JPS6342694A - 熱変性へテロ多糖の製法 - Google Patents

熱変性へテロ多糖の製法

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JPS6342694A
JPS6342694A JP62190571A JP19057187A JPS6342694A JP S6342694 A JPS6342694 A JP S6342694A JP 62190571 A JP62190571 A JP 62190571A JP 19057187 A JP19057187 A JP 19057187A JP S6342694 A JPS6342694 A JP S6342694A
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heteropolysaccharide
heat
aqueous solution
denatured
deacetylated
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JP62190571A
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マルシオ・ボロチ
デビッド・アイ・スターリング
キャサリン・ペグラム
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、任意メチロトローフ性細菌であるメチロフ
ィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓｖ
ｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株を増殖条件下で培養して蓄
積した量のエキソ多ｔｉ　＜例、ヘテロ多糖ポリ５４）
を含有する水溶液を生成させ、この水溶液を加熱して、
熱変性されたエキソ多糖を得ることからなる、熱変性エ
キソ多糖類の製造方法に関する。得られた熱変性エキソ
多糖は、水溶液に高い疑似塑性とチキソトロピー性とを
付与することができる。
（従来の技術） メチロフィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈ
ｉｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）は、ホルム
アルデヒド固定のりブロース−リン酸経路（ＲＭＰ）サ
イクルを利用する絶対メチロトローフ性細菌である。メ
チロフィルス・メチロトロフスの菌株ＡＳ−１は、一本
の極鞭毛を持ったダラム陰性の非着色桿菌である。
メタノールなどのＣ１化合物は一般に単細胞タンパク質
（ＳＣＰ）製造用の基質として検討されているが、メタ
ノールをＳＣＰ製造に適格とする因子により、これはま
たエキソ多糖類のような蓄積された細胞外代謝産物製造
用の供給原料としても有望である。メタノールを付加価
値の高い製品に転化させる多くの微生物学的方法が発表
されているが、それらは一般にアミノ酸のような低容積
／高価格の化合物の製造を目的としている。たとえば、
Ｊ、　ＢｏｌｂｏｔおよびＣ，Ａｎｔｈｏｎｙは、Ｐｒ
ｏｃ。
Ｓｏｃ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　５．４３
　（１９７８）において、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）　Ａ　Ｍ　Ｉのピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ欠乏変異株が、メタノールでの増殖中にアミノ酸で
あるアラニンとバリンを蓄積できることを見出した。Ｙ
、　Ｔａｎ１　らは、＾ｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４２．２２７５　（１９７
８）に、アルスロバクタ−・グロビフォルミス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｏｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌株
を使用してメタノールから５．２ｇ／！までのＬ−セリ
ンが生産されることを述べている。しかし、日常消費型
の大量化学物質へのＣ１化合物の生物学的転化に関して
は現在まで未だに報告がない。
（発明が解決しようとする問題点） よって、本発明の目的は、増殖炭素源を蓄積した量のエ
キソ多糖代謝産物に生物学的に転化させる醗酵方法を提
供することである。
本発明の別の目的は、Ｃ１化合物を蓄積した量のエキソ
多糖に生酔化させ、生成したエキソ多糖を熱変性して新
規なヘテロ多糖を形成する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、水溶液に高い擬似塑性およ
びチキソトロピー性を付与する、新規形態のヘテロ多糖
ポリ５４を提供することである。
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明
および実施例から明らかとなろう。
（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌
菌株の好気的培養により製造されたヘテロ多糖を含有す
る水溶液を溶液粘度の増大を達成するに十分な時間約６
０〜１５０℃の温度に加熱することからなる、前記水溶
液の粘度増大方法の提供により達成される。
この水溶液は、約５０重量％までの水混和性有機溶媒、
例えばメタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジ
メチルホルムアミドなど、を含有することができる。
別の態様において、本発明は、増殖炭素源（例、Ｃ１化
合物またはフルクトース）を含有する水性栄養培地中で
、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣＣ３９８
