CN117434038A - 一种快速无损测定血小板功能的新方法 - Google Patents

一种快速无损测定血小板功能的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速无损测定血小板功能的新方法，涉及生物技术领域。该方法通过包含一微流控芯片的装置实现，该微流控芯片包括依次连通的入口储液槽、分离区、出口储液槽；分离区具有纵向分布的若干组S形微柱阵列；微柱阵列由若干行微柱行构成；微柱行由多个水平分布的S形微柱组成；S形微柱包括首尾相连的第一竖柱、第一横柱和第二竖柱；微柱阵列的临界截止尺寸为Dc，其由公式Dc＝1.4×G×(tanθ)0.48决定；按照待测样品流动方向，每一组微柱阵列中的Dc值逐渐增大。其可用于快速、灵敏、无损且无标记地测定血小板表观尺寸，在血小板活化相关疾病监测和个体化治疗方面具有潜在的应用前景。

Description

一种快速无损测定血小板功能的新方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种快速无损测定血小板功能的新方法。
背景技术
血小板是小的无核细胞，对血栓形成和止血至关重要。已有研究表明平均血小板体积(MPV)可作为血小板反应性的指标，经常被用于快速诊断疾病、监测疾病严重程度、监测治疗效果以及筛选抗血小板药物。
由于血小板很容易被激活，从而导致血小板形态的定量研究非常困难。相关技术中，光透射聚集法(LTA)一直是诊断血小板疾病的金标准，但其在严重的血小板减少症中很难准确地确定血小板功能；VerifyNow系统、血小板功能分析仪(PFA-100或PFA-200)和系统具有仪器昂贵、耗时、劳动和技术密集的缺点；还有学者提出了一种通过荧光标记血小板，从而测量血小板尺寸的微流体装置，以及进一步利用具有特定通道几何形状的胶原涂层微流控装置检测血小板聚集行为，但是其具有样品前处理复杂，且需要使用昂贵的高速相机的缺点。
因此，需要提供一种能够简便、快速分离血小板，便于分析血小板尺寸和功能的装置。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种微流控芯片，可用于简单、快速、灵敏、无损且无标记地测定血小板表观尺寸(Dapp)，测量血小板尺寸分布的变化，用于血小板功能的评价。
本发明还提供一种血小板功能或尺寸的检测系统。
本发明还提供上述微流控芯片或检测系统在制备血小板功能或尺寸分析检测装置中的应用。
本发明还提供上述微流控芯片或检测系统在检测血小板尺寸或血小板功能评价中的应用。
本发明还提供一种测定血小板功能或尺寸的方法。
根据本发明的第一方面实施例的一种微流控芯片，包括依次连通的入口储液槽、分离区、出口储液槽；
所述分离区具有纵向分布的若干组微柱阵列；所述微柱阵列由若干行微柱行构成；所述微柱行由多个水平分布的S形微柱组成；所述S形微柱包括首尾相连的第一竖柱、第一横柱和第二竖柱；
所述微柱阵列的临界截止尺寸为Dc，其由公式Dc＝1.4×G×(tanθ)0.48决定，G为两个相邻S形微柱之间的间隔，θ为同列两个相邻S形微柱的梯度角度；所述Dc值为2.0μm～4.2μm；
按照待测样品流动方向，所述每一组微柱阵列的Dc值逐渐增大。
根据本发明实施例的微流控芯片，至少具有如下有益效果：
实施例的微流控芯片可用于简单、快速、灵敏、无损且无标记地测定血小板表观尺寸(Dapp)，可通过测量血小板尺寸分布的变化来分析血小板的功能，以用于血小板功能的评价，在血小板活化相关疾病监测和个体化治疗方面具有潜在的应用前景。
相对于已有的C形微柱构成的微柱阵列，实施例的微流控芯片通过采用S形微柱实现了对血小板的分离和灵敏测量。且实施例的微流控芯片与相关技术中结合荧光标记和胶原涂层的微流控装置测得的血小板聚集状态具有非常高的相关性，能够准确检测血小板的激活状态。
该微流控芯片的样品需求量少，检测速度快；只需使用一滴全血(10μL)，在模拟生理条件的剪切速率下，即可以在2分钟内快速无标记地测定全血血小板Dapp，且不会使血小板功能发生改变。该微流控芯片测定的血小板Dapp不仅与凝血酶诱导的血小板聚集和粘附结果高度吻合，而且与抗血小板药物治疗前后心肌缺血大鼠的心肌损伤情况一致，其测得的血小板Dapp可用于评估血小板活化状态，反映体内心肌损伤结果。
根据本发明的一些实施例，所述入口储液槽的数量为多个。所述入口储液槽用于存储待测样品和等渗稀释液。本领域技术人员可以合理调控入口储液槽的数量，以满足实际需求。
