JPS63309184A - 放線菌ストレプトミセス・テンジマリエンシス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はストレプトミセス属に属して抗生物質イスタマ
イシン（Ｉｓｔａｍｙｃｉｎ）　Ａおよびイスタマイシ
ンＢの生産菌として有用である新種の放線菌微生物に関
する。

本発明者らは、神奈川系三浦半島沿岸の海底土より昭和
５３年８月に分離した放線菌で５５−９３９号株の番号
が付された菌株を培養して、イスタマイシンＡまたはイ
スタマイシンＢ１またはこれらの混合物を蓄積せしめ、
その培養液からイスタマイシンＡまたはイスタマイシン
Ｂを採取できることを発見した。イスタマイシンＡとイ
スタマイシンＢは、諸種の細菌に広く且つ強い抗菌作用
を示し、毒性の低いアミノ配糖体抗生物質であることか
ら、化学療法剤として細菌感染症の治療に用いられる抗
生物質である。そして、本発明者は、上記の放線菌ＳＳ
−９３９号株をストレプトミセス・テンジマリエンシス
５５−９３９株と命名し、その菌学的性質を調べて新規
な微生物であることを確認した。

本発明の要旨とするところは、気菌糸の色調が白色で次
第に青緑色を帯びた灰色を増し、気菌糸に螺旋糸を示さ
ず、また胞子表面が平滑であり、メラニン様色素生産性
すなわちクロモゲン性があり、炭素源としてグルコース
とイノシトールを同化するがアラビノース、Ｄ−キシロ
ース、シュクロース、ラムノース、ラフィノース、Ｄ−
マンニットを同化せず、イスタマイシンＡ及びイスタマ
イシンＢの生産性を有する、突貫的に純粋に分離された
ストレプトミセス・テンジマリエンシスにある。

本発明のストレプトミセス・テンジマリエンシスにより
生産されるイスタマイシンＡは塩基性物質であり、その
炭酸塩として単離されたイスタマイシンＡは白色粉末で
、明確な融点を示さないが、　１０２〜１０８℃で分解
し、比旋光度は（Ｑ）：’　　＝＋１５５°（ｃ　Ｏ，
４、水）を示し、元素分析値はＣｌ７８３５Ｎ５０５・
１／２Ｈ２ＣＯ３の分子式の理論値（Ｃ４９，９９％、
　Ｈ８，８３％、　Ｎ　　１６．６５％。

０　２４．７３％）に合致し、さらにこの分子式は高分
解能マススペクトルによフて証明された（実測値：　ｍ
／ｅ　３８９．２５８８．　　Ｃｌ７８３ＳＮ５０５の
理論値＝３８９．２６３５）。水溶液中で測定した紫外
部吸収曲線は末端吸収を示すのみである。重水中で測定
したＩＨ−核磁気共鳴スペクトル（ＴＩＪＳ外部標準、
　ｐＤ５．４）で、δ　３．２０　（ｓ　、　Ｎ−ＣＨ
５）、　３．５７　（ｓ　。

Ｎ−ＣＩ（３）、　３．８９　（Ｓ　、　０−ＣＨ５）
、　４．５０　（Ｓ　、　ＣＨ２）および５．８０　（
ｄ　、　　Ｊ　＝３．５　Ｈｚ、　（：Ｈ）に特徴的な
シグナルを示した。イスタマイシンＡは水およびメタノ
ールに溶けるが、エタノール及びその他の一般の有機溶
媒に難溶あるいは不溶である。ニンヒドリン反応および
ライドン−スミス反応に陽性である。セルロース（アビ
セル）の薄層クロマトグラフィー（展開系：ブタノール
・ピリジン・酢酸・水、６：４：２：４容）で、イスタ
マイシンＡはＲｆ　０．２２に単一スポットを示し、後
述のイスタマイシンＢのＲｆ　０．２５と明らかに区別
される。蟻酸・酢酸・水（２５：　７５　：　９００容
）を用いた高圧濾紙電気泳動（３，３００Ｖ、　１５分
）で、アラニンの移動度を１．０としたとき、イスタマ
イシンＡおよびイスタマイシンＢの移動度は共に２．１
５を示して区別されない。