９３もしくはその変異株を好気培養して、細胞外ヘテロ
多糖ポリ５４の水溶液を生成させ、この水溶液を約６０
〜１５０℃の温度に加熱して、熱変性されたヘテロ多糖
ポリ５４の水溶液を得ることからなる方法を提供する。
本発明の方法におけるヘテロ多糖の熱処理時間は、一般
に約０．１〜１０時間の範囲内であろう。
熱処理により得られた熱変性ヘテロ多糖ポリ５４は新規
物質である。
任意操作とし”ζ、熱処理工程を実施する前に、培地か
ら全菌体を除去してもよい。培地からの全菌体の除去は
、遠心分離もしくは限外濾過のような慣用手段により実
施でき、次いで菌体を含有しないエキソ多糖代謝産物の
水溶液は、熱処理および生成物回収のために後続処理工
程に付すことができる。
本明細書で使用した「ＣＩ化合物」なる用語は、メタノ
ール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルムアミド、−酸化
炭素、ジメチルエーテル、メチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミンおよびトリメチルアミンＮ−オキ
シドのように、炭素−炭素結合を全く含有しない有機化
合物を意味する。
本明細書において、「エキソ多糖」とは、キサン（キサ
ンタン・ガム）で例示されるような、醗酵培地中に細胞
外代謝産物として蓄積する多糖を意味する。
本明細書において、「ヘテロ多糖」とは、少なくとも２
種類の異なる単糖単位、たとえばマンノースおよびガラ
クトース、から構成される多糖を意味する。
本明細書において、「熱変性」とは、水性媒質中での熱
処理により多糖に導入された物理化学的変化（熱処理前
の同じ多糖に対する変化）を意味する。
また別の態様において、本発明は、ヘテロ多糖ポリ５４
の水性スラリーを約６０〜１５０℃の温度に加熱して、
熱変性ヘテロ多糖ポリ５４を固体形態で得ることからな
る方法を提供する。このスラリーの水性相は水混和性の
有機溶媒を含有することができ、それにより熱処理時に
溶解状態のヘテロ多糖ポリ５４の含有量を低下させるこ
とができる。
本発明の方法により生成した熱変性ヘテロ多糖の水溶液
からの回収は、凍結乾燥、または水溶性有機溶媒（例、
アセトン、メタノール、エタノールなど）による沈澱と
いった任意の適当な方法により実施できる。熱変性ヘテ
ロ多糖の沈澱は、水溶液を多価金属（例、カルシウムも
しくはバリウム）の塩で処理することによっても達成で
きる。
粗製の熱変性ヘテロ多糖は、水に再溶解させ、得られた
水溶液を透析および凍結乾燥処理することにより精製品
とすることができる。
熱変性ヘテロ多糖ポリ５４生成物は、約８００．０００
〜１，５００，０００の範囲内の平均分子量を有する。
熱変性ヘテロ多糖ポリ５４は、脱イオン水性媒質中でブ
ルックフィールド回転円筒粘度計（少量試料用アダプタ
ー付き）のスピンドルＩＩｋ１３１により２５℃で測定
して、０．１ｓｅｃ−’の剪断速度において少なくとも
約８０００　ｃｐの０．２５重量％粘度を示す。熱変性
ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液は無色透明であり、疑似塑
性およびチキソトロピー性の粘度特性を示す。この水溶
液粘度特性は、約１３０℃までの温度および約１２まで
のｐＨ値において安定である。
低剪断速度条件下で、熱変性ヘテロ多糖ポリ５４は、一
般に市販のキサンタン・ガムの約５〜５０倍という見掛
は粘度を示す。ヘテロ多糖ポリ５４、熱変性ヘテロ多糖
ポリ５４、および市販のキサンタン・ガム〔例、ケルザ
ン（Ｋｅｌｚａｎ）　）の剪断条件下での粘度特性の比
較データを、添付の第１図に示す。
熱変性ヘテロ多糖ポリ５４のその他の物理化学的および
構造上の特徴は次の通りである。
Ａ、補（Ｄ＋Ｒｒ灸］四ｋ」リー グルコース　　　１０ ガラクトース　７〜１０ マンノース　　　１〜３ グリクロン　　１〜３ 熱変性ヘテロ多糖ポリ５４は約１〜３重量％の窒素を含
有する。熱変性ヘテロ多糖ポリ５４は、ピルビン酸もし
くはタンパク質含有量を示さず、４単糖単位あたり約１
個のアセチル基を含有する。そのグリクロン酸（ｇｌｙ
ｃｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）成分は、グルクロン酸およ
び／またはガラクツロン酸および／またはマンヌロン酸
からなる。
８０元１」１Ｌりり−１ Ｃ３９，２ Ｈ６，１ ０４３、Ｉ Ｎ　　　　２．１７ ＊平均値；灰分補正済 Ｃ０融点 明確な融点を示さず、約１５０℃より高温で分解する。
Ｄ、亦Ａノぐセ江し少 １７４０ｃｍ−’の吸収帯（脂肪族エステル基を示すと
考えられる）。
１６５０ｃｍ−’および１５４０ｃｍ−’の吸収帯（ア
ミド基を示すと考えられる）。
Ｅ、！外装蛸入さ久上西 紫外波長範囲では検出可能なピークを示さない。
Ｆ、主解牲 水には可溶であるが、すべての一般有機溶媒に不溶であ
る。
Ｇ、凡１人度 測定可能な比旋光度を示さない。
脱アセチル化ヘテロ多糖 別の態様において、本発明は、増殖炭素源を含有する水
性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌
菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖の
水溶液を生成させ、この水溶液のｐＨをアルカリ性範囲
に調整してヘテロ多糖を脱アセチル化し、前記水溶液を
約６０〜１５０　”ｃの温度に加熱して、熱変性された
脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることから
なる方法を提供する。
使用する細菌菌株がメチロフィルス・ビスコゲネスＡＴ
ＣＣ３９８９３またはその変異株であり、増殖炭素源が
メタノールである場合には、得られた生成物は、熱変性
された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４に相当する。