根据本发明的一些实施例，所述入口储液槽的数量为三个，包括第一入口储液槽、第二入口储液槽和第三入口储液槽。第一入口储液槽用于存储待测样品；第二入口储液槽和第三入口储液槽位于第一入口储液槽两侧，用于存储等渗稀释液。第二入口储液槽和第三入口储液槽的具体分布情况(左右任一侧)不影响其本身的作用与使用效果。
根据本发明的一些实施例，所述入口储液槽的容积为10μL～30μL。例如：可以为10μL。
根据本发明的一些实施例，所述入口储液槽上具有孔，所述孔的直径为1.5mm～3mm。该孔用于放置待测样品和等渗稀释液，本领域技术人员可以按需进行调整。例如：可以为1.5、2.0或3.0mm。
根据本发明的一些实施例，所述等渗稀释液包括生理盐水、细胞培养基、含血清的细胞培养基中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述等渗稀释液优选含血清的细胞培养基。相比于其他等渗稀释液，含血清的细胞培养基可以更好地减少对红细胞等的影响，提高分离效率。例如：可以为含10％～20％ FBS的细胞培养基；具体可以为含20％ FBS的RPMI-1640培养基。
根据本发明的一些实施例，所述分离区还设置有子通道。所述子通道可用于连通入口储液槽与所述分离区，或连通相邻微柱阵列，或连通所述分离区与所述出口储液槽。
根据本发明的一些实施例，所述子通道用于连通入口储液槽与所述分离区，所述子通道由下邻所述微柱阵列的左右相邻S形微柱之间形成的通道向竖直方向延伸形成。所述子通道的长度为50μm～100μm。
根据本发明的一些实施例，所述子通道用于连通相邻微柱阵列，所述子通道由上邻所述微柱阵列的左右相邻S形微柱之间形成的通道向竖直方向延伸形成。所述子通道的长度为50μm～100μm。
根据本发明的一些实施例，所述子通道用于连通所述分离区与所述出口储液槽，所述子通道由上邻所述微柱阵列的左右相邻S形微柱之间形成的通道向竖直方向延伸形成。所述子通道的长度为300μm～500μm。
子通道可以用于区分出不同Dc值的分段，也可以用于分析分离过程中以及分离后，细胞的分布情况。由此，能够更准确有效地分析血小板的尺寸。子通道过长会导致整个通道长度增加，可能影响回抽力，从而干扰血小板的分离。
根据本发明的一些实施例，所述梯度角度为同列相邻S形微柱的第二竖柱的底端连线与竖直方向的夹角。
根据本发明的一些实施例，所述S形微柱的尺寸具体可以为：第一竖柱长7.5μm，第一横柱长15μm，第二竖柱长7.5μm。
根据本发明的一些实施例，所述Dc值为2.0μm～4.0μm。由此，能够很好地分离红细胞、血小板和白细胞；如果Dc值小于该范围，所有细胞都会偏移至最右边的位置，各细胞无法有效分离。
根据本发明的一些实施例，所述每一微柱阵列的长度为360μm～1460μm。
根据本发明的一些实施例，所述微柱阵列的组数为15～30。例如：可以为21组。
根据本发明的一些实施例，所述微柱阵列的同一列中，S形微柱相较于上方S形微柱在水平方向上向右偏移预设距离。所述预设距离由θ和G决定。
根据本发明的一些实施例，所述出口储液槽上具有孔，所述孔的直径为1.5mm～3mm。该孔用于连接流体驱动装置，本领域技术人员可以按需进行调整孔的直径。例如：可以为1.0、1.5或2.0mm。
可以理解的是，本领域技术人员可以合理调控出口储液槽的数量，以满足实际需求。例如：所述出口储液槽的数量可以为一个。
根据本发明的第二方面实施例的一种血小板功能或尺寸的检测系统，包括上述微流控芯片、流体驱动装置和成像装置。由于检测系统采用了上述实施例的微流控芯片的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的一些实施例，所述流体驱动装置包括微流体注射泵和注射器。所述流体驱动装置用于驱动待测样品流经所述微流控芯片。
根据本发明的一些实施例，所述成像装置包括显微镜、电荷耦合器件(CCD)、相机或其任何组合。例如：所述成像装置可以为带有CCD相机的基本显微镜。
根据本发明的第三方面实施例的上述微流控芯片或检测系统在制备血小板功能或尺寸分析检测装置中的应用。
根据本发明的第四方面实施例的上述微流控芯片或检测系统在检测血小板尺寸或血小板功能评价中的应用。
根据本发明的第五方面实施例的一种快速无损测定血小板功能或尺寸的方法，采用上述微流控芯片或检测系统对待测样品中的血小板进行检测，包括以下步骤：
使所述待测样品流经所述微流控芯片的分离区；
获取分离区出口的细胞图像，并分析血小板的功能或尺寸。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。
