JPS63305248A

JPS63305248A - 酵素免疫検定方法及び検定用組成物

Info

Publication number: JPS63305248A
Application number: JP63119446A
Authority: JP
Inventors: ラバト、エイチ、アドルフゼン; モウハン、エス、サイニ; ランガ、アー、ヴアナム
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-05-18
Filing date: 1988-05-18
Publication date: 1988-12-13
Also published as: IL85596A0; DK267788A; CA1304292C; EP0292170A3; AU610866B2; DK267788D0; EP0292170A2; AU1416888A; IL85596A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は特異結合検定の分野、特に酵素免疫検定を行う
ための新規な検査組成物及び検査方法に関する。

特異結合検定技術の発達は、液体媒質中に非常に低濃度
で現れる診断上、医薬上および環境上重要な種種な有機
物質の測定のために、非常に有用な分析法を提供して来
た。特異結合検定は、測定されている結合できる検体と
それと結合する相手との間の特異な相互作用に基いてい
る。

従来の非同位体の競争結合検定にｔｒｘ　、（１１’Ｓ
出すべき検体（例えば抗原またハノ・ファン）を結合成
分としこれを標識成分と化学的に結合させた標織配合体
（１ａｂｅｌｅｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）および（２
）検体に対する特異結合の相手（例えば抗体）を含む試
薬手段が用いられている。検査試料と試薬手段とを組合
わせると、検査試料中に検出されるべき検体があればこ
れと標識配合体の結合成分とが特異結合相手上の非共有
結合的結合サイトに対して、実質的に差違なく競争結合
する。結合相手と結合した標識配合体（結合種とも言う
）のｉまたは結合相手と結合しないで残っている標識配
合体（遊離種とも言う）の量はその検査試料中に存在す
る検体量の関数である。従って、検査試料中の検体量は
、結合種または遊離種の量を通常の方法で測定し、既知
濃度の検体について同様に測定した量と比較することに
より、決定することができる。

結合種中の標識配合体と遊離種中の標識配合体とは標識
成分をモニターする手段によっては本質的には区別でき
ない場合は、結合種と遊離種とを物理的に分離する必要
がある。この型の検定は当業界においてへテロソニアス
検定と呼ばれる。結合種と遊離種とが区別できる場合に
はホモノニアス検定と呼ばれ、分離段階は不要である。

最初に開発された高感度の特異結合検定は標識あった。

この検定では標識のモニターできる性質が遊離種と結合
種とで定性的に変らない故に、必然的にヘテロソニアス
となる。放射性材料の取扱いの不便さと困難さの故に、
標識成分として放射性同位体以外の、酵素・螢光物質、
バクテリオファーヅ、金属、有機金属錯体、補酵素、酵
素基質、酵素抑制剤とサイクリック（ｃｙｃｌｉｃ　）
　　反応物、化学発光反応物等の材料を用いる多くの新
しい検定システムが開発されている。

標識物質として酵素を用いる方法の例は、米国特許第３
，６５４，０９０号、第３，７９１．９３２号、第３　
、８３９　。

１５３号、＠　３，８５０，７５２号、第３　、８７９
　、２６２号の各明細書ならびにＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓｌ　：
　２４７　（１９７２）およびＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０９　：　１２９　（１９７２
）に記載されている。

前記の何れの方法においても、酵素は検出されるべきリ
ガンドあるいはその結合相手の何れかに化学的に結合し
ていて、適切な特異結合反応体系が構成され、それによ
れば、試料と温置後でに不溶性の部分または液体部分の
何れかに伴はれる酵素活性量は試料中のりがンドの量の
関数である。

酵素配合体の合成と特性づけと安定性とがこの方法の重
大な欠点である。

ホモソニアス型の酵素標識免疫検定は米国特許第３，８
１７．８３４号明細書に記載されていて、それはりガン
ト酵素配合体を用いる。結合種における配合体の酵素活
性は遊離種における酵素活性より測定可能な程度に小さ
いのでホモソニアスな検定ができる。

ホモソニアスおよびヘテロジニアス型式に使われる、化
学発光物質、サイクリック反応物、分裂可能な螢光酵素
物質等の特別な材料については、ドイツ特許公開第２．
６１８，４１９号および第２，６１８，５１１号の各明
細書に記載されている。

