AT1853U1

AT1853U1 - Verfahren zum nachweis des adhäsionsverhaltens verschiedener zelltypen

Info

Publication number: AT1853U1
Application number: AT72296U
Authority: AT
Original assignee: Tecan Austria Gmbh
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 1997-12-29

Abstract

Ein Verfahren zum Nachweis des Adhäsionsverhaltens verschiedener Zelltypen. Gemäß dem Verfahren werden Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und in zumindestens bereichsweise lichtdurchlässige Probebehälter eingefüllt. Darauf wird die Fluoreszenz der Zellen mit einem Fluorometer von oben und von unten gemessen. Den Zellen wird in den Probebehältern (1) ein abgedunkeltes Kulturmedium beigefügt.

Description

AT 001 853 Ul

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis des Adhäsionsverhaltens verschiedener Zelltypen, wobei Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und in zumindestens bereichsweise lichtdurchlässige Probebehälter eingefüllt werden, worauf die Fluoreszenz der Zellen mit einem Fluorometer von oben und von unten gemessen wird.

Weiters bezieht sich die Erfindung auf Probebehälter und komplementären Abdeckbehälter zur Durchführung des Verfahrens sowie auf eine Halteplatte zur Aufnahme der Probebehälter.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Nachweis des Adhäsionsverhaltens verschiedener Zelltypen, wobei sowohl verschiedene Zellinien als auch maligne Zellen untersucht werden sollen. Ein wesentliches Ziel des Verfahrens ist es, verschiedene humane Tumorzellen (mit dem Schwerpunkt Leukämie) betreffend ihres Adhäsionsverhaltens zu untersuchen und auch klassifizieren zu können.

Die bekannten Verfahren zur Untersuchung verschiedener Zelltypen basieren auf radioaktiven Nachweismethoden. Diese Verfahrens sind sehr zeitaufwendig. Die Proben müssen vor dem Weiterverarbeiten in Stickstoff tiefgefroren werden, um letztlich die Probebehälter mit den Zellen abzuschneiden. Der Inhalt der Probebehälter muß gesammelt werden, um die Probe mit Hilfe eines Szintillationszählers zu messen. Weiters treten die Probleme hinzu, die sich durch die Gefährlichkeit der Arbeit mit radioaktivem Material für die die Untersuchung durchführenden Personen ergeben.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, das eine erhöhte Arbeitssicherheit bietet, das die Verwendung geringerer Mengen von Zellen für eine Untersuchung erlaubt und das im Verhältnis zu bekannten Verfahren durch einen wesentlich geringeren Zeitaufwand auszeichnet.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, daß den Zellen in den Probebehältem ein abgedunkeltes Kulturmedium beigefügt wird.

Ein vorteilhaftes Ausführungsbeispiel sieht die folgenden Verfahrensschritte vor. der Boden mindestens eines Probebehälters wird mit bekannten Molekülen flächendeckend beschichtet; 2 AT 001 853 Ul der Probebehälter mit Beschichtung ruht über einen Zeitraum von zwischen 1 Stunde und 24 Stunden; der Probebehälter wird ausgewaschen; die zu untersuchenden Zellen werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert; ein Standard-Zellkulturmedium wird durch Zugabe von 1-3 Vol.% schwarzer Tinte gedunkelt; die zu untersuchenden Zellen und das Standard-Zellkulturmedium werden vorzugsweise im Verhältnis 1; 4 in einen Probebehälter eingebracht; der Probebehälter mit Inhalt wird zentrifugiert; der Probebehälter samt Inhalt ruht bei einer Temperatur von zwischen 4 bis 37°C; der mit den Zellen und der Standard-Zellkultur oder gefü. ^Probebehälter wird mit einem mit der gleichen Standard-Zellkultur voll gefüllten komplementären Behälter abgedeckt, sodaß die beiden Behälter einen gemeinsamen gefüllten Hohlraum abgrenzen; die Behälter mit Inhalt werden zentrifugiert, wobei die Drehrichtung der der ersten Zentrifugation entgegengesetzt ist; die beiden Behälter werden gemeinsam und geschlossen und lotrecht ausgerichtet einem Fluormeter zugeführt und der Inhalt von oben und von unten gemessen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch gute Reproduzierbarkeit, hohe Präzision und hohe Flexibilität hinsichtlich der Untersuchung verschiedener Parameter aus.

