JPS63500632A - 新規なリグニン分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なリグニン分解酵素 発明の背景 ここに開示する発明はバルブ・紙工業で用いられる幾つかのプロセスに有用であ る。バルブ化プロセス中に、セルロース繊維はそれらを囲むリグニンマトリック スから、互・いに結合し、最終製品に強度をもたらすように、放出されなければ ならない。このポリマー分離は化学バルブにおけるようにリグニンを除去して、 または高収率メカニカルバルブにおけるようにリグニンを維持して行うことがで きる。

漂白プロセス中にリグニンは除去され、生成するバルブは光沢を帯びる。

セルロースフィブリル、ヘミセルロースとリグニンから成る木材の第２細胞壁は 木本植物に物理的強度と剛性とを与える。セルロースフィブリルはち密に充てん され、細胞を規則的な並行列として、または交差層として細胞を包囲している。

これらのフィブリルはヘミセルロースとリグニンのマトリックスによって支えら れている。

セルロースは木質組織に最も豊富にある成分であり、乾燥重量の３５〜４５％を 占める。セルロースはβ−１，４結合によって結合したグルコースモノマ一対の 規則的な線状ポリマーである。ヘミセルロースはペントース（炭素数５）モノマ ー（通常はキシロースとアラビノース）と；グルコース、ガラクトース、マンノ ースと置換ウロン酸から成るへキソース（炭素数６）モノマーとから成る分枝鎖 ポリマーである。

リグニンは置換シンナミルアルコール前駆体のフリーラジカル重合によって形成 される非常に複雑なポリマーである。リグニンは乾燥木材重量の１５〜３５％を 占める。

リグニンは生物学的作用に対して非常に耐性であるが、これはリグニン構造の複 雑さと安定性とを考えると意外ではない。微生物が単独炭素源としてのリグニン 上で増殖することはまだ実証されていない。しかし、複雑なリグニンポリマーは 種々な高等真菌の純粋な培養物によって、完全に分解される。このためには、ヒ グチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）のイクスパリエンシア（Ｅｘｐｅｒｆｅｎｔｆａ）　３ ８巻（１９８２）、　１５９〜１１３８頁；エッチ、ジャンシェカー（Ｈ，Ｊａ ｎｓｃｈｅｋａｒ）とエイ、ファイヒタ−（Ａ、　Ｆｅ１ｃｈｔｅｒ）による「 生化学工業／バイオテクノティ、ダブリュ、シェフリス（Ｔ、　Ｗ、　Ｊａｆｆ ｒｉｅｓ）編集。

２７巻−（１９８３）、　１１９〜１７ｇ頁、Ｓｔ）ｒ４ｎｇｅｒ、ベルリン、 ティ。

ケイ、カーク（Ｔ、　Ｋ、　Ｋｉｒｋ）の「微生物分解の生化学（Ｂｉｏｃｈｅ ｍｌｓｔｒｙ　１ｎ　Ｍｌｃｒｏｂｉａｌ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）Ｊデ仁　 ビー。

ギプソン（Ｄ、　Ｐ、　Ｇｉｂｓｏｎ）編集、（１９８４）　３９９〜４３７頁 。

Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク参照。

「完全リグニン化」組織（リグニン〉２０％）の主な分解菌は担子菌類であり、 これは白腐れタイプの木材腐食を生ずる。白腐れ菌によるリグニン生物学的分解 の最も広範囲な生理学的研究はコルチセアセアエ（Ｃｏｒｔ　ｉ　ｃｅａｃｅａ ｅ）科の菌であるファネロケーテ・クリソスポリウム　バード（Ｐｈａｎｅｒｏ ｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　Ｂｕｒｄｓ）によって行われてい る。

