斂しするようにするのが好ま しい。

測定室に対する供給部自体がスリット状の通路を有し、該通路の断面形状は流体 バイブ接続部から測定室へのスリット状の入口に向い変化するが、面積は一定に 留まり、それにより、液体が供給パイプから測定室入口に通流する間流れパター ンに変化が生じても液体の速度に増加が生じないようにするのが好ましい。

本発明を具現する装置は、比較的小さい容積の液体での使用に容易に適応され、 従って、細胞標本の利用可能な容積が非常に小さい場合が多い医療およびその他 の分野で使用することが可能である。

測定室の１つまたは複数の平行な壁は、必要に応じ予め調整しておくことができ る顕微鏡用スライドの形態にするのが便利である。

測定室は、滅菌の必要性を回避するために滅菌された使い捨て可能なユニットと して供給することができよう。

測定室の平行な壁の表面（単数または複数）を細胞が覆っている範囲もしくは程 度の検査は視覚的に行って、事後分析の目的で記録を行うこともできるし或いは また撮像技術を利用して検査し、その場合、室壁を撮像して、それにより得られ た像を、コンピュータで制御することができる画像分析装置および／またはコン ピュータを備えている画像分析を用いて分析し、分析の結果を観察のために表示 して観察者が記録できるようにし且っ／または分析装置と関連して、設けられて いるメモリに記憶することができる。

以上に述べた測定装置が依拠する原理は、細胞懸濁液を表面上で加速する（また は液体を表面上の細胞層上で加速する）に伴ない、最終的に、表面剪断応力が、 懸濁液中の細胞が表面に着生するのを阻止する（または表面に付着している細胞 を剥す）ような値に達する臨界速度が達成されるという点にある。

従って、細胞を懸濁状態で含んでいる液体を、上記臨界速度よりも低い速度から 該臨界速度を越える速度に加速するとすれば、成る期間後には、細胞は、懸濁液 が臨界速度を越えないそれよりも低い速度で通流した表面の部分に着生もしくは 付着していることが発見されるであろう。

同様にして、液体を、上記表面に既に着生している細胞の層と接触させながら低 い速度から高い速度に加速した場合には、液体が、臨界速度よりも高い速度で流 れる表面の部分からは細胞が剥離され、そして液体が臨界速度よりも低い速度で 流れる表面部分からは細胞は剥離されないことが発見されるであろう。

初期速度および加速度を一定にすると細胞が付着している（または着生した状態 に留まっている）表面の長さは、細胞と表面との間の癒合結合の強さに依存して 変るであろう。従って、例えば、該表面を、該表面に対する細胞の着生もしくは 付着を、流体が室を流れた後に細胞が存在する測定室の長さを直接観察すること により或いは自動的に分析することにより測定できるように目盛付けしておくこ とが可能である。

室の１つまたは複数の内部表面を、液体を室に流して細胞を剥離する試験を行う 前に、該細胞の層で被覆する場合には、単に、細胞を懸濁状態で含んでいる第１ の液体を室内に導入するだけで良く、その場合には細胞は、室の内部表面（単数 または複数）上に薄い層として付着される。このようにして、充分な細胞を沈着 したならば、室を、ゆっくりと流れる水で洗浄して、懸濁状態で細胞を含有して いる第１の液体の全ての痕跡を除去し、しかる後に洗浄または他の特定の目的に 用いられる液体の高速度の流れを利用して本来の試験を実施することができる。

（細胞を含有している）第１の液体は、皮下型のシリンジを用いて室内に、導入 し、懸濁液を室の入口または出口に注入することができる。該室は、そこで所望 により密封し、軽く攪拌するか或いは遠心分離するかあるいは単に成る時間放置 し、細胞が室の内壁を被覆するようにする。

室をそのまま放置し、室への流体接続に対する干渉を最小限にしつつ細胞を沈着 するのが好ましい場合には、細胞懸濁液を、典型的に緩衝液で充填されている閉 ループ内に注入できるように、室内かまたは室に通じる接続部に側部部分を設け て、細胞を懸濁状態で含有している緩衝溶液を、表面が完全に被覆されるまで緩 やかに循環させることにより細胞を沈着することができる。しかる後に、室を通 る緩衝液の流速を高めて試験を行うか或いは緩衝液を排出し、その代りに試験中 に用いるべき液体と交換するかは簡単な問題である。