さらに別の態様において、本発明は、脱アセチル化ヘテ
ロ多糖ポリ５４の水溶液を約６０〜１５０℃の温度に加
熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４
を得ることからなる方法を提供する。
また別の態様において、本発明は、脱アセチル化ヘテロ
多糖ポリ５４の水性スラリーを約６０〜１５０℃の温度
に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ
５４を固体形態で得ることからなる方法を提供する。
メチロフィルス・ビスコゲネス細菌菌株によるエキソ多
糖の生合成、および生成したエキソ多糖の脱アセチル化
ヘテロ多糖への化学的転化については、本出願人による
１９８６年３月３日出願の米国特許出願＆８３５．８１
３に説明されているので、参照されたい。
脱アセチル化エキソ多糖生成物を得るためのアルカリ処
理は、エキソ多糖中間体の水溶液のｐｉ−１を、約２０
〜ＩＯθ℃の温度でアルカリ性試薬により約７〜１３、
好ましくは約８〜１２のｐＨ値に調整し、このアルカリ
処理をエキソ多糖の加水分解性脱了セチル化を達成する
のに十分な時間続けることにより実施することができる
。−船釣な反応時間は約０．１〜２時間である。アルカ
リ性試薬としてはアンモニアもしくは有機アミン、また
は水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基性無機化
合物が使用できる。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖を得るための熱処理時間
は約０．１〜１０時間の範囲内であり、一般には約０．
５〜５時間の処理時間が採用されよう。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４のような本発明
の方法の生成物は、慣用手段、例えば、水性媒質を水混
和性有機溶媒により希釈して生成物を沈澱させることに
より、水性媒質から固体生成物として回収することがで
きる。好適な希釈用有機溶媒の例は、メタノール、エタ
ノール、プロパツール、アセトン、テトラヒドロフラン
などである。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖の沈澱はまた、水溶液を
炭酸カルシウムもしくは水酸化バリウムなどの金属塩で
処理することによっても可能である。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖生成物はカルボン酸基を
含有し、これはカルボン酸の金属塩もしくは遊離酸のい
ずれも形態でも存在できる。
本発明の熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４は新規
物質である。
熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４は、約ｓ
ｏｏ、　ｏｏｏ〜１，５００，０００の範囲内の平均分
子量を有する。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４は、脱イオン水
性媒質中でブルックフィールド粘度計（少量試料用アダ
プター付き）のスピンドル隘３１により２５℃で測定し
て、０．１ｓｅｃ−’の剪断速度において少なくとも約
８０００　ｃｐの０．２５重量％粘度を示す。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液は無色
透明であり、疑イ以塑性およびチキソトロピー性の粘度
特性を示す。この水溶液粘度特性は、約１３０℃までの
温度および約１２までＯｐＨ値において安定である。
低剪断速度条件下で、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポ
リ５４は、一般に市販のキサンタン・ガムの約５〜５０
倍の見掛は粘度を示す。脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５
４、熱変性した脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４、およ
び市販のキサンタン・ガム〔例、ケルザン（Ｋｅｌｚａ
ｎ）　〕の剪断条件下での粘度特性の比較データを、添
付の第２図に示す。
熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４のその他の物理
化学的および構造上の特徴は次の通りである。
Ａ、糖の構成（モル比） グルコース　　　１０ ガラクトース　７〜１０ マンノース　　　１〜３ グリクロン酸　１〜３ 上記グリクロン酸成分は、グルクロン酸および／または
ガラクツロン酸および／またはマンヌロン酸からなる。
熱変性脱了セチル化ヘテロ多糖ポリ５４は、ピルビン酸
もしくはタンパク質を含有せず、アセチル基含有量は４
単糖単位あたり約１個未満である。
通常は、上記アルカリ処理により、生成時のヘテロ多糖
ポリ５４に存在していたアセチル基はすべて除去されて
しまう。不完全に脱アセチル化されたヘテロ多糖ポリ５
４も製造および熱処理することができる。
Ｂ、メ１１」［ｋ流し１ ｃ　　　　３８．２２ Ｈ５，５７ ｏ　　　　４０．４１ Ｎ　　　　　１．５８ ＊灰分補正済 Ｃ９敗□点 明確な融点を示さず、約１５０℃より高温で分解する。
Ｄ、赤外スペクトル １７４０ｃｍ−’の吸収帯（脂肪族エステル基を示すと
考えられる）。
１６５０ｃｍ−’および１５４０ｃｍ−’の吸収帯（ア
ミド基を示すと考えられる）。
Ｅ、聚方漫濠り！を外り止 ２５４ｍμにブロードなλｍａｘピークを示す。
Ｆ、溶解性 水には可溶であるが、すべての一般有機溶媒に不溶であ
る。
Ｇ、几蓋叉農 測定可能な比旋光度を示さない。
熱処理に本奏変性 ヘテロ多糖ポリ５４型のエキソ多糖の熱処理は、ヘテロ
多糖分子の化学的構成に変化を及ぼさないようである。
ごのヘテロ多糖の元素分析の結果は、熱処理の前と後と
