JPS6346760B2 - - Google Patents

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JPS6346760B2
JPS6346760B2 JP55047655A JP4765580A JPS6346760B2 JP S6346760 B2 JPS6346760 B2 JP S6346760B2 JP 55047655 A JP55047655 A JP 55047655A JP 4765580 A JP4765580 A JP 4765580A JP S6346760 B2 JPS6346760 B2 JP S6346760B2
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JP
Japan
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fraction
ascites
present
isoelectric focusing
glycoprotein
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JP55047655A
Other languages
English (en)
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JPS56145297A (en
Inventor
Chikao Yoshikumi
Masahiko Fujii
Kenichi Matsunaga
Takao Ando
Norio Takahashi
Yoshiharu Oguchi
Tooru Hirai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kureha Corp
Original Assignee
Kureha Corp
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Publication date
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Priority to FR8107182A priority patent/FR2480122A1/fr
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Priority to GB8111349A priority patent/GB2078229B/en
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Granted legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Medicinal Chemistry (AREA)
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  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清あるいは腹水中に存在する免疫抑
制作用を有する糖蛋白質を分取して調製する方法
に関する。
従来より、癌に診断やその進行度の判定を行な
うために、患者の血清中に現われるα―feto―
ProteinやCEA（carcinoembryonic antigen）の
ような胎児性蛋白質の測定やpurified protein
derivative（PPD）反応、２，４―dinitro―
chlorobenzene（DNCB）反応、更に
phytohemagg―lutinine（PHA）に対する末梢血
リンパ球の幼若化反応の測定などが広く臨床で応
用されている。すなわち、近年癌の進行と、免疫
能の低下との相関が指示されるようになり、血清
中にも、なんらかの免疫抑制作用をもつ、物質の
存在することが1974年Cooperbandらが報告した
IRA（immuno―regulatory α―globulin）なら
びに昭和51年10月、日本癌学会第35回総会にて、
石田らが発表した酸性蛋白質等によつて確認され
ている。
上記石田らが発表した酸性蛋白質は、特開昭53
−44611号公報に開示されているとおり、ヒトま
たは動物の血清や腹水を陰イオン交換体クロマト
グラフイに付し、等電点2.9〜3.3の蛋白質を溶出
採取することにより調製される。
しかし、この方法では目的蛋白質を吸着により
分取するものであるためその収率が低く、かつ得
られる蛋白質の免疫抑制活性も低いという欠点が
みられる。
本発明者らはヒト又は動物の血清又は腹水から
上記活性の高い糖蛋白質を高収率で得る方法につ
いて検討した結果、上記血清又は腹水に等電点電
気泳動手法を適用してPH2.6〜3.6に泳動される画
分を分取することにより、免疫抑制活性の高い糖
蛋白質が高収率で得られることの知見を本発明を
なすに到つた。
以下本発明について詳しく説明する。
本発明において用いられる出発原料としては、
癌患者の血清又は腹水、あるいは癌を移植した動
物の血清又は腹水を例示し得る。
上記血清又は腹水を、本発明により等電点電気
泳動させるには、例えば癌患者の腹水を用いる場
合それを遠心分離又はろ過してそれに混在してい
る不溶解物を除去したものを下記に示すごときカ
ラム等電点電気泳動法あるいは顆粒状ゲル等電点
電気泳動法を適用してPH2.6〜3.6に電気泳動させ
るとよい。
カラム等電点電気泳動法は例えばPH2.5乃至6.0
の両性担体〔スエーデン，LKB社製の商品名ア
ンフオライン（Ampholine）〕を用い、ガラス製
のアンフオラインカラムを使用して蔗糖、エチレ
ングリコール、グリセロールのごとき密度勾配中
で分画を行う。また、顆粒状ゲル等電点電気泳動
法は上記両性担体を用い、セフアデツクスＧ―75
ゲルのごとき物質を支持体として用いて分画を行
なう。なお、上述したごとき等電点電気泳動法を
適用して上記出発原料を電気泳動させて得られる