根据本发明的一些实施例，所述待测样品包括A1)至A4)中的任一种；
A1)含血小板的样品原液；
A2)所述样品原液的稀释液。
根据本发明的一些实施例，A2)中所述稀释液由所述样品原液和等渗稀释液混合得到。所述样品原液和等渗稀释液的体积比为3～5：1。例如：可以为4：1。
根据本发明的一些实施例，所述方法具体包括如下步骤：
所述待测样品从所述入口储液槽流入所述分离区，经所述分离区的所述微柱阵列分选，所述待测样品中的血小板与其他细胞分离，由所述分离区的出口流入出口储液槽；
获取分离区出口的细胞图像，并分析血小板的功能或尺寸。
含血小板的待测样品流经分离区后，在装置中产生尺寸分布光谱，可以在明场显微镜下使用CCD相机测量。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包括：使所述待测样品和等渗稀释液流经所述微流控芯片的分离区。
根据本发明的一些实施例，所述待测样品与所述等渗稀释液的体积比为1：2～3。
根据本发明的一些实施例，所述分析血小板的尺寸具体包括：根据血小板Dapp评估血小板尺寸。
根据本发明的一些实施例，所述分析血小板的功能具体包括：根据血小板尺寸评价功能。
根据本发明的一些实施例，所述待测样品流经所述微流控芯片的速度为0.1μL/min～0.3μL/min。例如：可以为0.2μL/min。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是实施例1的微流控芯片的结构示意图；其中，A为微流控芯片的总体结构示意图，B为入口储液槽的结构示意图，C为微柱阵列的结构示意图；
图2是本发明微流控芯片的使用流程图(A)和机理图(B)；
图3是S形微柱阵列的模拟流体流动流线结果；
图4为在相同流速下不同尺寸的聚苯乙烯微球在实施例1的微流控芯片中的分布结果；
图5为流经实施例1的微流控芯片前后的血小板膜表面的CD62p含量变化；
图6为实施例1的微流控芯片对活化前后血小板血浆的分析结果；其中，A为分离区的输出区域的分布照片，B为血小板Dapp分布直方图；
图7为实施例1(A)和对比例1(B)的微流控芯片对全血样本的分析结果；
图8为实施例1(A)的微流控芯片对活化前后全血样本的分析结果；其中，A为血小板Dapp分布图，B为不同血小板Dapp范围内的血小板统计百分比；
图9为胶原蛋白功能化直通道芯片结构示意图；
图10胶原蛋白功能化直通道芯片对血小板聚集情况的检测结果；其中，A为血小板聚集物的荧光表达代表图，红色荧光信号代表对照组和凝血酶激活组的血小板聚集状态，B为平均血小板荧光强度直方图(n＝3)，***表示有极显著性差异(P<0.001)；
图11为实施例1的微流控芯片对不同处理组小鼠全血样本的分析结果；其中，A为不同处理组的血小板Dapp分布图，B为不同处理组的平均血小板Dapp，C为不同处理组的不同血小板Dapp范围内的血小板统计百分比；其中，*表示有显著性差异(P<0.05)，**表示有极显著性差异(P<0.01)，***表示有极显著性差异(P<0.001)；
图12为不同处理组中血小板Dapp与心肌损伤程度的关联；其中，A为血小板Dapp分布的直方图，B为代表性心电图，C为心脏组织切片的Masson三色染色代表性照片(放大倍率为10×，蓝色区域的面积代表纤维化程度)，D为心脏组织标本的HE染色代表性照片(放大倍率为20×)；
图13为不同处理组小鼠的中心肌损伤程度；其中，A为心电图的直方图，B为胶原容积分数(CVF)的直方图，****表示有极显著性差异(P<0.0001)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二、第三等只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
在本发明的描述中，“上下”，“左右”，“水平”、“竖直”均是基于微流控芯片的入口端和出口端的位置决定的，“上下”的定义为：以入口端为上，以出口端为下；“左右”的定义为：以“上下”的判断标准为基础，正视条件下的左右即为本发明实施例的“左右”。
本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的限定，设置、连接、连通等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
若无特殊说明，本发明中“室温”表示允许25℃±5℃。
实施例1
本实施例提供一种微流控芯片，结构如图1所示。该微流控芯片由依次连通的入口储液槽、分离区、出口储液槽组成；