で同じである。
このヘテロ多糖の紫外および赤外スペクトルについても
、熱処理の前後で有意差はない。
熱処理の前後で上記ヘテロ多糖に現れる差異は、ヘテロ
多糖分子の物理化学的配座（例、例ランダムコイル対ロ
ンド形状）に関係するようである。
別のパラメータは、非特異的絡み合い（ｅｎｔａｎｇｌ
ｅｍｅｎｔｓ）とは違った機械的および機能的特性を有
する分子内および分子間の静電気結合の存在である。
ヘテロ多糖ポリ５４のようなエキソ多糖は、水性媒質中
での熱処理により、分子内および分子間の静電気結合の
変化を生ずると考えられる。分子は物理的に再配列し、
熱力学的により有利な幾何学的配座（物理的測定および
ＮＭＲスペクトルが示すように永久的なもの）をとるも
のと推定される。
熱変性後のヘテロ多糖は、対応する未変性のヘテロ多糖
に比べてより効果的な粘度増強剤となる。
熱変性ヘテロ多糖水溶液の塩類に対する許容度は、対応
する未変性ヘテロ多糖より大きい。
本発明は、水性媒質中で改善された粘度増強特性を示す
熱変性ヘテロ多糖の製造のための別の新規な処理方法も
包含する。
その１態様によれば、本発明により、（ａｌ増殖炭素源
を含有する水性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコ
ゲネスの細菌菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外
ヘテロ多糖を含有する培地水溶液を生成させ、（ｂ）こ
の培地水溶液から水を除去して、約５〜２０ｇ／ｌの細
胞外ヘテロ多糖を含有する濃縮水溶液を形成し、（ｃ）
この濃縮水溶液を約６０〜１５０℃の温度に加熱して、
熱変性されたヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることから
なる方法が提供される。
工程（ｂｌおよび（ｃ１の機能は、これらを併合して１
操作として実施することができる。工程ｆｂｌにおける
水の除去は、減圧蒸留もしくは逆浸透などの手段により
実施することができる。
別の態様において、本発明は、（ａ）増殖炭素源を含有
する水性栄養培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネス
の細菌菌株を好気培養して、蓄積した量の細胞外ヘテロ
多糖を含有する培地水溶液を生成させ、（ｂｌこの水溶
液のｐＨをアルカリ性範囲に調整して生成したヘテロ多
糖を脱アセチル化し、ｆｃｌこの培地水溶液から水を除
去して、約５〜２０ｇ／βの細胞外脱アセチル化ヘテロ
多糖を含有する濃縮水溶液を形成し、（ｄｌこの濃縮水
溶液を約６０〜１５０℃の温度に加熱して、熱変性され
た脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の水溶液を得ることか
らなる方法を提供する。
工程（ｃ）および（ｄｌの機能は、例えば加熱しながら
減圧蒸留することで、１操作に併合して実施することが
できる。
上記の二つの態様による熱変性ヘテロ多糖水溶液の製造
において、メチロフィルス・ビスコゲネスＡＴＣＣ３９
８９３またはその変異株を細菌菌株として使用すると、
得られる生成物はそれぞれ熱変性ヘテロ多糖ポリ５４お
よび熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４を含有する
濃縮水溶液となる。
第１図および第２図に示したように、未変性のヘテロ多
糖ポリ５４および未変性の脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ
５４は、０．４％（ｗ／ｖ）より低濃度の水溶液ではキ
サンタン・ガムと同等の見掛は粘度を示す。さらに低濃
度〔例、０．２５％（−／ν）以下）ではキサンタン・
ガム水溶液の方がいくらか大きな見掛は粘度を示すこと
もある。ポリマー（多糖）温度が増大するにつれて〔例
、０．５％（ｖ＋／ｖ）以上になると〕、ヘテロ多糖ポ
リ５４水溶液の見掛は粘度は同濃度のキサンタン・ガム
水溶液より著しく大きくなり、例えば、見掛は粘度はキ
サンタン・ガムの５〜３０倍に達する。
ムチロフィルス・ビスコゲネス 新規菌種メチロフィルス・ビスコゲネスおよびそのエキ
ソ多糖の生産についての詳しい説明は、特願昭６２−２
４１２０１号に詳述されているので、参照されたい。
メチロフィルス・ビスコゲネスの各菌株は新規な組合せ
の性質を示し、それによりこれらは他のメチロトローフ
性細菌から区別される。菌株ＡＴＣＣ３９８９３のよう
なメチロフィルス・ビスコゲネス菌は、０１同化のりブ
ロース−リン酸経路を利用し、典型的には３５〜４０℃
で１〜３時間という増殖速度倍加時間を有する１型（タ
イプ１）の任意メチロトローフである。
ＡＴＣＣ３９８９３菌株はメタノール、フルクトースお
よびグルコースを基質として増殖する。また、ギ酸もし
くはメタノールの形態の外来エネルギー供給が存在する
場合には、この菌株はより広範囲の従属栄養基質（例、
コハク酸およびピルビン酸）でも増殖しよう。これは、
既知のどの微生物についても報告されたことのない特性
である。同定のために、この現象を示す細菌を、ここに
１潜在的任意メチロトローフ」と呼ぶことにする。
ＡＴＣＣ３９８９３菌株およびその変異株の特徴を包含
する性質を有する細菌はまた、固体培地での淡橙色コロ
ニーの非粘液性増殖によっても特徴づけられる。菌株Ａ
ＴＣＣ３９８９３型のメチロトローフ性細菌の別の菌学
的特徴は、ヘキスロースリン酸シンターゼ／ヘキスロー
スリン酸イソメラーゼ活性〔Ｊ、Ｐ、　Ｖａｎ　Ｄｉｊ
ｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　エフイーエムニス・マイクロ
バイオロジカル・レター（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ。
Ｌｅｔｔｅｒ）、　　４．９７　（１９７８）　）が、
タンパク質１■当たりの１分間のＮＡＤＨ生成量で少な
くとも約４００ナノモルであることである。