また、本発明のストレプトミセス・テンジマリエンシス
により生産されるイスタマイシンＢはその性状がイスタ
マイシンＡときわめて類似している。イスタマイシンＢ
も塩基性物質であり、その炭酸塩は白色粉末で、明確な
融点を示さないが、１１２〜１２４℃で分解し、比旋光
度は〔α］二５＝＋１６５°（ｃ　Ｏ，４、水）を示し
、元素分析値はＣｌ７Ｈ３ＳＮ５０５・１／２Ｈ２ＣＯ
３の分子式の理論値（Ｃ４９，９９％、　Ｈａ、Ｉ！３
％、　Ｎ　１６．６５％。

０２４．７３％）に合致し、さらにこの分子式は高分解
能マススペクトルによって証明された（実測値：　ＩＩ
ｌ／ｅ　３８９．２６２５．　　Ｃ，、Ｈ３，Ｎ、Ｏ，
の理論値：３８９．２６３５）。水溶液中で測定した紫
外部吸収曲線は末端吸収を示すのみである０重水中で測
定したＩＨ−核磁気共鳴スペクトル（ＴＭＳ外部標準、
　ｐＤ５．４）で、δ　３．２６　　（ｓ　、　Ｎ−Ｃ
Ｈ５）、　３．５９　（ｓ　。

Ｎ−ＣＨ５）、　３．９５　（ｓ　、　０−（：Ｈ３１
，４，５７（ｓ　、　ＣＨｘ）および５．９６　（ｄ　
、　Ｊ　＝３．５　Ｈｚ、　ＣＨ）に特徴的なシグナル
を示した。イスタマイシンＢは水およびメタノールに溶
けるが、エタノール及びその他の一般の有機溶媒に難溶
あるいは不溶である。ニンヒドリン反応およびライドン
ース走ス反応に陽性である。前述の如く、イスタマイシ
ンＡとはセルロースの薄膜クロマトグラフィーで区別さ
れる。

イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢは次の構造式
を有するものである。

Ｃ１（。

イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢの栄養寒天平
板上における諸種の試験菌に対する最低発育阻止濃度は
第１表に示すとおりで、ともにグラム陥・陰性菌の発育
を強く阻止する。

イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢの急性毒性は
、１００ｍｇ／Ｋｇの量をマウス静脈内投与した場合に
、いずれも７日間以上生存し、何らの副作用を誌めなか
った。

以上の諸性状から、イスタマイシンＡおよびイスタマイ
シンＢは、ホーティマイシンＡ（Ｒ，０ｋａｃｈｉら、
「ジャーナル・オブ・アンチビオチフス」３０巻、５４
１頁、　１９７７年）およびスポラリシンＡ　（Ｔ、Ｄ
ｅｕｓｈｉら、「ジャーナル・オブ・アンチビオチフス
」３２巻、１７３頁、　１９７９年）と類似であるが、
Ｃ−メチル基を有せず、Ｎ−メチル基を２個有する点で
、これらの抗生物質とは明らかに区別される。但し、イ
スタマイシンＡは特開昭５４−１４１７０１号公報（昭
和５４年１１月５日公開）に示された化合物に＾−７０
３８１と同一物質であると認められる。

本発明によるストレプトミセス・テンジマリエンシスＳ
５−９３９号株は三浦半島沿岸の海底土をカナマイシン
１０ｍｃｇ／ｍｕ含有のＭＹ培地（マルトース１％、イ
ーストエキス０．４％、寒天１．５％、　ｐＨ７，２）
で２７℃、３日間培養して生育した放線菌集落を釣菌し
、さらに炭水化物同化性試験培地（プリドハム・ゴツト
リーブ培地）にグルコース、キシロース、アラビノース
、ラムノース、ラフィノース、イノシトール夫々を各々
１％含有させて、イノシトールを含有する培地でイノシ
トールを同化して生育する放線菌をスクリーニングして
分離されたものである。