入口储液槽的数量为3个，每个入口储液槽均具有2.0mm的孔，容积20μL；其中，中间的第一入口储液槽用于储存待测样品，两侧的第二入口储液槽和第三入口储液槽用于储存含20％FBS的RPMI-1640培养基；
分离区具有纵向分布的21组微柱阵列(即DLD段)；微柱阵列由若干行微柱行构成；微柱行由多个水平分布的S形微柱组成；所述S形微柱包括首尾相连的第一竖柱、第一横柱和第二竖柱；
微柱阵列的临界截止尺寸为Dc，其由公式Dc＝1.4×G×(tanθ)0.48决定，G为两个相邻S形微柱之间的间隔，θ为同列两个相邻S形微柱的梯度角度；
按照待测样品流动方向，所述每一组微柱阵列的Dc值逐渐增大；
出口储液槽的数量为1个，入口储液槽均具有1.5mm的孔，容积10μL。
如图1中C图所示，S形微柱的尺寸具体为：第一竖柱长7.5μm，第一横柱长15μm，第二竖柱长7.5μm。
该微流控芯片具有子通道，用于连通入口储液槽与分离区，相邻微柱阵列，以及分离区与出口储液槽；利于观察细胞分布情况。子通道的数量为28个。连通入口储液槽与分离区的子通道对应分离区的输入区域；连通分离区与出口储液槽的子通道对应分离区的输出区域。
随着Dc的增加，每一DLD段的柱位移梯度增大，梯度范围为2.0μm～4.0μm，步长为0.1μm。具体信息如表1所示。
表1.分离区尺寸信息
注：段长度即微柱阵列的长度，其不包括子通道的长度；段长度＝微柱行行数×S形微柱边长(15μm)+(微柱行行数+1)×S形微柱间距(10μm)。
采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备上述微流控芯片。将带有PDMS微通道的硅片在真空室中进行60分钟的硅烷化处理，从而使PDMS微通道固化后更容易去除。将PDMS微通道从硅片上剥离。入口储液槽和出口储液槽通过分离区(PDMS微通道)连接。最后使用空气等离子机进行等离子处理后，PDMS微通道装置不可逆地结合到载玻片上，形成闭合的通道。通过泵管(聚乙烯管)将微流控芯片与微流体注射泵连接起来。
为了减少工作流程中细胞对S形微柱和通道壁的粘附，可以用泊洛沙姆F127(1％m/v)对微流控芯片进行改性，然后使用含20％ FBS的RPMI-1640培养基冲洗内部剩余的泊洛沙姆F127即可。
一种血小板功能或尺寸的检测系统，由上述微流控芯片、流体驱动装置和成像装置组成。
其中，流体驱动装置由微流体注射泵和注射器组成。通过出口储液槽的孔将微流控芯片与带有空注射器的聚乙烯管连通，同时将空注射器放置在带有注射/回抽功能的微流体注射泵上。通过注射和回抽功能将待测样品加载进微流控芯片。
一种快速无损测定血小板功能或尺寸的方法，基于上述血小板尺寸的检测系统实现，成像装置为显微镜(Leica DM IL LED)和CCD相机(Leica DFC 360FX)。步骤具体如下：
(1)向待测样本(如：可以通过肘静脉取血的方式获得血液样本)中加入1/4体积的含20％ FBS的RPMI-1640培养基，得到稀释后待测样本；
(2)取10μL稀释后待测样本，加入到中间的入口储液槽中；向两侧的入口储液槽加入等量的含20％ FBS的RPMI-1640培养基；使用微流体注射泵的回抽功能将液体通过聚乙烯管泵入微流控芯片中；
(3)微流控芯片中输入区、输出区和细胞运动的所有视觉数据均通过显微镜和CCD相机获得；分别在输入和输出区域通过10帧/秒收集50和200张图片，数据保存为未压缩的“.avi”格式。利用MATLAB软件对血液样本的输入区和输出区进行计数分析。所有数据都可以导出到excel表格中，以总结血小板的颗粒分布。
如果待测样本中含有红细胞，需要增设一组纯红细胞样本组作为对照组。利用Matlab软件调整识别不同细胞(血小板和红细胞)的尺寸。比如：当只需要识别红细胞时，调整参数(尺寸>30)，此时软件只识别红细胞；当参数调整为尺寸>5时，红细胞和血小板都会被识别；可以根据这两组数据的差值，得到血小板的分布情况。
流程图如图2中A图所示(红色框分别表示分离区的输入区域和输出区域)，机理图如B图所示。根据血小板的尺寸来表征血小板功能，检测时间仅需2分钟。当血小板发生活化时，血小板的尺寸会增大，硬度增加，当流速为0.2μL/min时，活化的血小板相对于正常的血小板在该装置中具有一个更大的Dapp值。
对比例1
本对比例提供一种微流控芯片，与实施例1基本相同，区别仅在于：将S形微柱替换为C形微柱，C形微柱由首尾相连的第二横柱、第三竖柱和第三横柱组成。