図面の簡単な説明 以下、単なる例として、本発明を、添付図面を参照し説明する。図面中、 第１図は、本発明を具現した装置の簡略図、第２図は、測定室の平面図、 第３図は、第２図の線ＩＩＩ−ＩＩＩにおける断面図、第４図は、第２図の線Ｉ Ｖ−ＩＶにおける断面図、第５図は、第２図の線Ｖ−■における断面図、第６図 は、測定室の壁の一部分が取り外し可能な変形装置の側面図であり、測定室の壁 の一部分を取り外した状態で示す図、 第７図は、取り外し可能な壁部分のよびカバー板な取り外して第６図の装置を示 す平面図、 第８図は、第７図の線ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩにおける断面図、第９図は、第７図の 線ＩＸ−ＩＸおける断面図、第１０図は、第６図の線ｘ−ｘにおける組立てられ たユニットの断面図、 第１１図ないし第１４図は、本発明の方法において用いられる測定室の構造の他 の形態を示す第７図ないし第１０図に類似の図、 第１５図ないし第１８図は、本発明の方法において用いられる測定室の構造の他 の形態を示す第７図ないし第１０図に類似の図、 第１９図は、第１５図ないし第１８図に示した測定室の変形例を示す断面図、 第２０図は、以上の図面に示した測定室であって、カバーが容易に装着または取 り外しすることができる測定室を斜視図で示す図、 第２１図は、自動観察および分析のために、以上の図に示されている測定室を受 けるように適応された卓上ユニットの斜視図、そして 第２２図は、試験後残留している細胞を表わす出力信号を発生する装置の簡略回 路図である。

の　：　細　な　８　８ 第１図に示しであるよう、ハウジング１１内の流量測定室１０は、容器１２、ポ ンプ１４および流量計１６を備えている配管系（図示せず）により閉じたループ の形態で接続されている。タップ１８により系から流体を排出し洗浄することが でき、そして漏斗２０および制御弁２２（または類似の装置）の形態にある入口 が、液体を回路内に導入するために設けられている。測定室１ｏは平面で見た場 合に大口台形をしており、そして側部から見た場合には狭いスリットの形態にあ る。このことは第２図および第３図を比較することにより最も良く理解されよう 。

測定室の上下の内側表面２４およに２６には、成る種の細胞に就いての癒合もし くわ着生すべき試験材料または原質が被覆されているかまたはこのような原質か ら形成されている。これら２つの表面間における流れは、はぼ矩形の流れ断面を 有し、全ての壁が測定室１ｏの入口スリットに向って発散している導入部３０を 設けることにより均等になるように構成されており、該導入部３ｏにおいては、 断面積は、入口接続部３６から、測定室１０の入口を画定する稜部３８に向って 実質的に一定である。

ポンプおよび流量計からの配管を接続することができる入口接続部３６は、典型 例において、５ｍｍの内径を有している。約４０ｍｍの距離に沿って、円形の入 口３６は、約２０ｍｍＸ１ｍｍの矩形断面のスリットに形を変えており、そして 、５ｍｍ径の入口バイブの面積および２０ｍｍＸ１ｍｍのスリットの面積は近似 的に同じであるので、流体は、部分３０の出口または入口において同じ速度を有 することになる。

測定室１０内における面２４および２６間の間隔は１ｍｍであり、幅は、稜線部 ３８（入口部）における２０ｍｍから出口における３ｍｍへと先細になっている 。この先細り部のテーパは一様であって、先細り部もしくはテーパ部は、稜線部 ３８から３ｍｍＸ　１ｍｍの最小矩形断面部まで約７６ｍｍの距離に亙って延在 している。

出口接続部４０は、測定室１０の端部における３ｍｍＸ１ｍｍの断面から、流体 を容器１２およびポンプ１４に搬送するための配管系（図示せず）に対する接続 スリーブ４０における２ｍｍの内径を有する通路へと形状が変化する内部通路を 有している。