Durch den Ersatz von radioaktivem Material ergeben sich Vorteile hinsichtlich der Sicherheitsmaßnahmen. Es sind keine speziellen Labors erforderlich. Man erzielt ein wesentlich sichereres und bequemeres Arbeiten für den Experimentator und die Probleme mit der Beseitigung von radioaktivem Abfall entfallen.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Figuren der beiliegenden Zeichnungen beschrieben.

Die Fig. 1 zeigt eine Draufsicht und einen Querschnitt durch einen Probebehälter; die Fig. 2 zeigt eine Draufsicht und einen Querschnitt durch einen Abdeckbehälter; die Fig. 3 zeigt eine Draufsicht auf die zusammengesetzten Behälter; die Fig. 4 zeigt eine Draufsicht auf je eine untere und eine obere Halteplatte; 3 AT 001 853 Ul die Fig. 5 zeigt eine Zwinge zum Verprassen der beiden Haltepiatten und die Fig. 6 zeigt ein Schema des Verfahrens.

Die Böden 3 der Probebehälter 1 eines oder mehrerer Behälterstreifen 2 werden flächendeckend mit bekannten Molekülen beschichtet. Diese Beschichtung wird über Nacht ruhen gelassen, worauf am nächsten Tag nicht am Probebehälter 1 haftende Moleküle ausgewaschen werden.

Die zu untersuchenden Zellen werden in frischem oder eingefrorenem Zustand mit einem Fluoreszenzfart>stoff markiert (normalerweise mit Substratmolekülen oder anderen Zellen überzogen) und in die Probebehälter 1 eingebracht.

Die Probebehälter 1 werden mit einer angemessenen Menge eines Standard-Zellkulturmediums oder physiologischem Puffer gefüllt. Dieses Medium wird mit PVP (Polyvinyl-Pyrolydon zur Erhöhung der Viskosität beim später folgenden Zentrifugieren und mit * zur Seoaration der Meßsignale supplementiert.

Die Behälterstreifen 2 werden dann mit einer definierten Kraft 5 Minuten zentrifugiert und darauffolgend für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Inkubation kann beispielsweise in einem Wärmeschrank erfolgen.

Die Behälterstreifen 2 werden nun mit komplementären Abdeckstreifen 4, die komplementäre Abdeckbehälter 5 aufweisen, die ebenfalls mit dem angeschwärzten Standard-Kulturmedium gefüllt sind, wie in der Fig. 6 unter den Punkten B, C und D gezeigt, abgedeckt, sodaß die Probebehälter 1 und die komplementären Abdeckbehälter 6 einen gemeinsamen, vollständig gefüllten Hohlraum abgrenzen.

Diese Einheit der Behälterstreifen 2 und 4 wird fixiert. Die Fixierung erfolgt vorteilhaft mit einer in der Fig. 5 gezeigten Zwinge. Die Behälterstreifen 2 sind einfüllseitig an ihren Rändern mit beidseitig klebenden Folien 7 versehen, die den Verbund zwischen Behälterstreifen 2 und Abdeckstreifen 4 hersteilen.

Die Abdeckstreifen 4 sind an ihren Längsrändem mit Rinnen 8 versehen. Dadurch können die Probebehälter 1 und die Abdeckbehälter 5 übervoll gefüllt werden. Beim Zusammensetzen der Behälterstreifen 2 und der Abdeckstreifen 4 wird der überschüssige 4 AT 001 853 Ul

Inhalt der Probebehälter 1 und der Abdeckbehälter 5 von den Rinnen 8 aufgenommen. Die Behälterstreifen 2, 4 werden in obere und untere Halteplatten 6 eingesetzt und es erfolgt eine zweite Zentrifugation. Die Drehrichtung dieser zweiten Zentrifugation ist der Drehrichtung der ersten Zentrifugation entgegengesetzt.