C形微柱的尺寸具体为：第二横柱长15μm，第三竖柱15μm，第三横柱长15μm。
检测例
1、通过使用Comsol Multiphysics 5.3a软件的数值模拟获得S形微柱阵列的流体流动流线；结果如图3所示。用直径分别为2、2.5、3、3.5和4.0μm的聚苯乙烯微球表征实施例1的微流控芯片，重悬浓度为107个/mL，微流体注射泵的回抽流速为0.2μL/min。对不同尺寸的聚苯乙烯微球进行表观尺寸(Dapp)的校准测量，并记录不同尺寸微球的分布情况。
检测结果如图4所示。
随着每个分段的Dc值增加，一定范围尺寸的颗粒被分离，并建立了尺寸和输出位置之间的相关性。
2、无损检测血小板功能的验证
血小板激活伴随着形态变化，血小板在暴露于凝血酶后，从扁盘状转变为球形细胞会在细胞壁上形成伪足(突出的或纤维状的突起)，扁盘状血小板可能具有颗粒状质地，其尺寸与最窄的尺寸成正比，在转变为带有伪足的球形细胞时，血小板的尺寸增加。
α-颗粒蛋白CD62p通常被认为是血小板活化的标志物，当血小板活化时，它从胞质转移到血小板膜上。为了验证实施例1的微流控芯片是否会诱导血小板的激活，以未流经实施例1的微流控芯片的血液样本作为对照组(Control)，以流经实施例1的微流控芯片后收集的血液样本作为实验组1(S-shaped Control)，以经凝血酶处理、再流经实施例1的微流控芯片后收集的血液样本作为实验组2(S-shaped Thrombin)，向10μL血液样本中加入等体积的PBS(含1％多聚甲醛)溶液，在22℃下固定30min后，加入180μL含有2μL抗CD62-PE染料的PBS溶液，于22℃避光孵育30min；最后加入200μL PBS溶液稀释样品，通过流式细胞术分析血小板膜表面的CD62p含量。
其中，Control组的血液样本的制备方法为：向320μL全血中加入60μL含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基和20μL含50mM GPRP的RPMI-1640(含20％ FBS)培养基，得到稀释后全血；向90μL稀释后全血中加入RPMI-1640(含20％ FBS)培养基进一步稀释，即得血液样本。
实验组1的血液样本的制备方法为：向320μL全血中加入60μL含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基和20μL含50mM GPRP的RPMI-1640(含20％ FBS)培养基，得到稀释后全血；向90μL稀释后全血中加入RPMI-1640(含20％ FBS)培养基进一步稀释，得到稀释后样本；取10μL稀释后样本流经实施例1的微流控芯片(回抽流速为0.2μL/min)，从出口收集得到血液样本。
实验组2的血液样本的制备方法为：向320μL全血中加入60μL含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基和20μL含50mM GPRP的RPMI-1640(含20％ FBS)培养基，得到稀释后全血；向90μL稀释后全血中加入10μL含凝血酶的RPMI-1640(含20％ FBS)培养基(凝血酶终浓度为1NIH U/mL，相当于10nM人α凝血酶)，室温孵育30min后，得到凝血酶处理后样本；取10μL凝血酶处理后样本流经实施例1的微流控芯片(回抽流速为0.2μL/min)，从出口收集得到血液样本。
检测结果如图5所示。
对照组和实验组1的血小板膜上的CD62p蛋白水平无显著差异，而暴露于凝血酶的血小板(实验组2)膜表面的CD62p蛋白表达水平明显高于对照组和实验组1。
这也表明当流速为0.2μL/min时，实施例1的微流控芯片不会刺激血小板活化。
3、分析富血小板血浆活化的可行性
取2mL全血(采自健康志愿者)在1200rpm的转速下离心5min，仔细收集交叉界面以上的所有上清液。然后上清液再次以1200rpm离心5min，丢弃四分之三的上清液，最后剩余的液体为富血小板血浆。
将160μL富血小板血浆与40μL含有GPRP的RPMI-1640(含20％ FBS)培养基充分混合(GPRP的终浓度为2.5mM)，室温放置10分钟，得到稀释后富血小板血浆。将90μL稀释后富血小板血浆与10μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)混合，作为正常组(Control)；将90μL稀释后富血小板血浆与10μL含凝血酶的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)混合，凝血酶的终浓度为1NIH U/mL，于室温避光孵育30min，作为凝血酶激活组(Thrombin)。利用微流体注射泵回抽上述样本和缓冲液(回抽流速为0.2μL/min)，使样本流经实施例1的微流控芯片，采集数据，绘制直方图，用来分析血小板尺寸的改变情况。
