JPS6342694A - 熱変性へテロ多糖の製法 - Google Patents

熱変性へテロ多糖の製法

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JPS6342694A
JPS6342694A JP62190571A JP19057187A JPS6342694A JP S6342694 A JPS6342694 A JP S6342694A JP 62190571 A JP62190571 A JP 62190571A JP 19057187 A JP19057187 A JP 19057187A JP S6342694 A JPS6342694 A JP S6342694A
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heteropolysaccharide
heat
aqueous solution
denatured
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JP62190571A
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マルシオ・ボロチ
デビッド・アイ・スターリング
キャサリン・ペグラム
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H1/00Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06Separation; Purification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0087Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) この発明は、任意メチロトローフ性細菌であるメチロフ
ィルス・ビスコゲネス(Methylophilusv
iscogenes)の菌株を増殖条件下で培養して蓄
積した量のエキソ多ti <例、ヘテロ多糖ポリ54)
を含有する水溶液を生成させ、この水溶液を加熱して、
熱変性されたエキソ多糖を得ることからなる、熱変性エ
キソ多糖類の製造方法に関する。得られた熱変性エキソ
多糖は、水溶液に高い疑似塑性とチキソトロピー性とを
付与することができる。
(従来の技術) メチロフィルス・メチロトロフス(Methyloph
ilus methylotrophus)は、ホルム
アルデヒド固定のりブロース−リン酸経路(RMP)サ
イクルを利用する絶対メチロトローフ性細菌である。メ
チロフィルス・メチロトロフスの菌株AS−1は、一本
の極鞭毛を持ったダラム陰性の非着色桿菌である。
メタノールなどのC1化合物は一般に単細胞タンパク質
(SCP)製造用の基質として検討されているが、メタ
ノールをSCP製造に適格とする因子により、これはま
たエキソ多糖類のような蓄積された細胞外代謝産物製造
用の供給原料としても有望である。メタノールを付加価
値の高い製品に転化させる多くの微生物学的方法が発表
されているが、それらは一般にアミノ酸のような低容積
/高価格の化合物の製造を目的としている。たとえば、
J、 BolbotおよびC,Anthonyは、Pr
oc。
Soc、 Gen、 Microbial、 5.43
 (1978)において、シュードモナス(Pseud
omonas) A M Iのピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ欠乏変異株が、メタノールでの増殖中にアミノ酸で
あるアラニンとバリンを蓄積できることを見出した。Y
、 Tan1 らは、^gric。
Biol、 Chem、、 42.2275 (197
8)に、アルスロバクタ−・グロビフォルミス(Art
hrobactor globiformis)の菌株
を使用してメタノールから5.2g/!までのL−セリ
ンが生産されることを述べている。しかし、日常消費型
の大量化学物質へのC1化合物の生物学的転化に関して
は現在まで未だに報告がない。
(発明が解決しようとする問題点) よって、本発明の目的は、増殖炭素源を蓄積した量のエ
キソ多糖代謝産物に生物学的に転化させる醗酵方法を提
供することである。
本発明の別の目的は、C1化合物を蓄積した量のエキソ
多糖に生酔化させ、生成したエキソ多糖を熱変性して新
規なヘテロ多糖を形成する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、水溶液に高い擬似塑性およ
びチキソトロピー性を付与する、新規形態のヘテロ多糖
ポリ54を提供することである。
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明
および実施例から明らかとなろう。
(問題点を解決するための手段) 本発明の目的は、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌
菌株の好気的培養により製造されたヘテロ多糖を含有す
る水溶液を溶液粘度の増大を達成するに十分な時間約6
0〜150℃の温度に加熱することからなる、前記水溶
液の粘度増大方法の提供により達成される。
この水溶液は、約50重量%までの水混和性有機溶媒、
例えばメタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジ
メチルホルムアミドなど、を含有することができる。
別の態様において、本発明は、増殖炭素源(例、C1化
合物またはフルクトース)を含有する水性栄養培地中で
、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ATCC398
93もしくはその変異株を好気培養して、細胞外ヘテロ
多糖ポリ54の水溶液を生成させ、この水溶液を約60
〜150℃の温度に加熱して、熱変性されたヘテロ多糖
ポリ54の水溶液を得ることからなる方法を提供する。
本発明の方法におけるヘテロ多糖の熱処理時間は、一般
に約0.1〜10時間の範囲内であろう。
熱処理により得られた熱変性ヘテロ多糖ポリ54は新規
物質である。
任意操作とし”ζ、熱処理工程を実施する前に、培地か
ら全菌体を除去してもよい。培地からの全菌体の除去は
、遠心分離もしくは限外濾過のような慣用手段により実
施でき、次いで菌体を含有しないエキソ多糖代謝産物の
水溶液は、熱処理および生成物回収のために後続処理工
程に付すことができる。
本明細書で使用した「CI化合物」なる用語は、メタノ