Anschließend wird die Fluoreszenz der Inhalte der Behälter 1, 5 in einem Fluorometer von oben und von unten gemessen und die Meßergebnisse ausgewertet.

Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist, daß die Messung mit dem Fluorometer sowohl von oben als auch von unten erfolgt und daß durch das gedunkelte bzw. geschwärzte Standard-Zellkulturmedium eine Separation der Signale von der Messung der an der Oberseite der Behälter 1, 5 von jenen der Unterseite erzielt wird.

Diese Messung erfolgt vorteilhaft mit einem Fluorometer gemäß der Gebrauchsmusteranmeldung GM 326/96 der Anmelderin. Mit einem derartigen Geräte ist die Messung sowohl von der Unterseite als auch der Oberseite der Behälterstreifen 2, 4 möglich, ohne daß die Behälterstreifen 2, 4 um 180° gedreht werden müssen.

Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Trennung der Signale der Messung von der Unterseite der Abdeckbehälter 1 und von der Oberseite der Abdeckbehätter 5.

Wie aus dem Testveriauf beschrieben, muß als Voraussetzung für den Separationsvorgang der Zellen und der darauffolgenden Berechnung des Adhäsionsverhältnisses ein Zusammenbau der Probebehälterstreifen 2 und der Abdeckstreifen 4 erfolgen. Diese zusammengesetzte Einheit stellt ein verbundenes Gefäß dar, welches mit einem Kulturmedium (oder physiologischem Puffer) gefüllt sein muß, um durch die Zentrifugation einen Transport der Zellen von der Oberseite zur Unterseite der Behälter 1, 5 zu ermöglichen.

Normalerweise sind das Standard-Kulturmedium bzw. der Puffer transparent, was für das Meßverfahren die Konsequenz hätte, daß bei der Durchführung der Messung jeweils die Meßsignale von der Oberseite jene der Unterseite beeinflussen und umgekehrt. Dies würde verhindern, ein entsprechendes Verhältnis der fluoreszierenden Zellen der Oberseite zu den Zellen der Unterseite und als Folge ein korrektes Additionsverhältnis zu errechnen. 5 AT 001 853 Ul

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wurde eine Art Excidations-Blockung (Erregungsblockung) erzielt, indem das Kulturmedium vollständig abgedunkelt wurde. Zahlreiche Tests und Vergleiche haben gezeigt, daß mit Zugabe von 1 bis 2% India-Tinte die effizienteste Blockung erzielt werden kann. Durch die Zugabe von India-Tinte entstand kein negativer Einfluß auf Vitalität und Adhäsionsverhalten der Zellen. Da durch die Zentrifugation sich die Zellen jeweils an den Böden 3 der Probebehälter 1 bzw. der komplementären Abdeckbehälter 5 befinden, kann das Adhäsionsverhalten der Zellen sehr gut sowohl von oben als auch von unten gemessen werden. 6