米国特許第３，８８０．９３４号明細書には、標識物質
として分光測光的に活性な物質の非活性前駆物質を用い
る特異結合検定が記載されている。試料を特異結合反応
システムと温置後、不溶性部分と液体部分とを分離し、
試料中の、検出されるべきり〃ンド愈の関数である、液
体部分に存在する標識物質量を、活性標識物質を色原体
または螢光分析的に活性な物質に変換させる反応段階を
実行し、それからそれを通常の方法で測定することによ
って決定する。

異った型の標識物質を用いる他の特異結合検定法として
は、標識手段として電子スぎ／共鳴を使用することが米
国特許第３　、８５０　、５７８号明細書に、標識手段
として螢光の消光と増大とを使用することが米国特許第
３　、９０１　、６５４号明細書に、化学発光反応によ
りモニターされるペテロソニアス検定システムに標識物
質として塩化ヘミンを用いる試みの失敗が米国Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣｏｍｍｅｒｃｅのＮａｔｉｏｎ
ａｌＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓ
ｅ　　　（ＮＴＩＳ）報告郭−２２４，８７５（１９７
３）　Ｋ記載されている。Ｎａｔｕｒｅ　２１９：１８
６（１９６８）には幾つかの放射免疫検定法について詳
しく述べ、標識物質として放射性同位体の代りに補酵素
およびビールスを使用する可能性についてごく一般的ガ
言及が成されている。しかし、実際にどのようにすれば
このような標識物質を使用して検定ができるのかも、ま
た本当に可能であるのかも、全く明らかにされていない
。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓ５ａｙｓ［０
ｄｅｌｌおよびＤａｕｇｈａｄａｙ編：］　（Ｊ、Ｂ、
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、　＋Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ　、　１９７２　）には、種種な既知の検定体系
ならびに、特異結合検定のために標識として用いられる
種種の材料と特徴とが記載されている。

特異結合検定について多くの新しい提案がなされ改良さ
れてはいるが、現在でも放射免疫検定と酵素標識免疫検
定とが最も広く使用されている。

しかし何れのシステムも明らかな欠点、放射免疫検定で
に危険で慎重な取扱いを要する放射性材料を用いる点、
そして酵素標識免疫検定では安定性の高い酵素標識配合
体の調製が困難である点がある。

米国特許第４，１３４，７９２号明細書には、標識物質
として、ホモソニアスおよびヘテロソニアス壓式双方に
用いてもよい可逆的結合酵素モノユレータを使用する特
異結合検定法が記載され、そこではリガンドについて検
査される液体媒質を標識配合体からなる試薬と組合わせ
て、配合体の結合種と遊離種とを持つ結合反応システム
を形成している。

結合種と遊離種との間の配合体の分布は、その活性が前
記モノユレータにより抑制的に（例えば競争阻害剤とし
ての）または刺戟的に（例えばアロステリックエフェク
タとしての）影響を受ける酵素を添加し、その結果得ら
れる酵素の活性を測定して決定する。

米国特許第４，２７３，８６６号明細書には、検査試料
を、リガンド類似体不可逆酵素阻害剤配合体と、リガン
ドおよびリガンド類似体不可逆酵素阻害剤配合体に結合
できる結合蛋白質とに混合することからなる検査試料中
のりがンド測定法が記載され、そこでは結合蛋白質と結
合したりがンド類似体不可逆酵素阻害剤配合体の量は検
査試料中のりがンド量に関係し、前記結合蛋白質は、配
合体のリガンド類似体部分と結合している場合、不可逆
酵素阻害剤を不活性し、結合蛋白質によって結合されて
いないりがンド類似体不町逆酵素阻害剤配合によって不
可逆的に阻害されている酵素を混合し、その酵素に基質
を混合し、酵素基質反応をモニターしている。

米国特許第４　、２３０　、７９７号明細書には、予め
定めた反応システムの構成物として反応活性を示す標識
物質および反応物質を用いることを基礎においたへテロ
ノニアス特異結合検定とその手段とが記載されている。