ファネロケーテ・クリソスポリウムはリグニンを完全に分解できるが、精製リグ ニンはこれの増殖を支持することができない。しかし、精製セルロースはこれら の菌に対する増殖栄養物になり得る。リグニンの分解はこれらの菌をリグニンマ トリックス中に含まれるセルロース栄養源に暴露させることになる。一定の実験 条件下で、培養の最初の３日間は菌によるリグニン分解が見られない。次に培養 は炭素または窒素不足状態になる。リグニン分解は１日か２日後に初めて見られ 、６日目に最大になる。炭素および窒素不足に応じてリグニン分解が誘導される ことは、菌によるリグニン代謝が二次的代謝イベントであることを示唆する〔ピ ー、カイセル（Ｐ、　Ｋｅｙｓｅｒ）、ティ、ケイ、カーク（Ｔ、　Ｋ、　Ｋｉ ｒｋ）とジエイ、ジー、ツァイクス（Ｊ、　Ｇ、　Ｚｅｉｋｕｓ）によるジェイ 、バタテリオル、（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｆｏｌ、）　１３５巻（１９７８）、　 ７９０〜７９７頁〕。

菌によるリグニン分解は幾つかの理由から営利的に実現不可能である。リグニン 分解作用は飢餓によって誘導しなければならないので、リグニン分解速度は緩慢 であり受容できない。さらに菌はセルロース繊維をその一次栄養源として代謝す るので、バルブ収率は低下し、バルブ製品の品質が劣化する。

リグニン中に存在する主要なＣ−Ｃ及びＣ−０−Ｃサブユニット間結合に関して は、サブユニット間結合の約８０％がＣまたはＣβ炭素への結合を含むことに留 意する必要α がある。

チェノ（Ｔｉｅｎ）とカーク（Ｋｉ　ｒｋ）はリグニンモデル化合物中のＣａ− Ｃβ結合を酸化開裂することのできる製剤を開示している〔エム、チェノ（Ｍ、 　Ｔｉｅｎ）とティ、ケイ。

カーク（Ｔ、　Ｋ、　Ｋｉｒｋ）によるブロク、ナトル、アカド。

サイ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　８１巻（１９８４ ）　、２２８０〜２２８４頁〕。この製剤は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上 に、見かけの分子量４２キロダルトン（ＫＤ）を有する蛋白質を優先的に示し、 さらに幾つかのマイナーバンドを示す。

この製剤は蛋白質の混合物であり、マイナーバンドから主要蛋白質を単離する手 段は示唆されていない。この論文が発表された後に、幾つかの科学論文が発表さ れて、この混合物から主要蛋白質を単離できないことを明らかにした。

これらの論文を以下に示す：ヴイービー、フィン（Ｖ−Ｂ。

Ｈｕｙｎｈ）とアール、エル、タララフオード（Ｒ，Ｌ、　Ｃｒａｗｆｏｒｄ） によるフエムス　ミクロバイオロジー　レタース（ＰＥ）ＩｓＭｉｃｒｏｂｌｏ ｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　２８巻（１９８５）、　１１９〜１２３頁；エム 、ライソーラ（Ｍ、　Ｌｅｉｓｏｌａ）等リグニン　バイオデグラデーション　 ワークショップ（１９８５）　、及びエム。

エッチ、ゴールド（Ｍ、　Ｈ，Ｇｏｌｄ）等、リグニン　バイオデグラデーショ ン　ワークショップ（Ｌｉｇｎｉｎ　ＢｆｏｄｅｇｒａｄａｔｌｏｎＷｏｒｋｓ ｈｏｐ）　（１９８５）。

これらの蛋白質分離はイオン交換クロマトグラフィかまたはサイズ排除イオン交 換カラムクロマトグラフィのいずれかによって行われている。特定成分を含むフ ラクションを等重点電気泳動かまたは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって分析して、多重の蛋白質を実証している。この研究を行った科学者は、 １９８５年にブリティッシュコロンビアのバンク−バーで開催されたリグニン生 物学的分解研究集会に参加したことから明らかであるように、リグニン酵素分野 の最先端にいる。これらの失敗はこの先行技術混合物の解明には克服しがたい問 題があることを示唆している。

チェノとカークの混合物から活性成分を単離することは、特にこのような混合物 の性質がこれらの実用性を実質的に妨げることが判明しているので、非常に望ま しい目的である。特に、チェノとカークの混合物及び同様な混合物は実際の貯蔵 温度及びこれらが実際に作用を発揮するのに適した温度において非常に不安定で あることが判明している。

特にチェノとカークの混合物の有効な活性は室温において約２日間で低下し、こ のような混合物は、周知のアゾコールテストによって実証されるように、破壊性 すなわち蛋白質分解性の自然プロテアーゼを含むことがわかっている。