任意メチロトローフであるＡＴＣＣ３９８９３型菌株の
別の顕著な特性は、メタノール基質を主転化させて、水
溶液に擬似塑性とチキソトロピー性とを付与するエキソ
多糖を蓄積した量で生産する能力である。ＡＴＣＣ３９
８９３菌株の細菌は、細胞増殖の有無にかかわらず多様
な培養条件下で培地中に多量の蓄積したエキソ多糖を生
産することができる点で特に顕著である。菌株ＡＴＣＣ
３９８９３型の細菌は、利用可能な炭素源のうちエキソ
多糖の生合成に利用される割合が大きいという固有の能
力を有している。
本明細書で使用した「メチロトローフ」なる用語は、１
もしくは２以上の炭素原子を含有するが、炭素−炭素結
合を含有していない炭素化合物により非独立栄養的に増
殖することのできる微生物を意味する。「独立栄養的」
とは、二酸化炭素基質による増殖を意味する。
本明細書において「任意メチロトローフ」とは、１種も
しくは２種以上の従属栄養基質（例、フルクトース）上
でも増殖できるメチロトローフを意味する。
本明細書で使用した「変異株」とは、親菌株から誘導さ
れた菌株であって、親菌株とは表現型および／または遺
伝子型が異なり、エキソ多糖を生合成することができる
というメチロトローフ性親菌株の能力を示すメチロフィ
ルス・ビスコケネスの菌株を意味する。
変異株の１例は、菌株ＡＴＣＣ３９８９３の突然変異菌
株である菌株ＡＴＣＣ５３４１２である。
ＡＴＣＣ３９８９３のリファンピシン耐性菌株の日常的
な継代培養中に、増殖培地に自然変異株が生成した。こ
の変異株はメタノール／アンモニウム無機塩類寒天プレ
ート上でのコロニー形態が普通とは違っていたために検
出された。
このプレート上で増殖させたＡＴＣＣ３９８９３のコロ
ニーは小さな丸型の淡橙色コロニーで、本質的に非粘液
性である。上記変異株の方のコロニーは、より大きく　
（直径約４ｍｍ）、色がオフホワイトないし透明であり
、本質的に非常に粘液性であった。
この新１株（ＡＴＣＣ５３４１２）は、リファンピシン
耐性を示し、ＡＴＣＣ３９８’１３菌株と同様の培養学
的および生化学的特性を示し、最終的にはＡＴＣＣ３９
８９３菌株との染色体ＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッド
形成能力から、ＡＴＣＣ３９８９３の変異株であると決
定された。
この変異株ＡＴＣＣ５３４１２は、ペテロ多糖ポリ５４
に相当するエキソ多糖を構成的に合成することができる
。菌株、ＡＴＣＣ５３４１２は、ＡＴＣＣ３９８９３の
２〜３倍の最適増殖速度を有する。
寄託番号ＡＴＣＣ３９８９３およびＡＴＣＣ５３４１２
の菌株の継代培養株は、米国メリーランド州ロックビル
所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）の恒久的微生物コレクシジンから請求によ
り入手することができる。この培養菌株は、特許手続き
のためのブダペスト条約の要件に従って寄託されている
。
以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであ
る。使用した要素および具体的成分は代表例として示し
たものであって、本発明の範囲内で以上の説明に基づい
て各種の変更をなすことができる。
メタノール同化細菌の増殖に対しては、無機塩類培地（
ＭＳ）（、第１表）を使用した。この培地に、Ｉｇ／β
の硝酸カリウムを補給して硝酸無機塩類培地（ＮＭＳ）
とするか、またはＩｇ＃！の塩化アンモニウムを補給し
てアンモニウム無機塩類培地（ＡＭＳ）とした。炭素源
のメタノールは０，２〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度で使
用するのが好ましい。
固体培地に対しては、滅菌の前に１７ｇ＃！のジフコ社
製細菌用寒天（バクトアガー）を、リン酸塩を抜いた基
本の無機塩類培地に添加する。次いで、滅菌した無機塩
類培地に冷却後に滅菌リン酸塩溶液を無菌添加する。
醗酵操作は、ビー・ブラウン（Ｂ、Ｂｒａｕｎ）インス
トルメンツ・バイオスタンドＳ型醗酵装Ｗ（容量６２）
を使用して行う。使用容積は３１とし、醗酵装置の滅菌
後にメタノールを無菌添加する。
４６０　ｍｌ／ｍｉｎの空気供給速度で、５００　ｒｐ
ｍの攪拌速度を日常的に使用する。この醗酵装置は、ｐ
Ｈおよび溶解酸素制御手段を備えている。
ヘキスロースリン酸シンターゼの酵素作用の生成物であ
るヘキスロース６−リン酸の分析法がないので、ヘキス
ロースリン酸シンターゼ／ヘキスロースリン酸イソメラ
ーゼを同時に分析する。へキスロースリン酸イソメラー
ゼにより、ヘキスロース６−リン酸はグルコース６−リ
ン酸に転化され、このグルコース６−リン酸はグルコー
ス６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、同時に起こる
ＮＡＤＰ”還元を３４０　ｎｍで追跡することにより測
定することができる。この酵素分析溶液は次の成分を含
有する（最終濃度）ニリン酸緩衝液５０　ｍＭ、　ｐＨ
７，２；　塩化マグネシウム２．５ｍＭ；グルコース６
−リン酸デヒドロゲナーゼ０．７単位；ホスホグルコイ
ソメラーゼ０．７５単位；ホスホリボースイソメラーゼ
１．７５単位；リボース５−リン酸５　ｄ　；　ＮＡＤ
Ｐ”　０．２５　ｍＭ　　；ならびにホルムアルデヒド
５　ｍＭ。
少しでもヒドロキシピルビン酸レダクターゼが存在する
ことは、微生物においてセリン経路のホルムアルデヒド
同化が起こったことを示す。この酵素は、次の成分を含
有する（最終濃度）酵素分析溶液により測定できるニリ
ン酸カリウムＩＭ。
ｐＨ６，３；ヒドロキシピルビン酸リチウム０．０１　
Ｍ；およびＮＡＤＨ２ｍＭ　。ＮＡＤＨの消失を３４０
　ｎｍで測定する。
グリセロールおよびジヒドロキシアセトンの測定は、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ／ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ（グリセロール：ＮＡＤ”２−オキシドレダ