本発明によるストレプトミセス・テンジマリエンシス５
５−９３９号株の菌学的性状は次に示す通りである。

ａ）形態 寒天培地上に良く生育した５５−９３９号株は単純分枝
し、良く伸長した基中菌糸から、直状または少しく湾曲
した気中菌糸を伸長し、成熟すると先端に１０〜５０の
長円筒状（巾１ミクロンで長さ４〜５ミクロン）の胞子
の連鎖を形成する。気菌糸には、螺旋糸や車軸分枝は示
さない。電子顕微鏡下で胞子表面は平滑で、刺状または
毛状構造は見られない。鞭毛や胞子のうもなく、典型的
なストレブトミセスである。

ｂ）各種培地上の特徴 ■　シュークロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）：
弱い無色の発育上に白色の気菌糸を生じ、次第に青緑色
を帯びた灰色（１７ｅｃ　Ａｑｕａ　Ｂｌｕｅ　、カラ
ー・ハーモニー・マニュアルによる。以下同じ）を増す
。培地に顕著な拡散性色素を生産することはない。

■　グリセリン・アスパラギン寒天培地（２７℃培養）
：■と殆んど同じであるが、気菌糸を着生しにくい。

■　スターチ寒天培地（２７℃培養）：■と殆んど同じ
であるが、気菌糸を着生し、菌発育の周辺のスターチは
透明となる。

■　チロシン寒天培地（３７℃培養）：の、■の所見に
殆んど同じであり、メラニン様色素を生産する。

■　栄養寒天培地（２７℃培！り：無色の発育上に白色
の気菌糸を着生し、培地は茶褐色を帯びる。

■　イースト・麦芽寒天培地（２７℃培養）：無色の発
育上に白色の気菌糸を着生し、次第に青緑色を帯びた灰
色（１９ｄａ　Ａｑｕａ　Ｇｒｅｅｎ）を示す。培地は
茶褐色を呈する。

■　オートミール寒天培地（２７℃培！り：無色の発育
上の白色ないし青灰色（１７ｅｃ　Ａｑｕａ　Ｂｌｕｅ
）を帯びた気菌糸を着生する。

Ｃ）生理的性質 ■　２０〜４１℃で生育可能である。

■　スターチ寒天培地上でスターチを加水分解する。

■　脱脂牛乳の凝固、ペプトン化は殆んど見られない。

■　メラニン様色素をチロシン寒天培地上およびペプト
ン・イースト・鉄寒天培地上に生成する。

ｄ）炭素源の同化性（ブリドハム・ゴツトリーブ寒天培
地上） グルコースとイノシトールのみを同化し、アラビノース
、Ｄ−キシロース、シュクロース、ラムノース、ラフィ
ノース、Ｄ−マンニットは同化しない。Ｄ−フラクトー
スの同化は疑わしい。

以上の性状は、本菌株が典型的なストレプトミセスに属
することを示し、気菌糸が螺旋糸を形成せず、メラニン
様色素産生性（クロモゲン性ク性）を有する。気菌糸の
色調、クロモゲン性から類似菌種を検索すると、ストレ
プトミセス・ピリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｖｉｒｆｄｏｃｈｒｏｍｏ−ｇｅｎｅｓ　）が
あげられるが、５５−９３９号株は螺旋糸をつくらず、
キシロース、アラビノース、ラムノース、フラクトース
、ラフィース、マンニットを利用しないことでも明らか
に区別され、胞子の表面が平滑であるが刺状でないこと
で決定的に異なる。クロモゲン性がなく、気菌糸の色調
のやき似たストレプトミセス・ビリデファシェンス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏＩＩＩｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｆｆａｃｉｅ
ｎｓ）とは、本菌株５５−９３９号株の気菌糸が螺旋状
にならないこと、および炭素源としてフラクトース９シ
ユクロースを同化しないことで区別される。その他、５
Ｓ−９３９号株の特徴的な炭素源同化性を示すストレプ
トミセス属の菌種はない。従ってＳＳ−９３９号株を含
む菌種は新種であり、ストレプトミセス・テンジマリエ
ンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｎｊｉｍａｒ
ｉｅｎｓｉｓ）と命名した。