さらに、リグニンの分解と改質に触媒作用を及ぼすために用いられる、他の酵素 を単離、確認することが明らかに必要である。

発明の簡単な概要 ここに開示する発明はここでγＬＤＭＴＭ６と呼ぶ、不安定化プロテアーゼを実 質的に含まない実質的に純粋な酵素製剤を製造することによって、前記問題の解 決に成功している。本発明のγＬＤＭＴ）（６製剤はチェノとカークの製剤が有 さなかったような、好ましい実用性を有している。

ファネロケーテ・クリソスポリウムの新規な菌株の培養からの細胞外液を以下に 述べる方法によって処理することによって、我々はγＬＤＭＴＭ６　（上記チェ ノとカークの混合物中の明らかに主要な蛋白質）のみでなく、不安定化性自然プ ロテアーゼを実質的に含まない、他の明確なリグニン分解酵素系列をも単離した 。これらの酵素は実用に適した安定性を有し、速効性であり、代謝誘導を必要と しない。

本発明によって提供する酵素はリグニンを分解し、リグニンモデル化合物で実証 されたように種々な反応を行うのみでなく、セルロースまたはヘミセルロースに は作用せず、木材バルブ中のリグニンの選択的分解と改質に有効であると実証さ れている（これが特に重要である）ため、このような結果をめていたバルブ・紙 工業での操作に使用できることが示唆されている。本発明の酵素製剤の種々な性 質は、これらが酵素活性分解性の自然蛋白質を含まず実質的に純粋であることと 共に、このような用途に非常に有利である。

従って、本発明はγＬＤＭＴＭ１、γＬＤＭＴＭ２　、ＴＭ γＬＤＭ　３、γＬＤＭＴＭ４、γＩ、ＤＭＴＭ５及びγＬＤＭＴＭ６と呼ばれ 、各々がこれらの酵素を分解する自然蛋白質を実質的に含まない新規なリグニン 分解酵素に関する。

これらの新規な化合物は有利に次の性質を有する＝（１）クラフトバルブ中のリ グニン量を減する；（２）サーモメカニカルバルブ（ＴＭＰ）の強度性質を強化 する；および （３）クラフトリグニンを脱色する。

本発明のγＬＤＭＴＭはベラトリルアルコールからベラトリルアルデヒドへの酸 化に触媒作用を及ぼし得るという重要な性質、ならびに次のような物理的パラメ ーターによって特性化される： （１）ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって測定した分子量、（２）アミノ酸組成、 （３）ヘム含量、 （４）抗体反応の相同性、 （５）リグニンモデル基質に対する活性の特異性、および（６）特定酢酸モル濃 度でのＦＰＬＣカラムからの溶離。

ここでγＬＤＭＴＭと呼ぶ本発明のリグニン分解酵素は以前にパブラーゼ（Ｐｕ ｐｌ　ａｓｅ）ＴＭと呼ばれていた。

発明の詳細な説明 本発明の新規なγＬＤＭＴＭの単離は、発酵培地中で多量のリグニン分解酵素を 合成するファネロケーテ・クリソスポリウムの新規な安定変異株の使用によつて 容易になる。

５Ｃ２Ｂと名づけられた、新規な変異株は少なくとも３０年間維持されるように 、公共培養物貯蔵所の永久コレクションとして寄託されている。この培養物貯蔵 所は合衆国農業省、ノーサーン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏ ｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 　（アメリカ合衆国、イリノイ州、ベオリア６１８０４）である。寄託番号はＮ ＲＲＬ　１５９７８、寄託臼は１９８５年７月３日である。この寄託した培養物 は本出願の対応出願またはその追加特許が出願されている国において、要請に応 じて一般に入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性が、政府から付与され た特許権を侵害して本発明を実施する許可を構成するものスポリウム、ＡＴＣＣ ２４７２５の紫外線突然変異誘発によって得られたものである。

新規な変異体５ＣＺ６はグルコースを補充し、ｐＨ４，５に緩衝化した窒素限定 痕跡元素培地上で増殖した。

発酵培地中のリグニナーゼ活性は、ベラトリルアルコールからベラトリルアルデ ヒドへの酸化速度を測定する標準方法によって周期的に測定した。発酵の細胞外 液からのリグニナーゼの単離と精製は限外濾過と、蔭イオン交換カラムを用いる 迅速蛋白質液体クロマトグラフィ（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）とによって達成された。