結合相と遊離相との何れかに存在する反応物の量は、い
ずれかの相を、反応物と特異結合反応をモニターする手
段として役立つ予め定めた反応システムを形成する少く
とも１つの試薬と接触させることにより測定される。そ
の方法は結合相と遊離相との分離段階を必要とする。

米国特許第４　、２７２　、９９２号明細書には、酵素
開裂できる基質標識として構造式（この式で、Ｇはグリコンであり、Ｄは染料指示薬部分
であＩｌｌ、Ｒは標識残基が在来の結合検定システムの
結合成分例えばリガンド、その類似体またはその特異結
合相手と共有結合で結合している結合基である）で表わされる残基を用いる、液体媒質中のりガント測定
の方法と試薬とが記載されている。その標識のモニター
される特性はグリコンと染料指示薬部分との間の配糖体
結合の酵素的開裂において、通常は螢光原体または色原
体である検出できる生成物を放出することである。この
検査法はへテロソニアスまたはホモソニアス型式に従っ
てもよい。

米国特許第４　、２３８　、５６５号明細書には、有機
の補欠分子族残基例えばフラビンアデニンジヌクレオチ
ド、フラビンモノヌクレオチドまｆｃ、はヘムの残基を
、標識された配合体中の標識成分として用いる、液体媒
質中のりがンドを測定する検定が記載されている。好ま
しくは、その標識成分は補欠分子族残基だけであるかあ
るいはホロ酵素複合体の形の中でアポ酵素と組合わされ
ている補欠分子族残基からなるホロ酵素残基である。前
者の場合、標識成分は好ましくは結合反応が開始された
後アポ酵素を添加し、その結果得られたホロ酵素活性を
測定することにより検定をモニターする。後者の場合は
、標識成分は単にホロ酵素活性の測定でモニターする。

この検定法は通常のホモソニアスまたはへテロソニアス
体系に従ってもよい。

米国特許第４　、４６３　、０９０号明細書には、感度
がカスケード増幅される酵素免疫検定が記載されている
。結合されたリガンド（酵素または賦活剤）はカスケー
ドを作るために基質に作用しまたは第３の酵素に作用で
きる第２の酵素を接触的に活性化する。

２７ｍｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｎｅ
ｗ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒＨｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　”　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　
３０　。

１４５２−１４５６頁（１９８４）には、抗原に配合さ
れた凝血ファクターＸが競争的結合過程の後、活性形に
変換される３段階カスケード反応が記載されている。（
プチドは不活性形から活性形に変換するためその分子が
開裂する。

本発明においては、調節酵素により標的蛋白質を共有結
合的に変性し、それ罠より標的蛋白質により仲介される
検出可能信号発生プロセスの速度を変化させる、酵素免
疫検定が提供される。この変性の程度が、検査試料中の
検体量の関数となる。

本発明は信号を生ずるプロセスを仲介できる標的蛋白質
を包含する検査組成物を提供する。標的蛋白質の仲介活
性は、それに調節基を共有結合させることにより調節で
きる。またその組成物中には調節基の標的蛋白質への共
有結合に接触作用を及ぼす調節酵素も包含される。調節
酵素用の基質分子と検体との配合体が、検体用の特異的
結合相手及び標的蛋白質の条件に応答して検出可能信号
を発生する試薬手段と共に提供される。

本発明は更に、実質的に、（ａ）検出可能信号を発生す
るプロセスを仲介することができる標的蛋白質と、標的
蛋白質への調節基の共有結合に接触作用を及ぼし、それ
によって標的蛋白質が仲介するプロセスの速度を変化さ
せることのできる調節酵素とを提供し、（ｂ）前記調節
基を含有する調節酵素用の基質とこれに共有結合した検
体とを含んでなる配合体を提供し、（Ｃ）前記配合体に
結合でき、それによって前記配合体が調節酵素用基質と
して働くのを制限する、検体の特異的結合相手を提供し
、（ｄ）調節酵素、標的蛋白質、標的蛋白質により仲介
されるプロセスの要素及び試料との存在の下に、前記配
合体を特異的結合相手と接触させ、１ｅ）標的蛋白質に
より仲介されるプロセスの速度を測定し、そして（ｆ）
試料の存在下に行ったプロセスの速度と、既知量の検体
を含有する一連の標準組成物の存在下で行ったプロセス
の速度とを比較する各段階を含んでなる、試料中の検体
の存在及び童を検出する方法を提供する。