測定室１０の断面が上記のように収斂し減少することにより、該室１０を流れる 構体は、該室を通流する間に速度が増大し、表面剪断力を増加する。液体が、懸 濁状態で細胞を保有している場合には、該細胞は、流速が、表面剪断力が過度に 大きく付着を生ぜしめないような臨界速度より低い個所で、参照数字２４または ２６で示すように表面に沈着し付着する。

細胞が、参照数字２４または２６で示すような表面上の最初の領域に付着してお って、液体が次いで室を通流する場合には、細胞は、流速が上記臨界速度よりも 小さい何れかの表面の領域にのみ留まることができる。

従って、稜線部３８から出口４０の方向において、細胞が付着している（または 表面２６或いは２４に着生した状態に留まっている）距離を測定することにより 、細胞と表面物質との間における癒合結合の尺度が得られる。

容器１２は、室１０内の摩擦に起因し、ポンプ１４が空になるのを阻止するため に流量を平滑化する働きをなす。

流量計１６は、装置の入口端部３６内への液体の流量を正確に測定し、そして典 型例においては、ポンプ出力は、一定の流量が維持されるように調整可能である 。

ハウジングを通る通路の断面を示す第３図と第２図とを比較することにより、装 置を通る通路の断面形状が入口３６から出口４０に向いどのように変化している かが理解されるであろう。

ハウジング１１は、ガラスまたは金属またはプラスチック材料或いはそれらの任 意の組み合わせから形成することができる。しかしながら、装置は、射出成形さ れたプラスチック材料から形成するのが好ましく、最も便利な方法としては、２ つの二分体に成形して然る後に結合し最終製品を形成する。

上側または下側（または両方）の壁４２．４４の少なくとも一部分を透明の材料 から形成すかまたはこれ等壁の少なくとも一方に窓を設けることにより、細胞の 沈着（または着生）の程度の測定を直接的な観察により行うこともできるし、ま たは窓（単数または複数）を介して見ることができる像を発生して、像分析コン ピュータ等（図示せず）を用いて像を分析することができる。

第４図および第５図は、装置を通る通路の種々な部分の断面形状を更に詳細に図 解する図であって、第４図には、測定室の側壁４６および４８が、ｌｍｍＸ３ｍ ｍの寸法を有する矩形の出口スリット５０に向いどのように収斂しているかが示 しである。さらに、この断面図から、矩形の出口スリット５０が約２ｍｍの直径 を有する円形の出口通路５２に移行する様子が明らかである。

第５図の断面図には、部分３０における先導部の収斂する側壁５４および５６が 示してあり、そして部分的に、入口接続部３６を通る５ｍｍの内径を有する入口 通路５８が詳細に示しである。

測定室１０内の試験表面２４または２６の少なくとも１つは、標準の３″×１″ の顕微鏡用スライドを具備するのが好ましい。このようにすれば、光学的に平坦 な表面が容易に利用可能となるばかりではなく、標準の培養および保管システム に適合する。第６図に示しである本発明の実施例は、顕微鏡用スライドで測定室 の壁のうちの１つを形成できるようにした既述の装置の変形例である。

第６図を参照するに、装置は、第１図ないし第３図に示した装置に類似の本体部 分６０から形成されているが、第６図に点線６２および６４で示すように、顕微 鏡用スライド６６を落し込むことができる凹部と、カバー板７２を装着すること ができる端壁６８および７０を有し凹部上方に位置する段部な有している点で第 １図ないし第３図に示した装置とは異っている。該カバー板は、ビン、リベット またはねじにより適宜に固定され、この目的で、６つの取付は部７４が第７図に 示しである。