检测结果如图6所示。
经过凝血酶刺激后，血小板分布明显向右移动。这表明血小板尺寸大于对照/正常情况下血小板的尺寸。此外，在血小板输出频率的分布图中也观察到了明显的血小板尺寸变化。以上结果表明，凝血酶诱导的血小板激活状态导致了血小板Dapp的增加。而实施例1的微流控芯片对富含血小板血浆样本的血小板尺寸变化具有足够的敏感性。
4、分析全血血小板活化的可行性
全血中含有三种主要的细胞类型，包括红细胞、白细胞和血小板。其中，红细胞是最丰富的细胞，并且其尺寸接近于血小板。因此，在检测血小板Dapp时，应该保证可以排除红细胞的干扰。
(1)将320μL全血与80μL含有GPRP的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)充分混合，使GPRP的终浓度为2.5mM，室温放置10分钟，得到稀释后全血样本。然后将90μL稀释后全血样本加入到10μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)中，得到血液样本。利用微流体注射泵回抽上述血液样本和缓冲液(回抽流速为0.2μL/min)，使样本流经实施例1或对比例1的微流控芯片，采集数据，绘制直方图，用来分析血小板尺寸的改变情况。
检测结果如图7所示。通过PS软件对血小板(Platelets)和红细胞(Red BloodCells)进行着色。
实施例1的微流控芯片在红细胞和血小板之间获得了高分离效率，而经对比例1的微流控芯片分离后，红细胞和血小板之间存在部分重叠。因此，实施例1的微流控芯片可以直接检测全血中的血小板Dapp。
(2)将320μL全血与80μL含有GPRP的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)充分混合，使GPRP的终浓度为2.5mM，室温放置10分钟，得到稀释后全血样本。然后将90μL稀释后全血样本加入到10μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)中，作为对照组(Control)；将90μL稀释后全血样本加入到10μL含有凝血酶的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)中，使凝血酶的终浓度为1NIH U/mL，于室温避光孵育30min，作为凝血酶激活组(Thrombin)。利用微流体注射泵回抽上述样本和缓冲液(回抽流速为0.2μL/min)，使样本流经实施例1的微流控芯片，采集数据，绘制直方图，用来分析血小板尺寸的改变情况，并根据血小板Dapp在分离区的输出区域的输出频率计算得到不同Dapp范围内的血小板百分比。
检测结果如图8所示。
经实施例1的微流控芯片分离，对照组和凝血酶激活组中的血小板Dapp平均值分别为2.5μm和3.13μm。凝血酶激活组中Dapp大于3.6μm的血小板数量比对照组高出4.5倍。这表明大型血小板更具反应性。
(3)胶原功能化的直通道芯片对血小板聚集情况的检测
根据参考文献(Li R,Diamond SL.Detection of platelet sensitivity toinhibitors of COX-1,P2Y1,and P2Y12using a whole blood microfluidic flowassay.Thromb Res.2014,133(2):203-210.)，设计如图9所示的胶原蛋白功能化直通道芯片。该芯片包括依次连通的入口储液槽、直通道和出口储液槽；直通道中设置有胶原涂覆部。直通道的高度为45μm，宽度为400μm，可以测量激动剂暴露后的血小板粘附情况。进口储液槽具有3.0mm的孔，用于加载全血样本。同样，出口储液池具有1.5mm的孔，用于作为废液收集池。
胶原蛋白功能化直通道芯片的制备方法如下：