ール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルムアミド、−酸化
炭素、ジメチルエーテル、メチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミンおよびトリメチルアミンN−オキ
シドのように、炭素−炭素結合を全く含有しない有機化
合物を意味する。
本明細書において、「エキソ多糖」とは、キサン(キサ
ンタン・ガム)で例示されるような、醗酵培地中に細胞
外代謝産物として蓄積する多糖を意味する。
本明細書において、「ヘテロ多糖」とは、少なくとも2
種類の異なる単糖単位、たとえばマンノースおよびガラ
クトース、から構成される多糖を意味する。
本明細書において、「熱変性」とは、水性媒質中での熱
処理により多糖に導入された物理化学的変化(熱処理前
の同じ多糖に対する変化)を意味する。
また別の態様において、本発明は、ヘテロ多糖ポリ54
の水性スラリーを約60〜150℃の温度に加熱して、
熱変性ヘテロ多糖ポリ54を固体形態で得ることからな
る方法を提供する。このスラリーの水性相は水混和性の
有機溶媒を含有することができ、それにより熱処理時に
溶解状態のヘテロ多糖ポリ54の含有量を低下させるこ
とができる。
本発明の方法により生成した熱変性ヘテロ多糖の水溶液
からの回収は、凍結乾燥、または水溶性有機溶媒(例、
アセトン、メタノール、エタノールなど)による沈澱と
いった任意の適当な方法により実施できる。熱変性ヘテ
ロ多糖の沈澱は、水溶液を多価金属(例、カルシウムも
しくはバリウム)の塩で処理することによっても達成で
きる。
粗製の熱変性ヘテロ多糖は、水に再溶解させ、得られた
水溶液を透析および凍結乾燥処理することにより精製品
とすることができる。
熱変性ヘテロ多糖ポリ54生成物は、約800.000
〜1,500,000の範囲内の平均分子量を有する。
熱変性ヘテロ多糖ポリ54は、脱イオン水性媒質中でブ
ルックフィールド回転円筒粘度計(少量試料用アダプタ
ー付き)のスピンドルIIk131により25℃で測定
して、0.1sec−’の剪断速度において少なくとも
約8000 cpの0.25重量%粘度を示す。熱変性
ヘテロ多糖ポリ54の水溶液は無色透明であり、疑似塑
性およびチキソトロピー性の粘度特性を示す。この水溶
液粘度特性は、約130℃までの温度および約12まで
のpH値において安定である。
低剪断速度条件下で、熱変性ヘテロ多糖ポリ54は、一
般に市販のキサンタン・ガムの約5〜50倍という見掛
は粘度を示す。ヘテロ多糖ポリ54、熱変性ヘテロ多糖
ポリ54、および市販のキサンタン・ガム〔例、ケルザ
ン(Kelzan) )の剪断条件下での粘度特性の比
較データを、添付の第1図に示す。
熱変性ヘテロ多糖ポリ54のその他の物理化学的および
構造上の特徴は次の通りである。
A、補(D+Rr灸]四k」リー グルコース   10 ガラクトース 7〜10 マンノース   1〜3 グリクロン  1〜3 熱変性ヘテロ多糖ポリ54は約1〜3重量%の窒素を含
有する。熱変性ヘテロ多糖ポリ54は、ピルビン酸もし
くはタンパク質含有量を示さず、4単糖単位あたり約1
個のアセチル基を含有する。そのグリクロン酸(gly
curonic acid)成分は、グルクロン酸およ
び/またはガラクツロン酸および/またはマンヌロン酸
からなる。
80元1」1Lりり−1 C39,2 H6,1 043、I N    2.17 *平均値;灰分補正済 C0融点 明確な融点を示さず、約150℃より高温で分解する。
D、亦Aノぐセ江し少 1740cm−’の吸収帯(脂肪族エステル基を示すと
考えられる)。
1650cm−’および1540cm−’の吸収帯(ア
ミド基を示すと考えられる)。
E、!外装蛸入さ久上西 紫外波長範囲では検出可能なピークを示さない。
F、主解牲 水には可溶であるが、すべての一般有機溶媒に不溶であ
る。
G、凡1人度 測定可能な比旋光度を示さない。
脱アセチル化ヘテロ多糖 別の態様において、本発明は、増殖炭素源を含有する水
性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌
菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖の
水溶液を生成させ、この水溶液のpHをアルカリ性範囲
に調整してヘテロ多糖を脱アセチル化し、前記水溶液を
約60〜150 ”cの温度に加熱して、熱変性された
脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることから
なる方法を提供する。
使用する細菌菌株がメチロフィルス・ビスコゲネスAT
CC39893またはその変異株であり、増殖炭素源が
メタノールである場合には、得られた生成物は、熱変性
された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54に相当する。
さらに別の態様において、本発明は、脱アセチル化ヘテ
ロ多糖ポリ54の水溶液を約60〜150℃の温度に加
熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54
を得ることからなる方法を提供する。
また別の態様において、本発明は、脱アセチル化ヘテロ
多糖ポリ54の水性スラリーを約60〜150℃の温度
に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ
54を固体形態で得ることからなる方法を提供する。
メチロフィルス・ビスコゲネス細菌菌株によるエキソ多
糖の生合成、および生成したエキソ多糖の脱アセチル化
ヘテロ多糖への化学的転化については、本出願人による
1986年3月3日出願の米国特許出願&835.81
3に説明されているので、参照されたい。
脱アセチル化エキソ多糖生成物を得るためのアルカリ処
理は、エキソ多糖中間体の水溶液のpi−1を、約20
〜IOθ℃の温度でアルカリ性試薬により約7〜13、
好ましくは約8〜12のpH値に調整し、このアルカリ
処理をエキソ多糖の加水分解性脱了セチル化を達成する
のに十分な時間続けることにより実施することができる
。−船釣な反応時間は約0.1〜2時間である。アルカ
リ性試薬としてはアンモニアもしくは有機アミン、また
は水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基性無機化
合物が使用できる。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖を得るための熱処理時間
は約0.1〜10時間の範囲内であり、一般には約0.