次の実施例によって、本発明を実施するための最良の態様も含めて、本発明の新 規な酵素と方法を説明する。これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべ きではない。

他に指示しないかぎり、％は全て重量％であり、溶媒混合物の割合は全て容量に よるものである。

窒素限定Ｂｍ／グルコース培地と呼ばれる、次のような培地を含む１Ωフラスコ 中で増殖した変異体５Ｃ２６の　１．５日間培養物５０ｍ１をホモジナイズする ことによって、接種物を調製した： Ｂｍ培地は酒石酸アンモニウム１．０８　Ｘ　１０−３Ｍ。

１０　Ｍ、　Ｃａ　Ｒ・２Ｈ０６，８Ｘ１０−４Ｍ、チアミンＨＣｆ１２．９８ Ｘ１０−６Ｍおよび微量元素溶液１０ｍ１／Ωを含有する。微量元素溶液はニト リロ酢酸７．８Ｘ　１０−３Ｍ。

１０　Ｍ、Ｆｅ　ＳＯ４・７Ｈ２０３，５９Ｘ１０　Ｍ、Ｃｏ　Ｃρ２７Ｈ２０ ３，４８ｘｌＯ−４Ｍ、　Ｃｕ　ＳＯ４”　５Ｈ２０４Ｘ１０−”Ｍ。

＝４ １．６刈ＯＭ、　Ｎａ　Ｍｏ　０　・２ＨＯ４，ｌＸ１０−”ＭおよびＭｎ　Ｓ Ｏ４”Ｈ２Ｏ２，９ｘｌＯ’Ｍを含有する。

この培地にグルコース１０％（重量／ρ）を補充した。

フラスコ（１２５ｍｌ、上記培地を有する無菌培地１０ｍ１含有）にそれぞれ、 上記ホモシネ−）　０．５ｍｌを接種し、３９℃に静置保持した。このフラスコ に０．３．６日目に水で飽和した０２でフラッシュした。この代りに、生物学的 回転コントラクター（ＲＢＣ）を用いて、真菌を増殖させた。上記培地２．５ｇ に上記ホモジネート１００ｍ１を接種し、連続的に酸素を供給しながら、１　ｒ ｐｍで回転する生物学的回転コントラクターによって３９℃で増殖させた。ベラ トリルアルコールからベラトリルアルデヒドへの酸化速度を測定することによっ てリグニナーゼ活性を周期的に測定した。反応混合物は細胞外液（フラスコまた は生物学的回転コントラクターから）２７５μｇ、ベラトリルアルコール２ｍＭ 、緩衝液を加えた直後に加えたＨ２Ｏ。０．４ｍＭを含んだ。この反応混合物を ３１０１１１［ｌ＋においてモニターした。標準としてウシ血清アルブミン（Ｓ ｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズリー州セントルイス）を用いて、ブラッドフ ォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法に従って測定した〔エム、エム、ブラッドフ ォード（Ｍ、　Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アナル、バイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、）７２巻（１９７Ｂ）、　２４８〜２５４頁〕。

実施例２ 新規なγＬＤＭＴＭの単離と調製 上記のようにフラスコ内で増殖した培地から５０００ＸＧ。

１０分間、４℃における遠心分離によって細胞外増殖培地を回収した。次に、細 胞外増殖培地をＩＯＫフィルターによる限外ン濾過によって濃縮した。生成した 濃縮物をリグニン分解混合物（Ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔ４ｃ　Ｍｆｘｔｕｒｅ）　 ＴＭと呼ぶ。リグニン分解混合物耐は１種類以上のγＬＤＭＴＭまたはその他の リグニン分解酵素を種々な割合で含有する。このリグニン分解混合物中に含まれ るγＬＤＭＴＭを、ファルマシア・モノＱカラム（Ｐｈａ１ｍａｃ］ａ　、ニュ ーシャーシー州、ビスカタウエイ）と１０ｍＭ〜ＩＭの濃度勾配の酢酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ６）とを用いた迅速蛋白質液体クロマトグラフィ（Ｆ　Ｐ　Ｌ　 Ｃ）によって分離した。γＬＤＭ”１．２．３゜４．５および６は、それぞれ本 質的に純粋なγＬＤＭＴＭ１〜６となるように、次の酢酸ナトリウムモル濃度： 　０．Ｌ６゜０．１８１ｇ、　０．３４．０．４０．０．５８および０．４３　 Ｍのところで典型な製剤としてカラムから溶離した。各γＬＤＭＴＭは他のγＬ ＤＭＴＭを実質的に含まず、自然蛋白質は好ましくない破壊性自然プロテアーゼ を実質的に含まない。分離し難い粗混合物中のこれらのプロテアーゼの存在が示 唆される〔実質的に純粋な各γＬＤＭＴＭはアゾコール・テストで陰性結果を与 える〕。