第７図は、顕微鏡用スライド６６を装着することができる凹部７６を更に詳細に 示すと共に、カバー板７２が座着する該凹部を取り巻く段部を明瞭に示している 。

凹部７６の詳細は、更に、第８図の断面図と、第９図の断面図並びに第１０図に 示しである。組み立てられた装置の断面図を比較することにより更に明瞭に理解 されよう。

第１１図ないし第１４図は、透明なプラスチック材料から形成されたカバー板８ ０により定位置にガラス製顕微鏡スライド７８が保持されている室を示す、なお 、カバー板７０には、スライドを定位値に保持するためには、浅い段状部分８１ が形成されている。この段状部８１の深さは、スライドの厚さに丁度等しく、そ れにより、これらを組み合わせた場合、下側面は平滑で扁平となり、基台８ｏの ２つの平行な側部隆起部８２．８４上に載置することができる。スライド７８並 びにカバー板８０の下側面の段状部分８１の幅はカバー板の幅よりも小さく、そ してカバー板の周辺領域も基部８６に形成されている周辺棚部８０内に嵌着する 薄肉の外側フランジ８８を形成するように段状になっている。

カバーの段部と基部の周辺棚部９０との間に、例えば接着性の密封材からなる層 によりスライド７８を密封しカバー８０を定位置に固定することができる。別の 例として、両側に接着材が塗布しであるテープを段部と周辺棚部９０との間に嵌 着することが可能である。

第１５図ないし第１８図には、長いガラス製スライド９２が用いられている別の 設計例が示しである。このスライド９２の長さは、室の収斂領域および発散領域 双方を包摂するのに充分な長さであり、それにより、第１１図ないし第１４図に 示したようにカバー板９４の下側面に段部を形成する必要はなくなる。他の全て の点に関しては、この設計例は、第１１図ないし第１４図に示したものに類似で あり、同じ参照数字が用いであるので、これら他の要素に関しては第１１図ない し第１４図と関連しての説明を参照されたい。

細胞着生範囲の推定が要求される場合には、スライド９２を、例えば下から照明 して上から観察することができる。このし察を容易にするために、第１９図に示 しであるように基部の下側面に成形によるなどして一連の円筒状集光レンズ９６ を形成し、他方、カバー板９４の上面に成形によるなどして対応の円筒状レンズ 配列９８を形成することができよう。

この技術は、第７図ないし第１８図に示した構造のいずれにも適用することがで きる。

カバー板９４を、保護衣服を着用している取扱者或いは暗闇の中でも装着できる ようにするために、取り扱いを容易にするべく、上部周辺領域（第１１図ないし 第１４図に８８で示す）を基部８６の縁部な越えて拡張するのが有利である。こ の目的で、カバー板には第２０図に示すように、過大寸法の唇部１００を形成す ることができる。

過大寸法のカバー板は第１１図ないし第１４図および第１５図ないし第１８図に 示しである構造の何れにも取付けることができる。第７図ないし第１０図に示し た構造においてもこの特徴が要求される場合には、それには、カバー板７２の幅 を単に図示の幅を越えて増加するだけでよい。

自動検査および分析を行う場合には、試験室は、ヒンジ連結された蓋１０６を有 する検査装置の基部１０４に形成されている凹部１０２に適宜支持する。凹部１ ０２の対向端に設けられているスロット１０８．１１０により、第１１図ないし 第１８図に参照数字１１２．１１４で示すような入口および出口バイブ接続部を 基部の外部に伸張させて、撓み性のパイプ（図示せず）に接続し、流体回路を完 結することができる。ばね荷重されているジョー１１６．１１８および１２０お よび１２２は、接続部１１２．１１４を掴み、基部およびカバー板の測定室アッ センブリを定位置に保持する働きをなす。

凹部１０２の基底部は、参照数字１２４で示すような複数個のウィンドウもしく は窓１２４を備えており、これら窓を介し、下方に配設されている電球或いは発 光ダイオード１２５からの光が透過することができる。

蓋１０６の下側面にも同様に、対応数の窓１２６が形成されており、これら窓を 介して、測定室の照明された領域な各窓の背側から光検知装置１２７により観察 することができる。