5〜5時間の処理時間が採用されよう。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54のような本発明
の方法の生成物は、慣用手段、例えば、水性媒質を水混
和性有機溶媒により希釈して生成物を沈澱させることに
より、水性媒質から固体生成物として回収することがで
きる。好適な希釈用有機溶媒の例は、メタノール、エタ
ノール、プロパツール、アセトン、テトラヒドロフラン
などである。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖の沈澱はまた、水溶液を
炭酸カルシウムもしくは水酸化バリウムなどの金属塩で
処理することによっても可能である。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖生成物はカルボン酸基を
含有し、これはカルボン酸の金属塩もしくは遊離酸のい
ずれも形態でも存在できる。
本発明の熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54は新規
物質である。
熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54は、約s
oo、 ooo〜1,500,000の範囲内の平均分
子量を有する。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54は、脱イオン水
性媒質中でブルックフィールド粘度計(少量試料用アダ
プター付き)のスピンドル隘31により25℃で測定し
て、0.1sec−’の剪断速度において少なくとも約
8000 cpの0.25重量%粘度を示す。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の水溶液は無色
透明であり、疑イ以塑性およびチキソトロピー性の粘度
特性を示す。この水溶液粘度特性は、約130℃までの
温度および約12までOpH値において安定である。
低剪断速度条件下で、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポ
リ54は、一般に市販のキサンタン・ガムの約5〜50
倍の見掛は粘度を示す。脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ5
4、熱変性した脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54、およ
び市販のキサンタン・ガム〔例、ケルザン(Kelza
n) 〕の剪断条件下での粘度特性の比較データを、添
付の第2図に示す。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54のその他の物理
化学的および構造上の特徴は次の通りである。
A、糖の構成(モル比) グルコース   10 ガラクトース 7〜10 マンノース   1〜3 グリクロン酸 1〜3 上記グリクロン酸成分は、グルクロン酸および/または
ガラクツロン酸および/またはマンヌロン酸からなる。
熱変性脱了セチル化ヘテロ多糖ポリ54は、ピルビン酸
もしくはタンパク質を含有せず、アセチル基含有量は4
単糖単位あたり約1個未満である。
通常は、上記アルカリ処理により、生成時のヘテロ多糖
ポリ54に存在していたアセチル基はすべて除去されて
しまう。不完全に脱アセチル化されたヘテロ多糖ポリ5
4も製造および熱処理することができる。
B、メ11」[k流し1 c    38.22 H5,57 o    40.41 N     1.58 *灰分補正済 C9敗□点 明確な融点を示さず、約150℃より高温で分解する。
D、赤外スペクトル 1740cm−’の吸収帯(脂肪族エステル基を示すと
考えられる)。
1650cm−’および1540cm−’の吸収帯(ア
ミド基を示すと考えられる)。
E、聚方漫濠り!を外り止 254mμにブロードなλmaxピークを示す。
F、溶解性 水には可溶であるが、すべての一般有機溶媒に不溶であ
る。
G、几蓋叉農 測定可能な比旋光度を示さない。
熱処理に本奏変性 ヘテロ多糖ポリ54型のエキソ多糖の熱処理は、ヘテロ
多糖分子の化学的構成に変化を及ぼさないようである。
ごのヘテロ多糖の元素分析の結果は、熱処理の前と後と
で同じである。
このヘテロ多糖の紫外および赤外スペクトルについても
、熱処理の前後で有意差はない。
熱処理の前後で上記ヘテロ多糖に現れる差異は、ヘテロ
多糖分子の物理化学的配座(例、例ランダムコイル対ロ
ンド形状)に関係するようである。
別のパラメータは、非特異的絡み合い(entangl
ements)とは違った機械的および機能的特性を有
する分子内および分子間の静電気結合の存在である。