本発明の好ましい態様においては、検定試薬検査組成物
ならびに免疫検定に本発明検査組成物を用いる方法が含
まれる。

本発明による検定は抗体抗原反応を用いての検定、即ち
免疫検定をすることのできる任意の物質の定性および（
またＩＩ′ｉ）定量測定忙用いることができる従来の酵
素結合免疫検定に対して、本発明の検定は調節酵素と標
的蛋白質との組を用いる。

調節酵素は基質から標的蛋白質への調節基の共有結合に
接触作用を及はして、信号を生ずる反応を仲介する標的
蛋白質の能力を変化させるように適合させである。調節
酵素は配合体の基質分子の部分を、標的蛋白質上の、活
性サイトとは独立した別の特異なサイトに移す。この型
の酵素活性調節はアロステリックではないことを理解す
べきである。アロステリック調節は、活性サイトから独
立した別のサイトにおける、調節分子の非共有結合を含
むものであり、このような調節には調節酵素は関与しな
い。

以下に、適当な調節酵素、標的蛋白質及び特異調節酵素
−標的蛋白質上の例をあげ、その後に実施例を述べる。

調節酵素の幾つかの代表例は表１に挙げたプロティンキ
ナーゼである（　Ｅ、Ｇ、ＫｒｅｂｓおよびＪ、Ａ。

旦、　８３１−８８７　（１９７４））。蛋白質キナー
ゼを調節酵素として用いると蛋白質リン酸化が行われ、
それＫよってホスフェート基を配合体基質から標的蛋白
質へ移すことにより標的蛋白質の調節が達成される。蛋
白質リン酸化に加えて、他の型の部分を共有結合で標的
蛋白質に結合させることで調節が達成されてもよい。例
えばアデニル化ＨＥ、ｃｏｌｉグルタミンシンテターゼ
およびＥ、ｃｏｌｉ　　リジン感受性アスパルチルキナ
ーゼを調節する手段である（　Ｅ、Ｒ，Ｓｔａｄｔｍａ
ｎ＋　Ｔｈｅ　Ｅｎｇｍｅｓ、　Ｖ［［Ｉ＋　１−４９
（１９７３））。

調節はまたウリツル化、アセチル化またはメチル化で達
成されてもよい（ＫｒｅｂｓおよびＢｅａｖｏ　、同誌
）。

表　　　　　１ｃＡＭＰ　１５存性プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ依存
性プロティンキナーゼ、ｃＩＭＰ依存性プロティンキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、カルシウム依存性ミオシン軽鎖キナーゼ、カルシウム依
存性二重鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ、ピルベート脱水素酵
素キナーゼ、膜プロティンキナーゼ、ヒストンプロティンキナーゼ、リポソームプロティンキナーゼ、標的蛋白質の例は表２に示す。プロティンキナーゼ′に
よりリン酸化された酵素（ＫｒｅｂｓおよびＢｅａｖｏ
　、同誌；　ＲｕｂｉｎおよびｆＬＯＢｅｎｔ同誌）も
また含まれる。これらの酵素のあるものはそれ自身プロ
ティンキナーゼである。また標的蛋白質は必ずしも細胞
質酵素である必要はない。膜蛋白質（１リン酸化して膜
透過性を変化させることができる。

例えばシナプス膜はｃＩＭＰ　依存性キナーゼによりリ
ン酸化されることは知られている。それに加えて、リポ
ソーム蛋白質はｃＡＭＰ　依存性キナーゼによりリン酸
化されることができ、おそらく蛋白質合成を・調節する
ようになる。ヒスト／ニリン酸化され、遺伝子表現を調
節することになる。