基部には電源手段１２９が配設されておって、電流を、窓１２４の下方に位置す る光源並びに窓１２６の後ろ側に設けられている光センサに供給すると共に、セ ンサからの出力に応答して、それぞれの光源１２５からの光出力を受けるセンサ １２７の数に比例するパラメータ（例えば電圧あるいは電流）を有する電気信号 を発生する回路手段（第２４図参照）に供給する。細胞の層が、センサ１２７か らの出力信号レベルを制限するのに充分な程度に光の通過を遮断するように配設 することにより、上記パラメータの大きさを、（試験の開始時におけるスライド 状の細胞の層により）全ての光路が遮断されている試験の開始時或いは（試験中 細胞が付着することにより光路が遮断される）時点並びに（スライドの成る長さ 部分に沿ってだけ細胞が付着する）試験の経時に測定することができる。２つの 測定されたパラメータ値間の差は、試験の内容に依存し、細胞が除去された（或 いは細胞が着生しなかった）スライドの長さの尺度となる。

各センサからの出力は、例えばセンサ出力な差動増幅器１３３で基準１３１と比 較して基準が越えられた場合には第１の信号状態を発生し、出力信号が基準に達 成しなかった場合には、第２の出力信号状態を発生することによる等して、他の のセンサ出力と結合する前に２値形態に変換するのが好ましい。

全ての差動増幅器１３３．１３３′等々の出力を加算抵抗器１３５．１３５′等 々を介して共通点に接続し、出力電流が、（細胞が存在しないために）充分に照 明されるセンサ１２７．１２７′等の数に比例するようにして、基準電圧Ｖｒｅ ｆ　（１３１）を越える出力電圧を発生し、それにより、関連の増幅器１３３． １３３′等を導通に切換えるようにすることができる。

装置は、出力信号Ｖｏｕｔの値をディジタル的に（または可動線輪メータを用い アナログ様式で）表示するための表示装置１３７を備えることができる。

参照数字１３９で示すような追加の光源を１４１で示すように下方および／また は上方に設けて、その場で測定室を照明したり、可視光或いは赤外線或いは紫外 線を発生することができる。このような照明を制御し選択するためにスイッチ１ ４３が設けられている。

蓋が閉じられた場合には、蓋は光が検査装置のハウジング内に入るのを阻止する ようにするのが好ましい。

検査装置のハウジング内部を温度制御し、この目的で加熱あるいは冷却要素１４ ５またはその両者を設けて、少なくとも試験期間中装置の内部環境を制御できる ようにすることができる。スイッチ１４７は加熱または冷却装置１４５を制御す る。

光としては、紫外線および赤外線並びに可視スペクトル放射が含まれる。

紫外線または赤外線放射或いは可視光の細胞着生に対する影響もしくは効果を評 価できるようにすることが望ましい場合には、試験中室を照射するための適当な 光源（例えば１３９．１４１）を選択することができる。

■ 試験の示すところによれば、微生物細胞の場合には、付着力および分離力は実質 的に同じであることが判明した。しかしながら、動物の細胞の場合には、これら 力は数桁も異り得る。動物の細胞の着生もしくは癒合はまたｐＨ並びに源生体お よび血清の濃度により相当の影響を受け得る。

Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＳｔｏｋｅＰｏｇｅＳ所在のＬＨＥｎｇｉｎ ｅｄｒｉｎｇＣｏ、Ｌｔｄ、社から入手可能なｒＬＨＦｏｗｌｅｒＣｅｌｌ　Ａ ｄｈｅｓｉｏｎ　ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＭｏｄｕｌｅ」のような接合のもしく は癒合測定のための初期の装置を参考にした。この初期の装置においては、細胞 の懸濁液を中心部の扁平で円形の室内に入れて半径方向に分布させた。細胞の沈 積は、中心からの距離で液体の速度の減少するに伴ない生起する。本発明の目的 の１つは、このような測定を行うのに必要とされる液体の容積を減少することで あった。−見したところでは、半径方向流動系における液体の容積を減少゛する １つの方法は、円形室の１０％または１５％を表わす扇形部を形成し、このよう にして得られた発散状の通路において減少する剪断力の範囲をめることにあると 思われた。