新規なγＬＤＭ”の特性化 （１）ベラトリルアルコールからベラ１−ジルアルデヒドへの酸化への触媒作用 、 （２）　Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に よって測定した分子量、（３）アミノ酸組成、 （４）ヘム含有、 （５）抗体反応性における相同性、 （６）リグニンモデル基質に対する作用の特異性、（７）特定酢酸塩モル濃度で のＦＰＬＣカラムからの溶離。

３１０　ｎｍにおいて分光測光法によって監視すると、γＬＤＭＴＭの全てがベ ラトリルアルコールからベラトリルアルデヒドへの酸化に触媒作用を及ぼす。活 性単位はγＬＤＭＴＭが触媒作用した反応におけるベラトリルアルデヒド１μｍ ｏｌｅの生産として定義する。約２４°Ｃにおける典型的な製剤の比活性を次に 示す： ＴＭ γＬＤＭ１２３４５６ 分子量　ＫＤ３８　３８　４２　４２　４３　４２（キロダルトン） アミノ酸組成　アミノ酸組成はジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）等の方法〔ビー、エフ 。ジョーンズＣＢ、　Ｎ、　Ｊｏｎｅｓ）、　ニス。

パーボ（Ｓ、　ｐａａｂｏ）、ニス、スティン（Ｓ、　５ｔｅｉｎ）による、ジ ェイ、リクイド、クロマトグラフィ　（Ｊ、　Ｌｊ、ＱｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏ ｇｒａｐｈｙ）　４巻（１９８１）、　５ｆ３５〜５８Ｂ頁〕の修正法によって 測定した。各構成アミノ酸の比は方法の限界と測定に用いた蛋白質の量の制約」 二、大体の値である。第１表参照。

ヘムと炭水化物含量　γＬＤＭＴＭ１，２，３，４．５および６の各々は単一の プロトヘム■成分を含有する。全てが過ヨウ素酸染色（ＰＡＳ）およびＣｏｎ　 Ａ　−セファロース（Ｓｉｇｍａ）によるとグリコジル化されている。

イムノプロット方法　この方法を用いてγＬＤＭＴＭをさらに特性化した。この 方法はトウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等が開示している標準方法である〔エッチ、ト ウビン（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎｅ）。

テ仁ステへリン（Ｔ、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ）、ジエイ、ゴルドン（Ｊ　、Ｇｏ ｒｄｏｎ）によるブロク、ナトル、アカド、サイ。

ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ）　７６ 巻（１９７９）　。

４３５０頁〕。この方法は、ゲル中での電気泳動による蛋白質の分離、蛋白質の 固体マトリックスへの転移、ならびに（１）−次ブローブ、ウサギ抗γＬＤＭＴ Ｍ抗体と（２）二次プローブ、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウ サギ抗体と反応させることを含む。

γＬＤＭＴＭ１，３，４，５．６は上記イムノプロット方法を用いて、γＬＤＭ ＴＭ２と６に対して形成されたポリクローナル抗体と反応する。γＬＤＭＴＭ２ は同じ反応で、γＬＤＭＴＭ６に対して形成されたポリクローナル抗体に反応す る。

ここに開示したγＬＤＭＴＭは全て、リグニンモデル基質すなわち、ベラトリル アルコール、１−（３’、４’　−ジメトキシフェニル）グリセロール−β−グ アイアシルエーテル、フェノール、メトキシル化ベンゼン（例えば１，４−ジメ トキシベンゼン）に対して、次のような独特の活性を有する：（１）Ｃａ−Ｃβ の酸化開裂； （２）ベンジルメチレン基のヒドロキシル化；（３）ベンジルアルコールをアル デヒドへ酸化；（４）フェノールの酸化；ならびに （５）メトキシおよびエトキシベンゼンの酸化。