ヘテロ多糖ポリ54のようなエキソ多糖は、水性媒質中
での熱処理により、分子内および分子間の静電気結合の
変化を生ずると考えられる。分子は物理的に再配列し、
熱力学的により有利な幾何学的配座(物理的測定および
NMRスペクトルが示すように永久的なもの)をとるも
のと推定される。
熱変性後のヘテロ多糖は、対応する未変性のヘテロ多糖
に比べてより効果的な粘度増強剤となる。
熱変性ヘテロ多糖水溶液の塩類に対する許容度は、対応
する未変性ヘテロ多糖より大きい。
本発明は、水性媒質中で改善された粘度増強特性を示す
熱変性ヘテロ多糖の製造のための別の新規な処理方法も
包含する。
その1態様によれば、本発明により、(al増殖炭素源
を含有する水性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコ
ゲネスの細菌菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外
ヘテロ多糖を含有する培地水溶液を生成させ、(b)こ
の培地水溶液から水を除去して、約5〜20g/lの細
胞外ヘテロ多糖を含有する濃縮水溶液を形成し、(c)
この濃縮水溶液を約60〜150℃の温度に加熱して、
熱変性されたヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることから
なる方法が提供される。
工程(blおよび(c1の機能は、これらを併合して1
操作として実施することができる。工程fblにおける
水の除去は、減圧蒸留もしくは逆浸透などの手段により
実施することができる。
別の態様において、本発明は、(a)増殖炭素源を含有
する水性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネス
の細菌菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外ヘテロ
多糖を含有する培地水溶液を生成させ、(blこの水溶
液のpHをアルカリ性範囲に調整して生成したヘテロ多
糖を脱アセチル化し、fclこの培地水溶液から水を除
去して、約5〜20g/βの細胞外脱アセチル化ヘテロ
多糖を含有する濃縮水溶液を形成し、(dlこの濃縮水
溶液を約60〜150℃の温度に加熱して、熱変性され
た脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることか
らなる方法を提供する。
工程(c)および(dlの機能は、例えば加熱しながら
減圧蒸留することで、1操作に併合して実施することが
できる。
上記の二つの態様による熱変性ヘテロ多糖水溶液の製造
において、メチロフィルス・ビスコゲネスATCC39
893またはその変異株を細菌菌株として使用すると、
得られる生成物はそれぞれ熱変性ヘテロ多糖ポリ54お
よび熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54を含有する
濃縮水溶液となる。
第1図および第2図に示したように、未変性のヘテロ多
糖ポリ54および未変性の脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ
54は、0.4%(w/v)より低濃度の水溶液ではキ
サンタン・ガムと同等の見掛は粘度を示す。さらに低濃
度〔例、0.25%(−/ν)以下)ではキサンタン・
ガム水溶液の方がいくらか大きな見掛は粘度を示すこと
もある。ポリマー(多糖)温度が増大するにつれて〔例
、0.5%(v+/v)以上になると〕、ヘテロ多糖ポ
リ54水溶液の見掛は粘度は同濃度のキサンタン・ガム
水溶液より著しく大きくなり、例えば、見掛は粘度はキ
サンタン・ガムの5〜30倍に達する。
ムチロフィルス・ビスコゲネス 新規菌種メチロフィルス・ビスコゲネスおよびそのエキ
ソ多糖の生産についての詳しい説明は、特願昭62−2
41201号に詳述されているので、参照されたい。
メチロフィルス・ビスコゲネスの各菌株は新規な組合せ
の性質を示し、それによりこれらは他のメチロトローフ
性細菌から区別される。菌株ATCC39893のよう
なメチロフィルス・ビスコゲネス菌は、01同化のりブ
ロース−リン酸経路を利用し、典型的には35〜40℃
で1〜3時間という増殖速度倍加時間を有する1型(タ
イプ1)の任意メチロトローフである。
ATCC39893菌株はメタノール、フルクトースお
よびグルコースを基質として増殖する。また、ギ酸もし
くはメタノールの形態の外来エネルギー供給が存在する
場合には、この菌株はより広範囲の従属栄養基質(例、
コハク酸およびピルビン酸)でも増殖しよう。これは、
既知のどの微生物についても報告されたことのない特性
である。同定のために、この現象を示す細菌を、ここに