表　　　　２アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、コレステロールエステルヒドロラーゼ、ＤＮＡ−依存性
ＲＮＡシ／テターゼ、フラクトース−１，６−ソポスフアターゼ、ＣＧＭＰ依
存性プロティンキナーゼ、グリセロホスフェートアシルトランスフェラーゼ、グリ
コーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲンシンテターゼ、ホルモン感受性リノーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ、ミオ
シン軽鎖ＮＡＤ依存性グルタメート脱水素酵素（酵母）
、フェニールアラニンヒドロキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ（肝）、ホスホリラーゼキナーゼ、　　　、ホスホリラーゼホスファターゼ抑制剤、ポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ、ピルベート脱水素酵素３、ピルベートキナーゼ（肝）、　　、逆転写酵素、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ｎ　ｍ　ｃＡＭＰ依存性ゾロティンキナーゼ、テロシン
ヒドロキシラーセ、本発明の好ましい調節酵素−標的蛋白質組に、ホスホリ
ラーゼキナーゼが調節酵素であり、グリコーゲンホスホ
リラーゼ（ホスホリラーゼｂ）が標的であるホスホリラ
ーゼキナーゼシステムである。ＡＴＰ−配合体の末端ホ
スフェート基はホスホリラーゼ１（不活性型）に移され
、調節酵素、ホスホリラーゼキナーゼによりそれをホス
ホリラーゼ！（活性型）に変換する。このリン酸化反応
が標的酵素の活性を非常に増大させる。

他の好ましいシステムはグリコーゲンシンテターゼシス
テムである。この場合、標的酵素（グリコーゲンシンテ
ターゼ）のリン酸化された型は変化されない酵素より低
い活性を持っている。その調節酵素はサイクリックＡＭ
Ｐｆｆｆ存性プロティンキナーゼである。

ホスフェート基以外の基が結合されている例はグルタミ
ンシンテターゼの例である。その調節酵素はアデニルト
ランスフェラーゼである。アデニルトランスフェラーゼ
はアデニル基をグルタミンシンテターゼ（標的）に結合
させる。アデニル基の結合で、この酵素の活性は低下す
る。

これらの酵素システムに関して、Ｈ，Ｈｏ１ｚｅｒ　　
およびＷ、　Ｄｕｎｔｚ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、＋　４０　＋　７５６（１９７１）にさらに詳
しく記述されている。これらおよび他のｌ１ｌｔ１様な
システムについて、さらにＨ，Ｌ、Ｓｅｇａｌ　＋５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　１８０＋　２５（１９７３）　；　Ｄ、
Ｈ，Ｂｒｏｗｎ及びＣ，Ｆ。

２９７（１９８０）等の文献がある。

従来のへテロソニアス検定型式においては、抗体を、検
体とこの検体に共有結合で結合する酵素基質（例えばア
デノシン三リン酸″’ＡＴＰ”）を含有する配合体とを
含有する標本と混合する。次に遊離配合体と結合配合体
との分離を通常の手順で行う。次に遊離配合体を酵素対
と製置して検定する。その結果標的蛋白質の活性が変化
する。次に標的蛋白質の活性を測定する。すべての成分
が可溶であれば、遊離配合体の分離はｒ過（例えばＡｍ
１ｃｏｎ限外ｒ過蛋白質濃縮器またはｒルｒ過カラムを
用いて）により行う。あるいは、抗体一検体および抗体
−配合体複合体を沈殿させる薬剤例えば抗−抗体を加え
る。あるいは、抗体を管またはミクロタイター板に固定
し、遊離配合体を含有する溶液を物理的に分離管に移す
。

抗体との製置は競争的あるいは逐次的に行う。

後者の場合には、配合体を添加する前に、抗体を標本と
共に製置する。これにより感度が改善されることがある
。

上記はこの概念を用いてペテロソニアス検定を行う多く
の可能性ある方法の中の数例である。

ホモジニアス検定においては、遊離配合体と結合配合体
との分離は不要である。例えば配合体が調節酵素用基質
として働くのを妨げる抗体であれば、分離は必要でない
。検定法は競争的あるいは逐次的である。後者の場合は
、抗体を配合体添加前に標本と製置する。これにより感
度が改善されることがある。

一般に、本発明のホモジニアス酵素免疫検定は、検出可
能信号を発生するプロセスを仲介できる標的蛋白質の使
用を包含する。本明細書において”検出可能信号″は、
直接の観察または機器で感知でき、試料中の検体の存在
の関数である。酵素システム中の性質の変化または出現
を意味する。検出可能信号の幾つかの例は可視または赤
外吸収、螢光、リン光、反射あるいは化学受光における
変化である。検出可能信号の他の例は電気化学的性質の
変化であってもよい。