「リグニンモデル基質」はリグニンの一部に似た化学物質である。モデル化合物 とγＬＤＭ”、！：の反応生成物は特に食品工業、製薬工業および化学工業（こ れらに限定されるわけではない）において化学飼料として実際的効用を有する。

上記活性はここに開示するγＬ　Ｄ　Ｍ”＋７＞特徴である。

実施例３ γＬＤＭＴＭによるクラフトパルプの漂白トランスアコニット酸１０ｍＭ−ｐＨ ４，５、Ｈ２０２４００を単独でまたはそれらの混合物として加える。

このパルプスラリーを０２でフラッシュし、３９°Ｃにおいて緩慢に振とうしな がら１２時間インキュベートし、次にクラフトパルプ溶液をデカントシ、１ＭＮ ａＯＨ溶液をパルプに加え、６５℃において６０分間インキュベートする。次に これをデカントし、クラフトパルプを水で洗浄する。生成したクラフトパルプは もはや暗褐色を有さす、代りに好ましい明色を有する。

Ｍｎ　ＳＯ４の使用、不使用は任意である。

実施例４ γＬＤＭＴＭによるサーモメカニカルパルプ（ＴＭＰ）の処理 γＬ　Ｄ　ＭＴＭ１〜６を、単独でまたはそれらの混合物として、トランスアコ ニット酸１０ｒｎＭ、　ｐＨ４，５、Ｈ２０２４００μＭおよびＭｎ　Ｓ０４　 １００μＭ中、３％濃度のＴＭＰｌｏｇ（乾燥重量）に加える。パルプスラリー を０２でフラッシュし、ゆっくり振とうしながら３９℃において１２時間インキ ュベートし、次にＴＭＰを水で洗浄する。パルプの引張り率、引裂き率、破裂率 ならびに破断長さを測定して、未処理サンプルに比べて強度が強化されているこ とを発見した。処理サンプルの光沢もどりは未処理サンプルに比べて小さかった 。従って、光沢安定性はγＬＤＭＴＭによる処理によって増大するといえる。

Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４の使用、不使用は任意である。

本発明のγＬＤＭＴＭは未精製形または精製形で用いることができる。各γＬＤ Ｍ”は他のγＬＤＭＴＭと自然蛋白質およびこれらの混合物を実質的に含まない 。実質的に精製され、分解性プロテアーゼを本質的に含まないγＬＤＭＴＭを用 いることが望ましい。γＬＤＭＴＭ製剤の純度に応じて、γＬＤＭＴＭ使用量を 調節することは、充分に当業者の技術範囲内である。γＬＤＭＴＭは、例えば市 販可能な形態にしたり、使用しやすくするといったような種々の目的のために、 γＬＤＭＴＭ、！：その使用を妨げないような、種々な希釈剤、補助剤および蛋 白質を含めた他の化学物質と組合せることができる。

ここで用いる「自然蛋白質」は上記の細胞外発酵培地に含まれる他の蛋白質を意 味する。

実施例　５ γＬＤＭＴＭによる軟材クラフトパルプの処理的４０ｍ？１４トランジスアコニ ット酸、ｐＨ４，５中で軟材クラフトパルプの１部を約１０　Ｘ　１０’〜約２ ０　Ｘ　１０−６部　のγＬＤＭＴＭによって、約３９℃において約１〜１６時 間処理する。次にバルブを約１ＭＮａＯＨ中で約６５℃において、約１時間洗浄 し、水ですすぎ洗いする。軟材クラフトパルプのこの処理によって、カッパ数の 約１８から約１３への減少によって明らかなように、リグニンの約１／３が除去 される。