1潜在的任意メチロトローフ」と呼ぶことにする。
ATCC39893菌株およびその変異株の特徴を包含
する性質を有する細菌はまた、固体培地での淡橙色コロ
ニーの非粘液性増殖によっても特徴づけられる。菌株A
TCC39893型のメチロトローフ性細菌の別の菌学
的特徴は、ヘキスロースリン酸シンターゼ/ヘキスロー
スリン酸イソメラーゼ活性〔J、P、 Van Dij
ken et al、+ エフイーエムニス・マイクロ
バイオロジカル・レター(FEMS Microbio
l。
Letter)、  4.97 (1978) )が、
タンパク質1■当たりの1分間のNADH生成量で少な
くとも約400ナノモルであることである。
任意メチロトローフであるATCC39893型菌株の
別の顕著な特性は、メタノール基質を主転化させて、水
溶液に擬似塑性とチキソトロピー性とを付与するエキソ
多糖を蓄積した量で生産する能力である。ATCC39
893菌株の細菌は、細胞増殖の有無にかかわらず多様
な培養条件下で培地中に多量の蓄積したエキソ多糖を生
産することができる点で特に顕著である。菌株ATCC
39893型の細菌は、利用可能な炭素源のうちエキソ
多糖の生合成に利用される割合が大きいという固有の能
力を有している。
本明細書で使用した「メチロトローフ」なる用語は、1
もしくは2以上の炭素原子を含有するが、炭素−炭素結
合を含有していない炭素化合物により非独立栄養的に増
殖することのできる微生物を意味する。「独立栄養的」
とは、二酸化炭素基質による増殖を意味する。
本明細書において「任意メチロトローフ」とは、1種も
しくは2種以上の従属栄養基質(例、フルクトース)上
でも増殖できるメチロトローフを意味する。
本明細書で使用した「変異株」とは、親菌株から誘導さ
れた菌株であって、親菌株とは表現型および/または遺
伝子型が異なり、エキソ多糖を生合成することができる
というメチロトローフ性親菌株の能力を示すメチロフィ
ルス・ビスコケネスの菌株を意味する。
変異株の1例は、菌株ATCC39893の突然変異菌
株である菌株ATCC53412である。
ATCC39893のリファンピシン耐性菌株の日常的
な継代培養中に、増殖培地に自然変異株が生成した。こ
の変異株はメタノール/アンモニウム無機塩類寒天プレ
ート上でのコロニー形態が普通とは違っていたために検
出された。
このプレート上で増殖させたATCC39893のコロ
ニーは小さな丸型の淡橙色コロニーで、本質的に非粘液
性である。上記変異株の方のコロニーは、より大きく 
(直径約4mm)、色がオフホワイトないし透明であり
、本質的に非常に粘液性であった。
この新1株(ATCC53412)は、リファンピシン
耐性を示し、ATCC398’13菌株と同様の培養学
的および生化学的特性を示し、最終的にはATCC39
893菌株との染色体DNA : DNAハイブリッド
形成能力から、ATCC39893の変異株であると決
定された。
この変異株ATCC53412は、ペテロ多糖ポリ54
に相当するエキソ多糖を構成的に合成することができる
。菌株、ATCC53412は、ATCC39893の
2〜3倍の最適増殖速度を有する。
寄託番号ATCC39893およびATCC53412
の菌株の継代培養株は、米国メリーランド州ロックビル
所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(ATCC)の恒久的微生物コレクシジンから請求によ
り入手することができる。この培養菌株は、特許手続き
のためのブダペスト条約の要件に従って寄託されている
以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであ
る。使用した要素および具体的成分は代表例として示し
たものであって、本発明の範囲内で以上の説明に基づい
て各種の変更をなすことができる。
メタノール同化細菌の増殖に対しては、無機塩類培地(
MS)(、第1表)を使用した。この培地に、Ig/β
の硝酸カリウムを補給して硝酸無機塩類培地(NMS)
とするか、またはIg#!の塩化アンモニウムを補給し
てアンモニウム無機塩類培地(AMS)とした。炭素源
のメタノールは0,2〜0.5%(v/v)の濃度で使
用するのが好ましい。
固体培地に対しては、滅菌の前に17g#!のジフコ社
製細菌用寒天(バクトアガー)を、リン酸塩を抜いた基
本の無機塩類培地に添加する。次いで、滅菌した無機塩
類培地に冷却後に滅菌リン酸塩溶液を無菌添加する。
醗酵操作は、ビー・ブラウン(B、Braun)インス
トルメンツ・バイオスタンドS型醗酵装W(容量62)
を使用して行う。使用容積は31とし、醗酵装置の滅菌
後にメタノールを無菌添加する。
460 ml/minの空気供給速度で、500 rp
mの攪拌速度を日常的に使用する。この醗酵装置は、p