クターゼ、　ＰＣ１，１，１，６）により行われる。こ
の酵素は、エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から誘導され
、シグマ・バイオケミカルズ社より入手できる。
グリセロールの測定に対しては、反応混合物（１、Ｏｍ
ｌ）は、５（Ｄｌｍｏｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（シグ
マ・ハイオケミカルズ社）、　ｐＨ９，７；０．２　μ
ｍｏｌのＮＡＤ”　　；　１単位の酵素；および１５．
ｃ＋ｍｏｌのグリセロール（もしくは試験溶液／醗酵ブ
ロス、２０〜５０μβ）を含有する。分析は、基質の添
加により開始され、その後、ペックマン２５型ＵＶ分光
光度計により３４０　ｎｍでの吸光度の増大を監視する
。
ジヒドロキシアセトンの測定に対しては、反応混合物（
０，１ｍｌ）は、５０μｗｌｏｌのリン酸緩衝液。
ｐＨ６，０；　０．５７Ｍ＋ｏｌのＮＡＤＨ；　１単位
の酵素；および１５μｌｌ１ｏｌのジヒドロキシアセト
ン（もしくは試験溶液／醗酵ブロス、２０〜５０　ｍｌ
）を含有する。
分析は、基質の添加により開始され、その後３４０ｎｍ
での吸光度の減少を監視する。
多糖類の水溶液のレオロジー特性の測定は、ウェルズ（
Ｗｅｌ　Ｉｓ；）　／ブルックフィールド・コーン／プ
レート・ディジタル式粘度計、あるいは同軸シリンダ・
センサ・システムを取りつけたレオマツ）　（Ｒｈｅｏ
ｍａｔ）　３０型粘度計により行う。
比較用の粘度測定に用いたキサンタン・ガムは、米国カ
リフォルニア州すンジエゴ所在のケルコ社（Ｋｅｌｃｏ
　Ｃｏ、）製の市販品ケルザン（Ｋｅｌｚａｎ）である
。
エキソ多糖の単糖含有量の分析は、加水分解−気液クロ
マトグラフィー法により行う。
ス１」０一 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多糖代謝産物の生産、およ
びその後の熱処理による熱変性エキソ多糖の生成を例示
する。
ＡＴＣＣ３９８９３菌株の接種液５００　ｍｌを、ＭＳ
培地、１ｇ／ｌの塩化アンモニウムおよび増殖炭素源と
して０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを使用して増殖さ
せる。フラスコは３７℃で２日間インキユヘーションす
る。こうして得られた培養液を使用して、ＭＳ培地１０
　ｅ、塩化アンモニウムＩｇ／β、およびメタノール０
．５％（ｖ／ｖ）を入れた容量１４１のニュー・ブラン
ズウィンク・マイクロファーム（ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉ
ｃｋ　Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）醗酵装置を接種する。
最初の醗酵条件は次の通りである１３７℃、攪拌２０Ｏ
ｒｐｍ、空気流量２ｆｆ／ｍｉｎ、およびｐＨ７，０゜
ｐＨは醗酵中はぼ７．０に制御する。醗酵培地中の炭素
分が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して、０
．５％（ｖ／ｖ）の濃度を保持する。メタノールの濃度
は気液クロマトグラフィーにより測定する。２４〜３６
時間の醗酵後、攪拌速度を４０Ｏｒｐｍに増大させる。
メタノールが培養液により利用されなくなったら（ｉ！
常５〜７日後）、醗酵を終了させる。
得られた水溶液をオートクレーブに移し、１２１℃に１
時間加熱する。
この熱処理の後、得られた水溶液をイソプロパノール水
溶液（アルコール：水−２：１）で希釈して、ヘテロ多
糖生成物を沈澱させる。この沈澱を濾別する。濾別した
沈澱をほぼ同量のイソプロパツールで洗浄した後、風乾
するか、または強制空気循環式乾燥器により５５℃で乾
燥する。乾燥した固体をその後、ウィリーミルまたはハ
ンマーミルにより粉砕して粉末状とする。かくして得ら
れた熱処理後のヘテロ多糖生成物の物理化学的性質は、
熱変性ヘテロ多糖ポリ５４について上述した性質と一致
している。
実施例２ 本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多糖代謝産物の生産、およ
びその後のアルカリ処理と熱処理による熱変性脱アセチ
ル化ヘテロ多糖の生成を例示する。
八ＴＣＣ３９８９３菌株の接種液５００　ｍｌを、ＭＳ
培地、Ｉｇ／ｊ！の塩化アンモニウムおよび増殖炭素源
として０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを使用して増殖
させる。フラスコは３７℃で２日間インキュヘーション
する。こうして得られた培養液を使用して、ＭＳ培地１
０１、塩化アンモニウム１ｇ／ｌ、およびメタノール０
．５％（ｖ／ｖ）を入れた容量１４　βのニュー・ブラ
ンズウィンク・マイクロファーム醗酵装置を接種する。
最初の醗酵条件は次の通りである２３７℃、攪拌２０Ｏ
ｒｐｍ、空気流量２ｎ／ｍｉｎ、およびｐＨ７，０゜ｐ
Ｈは醗酵中はぼ７．０に制御する。醗酵培地中の炭素分
が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して、０．
５％（Ｖ／ν）の濃度を保持する。メタノールの濃度は
気液クロマトグラフィーにより測定する。２４〜３６時
間の醗酵後、攪拌速度を４０Ｏｒｐｍに増大させる。
メタノールが培養液により利用されなくなったら（通常
５〜７日後）、醗酵を終了させる。この水性醗酵培地の
ｐＨを、水酸化ナトリウムによりｐＨ１２に調整し、ｐ
Ｈ１２に２時間保持した後、醗酵培地を塩酸で中和して
、脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液を得る。
得られた水溶液をオートクレーブに移し、１２１℃に１
時間加熱する。
この熱処理の後、得られた水？８液をイソプロパツール
水溶液（アルコール：水−２：ｌ）で希釈して、ヘテロ