国際調査報告 ＋ｍｓ＋、＋＋１゜ｓａｔ　Ａ１１ｌｌ＋ｉ、ｅＡ　Ｎ。ＰＣＴ／ｌｌｓ　８６ １０１４７１　２ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１４７１　３ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥンＩＲＣ：（Ｒ ＥＰＯＲτ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の特徴： ａ．約２．６単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒドの酸化の触媒作用をする、ｂ．約３８キロダルトンの分子量を有する、ｃ ．単一のプロトヘムＩＸ成分を含む、ｄ．グリコシル化されている、 ｅ．次のアミノ酸比を含む； ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ａｓｐ／ａｓｎ　１．４ ｇｌｕ／ｇｌｎ　６．０ ｓｅｒ　　　　　４．３ ｈｉｓ　　　　　４．４ ｇｌｙ　　　　　６．５ ｔｈｒ　　　　　２．２ ａｒｇ　　　　　１．１ ａｌａ　　　　　７．３ ｔｙｒ　　　　　０．２ ｍｅｔ　　　　　− ｖａｌ　　　　　１．６ ｐｈｅ　　　　　１．１ ｉｌｅ　　　　　１．０ ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ｌｅｕ　　　　　１．５ ｌｙｓ　　　　　０．５ ｆ．イムブロット方法でｒＬＤＭＴＭ２と６に対して形成された各ポリクローナ ル抗体と反応する、ｇ．約０．１６の酢酸ナトリウムモル濃度でＦＰＬＣカラム から溶離する、 ｈ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂 （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化（３）ベンジルアルコールからア ルデヒドヘの酸化（４）フェノールの酸化、および （５）メトキシル基の酸化開裂 を有する、実質的にプロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ１。 （２）次の特徴： ａ．約１７．１単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルア ルデヒドヘの酸化の触媒作用を及ぼす、 ｂ．約３８キロダルトンの分子量を有する、ｃ．単一のプロトヘムＩＸ成分を有 する、ｄ．グリコシル化されている、 ｅ．次のアミノ酸比を含む： ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ａｓｐ／ａｓｎ　２．０ ｇｌｕ／ｇｌｎ　７．７ ｓｅｒ　　　　　４．１ ｈｉｓ　　　　　３．２ ｇｌｙ　　　　　５．７ ｔｈｒ　　　　　３．５ ａｒｇ　　　　　１．２ ａｌａ　　　　　７．９ ｔｙｒ　　　　　− ｍｅｔ　　　　　− ｖａｌ　　　　　２．６ ｐｈｅ　　　　　３．０ ｉｌｅ　　　　　２．２ ｌｅｕ　　　　　６．５ ｌｙｓ　　　　　２．５ ｆ．イムノブロット法においてｒＬＤＭＴＭ６に対して形成された各ポリクロナ ール抗体に反応する；ｇ．約０．１８の酢酸ナトリウムモル濃度でＦＰＬＣカラ ムから溶離する； ｈ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂、 （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化、（３）ベンジルアルコールから アルデヒドヘの酸化、（４）フェノールの酸化、および （５）メトキシ基の酸化開裂 を有する、実質的にプロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ２。 （３）次の特徴： ａ．約５．１単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒドヘの酸化の触媒作用を及ぼす、 ｂ．約４２キロダルトンの分子量を有する、ｃ．単一のプロトヘムＩＸ成分を有 する、ｄ．グリコシル化されている、 ｅ．次のアミノ酸比を含む： ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ａｓｐ／ａｓｎ　５．４ ｇｌｕ／ｇｌｎ　１６．８ ｓｅｒ　　　　　１４．０ ｈｉｓ　　　　　７．３ ｇｌｙ　　　　　２４．０ ｔｈｒ　　　　　− ａｒｇ　　　　　２．９ ａｌａ　　　　　１４．４ ｔｙｒ　　　　　１．０ ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ｍｅｔ　　　　　１．２ ｖａｌ　　　　　７．４ ｐｈｅ　　　　　７．０ ｉｌｅ　　　　　４．１ ｌｅｕ　　　　　６．５ ｌｙｓ　　　　　２．５ ｆ．イムノブロット法においてｒＬＤＭＴＭ２と６に対して形成された各ポリク ロナール抗体に反応する；ｇ．約０．