本発明の概念は所望に上りへテロソニアス型式またはホ
モジニアス型式で利用することができる。

本発明による免疫検定は（ａｌ基質分子と検出すべき検
体との配合体と（ｂｌ検体の特異結合相手との間の通常
の競争的結合平衡を包含している。この結合平衡は基質
中の調節基の標的蛋白質への共有結合に接触作用を及ぼ
す調節酵素の存在で起る。標的蛋白質は、調節基がそれ
に共有結合で結合した場合、検出可能信号を生ずるプロ
セスを仲介、例えば刺戟または抑制できる。検出可能信
号の変化を測定し、検査試料中の検体量が決定できる。

好ましい態様によれば、ｔａｌ　ＡＴＰを含有する配合
体を包含する競争的結合平衡ｔＩ＋と、Ａｂ　＋　Ａｇ
−ＡＴＰ、＝−−＝公Ａｂ：　Ａｇ−ＡＴＰ＋ＡＩ）：Ａｇｔｂ）調節酵素としてホスホリラーゼキナーゼ、標的蛋
白質として不活性ホスホリラーゼｙを使う、配合体のＡ
ＴＰ部分の末端ホスフェート基を不活性ホスホリラーゼ
艷に移し、ホスホリラーゼｙを活性ホスホリラーゼキナ
ーゼする接触的変換段階ｔＵｔと、Ａｇ−ＡＴＰ　＋　Ｐｈｏｓ互−→Ａｇ−ＡＪ）Ｐ　＋
　Ｐｈｏｓ互　１１１１１ｅｔ甲活性ホスホリラーゼａ
がグリコ−ｒンと無機リン酸（Ｐｉ）　　とから第１の
信号前駆物質であるグルコース−１−ホスフェートを生
成し、（ｉｉｌホスホグルコムターゼがグルコース−１
−ホスフェートから第２の信号前駆物質であるグルコー
ス−６−ホスフェートを生成し；　＋ｉ；＋グルコース
ー　６−＊スフエート脱水素酵素がグルコース−６−ホ
スフェートとニコチンアミドアデニンソヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ　）からニコチンアミドアデニンソヌク
レオチドホスフエートの還元型と６−ホスホグルコネー
トとを生成し；そして（ψＮＡＤＰＨ生成速度を測定す
る、検出可能信号生成シーケンスと、を包含する。

上記のシーケンスにおいて１１！、１つの遊離配合体が
１つの活性酵素を生成し、検定の増幅係数はホスホリラ
ーゼ１の代謝回転数に等しい。このことにより高感度の
検定が可能となる。

この態様において配合体が充足しなければならない２つ
の基本的要件がある。第１はその配合体がホスホリラー
ゼキナーゼの基質であるという要件である。第２Ｊｒｉ
それが抗体と結合した場合はこの酵素の基質でないとい
う要件である。例えば、ＡＴＰ−ノニトロフェニル配合
体は、溶液中遊離の場合はルシフェラーゼの基質である
が、抗体と結合するとそうではないことが見出されてい
る（頁（１９７６））。

第２の好ましい免疫検定の態様は標的酵素として分枝鎖
ケト酸脱水素酵素（ＢＣＫＤＨ）を用いる。

調節酵素はＢＣＫＤＨキナーゼである。競争的結合反応
すなわち前記のｆＩｌの後、遊離配合体は前記のキナー
ゼにより前記標的蛋白質のリン酸化に用いられる。

この態様において、リン酸化は標的酵素の活性を約９９
チ妨げる。従って引続く反応においてニコチンアミドア
デニンソヌクレオチド（ＮＡＤＨ）生成速度は前記検査
試料中の検体量に逆比例する。標的蛋白質により仲介さ
れる反応は次の：（この式で、ＢＣＫは分枝鎖ケト酸で
あり、ＣｏＡＳＨは補酵素Ａの還元型であシ、ＴＰＰは
補因子であるチアミンピロホスフェートである）である
。このシステムはさらに詳しくはＰ、Ｊ、Ｒａｎｄｌｅ
＋　Ｐ、Ａ、ｐａｔｓｔｏｎおよびＪ、Ｅｓｐｉｎａｌ
によりＴｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ＋　ＸＶＬ　９７（１９
８７）中で記述されている。