多糖生成物を沈澱させる。この沈澱を濾別する。濾別し
た沈澱をほぼ同量のイソプロパツールで洗浄した後、風
乾するか、または強制空気循環式乾燥器により５５℃で
乾燥する。乾燥した固体をその後、ウィリーミルまたは
ハンマーミルにより粉砕して粉末状とする。かくして得
られた熱処理後の脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の物理
化学的性質は、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４
について上述した性質と一致している。
Ｍｇ５０．・７Ｈ２０１ｇ ＣａＣｌｚ　　　　　　　　　　　０．２ｇＮａ、ＨＰ
ｏ、　　　　　　　　　　０．３３　ｇｇｎｚｐｏａ　
　　　　　　　　　０．２６ｇＦｅＥＤＴＡ　　　　　
　　　　　　５．ＯｍｇＣｕＣＩｚ　・Ｈ２Ｏ２，Ｏｍ
ｇ ＮａｘＭｏＯ４・２）１ｚＯ２，ＯｍｇＦｅＳＯｔ・７
ＨｚＯ５００、ｕｇ ＺｎＳＯａ　・７Ｈ２０４００８８ ＭｎＣ１ｚ　・４Ｈｚ０　　　　　　２０　　μｇＨ３
Ｂ０．　　　　　　　　　　１５　８ｇＣｏＣ１ｚ　’
　６１４２０　　　　　　５０　　μｇＮｉＣｈ・６Ｈ
２０１０μｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　２５０　　μｇＨ２０
１１！、　　ｐＨ６，８
【図面の簡単な説明】
第１図は、熱変性ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液粘度特性
（多糖濃度１　ｇ／　１　）を、未変性のヘテロ多糖ポ
リ５４および市販のキサンタン・ガムと比較して示すグ
ラフ、および 第２図は、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の水
溶液粘度特性（多＄１！　ｔａ度１ｇ／ｆｆ）を、未変
性の脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４および市販のキサ
ンタン・ガムと比較して示すグラフである。 出願人　セルジーン・コーポレーション代理人　弁理士
　広　瀬　章　− １ｇ１ 一〇　黙変４ｉヘテロク糟ホ・ン５４ ＋＝キブンタ／カム ◇；へナロク總ホ０ン５４

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）メチロフィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏ
    ｐｈｉｌｕｓｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の細菌菌株の好気
    的培養により製造されたヘテロ多糖を含有する水溶液の
    粘度増大方法であって、この水溶液を溶液粘度の増大を
    達成するに十分な時間約６０〜１５０℃の温度に加熱す
    ることからなる、前記水溶液の粘度増大方法。
  2. （２）前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネス
    ＡＴＣＣ３９８９３もしくはＡＴＣＣ５３４１２または
    これらの変異株である、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. （３）前記水溶液が約５０重量％までの水混和性有機溶
    媒を含有するものである、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  4. （４）増殖炭素源としてメタノールを含有する水性栄養
    培地中で、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株ＡＴＣ
    Ｃ３９８９３もしくはその変異株を好気培養して、細胞
    外ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液を生成させ、この水溶液
    を約６０〜１５０℃の温度に加熱して、熱変性されたヘ
    テロ多糖ポリ５４の水溶液を得ることからなる、熱変性
    ヘテロ多糖ポリ５４の製造方法。
  5. （５）ヘテロ多糖５４の水性スラリーを約６０〜１５０
    ℃の温度に加熱して、熱変性ヘテロ多糖ポリ５４を固体
    形態で得ることからなる、熱変性ヘテロ多糖ポリ５４の
    製造方法。
  6. （６）熱変性されたヘテロ多糖ポリ５４。
  7. （７）脱イオン水性媒質中でブルックフィールド・スピ
    ンドルＮｏ．３１により２５℃で測定して、０．１ｓｅ
    ｃ＾−＾１の剪断速度において少なくとも約８０００ｃ
    ｐの０．２５重量％粘度を示す、特許請求の範囲第６項
    記載の熱変性ヘテロ多糖ポリ５４。
  8. （８）０．００５〜５重量％の濃度範囲について約０．
    ０１〜１０００ｓｅｃ＾−＾１の専断速度で、ヘテロ多
    糖ポリ５４の同濃度水溶液について測定した水溶液粘度
    〔単位：センチポアズ（ｃｐ）〕の少なくとも２倍の水
    溶液粘度を示すことを特徴とする、特許請求の範囲第６
    項記載の熱変性ヘテロ多糖ポリ５４。
  9. （９）増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で、メチロ
    フィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養して、蓄
    積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する水溶液を生成さ
    せ、この水溶液のｐＨをアルカリ性範囲に調整してヘテ
    ロ多糖を脱アセチル化し、前記水溶液を約６０〜１５０
    ℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ
    多糖生成物の水溶液を得ることからなる、熱変性脱アセ