将预处理后的玻璃载玻片用氮气吹干，通过可逆粘结方法将具有400μm宽和45μm高的穿通式PDMS倒置于玻璃载玻片上。在穿通式PDMS的进样口滴加胶原溶液，并使用1毫升的塑料注射器将胶原溶液从出样口泵回，以使得胶原溶液充满整个穿通式PDMS的通道。然后将带有PDMS的玻璃载玻片放入塑料组织培养皿中，用锡箔覆盖，在室温下密封孵育90min后，将PDMS从玻璃载玻片上剥离；采用空气等离子体机器对玻璃载玻片进行等离子处理，并将被胶原蛋白修饰的玻璃载玻片不可逆地粘结在一片具有一个直通通道的PDMS上，从而得到胶原蛋白功能化的直通道芯片。为了减少非特异性血小板粘附，使用注射泵以8μL/min的负压覆盖0.5％的BSA溶液于直通道芯片的通道上。覆盖有BSA的直通道芯片在室温下放置至少60min，以防止非特异性血小板与PDMS和未与胶原反应的玻璃载玻片表面结合。重要的是要仔细观察通道中是否有会阻碍溶液正常流动的气泡。
玻璃载玻片的预处理方法如下：
使用去离子水和乙醇清洁所有玻璃器皿。将玻璃载玻片于含有大约60mL的盐酸-甲醇溶液的玻璃结晶皿(直径为6英寸)中室温浸泡30min，并每10min轻轻地手动搅拌；取出玻璃载玻片并在去离子水中冲洗5min后，转置于含有20mL乙醇-氨基丙基三乙基硅烷溶液的玻璃结晶皿(直径为6英寸)中静置30秒，依次用去离子水、无水乙醇冲洗；再将玻璃载玻片放入玻璃结晶皿(直径为6英寸)中，并覆盖锡箔纸，在115℃的对流烤箱中烘烤15min后，取出冷却至室温；将玻璃载玻片转入含有63mL 25％戊二醛溶液的玻璃结晶皿(直径为6英寸)中，室温避光放置1h后，用去离子水冲洗玻璃载玻片后，置于1×HBS溶液中，于4℃避光、密封保存。
其中，盐酸-甲醇溶液由盐酸、甲醇按体积比1:1混合得到；乙醇-氨基丙基三乙基硅烷溶液由20mL无水乙醇和200μL 95％氨基丙基三乙基硅烷溶液混合得到。
将320μL全血与80μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)混合后，取90μL混合样本与10μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)混合；随后与抗CD62p-PE染料按体积比10：1混合，在室温下孵育20min，作为对照组(Control)。将320μL全血与80μL RPMI-1640培养基(含20％FBS)充分混合，室温放置10min，得到稀释后全血样本，取180μL稀释后全血样本与20μL含有凝血酶的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)混合，使凝血酶的终浓度为1NIH U/mL于室温避光孵育30min；随后与抗CD62p-PE染料按体积比10：1混合，在室温下孵育20min，作为凝血酶激活组(Thrombin)。
将50μL的对照组样本或凝血酶激活组样本以8μL/min的流速灌注到胶原蛋白功能化直通道芯片的胶原包被表面，对应的剪切速率为1000s-1(生理流速)。在同一显微镜下连续记录血小板聚集过程。对血小板聚集图像进行分析，采用二值化方法对图像进行分割，利用ImageJ软件测定血小板覆盖胶原表面的百分比。
检测结果如图10所示。
与对照组相比，凝血酶激活组的血小板聚集明显升高(P<0.001)，表明血小板活化状态较高。
来自S-MDC的血小板Dapp与来自胶原功能化直通道芯片的血小板聚集高度相关。因此，本发明的微流控芯片能够用于检测分析血小板活化情况。
5、不同治疗组心肌缺血大鼠模型全血中的血小板尺寸分析
雄性无病原体SD大鼠(体重200g～220g)由南方医科大学(中国广州)动物中心提供。
将12只SD大鼠随机分组，共分为4组。一组口服阿司匹林(10.42mg/kg)，连续口服7天，每天一次，记为阿司匹林/模型组(Aspirin+Model)；一组口服替格瑞洛(150mg/kg)，连续口服7天，每天一次，记为替格瑞洛/模型组(Ticagrelor+Model)；一组口服等量生理盐水，连续口服7天，每天一次，记为模型组(Model)。一组口服等量生理盐水，连续口服7天，每天一次，作为对照组(Control)。接着对阿司匹林组、替格瑞洛组、模型组连续2天皮下注射65mg/kg异丙肾上腺素，建立心肌缺血大鼠模型。处理后，测试各小鼠的心电图，取各组小鼠全血、心脏组织。心脏组织用于进行Masson三色染色以及HE染色。全血用于测量血小板尺寸，测量方法如下：
将320μL全血与80μL含有GPRP的RPMI-1640培养基(含20％ FBS)充分混合，使GPRP的终浓度为2.5mM，室温放置10分钟，得到稀释后全血样本。然后将90μL稀释后全血样本加入到10μL RPMI-1640培养基(含20％ FBS)中，得到待测样本。利用微流体注射泵回抽上述待测样本和缓冲液(回抽流速为0.2μL/min)，使样本流经实施例1的微流控芯片，采集数据，分析血小板尺寸的改变情况。