Claims

AT 001 853 Ul Ansprüche: 1. Verfahren zum Nachweis des Adhäsionsverhaltens verschiedener Zeiltypen, wobei Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und in zumindestens bereichsweise lichtdurchlässige Probebehälter eingefüllt werden, worauf die Fluoreszenz der Zellen mit einem Fluorometer von oben und von unten gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß den Zellen in den Probebehältem (1) ein abgeduntyfeltes Kulturmedium beigefügt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Einfüllen der Zellen die Böden (3) der Probebehälter (1) mit Molekülen mit bekannten Eigenschaften beschichtet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Böden (3) der Probebehälter (1) flächendeckend beschichtet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probebehälter (1) nach einem Zeitraum von maximal 24 Stunden gewaschen werden, wobei die nicht an der Wandung der Probebehälter (1) haftenden Moleküle ausgewaschen werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein gedunkeltes Standard-Zellkulturmedium in die Probebehälter (1) gefüllt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard-Zellkulturmedium mit schwarzer Tinte gedunkelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Tintenanteil zwischen 1 und 6, vorzugsweise bei 2 bis 3 Vol% liegt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Probebehälter (1) mit den Zellen und dem Standard-Zellkulturmedium zentrifugiert werden. 7 AT 001 853 Ul
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Zentrifugieren die Probebehälter (1) mit den Zellen und dem Standard-Zellkulturmedium bei einer Temperatur von zwischen 4 und 37°C gelagert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Probebehälter (1) über einen bestimmten Zeitraum gelagert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lagerung in einem Wärmeschrank erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Probebehälter (1) mit einem komplementären Abdeckbehälter (6) abgedeckt werden, der ebenfalls mit einem angeschwärzten Medium gefüllt ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das angeschwärzte Medium das gleiche gedunkelte Standard-Zellkulturmedium wie im Probebehälter (1) ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die miteinander verbundenen Probebehälter (1) und Abdeckbehälter (5) bzw. deren Inhalt zentrifugiert werden, wobei die Drehrichtung zur Drehrichtung der ersten Zentrifugation entgegengesetzt ist.
15. Verfahren zum Nachweis des Adhäsionsverhaltens verschiedener Zelltypen, wobei Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und in zumindestens bereichsweise lichtdurchlässige Probebehälter eingefüllt werden, worauf die Fluoreszenz der Zellen mit einem Fluorometer von oben und von unten gemessen wird nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: der Boden mindestens eines Probebehälters (1) wird mit bekannten Molekülen flächendeckend beschichtet; der Probebehälter (1) mit Beschichtung ruht über einen Zeitraum von zwischen 1 Stunde und 24 Stunden; der Probebehälter (1) wird ausgewaschen; die zu untersuchenden Zellen werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert; ein Standard-Zellkulturmedium wird durch Zugabe von 1-3 Vol.% schwarzer Tinte gedunkelt; 8 AT 001 853 Ul die zu untersuchenden Zellen und das Standard-Zellkulturmedium werden vorzugsweise im Verhältnis 1: 4 in einen Probebehälter (1) eingebracht; der Probebehälter (1) mit Inhalt wird zentrifugiert; der Probebehälter (1) samt Inhalt ruht bei einer Temperatur von zwischen 4 bis 37°C; der mit den Zellen und der Standard-Zellkultur gefüllte Probebehälter wird mit einem mit der gleichen Standard-Zellkultur voll gefüllten komplementären Abdeckbehälter (5) abgedeckt, sodaß die beiden Behälter (1, 5) einen gemeinsamen gefüllten Hohlraum abgrenzen; die Behälter (1, 5) mit Inhalt werden zentrifugiert, wobei die Drehrichtung der der ersten Zentrifugation entgegengesetzt ist; die beiden Behälter (1, 5) werden gemeinsam und geschlossen und lotrecht ausgerichtet einem .. - - ^ zugeführt und deren Inhalt von oben und von c •T’kxcroiMeKrN unten gemessen.
16. Probebehälter zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Probebehälter (1) linear zu einem Behälterstreifen (2) zusammengefaßt sind.
17. Probebehälter nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälterstreifen (2) aus nachgiebigem Kunststoff gefertigt ist.
18. Probebehälter nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens die Längsränder des Behälterstreifens (2) an der Einfüllseite mit einer beidseitig klebenden Folie (7) versehen sind.
19. Probebehälter nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälterstreifen (4) der Abdeckbehälter (5) mit Rinnen (8) versehen sind.
20. Halteplatten zur Aufnahme von Probebehältem nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Halteplatten (6) mit Lochreihen (9) versehen sind, die den Behälterstreifen (2, 4) entsprechen, wobei jeder Probebehälter (1) und jeder Abdeckbehälter (5) in ein durchgehendes Loch (10) einer Halteplatte (6) einsetzbar ist. 9 AT 001 853 Ul
21. Behälterstreifen nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälterstreifen (2, 4) aus flexiblem Kunststoff gefertigt sind. 10