第３の好ましい態様では標的蛋白質としてホルモン感受
性−リパーゼ（Ｈ８Ｌ）ｔ−用いる。調節酵素はｃＡＭ
Ｐ　依存性プロティンキナーゼである。競争的結合反応
の後、遊離配合体はそのキナーゼにより標的蛋白質のリ
ン酸化に用いられ、活性を３倍増大させる：標的蛋白質により仲介される反応は以下で示されるよう
に、中間体信号前駆物質を最終の信号を生ずる材料ＮＡ
ＤＨに変換するため結合酵素としてさらに２つの酵素が
必要である。

コノシステムはＰ、５ｔｒａｌｆｏｒｓ＋　Ｈ，０１ｓ
ｓｏｎおよび１４７（１９８７）に記述されている。

さらに好ましい態様においては、標的蛋白質としてヒド
ロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼを、調節
酵素としてＨＭＧ　ＣＲキナーゼを用いる。競争的結合
反応の後、遊離配合体はＨＭＧＣＲキナーゼにより、次
の如く、標的蛋白質のリン酸化に用いられる。

Ｅ痕ＫＲキナーゼＡｇ−ＡＴＰ　＋　ＥＭＣＣＲＡｇ−ＡＤＰ　＋　）Ｍ
ｆＲ−Ｐこのシステムにおいて、リン酸化は標的蛋白質
の活性を実質的に妨げる。それ故、酵素反応速度は調査
試料中の検体量と逆に関連する。標的蛋白質に仲介され
る反応は次のものである。

上記の反応式で示す如く、測定されるのはＮＡＤＰＨの
消失であって、他の式での如＜　ＮＡＤＨの出現ではな
い。このシステムはり、Ｍ、ＧｉｂａｏｎとＲ，Ａ、Ｐ
ａｒｋｅｒにより　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　ＸＶｍ
、　１７９（１９８７）　Ｋ詳しく述べられている。

更に他の好ましい態様では標的蛋白質としてフェニルア
ラニンヒドロキシラーゼ（ＰＨ）ｉ用いる。調節酵素は
ｃＡＭＰ　依存性プロティンキナーゼである。競争的結
合反応の後、前記の遊離配合体は標的蛋白質のリン酸化
のため前記キナーゼによって用いられ、酵素活性の増加
になる。

Ｐｆ（により仲介される反応を下記に示す。信号前駆物
質の信号材料、ＮＡＤＨへの転換には信号生成反応順序
中で池の１つの結合酵素が必要である。

池の２つのヒドロキシラーゼを前記標的蛋白質に換えて
もよい。これらはチロシンヒドロキラーゼとトリプトフ
ァンヒドロキシラーゼである。このシステムはＳ、　Ｋ
ａｕｆｍａｎ　　によって工ｈｅ　Ｅ、ｕｎ！ＬＸＶ１
ｆｉ　、　２１７（１９８７）中で詳しく述べられてい
る。

他の好ましい態様では標的蛋白質としてグルタミンシン
テターゼ（ＧＳ　）　　を用いる。調節酵素はアデニル
トランスフェラーゼ（ＡＴ）である。この態様において
は、ＡＴＰ配合体からのアデニル基の標的蛋白質への転
移がある。

アデニル基のグルタミンシンテターゼへの結合は酵素活
性を約９５チ減少させる。それ故、反応性は抗原濃度に
逆比例する。標的蛋白質により仲介される反応は次のよ
うなものである。

朋　　＋グルタミン酸−ＧＳ−→グルタミン信号を作り
出す材料はアンモニウムイオンで、それは反応基質であ
る。このイオンの濃度はアンモニウム電極でモニターで
きる。このシステムハＨ０１（ｏｌｚｅｒとＷ、Ｄｕｎ
ｔｚｅとによりＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
＋ｍ　、　７５６（１９７１）に詳しく述べられている
。

以下の実施例においては、できる限り標準の市場で入手
できる試薬級化学薬品を使用した。これらの例は本発明
を説明するためのものであり、本発明を制限するための
ものではない。