结果如图11-13所示。
四组的平均血小板Dapp分别为2.40、2.87、2.56和2.57μm。与对照组相比，模型组、阿司匹林/模型组和替格瑞洛/模型组的ΔDapp(异丙肾上腺素或抗血小板药物引起Dapp的不同偏移和Dapp的相对变化)分别增加了0.47μm、0.16μm和0.17μm，即血小板Dapp分别增加了19.6％、6.7％和7.1％。与模型组相比，阿司匹林/模型组和替格瑞洛/模型组的Dapp分别减少了10.8％和10.5％。这表明血小板激活显著减少，这对于预防体外循环期间的血栓形成至关重要。
与对照组相比，模型组直径小于2.50μm的血小板数量减少了1.62倍，直径大于3.60μm的血小板数量增加了2.97倍。这表明大血小板参与了心肌缺血的发病机制，与相关研究结果一致。而抗血小板药物治疗显著减少了大血小板含量。
模型组的血小板Dapp明显向右偏移，即尺寸较大。与对照组的心电图相比，心肌缺血大鼠(模型组)的ST段显著增加了0.16个单位；而阿司匹林/模型组和替格瑞洛/模型组的ST段水平明显降低。
并且，模型组大鼠存在广泛的心脏组织纤维化，而对照组、阿司匹林/模型组和替格瑞洛/模型组未观察到广泛纤维化，胶原容积分数分别为1.45％、28.35％、16.85％和12.02％。HE染色结果也显示模型组中心肌组织损伤和炎症反应明显严重，如心肌细胞凋亡、核仁消失、空泡形成、水肿和大量炎症细胞浸润。长期口服阿司匹林和替格瑞洛显著减轻了阿司匹林/模型组和替格瑞洛/模型组中观察到的病理恶化。这表明在抗血小板药物治疗下，体外的缺血性心肌功能与体内的血小板Dapp变化趋势一致。进一步表明提示通过实施例1的微流控芯片测定的体外血小板Dapp可以准确反映药物的体内效果。
综上可知，实施例1的微流控芯片对于血小板的分离和测定不仅具有高分离效率，还具有高敏感性。并且能够显示不同条件下心肌缺血大鼠血小板尺寸的差异。
上面结合实施例对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括依次连通的入口储液槽、分离区、出口储液槽；
所述分离区具有纵向分布的若干组微柱阵列；所述微柱阵列由若干行微柱行构成；所述微柱行由多个水平分布的S形微柱组成；所述S形微柱包括首尾相连的第一竖柱、第一横柱和第二竖柱；
所述微柱阵列的临界截止尺寸为Dc，其由公式Dc＝1.4×G×(tanθ)0.48决定，G为两个相邻S形微柱之间的间隔，θ为同列两个相邻S形微柱的梯度角度；所述Dc值为2.0μm～4.2μm；按照待测样品流动方向，所述每一组微柱阵列的Dc值逐渐增大。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述Dc值为2.0μm～4.0μm。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列的组数为15～30。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述入口储液槽的数量为多个。
5.一种血小板功能或尺寸的检测系统，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的微流控芯片、流体驱动装置和成像装置。
6.权利要求1至4任一项所述的微流控芯片或权利要求5所述的检测系统在制备血小板功能或尺寸分析检测装置中的应用。
7.权利要求1至4任一项所述的微流控芯片或权利要求5所述的检测系统在检测血小板尺寸或血小板功能评价中的应用。
8.一种快速无损测定血小板功能或尺寸的方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的微流控芯片或权利要求5所述的检测系统对待测样品中的血小板功能或尺寸进行检测，包括以下步骤：
使所述待测样品流经所述微流控芯片的分离区；
获取分离区出口的细胞图像，并分析血小板的功能或尺寸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：使所述待测样品和等渗稀释液流经所述微流控芯片的分离区；
优选地，所述待测样品与所述等渗稀释液的体积比为1：2～3。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样品流经所述微流控芯片的速度为0.1μL/min～0.3μL/min。
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