しかしながら、理論モデルを用いての実験から、このことは不可能であることが 発見された。流体力学的理論によれば、発散状の通路においては境界層分離が生 じ、実際、細胞測定装置と関連して関心のある領域であるこのような通路の壁の 近接する個所で流れの方向が完全に逆転し得るのである。ところが、収斂状の通 路においてはこうような分離は生ぜず、この通路においては流れは安定に留まっ ていることが発見された。実際、層流擾乱として知られてえいる現象は観察され なかった。即ち、収斂状の通路に対する入口部で成る程度の擾乱のもしくは乱流 があっても、迅速に層流が形成されて、乱流が予想されるレイノルド数を示す速 度においてさえ（通路パラメータが適正であれば）層流が維持される。

従って、本発明を具現する装置においては、室の入口において最も小さい剪断力 が期待され、この剪断力は室を経て出口に向い増加するが、他方、放射状の室の 場合には事情が逆になる。

収斂状の通路における再成層化と関連する流体力学的利点を度外視しても、生物 学的利点が得られる。上に述べたＲＨＦｏｗｒｅｒ装置のような放射状室を使用 し細胞の癒合層を用いての数多の実験で、入口部近傍の高い剪断力で細胞層の縁 が持ちあげられて、大面積細胞は１つの片として離れてしまうことが観察された 。これに対し、収斂状の通路においてはこのような現象は観察されず、この収斂 状の通路と放射状に発散する通路との比較から、収斂状の通路の方が、分離が生 ずる前に高い臨界剪断力を有することが示された。

滅菌および無菌動作が重要な考察因子である場合には磁気駆動型のポンプが有利 である。しかしながら、系からの空気の除去に問題があり、別法として螺動ポン プを使用することができよう。

収斂状測定室は圧力降下を増加する絞り作用を与え、ポンプにより発生される脈 動を減少する。こにょうな作用は、図面に示した実施例における容器のような変 動減衰装置を用いることのより除去するこができる。

丸墓監皇ＬＩＩ 子供のハムスターの腎細胞（Ｆｒｏｗ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ社 から入手可能なりＨＫ２　Ｉ　Ｃ−１３）を用いての実験に限定した。これら細 胞は、固定依存性を有することが知られており、実験結果を、初期の細胞癒合測 定装置を用いて得られる類似の結果との比較を可能にする。

上のような実験の目的から、図面中第６図ないし第１Ｏ図に示した装置に類似の 装置を使用し、何れの場合にも、ガラス製の顕微鏡スライドに細胞を被覆して、 分離過程後に取り出し、残存している細胞を固定してＣｏ。

ｍ　ａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ青を用いて染色し、顕微鏡で検査して、臨界長をめた。

このような装置で得られた典型的な結果は表１に掲げられている。この表におい て、全ての試験は２１’Ｃで２０分間室に媒質を通流させて実施した。

臨界剪断力に関しこの表における値を比較すれば、プロタイプ（ｐｒｏｔｙｐｅ ）展開段階において許容し得る一貫性が見られる。さらに直接的比較が可能な放 射状流れ測定装置を用いての初期の作業から得られた結果との良好な一致が得ら れた。この場合、本発明を具現した装置を用いて測定した臨界剪断力は、放射状 流動系で得られた結果と比較して若干高いように考えられる。この理由は、２つ の系における流れの方向が反対であることによるものと考えられる。従って、初 期の放射状装置においては、剪断力は最初高くそれから減少するが、本発明の装 置の場合には逆である。従って、放射状流動系においては、癒合層の縁が持ち上 げられて直接得られる値よりも小さい値で引き離されてしまう。細胞が癒合して おらず、個々の細胞が分離している事例においては、良好な一致が見られる。

細胞の癒合の影響は、スライド上で細胞を成長させたり該スライドに細胞を着生 する厳密に定義された予備試験手続を設定する必要があることを物語っている。

従つて細胞の年令並びに接種段階が重要な影響を有し得る。

例えば、一貫性のある結果を得るためには、細胞沈着が進行するベトリ皿におい て同じ深さの液体を使用することが重要である。

また、１つの使用媒質（液体）を他の媒質と交換した場合には得られる結果に顕 著な影響があることも判る。

例えば、培養質の代りに食塩水溶液を使用した場合には臨界剪断力は半分になっ た。このことは、実験７／２７５および９／２７５の結果を比較することにより 理解できよう。