３４の酢酸ナトリウムモル濃度でＦＰＬＣ カラムから溶離する； ｈ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂 （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化（３）ベンジルアルコールからア ルデヒドヘの酸化（４）フェノールの酸化、および （５）メトキシル基の酸化開裂 を有し、実質的にプロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ３。 （４）次の特徴： ａ．約９．７単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒドヘの酸化の触媒作用を及ぼす、 ｂ．約４２キロダルトンの分子量を有する、ｃ．単一のプロトヘムＩＸ成分を有 する、ｄ．グリコシル化されている、 ｅ．イムノブロット法においてｒＬＤＭＴＭ２と６に対して形成された各ポリク ロナール抗体に反応する；ｆ．約０．４０の酢酸ナトリウムモル濃度においてＦ ＰＬＣカラムから溶離する； ｇ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂 （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化（３）ベンジルアルコールからア ルデヒドヘの酸化（４）フェノールの酸化、および （５）メトキシル基の酸化開裂 を有し、実質的にブロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ４。 （５）次の特徴： ａ．約９．４単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒドヘの酸化の触媒作用を及ぼす； ｂ．約４３キロダルトンの分子量を有する；ｃ．単一のプロトヘムＩＸ成分を含 む；ｄ．グリコシル化されている； ｅ．次のアミノ酸比を含む： ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ａｓｐ／ａｓｎ　５．０ ｇｌｕ／ｇｌｎ　１９．９ ｓｅｒ　　　　　２２．３ ｈｉｓ　　　　　１５．９ ｇｌｙ　　　　　４４．７ ｔｈｒ　　　　　− ａｒｇ　　　　　４．８ ａｌａ　　　　　１３．８ ｔｙｒ　　　　　１．０ ｍｅｔ　　　　　− ｖａｌ　　　　　６．５ ｐｈｅ　　　　　３．３ ｉｌｅ　　　　　３．６ ｌｅｕ　　　　　６．０ ｌｙｓ　　　　　２．３ ｆ．イムノブロット法においてｒＬＤＭＴＭ２と６に対して形成された各ポリク ロナール抗体に反応する；ｇ．約０．５８の酢酸ナトリウムモル濃度においてＦ ＰＬＣカラムから溶離する； ｈ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂； （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化；（３）ベンジルアルコールから アルデヒドヘの酸化；（４）フェノールの酸化、および （５）メトキシル基の酸化開裂 を有し、実質的にブロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ５。 （６）次の特徴： ａ．約１２．４単位／ｍｇ・分の割合でベラトリルアルコールからベラトリルア ルデヒドヘの酸化の触媒作用を及ぼす； ｂ．約４２キロダルトンの分子量を有する；ｃ．単一のプロトヘムＩＸ成分を含 む；ｄ．グリコシル化されている； ｅ．次のアミノ酸比を有する； ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ａｓｐ／ａｓｎ　３．０ ｇｌｕ／ｇｌｎ　８．０ ｓｅｒ　　　　　６．８ ｈｉｓ　　　　　３．２ ｇｌｙ　　　　　８．３ ｔｈｒ　　　　　４．９ ａｒｇ　　　　　１．３ ａｌａ　　　　　６．７ ｔｙｒ　　　　　０．２ ｒＬＤＭＴＭ１ アミノ酸　　　　比 ｍｅｔ　　　　　０．１４ ｖａｌ　　　　　４．２ ｐｈｅ　　　　　３．２ ｉｌｅ　　　　　２．４ ｌｅｕ　　　　　３．３ ｌｙｓ　　　　　１．０ ｆ．イムノブロット法でｒＬＤＭＴＭ２と６に対して形成された各ポリクロナー ル抗体と反応する；ｇ．約０．４３の酢酸ナトリウムモル濃度でＦＰＬＣカラム から溶離する；および ｈ．リグニンモデル基質に対して次の活性を有する；（１）Ｃα−Ｃβの酸化開 裂； （２）ベンジルのメチレン基のヒドロキシル化；（３）ベンジルアルコールから アルデヒドヘの酸化；（４）フェノールの酸化；および （５）メトキシル基の酸化開裂 を有し、実質的にブロテアーゼを含まないｒＬＤＭＴＭ６。 （７）変異体ＳＣ２６と呼ばれ、寄託番号ＮＲＲＬ１５９７８を有し、適当な培 地内での増殖時にｒＬＤＭＴＭ１，ｒＬＤＭＴＭ２，ｒＬＤＭＴＭ３，ｒＬＤＭ ＴＭ４，ｒＬＤＭＴＭ５およびｒＬＤＭＴＭ６を培地中に形成するファネロケー テ・クリソスポリウムの生物学的に純粋な変異体培養物。