Hおよび溶解酸素制御手段を備えている。
ヘキスロースリン酸シンターゼの酵素作用の生成物であ
るヘキスロース6−リン酸の分析法がないので、ヘキス
ロースリン酸シンターゼ/ヘキスロースリン酸イソメラ
ーゼを同時に分析する。へキスロースリン酸イソメラー
ゼにより、ヘキスロース6−リン酸はグルコース6−リ
ン酸に転化され、このグルコース6−リン酸はグルコー
ス6−リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、同時に起こる
NADP”還元を340 nmで追跡することにより測
定することができる。この酵素分析溶液は次の成分を含
有する(最終濃度)ニリン酸緩衝液50 mM、 pH
7,2; 塩化マグネシウム2.5mM;グルコース6
−リン酸デヒドロゲナーゼ0.7単位;ホスホグルコイ
ソメラーゼ0.75単位;ホスホリボースイソメラーゼ
1.75単位;リボース5−リン酸5 d ; NAD
P” 0.25 mM  ;ならびにホルムアルデヒド
5 mM。
少しでもヒドロキシピルビン酸レダクターゼが存在する
ことは、微生物においてセリン経路のホルムアルデヒド
同化が起こったことを示す。この酵素は、次の成分を含
有する(最終濃度)酵素分析溶液により測定できるニリ
ン酸カリウムIM。
pH6,3;ヒドロキシピルビン酸リチウム0.01 
M;およびNADH2mM 。NADHの消失を340
 nmで測定する。
グリセロールおよびジヒドロキシアセトンの測定は、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ/ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ(グリセロール:NAD”2−オキシドレダ
クターゼ、 PC1,1,1,6)により行われる。こ
の酵素は、エンテロバクタ−・アエロゲネス(Ente
robacter aerogenes)から誘導され
、シグマ・バイオケミカルズ社より入手できる。
グリセロールの測定に対しては、反応混合物(1、Om
l)は、5(Dlmolのトリス−HCl緩衝液(シグ
マ・ハイオケミカルズ社)、 pH9,7;0.2 μ
molのNAD”  ; 1単位の酵素;および15.
c+molのグリセロール(もしくは試験溶液/醗酵ブ
ロス、20〜50μβ)を含有する。分析は、基質の添
加により開始され、その後、ペックマン25型UV分光
光度計により340 nmでの吸光度の増大を監視する
ジヒドロキシアセトンの測定に対しては、反応混合物(
0,1ml)は、50μwlolのリン酸緩衝液。
pH6,0; 0.57M+olのNADH; 1単位
の酵素;および15μll1olのジヒドロキシアセト
ン(もしくは試験溶液/醗酵ブロス、20〜50 ml
)を含有する。
分析は、基質の添加により開始され、その後340nm
での吸光度の減少を監視する。
多糖類の水溶液のレオロジー特性の測定は、ウェルズ(
Wel Is;) /ブルックフィールド・コーン/プ
レート・ディジタル式粘度計、あるいは同軸シリンダ・
センサ・システムを取りつけたレオマツ) (Rheo
mat) 30型粘度計により行う。
比較用の粘度測定に用いたキサンタン・ガムは、米国カ
リフォルニア州すンジエゴ所在のケルコ社(Kelco
 Co、)製の市販品ケルザン(Kelzan)である
エキソ多糖の単糖含有量の分析は、加水分解−気液クロ
マトグラフィー法により行う。
ス1」0一 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多糖代謝産物の生産、およ
びその後の熱処理による熱変性エキソ多糖の生成を例示
する。
ATCC39893菌株の接種液500 mlを、MS
培地、1g/lの塩化アンモニウムおよび増殖炭素源と
して0.5%(v/v)のメタノールを使用して増殖さ
せる。フラスコは37℃で2日間インキユヘーションす
る。こうして得られた培養液を使用して、MS培地10
 e、塩化アンモニウムIg/β、およびメタノール0
.5%(v/v)を入れた容量141のニュー・ブラン
ズウィンク・マイクロファーム(NewBrunswi
ck Microferm)醗酵装置を接種する。
最初の醗酵条件は次の通りである137℃、攪拌20O
rpm、空気流量2ff/min、およびpH7,0゜
pHは醗酵中はぼ7.0に制御する。醗酵培地中の炭素
分が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して、0
.5%(v/v)の濃度を保持する。メタノールの濃度
は気液クロマトグラフィーにより測定する。24〜36
時間の醗酵後、攪拌速度を40Orpmに増大させる。
メタノールが培養液により利用されなくなったら(i!