    チル化ヘテロ多糖の製造方法。
  10. （１０）前記増殖炭素源がメタノールである、特許請求
    の範囲第９項記載の方法。
  11. （１１）前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スＡＴＣＣ３９８９３もしくはその変異株であり、前記
    生成物が熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４である
    、特許請求の範囲第９項記載の方法。
  12. （１２）脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の水溶液を約
    ６０〜１５０℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセ
    チル化ヘテロ多糖ポリ５４を得ることからなる、熱変性
    脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の製造方法。
  13. （１３）脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の水性スラリ
    ーを約６０〜１５０℃の温度に加熱して、熱変性された
    脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４を固体形態で得ること
    からなる、熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の製
    造方法。
  14. （１４）熱変性された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４
    。
  15. （１５）脱イオン水性媒質中でブルックフィールド・ス
    ピンドルＮｏ．３１により２５℃で測定して、０．１ｓ
    ｅｃ＾−＾１の剪断速度において少なくとも約８０００
    ｃｐの０．２５重量％粘度を示す、特許請求の範囲第１
    ４項記載の熱変性脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４。
  16. （１６）０．００５〜５重量％の濃度範囲について約０
    ．０１〜１０００ｓｅｃ＾−＾１の専断速度で、脱アセ
    チル化ヘテロ多糖ポリ５４の同濃度水溶液について測定
    した水溶液粘度〔単位：センチポアズ（ｃｐ）〕の少な
    くとも２倍の水溶液粘度を示すことを特徴とする、特許
    請求の範囲第１４項記載の熱変性脱アセチル化ヘテロ多
    糖ポリ５４。
  17. （１７）（ａ）増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で
    、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養
    して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する培地水
    溶液を生成させ、（ｂ）この培地水溶液から水を除去し
    て、約５〜２０ｇ／ｌの細胞外ヘテロ多糖を含有する濃
    縮水溶液を形成し、（ｃ）この濃縮水溶液を約６０〜１
    ５０℃の温度に加熱して、熱変性されたヘテロ多糖生成
    物の水溶液を得ることからなる、熱変性ヘテロ多糖水溶
    液の製造方法。
  18. （１８）工程（ｂ）および（ｃ）を併合して１操作とし
    て実施する、特許請求の範囲第１７項記載の方法。
  19. （１９）増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範
    囲第１７項記載の方法。
  20. （２０）前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スＡＴＣＣ３９８９３もしくはＡＴＣＣ５３４１２また
    はこれらの変異株であり、前記生成物が熱変性ヘテロ多
    糖ポリ５４である、特許請求の範囲第１７項記載の方法
    。
  21. （２１）（ａ）増殖炭素源を含有する水性栄養培地中で
    、メチロフィルス・ビスコゲネスの細菌菌株を好気培養
    して、蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を含有する培地水
    溶液を生成させ、（ｂ）この水溶液のｐＨをアルカリ性
    範囲に調整して生成したヘテロ多糖を脱アセチル化し、
    （ｃ）この培地水溶液から水を除去して、約５〜２０ｇ
    ／ｌの細胞外脱アセチル化ヘテロ多糖を含有する濃縮水
    溶液を形成し、（ｄ）この濃縮水溶液を約６０〜１５０
    ℃の温度に加熱して、熱変性された脱アセチル化ヘテロ
    多糖生成物の水溶液を得ることからなる、熱変性脱アセ
    チル化ヘテロ多糖水溶液の製造方法。
  22. （２２）工程（ｃ）および（ｄ）を併合して１操作とし
    て実施する、特許請求の範囲第２１項記載の方法。
  23. （２３）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を併合して１
    操作として実施する、特許請求の範囲第２１項記載の方
    法。
  24. （２４）増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範
    囲第２１項記載の方法。
  25. （２５）前記細菌菌株が、メチロフィルス・ビスコゲネ
    スＡＴＣＣ３９８９３もしくはＡＴＣＣ５３４１２また
    はこれらの変異株であり、前記生成物が熱変性脱アセチ
    ル化ヘテロ多糖ポリ５４である、特許請求の範囲第２１
    項記載の方法。
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