このストレプトミセス・テンジマリエンシスＳＳ−９３
９号株は昭和５４年４月２１日に工業技術院微生物工業
技術研究所に保管委託申請し、微工研菌寄第４９３２号
である。

なお、前記の特開昭５４−１４１７０１号公報に記載さ
れるストレプトミセスｓｐ、　Ｎｏ、にＣ−７０３８株
（＠工研菌寄第４３８６号）は、イスタマイシンＡと同
−物買と肥められる化合物ＫＡ−７０３８Ｉ物質を生産
するので、本発明によるストレプトミセス・テンジマリ
エンシス５Ｓ−９３９株と上記にＣ−７０３８株との比
較を次の第２表に要約して示す。

第　　２　　表 上記の両菌株は、共にストレプトミセス属に属するが、
形態的に気菌糸の色調、螺旋糸の有無、胞子表面の性状
において明らかに異フており、また生理的性状も、メラ
ニン様色素の産生、資化性炭素源の内容において明らか
に相異なる菌種である。なお、ＫＣ−７０３８株はイス
タマイシンＢを生産しない点でも異なる。

本発明の新規微生物をイスタマイシンＡ１イスタマイシ
ンＢの生産に利用する場合には、通常の微生物が利用し
つる栄養源含有培地に接種して、好気的に発育させるこ
とによって、イスタマイシンＡまたは（および）イスタ
マイシンＢを含む培養液を得る。栄養源としては放線菌
の栄養源として用いられる公知のものが使用できる。例
えば市販されている大豆粉、落花生粉、綿実粉、乾燥酵
母、ペプトン、肉エキス、カゼイン、コーン・スチーブ
・リカー、硝酸ソーダ、硫酸アンモニウムなどの窒素源
、および市販されているグルコース、澱粉、グリセリン
、マルトース、デキストリン、ｍ糖、乳糖などの炭水化
物、あるいは大豆油、脂肪などの炭素源と、必要に応じ
て食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マン
ガン、燐酸塩などの無機塩類および各種のアミノ酸など
を使用できる。これらのものは、本発明の菌が利用し、
イスタマイシンＡまたはイスタマイシンＢの生産に役立
つものであれば良く、公知の放線菌の培養材料はすべて
使用できる。その大量生産には液体通気攪拌培養が好ま
しく、培養温度は本発明の菌が発育し、イスタマイシン
ＡまたはイスタマイシンＢを生産する範囲で通用しつる
が、殊に好ましいのは２５〜３０℃である。培養は普通
イスタマイシンＡまたは（および）イスタマイシンＢが
充分蓄積するまで継続される。通常２〜７日間の培養が
行なわれる。

イスタマイシンＡまたは（および）イスタマイシンＢの
定量は、試験菌としてバシルス・サブチリスＰＣＩ　２
１９株を使用して、抗生物質の定量に用いられる通常の
円筒平板法によって行ない、精製イスタマイシンＡを１
００１００Ｏ（単位）　７１１ｇとして標準物質とした
。なお、精製イスタマイシンＢは３１７０　ａａｃｇ　
（単位）　／ｍｇの力価を示した。

イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢおよびそれら
の塩は水によく溶け、本発明の菌の培養液では主として
液体部分に存在する。液体中のイスタマイシンＡおよび
イスタマイシンＢは実質的にブタノール、酢酸ブチル、
クロロホルムなどの有機溶媒に抽出されないので、これ
らの溶媒による処理は夾雑物の除去のために必要ならば
利用できる。培養液あるいは水溶液中のイスタマイシン
Ａまたは（および）イスタマイシンＢは種々の吸着剤を
用いて採取することができる。吸着剤として活性炭を使
用した場合、吸着した抗生物質は弱酸性水および弱酸性
のメタノール水、プロパツール水、アセトン水などで溶
出される。