常5〜7日後)、醗酵を終了させる。
得られた水溶液をオートクレーブに移し、121℃に1
時間加熱する。
この熱処理の後、得られた水溶液をイソプロパノール水
溶液(アルコール:水−2:1)で希釈して、ヘテロ多
糖生成物を沈澱させる。この沈澱を濾別する。濾別した
沈澱をほぼ同量のイソプロパツールで洗浄した後、風乾
するか、または強制空気循環式乾燥器により55℃で乾
燥する。乾燥した固体をその後、ウィリーミルまたはハ
ンマーミルにより粉砕して粉末状とする。かくして得ら
れた熱処理後のヘテロ多糖生成物の物理化学的性質は、
熱変性ヘテロ多糖ポリ54について上述した性質と一致
している。
実施例2 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多糖代謝産物の生産、およ
びその後のアルカリ処理と熱処理による熱変性脱アセチ
ル化ヘテロ多糖の生成を例示する。
八TCC39893菌株の接種液500 mlを、MS
培地、Ig/j!の塩化アンモニウムおよび増殖炭素源
として0.5%(v/v)のメタノールを使用して増殖
させる。フラスコは37℃で2日間インキュヘーション
する。こうして得られた培養液を使用して、MS培地1
01、塩化アンモニウム1g/l、およびメタノール0
.5%(v/v)を入れた容量14 βのニュー・ブラ
ンズウィンク・マイクロファーム醗酵装置を接種する。
最初の醗酵条件は次の通りである237℃、攪拌20O
rpm、空気流量2n/min、およびpH7,0゜p
Hは醗酵中はぼ7.0に制御する。醗酵培地中の炭素分
が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して、0.
5%(V/ν)の濃度を保持する。メタノールの濃度は
気液クロマトグラフィーにより測定する。24〜36時
間の醗酵後、攪拌速度を40Orpmに増大させる。
メタノールが培養液により利用されなくなったら(通常
5〜7日後)、醗酵を終了させる。この水性醗酵培地の
pHを、水酸化ナトリウムによりpH12に調整し、p
H12に2時間保持した後、醗酵培地を塩酸で中和して
、脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の水溶液を得る。
得られた水溶液をオートクレーブに移し、121℃に1
時間加熱する。
この熱処理の後、得られた水?8液をイソプロパツール
水溶液(アルコール:水−2:l)で希釈して、ヘテロ
多糖生成物を沈澱させる。この沈澱を濾別する。濾別し
た沈澱をほぼ同量のイソプロパツールで洗浄した後、風
乾するか、または強制空気循環式乾燥器により55℃で
乾燥する。乾燥した固体をその後、ウィリーミルまたは
ハンマーミルにより粉砕して粉末状とする。かくして得
られた熱処理後の脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の物理
化学的性質は、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54
について上述した性質と一致している。
Mg50.・7H201g CaClz           0.2gNa、HP
o、          0.33 ggnzpoa 
         0.26gFeEDTA     
      5.OmgCuCIz ・H2O2,Om
g NaxMoO4・2)1zO2,OmgFeSOt・7
HzO500、ug ZnSOa ・7H2040088 MnC1z ・4Hz0      20  μgH3
B0.          15 8gCoC1z ’
 61420      50  μgNiCh・6H
2010μg EDTA           250  μgH20
11!、  pH6,8
【図面の簡単な説明】
第1図は、熱変性ヘテロ多糖ポリ54の水溶液粘度特性
(多糖濃度1 g/ 1 )を、未変性のヘテロ多糖ポ
リ54および市販のキサンタン・ガムと比較して示すグ
ラフ、および 第2図は、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の水
溶液粘度特性(多$1! ta度1g/ff)を、未変
性の脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54および市販のキサ
ンタン・ガムと比較して示すグラフである。 出願人 セルジーン・コーポレーション代理人 弁理士
 広 瀬 章 − 1g1 一〇 黙変4iヘテロク糟ホ・ン54 +=キブンタ/カム ◇;へナロク總ホ0ン54

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)メチロフィルス・ビスコゲネス(Methylo
    philusviscogenes)の細菌菌株の好気
    的培養により製造されたヘテロ多糖を含有する水溶液の
    粘度増大方法であって、この水溶液を溶液粘度の増大を
    達成するに十分な時間約60〜150℃の温度に加熱す
    ることからなる、前記水溶液の粘度増大方法。
  2. (2)前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネス
    ATCC39893もしくはATCC53412または
    これらの変異株である、特許請求の範囲第1項記載の方
    法。
  3. (3)前記水溶液が約50重量%までの水混和性有機溶
    媒を含有するものである、特許請求の範囲第1項記載の
    方法。
  4. (4)増殖炭素源としてメタノールを含有する水性栄養
    培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ATC
    C39893もしくはその変異株を好気培養して、細胞
    外ヘテロ多糖ポリ54の水溶液を生成させ、この水溶液
    を約60〜150℃の温度に加熱して、熱変性されたヘ
    テロ多糖ポリ54の水溶液を得ることからなる、熱変性
    ヘテロ多糖ポリ54の製造方法。
  5. (5)ヘテロ多糖54の水性スラリーを約60〜150
    ℃の温度に加熱して、熱変性ヘテロ多糖ポリ54を固体
    形態で得ることからなる、熱変性ヘテロ多糖ポリ54の
    製造方法。
  6. (6)熱変性されたヘテロ多糖ポリ54。
  7. (7)脱イオン水性媒質中でブルックフィールド・スピ
    ンドルNo.31により25℃で測定して、0.1se
    c^−^1の剪断速度において少なくとも約8000c
    pの0.25重量%粘度を示す、特許請求の範囲第6項
    記載の熱変性ヘテロ多糖ポリ54。
  8. (8)0.005〜5重量%の濃度範囲について約0.