ミ　卿　− 国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｔＦＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣ！（Ｒ ＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．原質に対する細胞の着生を測定する方法において、（１）原質に対する着生 を測定すべき細胞の懸濁物を含む流体を、少なくとも内壁表面の一部が前記原質 から形成されるかまたは該原質で被覆されている測定室の入口から出口に向い通 流する間、第１の速度から第２の速度に加速し、 （２）測定室に向う流速（前記第１の速度）を測定し、前記測定室における前記 表面上に細胞が沈着している距離を測定室内の固定の点から測定室の出口に向う 方向に測定し、該測定距離もしくは長さを原質に対する細胞の着生の尺度とする 段階を含む方法。 ２．原質に対する細胞の着生を測定する方法において、（１）流体を、少なくと も内壁表面の一部が前記原質から形成されるかまたは該原質で被覆されている測 定室の入口から出口に向い通流する間、第１の速度から第２の速度に加速し、 （２）測定室に向う流速（前記第１の速度）を測定し、前記測定室における前記 表面上に細胞が沈着している距離を測定室内の固定の点から測定室の出口に向う 方向に測定し、該測定距離もしくは長さを原質に対する細胞の着生の尺度とする 段階を含む方法。 （３）或る時間経過後、流体の通過後の測定室内の前記表面上に細胞が残存して いる距離を測定室における固定の点から測定室の出口に向う方向に測定し、この 測定距離を原質に対する細胞の着生の尺度とする方法。 ３．原質に対するセルの着生度を測定するための装置において、 （１）入口および出口と、流体が通流する際に該流体を加速するように適応され た内部断面を有する測定室と、（２）流体を、測定室を含む閉回路を循環せしめ るためのボンブ手段と、 （３）前記室内への流体の流速を監視するための流体流速測定手段とを備え、 前記測定室の内壁面の少なくとも一部分は前記原質から形成されるかまたは該原 質で被覆されている装置。 ４．前記閉回路内に細胞および／または液体を導入することができる入口手段を 備えている請求の範囲第３項記載の装置。 ５．閉回路の内容物を排出することができる排出手段を備えている請求の範囲第 ３項記載の装置。 ６．測定室が矩形断面を有し、測定室の対向する対をなす平行な内面の一方また は両者が、試験細胞に対する着生を測定すべき材料から形成されるかまたは該材 料で被覆されている請求の範囲第３項記載の装置。 ７．対向する平行な内面の対の内の一方の対の内面が、１ｍｍないし２ｍｍ台の ギャップで離間されている請求の範囲第６項記載の装置。 ８．室の断面の幅が、２０ｍｍ×１ｍｍ台のスリットから３ｍｍ×１ｍｍ台の出 口スリットに減少するように室の側壁が出口に向い収斂している請求の範囲第６ 項記載の装置。 ９．測定室に対する供給部自体がスリット状の通路を有し、該通路の断面形状は 流体バイブ接続部から測定室ヘのスリット状の入口に向い変化するが面積は一定 に留まり、それにより、液体が供給バイブから測定室入口に通流する間流れパタ ーンに変化が生じても液体の速度に増加が生じないようにした請求の範囲第３項 記載の装置。 １０．測定室の１つまたは２つ以上の平行な壁が顕微鏡用スライドの形態にある 請求の範囲第６項記載の装置。 １１．試験後細胞が残存する室の壁を、直接観察により測定が可能なように目盛 付した請求の範囲第６項記載の装置。 １２．測定室の壁にレンズが形成されている請求の範囲第６項記載の装置。 １３．少なくとも試験中測定室を装着することができるハウジングと、室の一側 でハウジング内に配設された１つまたは２つ以上の光源と、室の他側でハウジン グ内に取付けられた１つまたは２つ以上の光検知装置を備え、試験後室壁に対し 細胞が着生している距離の測定を自動的に行うことを可能にした請求の範囲第６ 項記載の装置。 １４．ハウジングが閉じた時の実質的に光を通さない請求の範囲第１３項記載の 装置。 １５．ハウジング内の温度を制御するための手段が設けられている請求の範囲第 １４項記載の装置。