また、イスタマイシンＡまたは（および）イスタマイシ
ンＢはその塩基性の性状にもとづいて、収率よく陽イオ
ン交換樹脂に吸着溶出される。この方法は大量の培養液
より採取するのに最も適した方法である。陽イオン交換
体としてはカルボン酸を活性基とするアンバーライト　
ＩＲＣ−５０，ＣＧ−５０（ローム・アンド・ハース社
製）、レワチットＧＮＰ　　（バイエル社製、ＣＭ−セ
ファデックス（ファルマシア社製）などのＨ型、　Ｎａ
型、　ＮＨ４型などおよびそれらの混合型が用いられ、
吸着した抗生物質は酸性水、稀アンモニア水および無機
塩の水溶液などによって収率よく溶出され、通常０，２
−ＩＮ塩酸および０．２Ｎ　−Ｉ　Ｎアンモニア水が使
用される。イスタマイシンＡまたはおよびイスタマイシ
ンＢは実質的に陰イオン交換樹脂に吸着しないので、そ
の酸性溶液の中和や、酸性の夾雑物を除去するのに好ま
しい材料である。

イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢは、前述の如
くブタノール・ピリジン・酢酸、水（６：４：２：４容
）を展開系とするセルロース（アビセル）の薄膜クロマ
トグラフィーで、分離される（イスタマイシンＡ　：　
Ｒｆ　Ｏ，２２、イスタマイシンＢ　：　Ｒｆ　０．２
５　）性状にもとずいて、セルロースのカラムクロマト
グラフィーによって、薄膜クロマトグラフィーと同一ま
たは類似の溶媒系で展開することにより、有効に分離精
製することができる。

以下に、本発明の微生物を利用したイスタマイシンＡま
たは（および）イスタマイシンＢの製造法の実施例を示
す。

実施例　１ 寒天斜面培地に培養したストレプトミセス・テンジマリ
エンシス５５−９３９号株（徴工研菌寄第４９３２号）
を、澱粉１．０％、グルコース０．２％、大豆粉１．０
％２食塩０，３％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マ
グネシウム（７Ｈ２０）　０．１％を含む液体培地（５
００ｍＡ三角フラスコ中ｕｏｍ５１）に接種し、２７℃
で４８時間回転振盪培養して種培養を得た。この種培養
２２０ｍλを、澱粉２．０％、グルコース０．２％、大
豆粉２．０％１食塩０．３％、リン酸二カリウム０．１
％、硫酸マグネシウム（７Ｈ２０）０．１％の液体培地
（１５ｊ２　）を含む３０ｊ２容のジャーファーメンタ
−に接種し、２７℃で７２時間通気攪拌培養（毎分１５
ＩＬ通気、毎分３００回転）した。

この培養液（ジャーファーメンタ−１６基分）を集め、
塩酸でｐＨ２，０に調整して濾過し、９０℃の濾液（２
，５ｍｃｇ／ｍρ）を得た。この濾液をアンバーライト
　ＩＲＣ−５０（ＮＨ４型）１２１を充填した塔に通過
吸着せしめ、水洗（２４ｆＬ）後、ＩＮアンモニア水で
溶出した。活性溶離液（３℃）を集めて減圧濃縮乾燥し
、粗粉末３．５１　ｇ　（８１ｍｃｇ／ｍｇ　）を得た
。

この粗粉末をｔｏｏ＋＋＋１２の水にとかし、ダウエッ
クス１−Ｘ４　（ＯＨ型）　　３００ｍ１ｌをつめた塔
（内径４０ｎ＋ｍ）にかけ、続いて水で展開し、はじめ
の流出液２００ｍＲを捨て、次の８８０蔵を集め、これ
を、続いてアンバーライトＣＧ　　５０（Ｎ）Ｉ＜型）
１５０淑をつめた塔（内径２５ｍｍ）にかけて吸着せし
め、水洗（３００ｍＲ）後、　０．２Ｎアンモニア水９
ｏｏｍＵ、次いで０．４Ｎアンモニア水９００叔で溶出
し、１８ｍ５１ずつ分画した。分画６６〜８０を合して
減圧濃縮乾固してイスタマイシンＡおよびＢを含有する
２１０ｍｇの白色粉末（力価４６０　ｍｃｇ／ｍｇ）を
得た。（なお、分画２８〜６５にはイスタマイシンＡま
たはイスタマイシンＢ以外の数種の抗生物質が溶離され
た。） 実施例　２ 実施例１に述べたと同様の方法で得られた培養濾液（ジ
ャーファーメンタ−１１０基分、１５ｉ）をアンバーラ
イト　ＩＲＣ−５０（ＮＨ４）　２０’ｕを充填した塔
に通過吸着せしめ、水洗（４０ＩＬ）後、ＩＮアンモニ
ア水で溶出、活性溶離液を減圧濃縮乾燥して、粗粉末４
．１ｇ　（力価２４０　ｍｃｇ／ｍｇ　）を得た。