    01〜1000sec^−^1の専断速度で、ヘテロ多
    糖ポリ54の同濃度水溶液について測定した水溶液粘度
    〔単位:センチポアズ(cp)〕の少なくとも2倍の水
    溶液粘度を示すことを特徴とする、特許請求の範囲第6
    項記載の熱変性ヘテロ多糖ポリ54。
  9. (9)増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で、メチロ
    フィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養して、蓄
    積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する水溶液を生成さ
    せ、この水溶液のpHをアルカリ性範囲に調整してヘテ
    ロ多糖を脱アセチル化し、前記水溶液を約60〜150
    ℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ
    多糖生成物の水溶液を得ることからなる、熱変性脱アセ
    チル化ヘテロ多糖の製造方法。
  10. (10)前記増殖炭素源がメタノールである、特許請求
    の範囲第9項記載の方法。
  11. (11)前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スATCC39893もしくはその変異株であり、前記
    生成物が熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54である
    、特許請求の範囲第9項記載の方法。
  12. (12)脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の水溶液を約
    60〜150℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセ
    チル化ヘテロ多糖ポリ54を得ることからなる、熱変性
    脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の製造方法。
  13. (13)脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の水性スラリ
    ーを約60〜150℃の温度に加熱して、熱変性された
    脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54を固体形態で得ること
    からなる、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54の製
    造方法。
  14. (14)熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54
  15. (15)脱イオン水性媒質中でブルックフィールド・ス
    ピンドルNo.31により25℃で測定して、0.1s
    ec^−^1の剪断速度において少なくとも約8000
    cpの0.25重量%粘度を示す、特許請求の範囲第1
    4項記載の熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ54。
  16. (16)0.005〜5重量%の濃度範囲について約0
    .01〜1000sec^−^1の専断速度で、脱アセ
    チル化ヘテロ多糖ポリ54の同濃度水溶液について測定
    した水溶液粘度〔単位:センチポアズ(cp)〕の少な
    くとも2倍の水溶液粘度を示すことを特徴とする、特許
    請求の範囲第14項記載の熱変性脱アセチル化ヘテロ多
    糖ポリ54。
  17. (17)(a)増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で
    、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養
    して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する培地水
    溶液を生成させ、(b)この培地水溶液から水を除去し
    て、約5〜20g/lの細胞外ヘテロ多糖を含有する濃
    縮水溶液を形成し、(c)この濃縮水溶液を約60〜1
    50℃の温度に加熱して、熱変性されたヘテロ多糖生成
    物の水溶液を得ることからなる、熱変性ヘテロ多糖水溶
    液の製造方法。
  18. (18)工程(b)および(c)を併合して1操作とし
    て実施する、特許請求の範囲第17項記載の方法。
  19. (19)増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範
    囲第17項記載の方法。
  20. (20)前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スATCC39893もしくはATCC53412また
    はこれらの変異株であり、前記生成物が熱変性ヘテロ多
    糖ポリ54である、特許請求の範囲第17項記載の方法
  21. (21)(a)増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で
    、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養
    して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する培地水
    溶液を生成させ、(b)この水溶液のpHをアルカリ性
    範囲に調整して生成したヘテロ多糖を脱アセチル化し、
    (c)この培地水溶液から水を除去して、約5〜20g
    /lの細胞外脱アセチル化ヘテロ多糖を含有する濃縮水
    溶液を形成し、(d)この濃縮水溶液を約60〜150
    ℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ
    多糖生成物の水溶液を得ることからなる、熱変性脱アセ
    チル化ヘテロ多糖水溶液の製造方法。
  22. (22)工程(c)および(d)を併合して1操作とし
    て実施する、特許請求の範囲第21項記載の方法。
  23. (23)工程(b)、(c)および(d)を併合して1
    操作として実施する、特許請求の範囲第21項記載の方
    法。
  24. (24)増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範
    囲第21項記載の方法。
  25. (25)前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スATCC39893もしくはATCC53412また
    はこれらの変異株であり、前記生成物が熱変性脱アセチ
    ル化ヘテロ多糖ポリ54である、特許請求の範囲第21
    項記載の方法。
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