画分中に共存する両性担体や密度勾配物質は透析
や限外ろ過の手法により除去して該画分を精製す
る。
上述のごとくして得られる電気泳動画分を凍結
乾燥すると目的とする糖蛋白質が得られる。
本発明により調製して得られる糖蛋白質は次の
ごとき物性特性を有する。
１ 外 観：白色粉末 ２ 溶解性 ：水，生理的食塩水，リン酸緩衝液
に可溶、メタノール，エタノー
ル，ブタノール，アセトン，クロ
ロホルム，エーテル，酢酸エチル
に不溶 ３ 等電点 ：2.6〜3.6（等電点平板電気泳動法） ４ 呈色反応：ローリー・フオーリン，エールリ
ツヒ，ビウレツト，ニンヒドリン
反応陽性、モーリツシユ・フエノ
ール硫酸反応陽性 ５ 赤外線吸収スペクトル：第１図に示すとお
り。
（KBr打錠法で測定） ６ 紫外線吸収スペクトル：第２図に示すとお
り。
（純水溶解物で測定） 本発明による糖蛋白質の免疫抑制作用を、該蛋
白質をヒト末梢血リンパ球並びにマウス脾細胞の
フイトヘマグルチリン（PHA）による幼若化現
象抑制について調べた結果によると、1.0mg／ml
でそれぞれに対して100％並びに90％の抑制率を
示し、また、0.1mg／mlでそれぞれに対して80％
並びに55％の抑制率を示した。
また本発明による糖蛋白質の100マイクログラ
ム（μｇ）をICRマウスの腹腔内に投与して羊赤
血球に対する遅延型足蹠反応を調べた結果による
と、非投与の対照マウスに対し約50％の抑制率を
示した。
上記調査結果から、本発明による糖蛋白質は高
い免疫抑制能を有すること理解し得る。したがつ
て、本発明による糖蛋白質は各種疾患の病態の変
化、特に、癌疾患の進行状況を知るうえで有用で
ある。
以下に実施例を例示して本発明を具体的に説明
する。
実施例 １ 肝ガン患者より採血した血液10mlを30〜60分間
放置したのち、約1500Gにて10分間遠心分離し、
上澄５mlを得る。
次に、PH2.5〜4.0ならびに4.0〜6.0の両性担体
（LKB社製のアンフオラインを使用）溶液を混合
してPH2.5〜6.0の両性担体液（以下アンフオライ
ン溶液と称する）を作る。このアンフオライン溶
液を用い蔗糖を密度勾配液としLKB社製のガラ
ス製のアンフオラインカラムを使用して上記上澄
の等電点電気泳動を行なう。LKB社8102型カラ
ム（440ml）では、上記上澄試料を５ml、8100型
カラム（110ml）では、上記上澄試料１mlを用い
る。又、この時の電気泳動条件は電力（Power）
5W（ワツト）、通電開始時9.0mA550Vで約20〜25
時間泳動を行ない、最終電圧1500Vで終了する。
泳動後フラクシヨンコレクターにて泳動画分を分
取し、PH2.6〜3.6の画分を集める。次にこの画分
を流水中にて透析し、アンフオライン、蔗糖等を
除去したのち、凍結乾燥すると、血液10ml当り、
5.2mgの糖蛋白質が得られる。
この糖蛋白質について、ヒト末梢血リンパ球並
びにマウス脾細胞のPHAによる幼若化現象抑制
を調べたところ、夫々1.0mg／mlで100％並びに90
％の抑制率を、0.1mg／mlで80％並びに55％の抑
制率がそれぞれ認められた。
また、本物質100mgについてICRマウスの腹腔
内に投与し、羊赤血球に対する遅延型足蹠反応を
調べたところ、49％の抑制率を示した。
実施例 ２ 大腸癌患者から採取した腹水25mlを、冷却遠心
分離機を用い10000Gにて、30分間遠心分離し、
その上澄を分取する。
次に、この上澄液を、実施例１で調製したPH
2.5〜6.0のアンフオライン溶液に用いセフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ―75ゲル（スエーデン，フ
アルマシア社製）を支持体として、LKB社製平
板等電点電気泳動装置にて電力、８ワツトで40時
間通電して電気泳動を行う。最終電圧1200Vにて
電気泳動を終了する。
泳動後PH2.6〜3.6の画分を、支持体のセフアデ
ツクスゲルとともに取り出し、純水にて該画分を
セフアデツクスゲルより洗い出し、ついで流水透
析して上記画分に共存するアンフオライン等を除
去する。得られる画分を凍結乾燥を行ない、24mg
の糖蛋白質を得る。
本物質は、PHA法で抑制活性を調べたところ、
実施例１と同様の強い抑制活性を示した。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で得られる糖蛋白質の赤外線吸
収スペクトルを示し、第２図は同じく紫外線吸収
スペクトルを示す。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ヒトまたは動物の血清あるいは腹水を、等電
    点電気泳動させて泳動画分を分取して等電点2.6
    乃至3.6の画分を採取することを特徴とする免疫
    抑制作用を有する糖蛋白質の調製法。
JP4765580A 1980-04-11 1980-04-11 Preparative method of glycoprotein having immunosupressing activity Granted JPS56145297A (en)

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GB8111349A GB2078229B (en) 1980-04-11 1981-04-10 Production of glycoprote in having immunosuppressive activity

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GB2078229A (en) 1982-01-06
FR2480122A1 (fr) 1981-10-16
FR2480122B1 (ja) 1983-11-10
JPS56145297A (en) 1981-11-11
GB2078229B (en) 1983-08-10

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