この粗粉末を２０ｍＱの水にとかし、ダウエックス１−
Ｘ４　（叶型）　　２００ｍｕをつめた塔（内径３０ｍ
ｍ）にかけ、続いて水で展開し、はじめの流出液ｏｏｍ
Ｒを捨て、次の２ｙｏｒｒｆ）を集め、続いてこれをア
ンバーライトＣＧ−５０（Ｎ）＋４型）　　１５０ｍＪ
ｌをつめた塔（内径２５ｎｍ）にかけて吸着せしめ、水
洗（１５゜叔）後、０．２Ｎ７ンモニ７水９００叔、次
いで０．４Ｎアンモニア水９００＋ｎｌＪで溶出し、１
８叔ずつ分画した。分画５５〜９０を合して減圧濃縮乾
固してイスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢを含有
する９８０ｍｇの白色粉末（力価９４０　ｍｃｇ／ｍｇ
）を得た。

亙五璽−ユ 実施例２で得られたイスタマイシンＡおよびイスタマイ
シンＢを含有する白色粉末（力価９４０ｍｃｇ／Ｂ）　
９８０Ｂを、ブタノール・ピリジン・酢酸・水（６：　
４　：　２　：　２容）の混液１５ｍλにとかし、セル
ロース粉末（アビセル）６０ｇを充填した塔（内径２５
ｍｏ＋）にかけ、はじめに、ブタノール・ピリジン・酢
酸・水（６：　４　：　２　：　２容）の混液１２ｏｏ
ｍＡ、次いで６：４：２：４容の混液８００ｍ１２で展
開し、ｘｏ＋＋Ｒずつ分画した。分画４５〜７４にイス
タマイシンＢが分画１１４〜１５４に、イスタマイシン
Ａが分画７５〜１１３に、両者が混合して溶出された。

分画４５〜７４を合して減圧濃縮乾固し、５ｍλの水に
とかして、アンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ４型）２５
ｍ９の塔に通過吸着せしめ、水洗（２５ｍＲ）後、０．
４Ｎアンモニア水で溶離し、活性溶離液（４０＋＋＋Ｒ
）を減圧濃縮乾固して、イスタマイシンＢの精製粉末１
５．３ｍｇ　（力価３１７０　ｍｃｇ／ｍｇ　）を得た
。

同様に、分画１１４〜１５４を合して減圧濃縮乾固し、
５ｍ＄１の水にとかして、アンバーライトＣＧ−５０（
ＮＨ４型）　２５ｍ５１の塔に通過吸着せしめ、水洗（
２５ｍＮ）後、０．４Ｎアンモニア水で溶離し、活性溶
離液（４５ｄ）を減圧濃縮乾固してイスタマイシンＡの
精製粉末５０ｍｇ　（力価ｔｏｏｏ　ｍｃｇ／ｍｇ　）
を得た。

手続？市正書（自発） 昭和６３年　２月　９日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　気菌糸の色調が白色で次第に青緑色を帯びた灰色を増
   し、気菌糸に螺旋糸を示さず、また胞子表面が平滑であ
   り、メラニン様色素生産性すなわちクロモゲン性があり
   、炭素源としてグルコースとイノシトールを同化するが
   アラビノース、Ｄ−キシロース、シュクロース、ラムノ
   ース、ラフィノース、Ｄ−マンニットを同化せず、イス
   タマイシンＡ及びイスタマイシンＢの生産性を有する、
   実質的に純粋に分離されたストレプトミセス・テンジマ
   リエンシス。