実施例ＩＡＴＰ−フェニトイン配合体の調製この配合体の合成は、無水ぎりノン中のフェニトインの
吉草酸誘導体による、ＡＴＰのリボース部分のアシル化
を包含している。ＡＴＰのナトリウム塩はピリジンて不
溶である故に、可溶性の型π変換する必要がある。

第１に、ＡＴＰを次の如くしてピリジニウム塩に変換す
る。即ち、ＡＴＰナトリウム塩（１，１７。

０．２ミリモル）を水４　ｒａｔに溶解し、Ｄｏｗｅｘ
　５０ｘ２（ピリソニウム型）の２．５　ｘ　２５　ｃ
！！Ｌ力万ムを通過ささせる。そのカラムを、紫外吸収
をする材料が溶離液になくなるまで水（４０１Ｒ１）で
溶離する。その水性溶液を凍結乾燥し、得られる白色固
体を一２０℃で貯蔵する。この生成物はイソブチル酸−
濃水酸化アンモニウム−水（６６：２：３３）を用いる
セルローズ板（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ＋　Ｒｏｃ
ｈｅｓｔｅｒ＋　ＮＹ　）上のＴＬＣで単一スポットを
与えている。

第２ＫＡＴＰｆ１次の如くしてトリオクチルアミン塩に
変換する。即ち、トリオクチルアミン２５０μｔ　を含
有するメタノール中のＡＴＰ−ピリジニウム塩（０，１
ｍモル）の透明な溶液を減圧の下乾燥するまで蒸発する
。残渣を無水ピリジンから、そして乾燥ツメチルホルム
アミドから繰返し蒸発して乾燥する。油状残渣を乾燥ｄ
　ＩＪジノン　ｍｌに溶解する。

フェニトイン−吉草酸によるアシル化：ＡＴＰを含有す
るピリジン溶液を４℃に冷却し、フェニトイン−吉草酸
（７０４１１ｇ、２ミリモル）とソシクロヘキシルカル
ボジイミド（２０６ｍｇ　、０．１ミリモル）と共に攪
拌する。その溶液を４℃で約団時間貯蔵後、冷水２　ｍ
ｌを加え、その溶液を４℃でさらに４時間貯蔵する。こ
の段階の目的は形成されていることのある混合酸無水物
を分解するにある。この反応混合物のＴＬＣを、イソブ
チル酸−水酸化アンモニウム−水（６６：　１　：　１
６．５　）　　中のセルローズ板で行う。その板にモリ
ブデン酸アンモニウム−水−７０チ過塩素酸−濃塩酸−
アセトン（１：　１０：　５　：　２．２　：　８２）
を噴霧することによりリン酸塩の存在を決定する。アデ
ノシンの存在は紫外線ランプを用いて検出する。リン酸
塩とアデノシンと双方を含有する２つの生成物を見出し
た。これらの生成物のＲｆ値［０，４５と０．６０であ
る。

その反応混合物はさらに次の如く処理する。沈殿した材
料を遠心分離によって除去し、上澄液を乾燥するまで蒸
発する。残渣をクロロホルム１０　ｍｌと水１０　ｍｌ
との間で分配する。その水性相をクロロホルムで再洗浄
し、固体ＮａＨＣＯ３でｐＨ７に調節する。生成物Ａ　
（ＲｆＯ，４５）は水性相に抽出され、生成物Ｂ　（Ｒ
ｆＯ，６０）は有機相に抽出される。

両生成物共ホスホリラーゼキナーゼに関（７活性をもつ
。また生成物Ａはフェニトインに対する抗体と相互作用
をなし、それはホモソニアス免疫検定に対し生成物Ａを
有用にしている。生成物Ｂは抗体と相互作用せず、従っ
てそれは免疫検定に対し有用ではない。

配合体（生成物Ａ）はまずに−・ぐ−クロマトグラフイ
ーで、それから［）□ｗｅｘイオン交換によって精製す
る。ペー・ぐ−クロマトグラフイーは硫酸アンモニウム
−水−イソゲロバノール（６：　１００　：０．２　ｗ
／ｖ／ｖ　）中で行う。この溶液中では、残っている未
反応のＡＴＰがあると元の物から離れるが、生成物は離
れない。配合体は元の物から水で溶離され、未反応ＡＴ
Ｐは元の物から離れるが、生成物は離れない。配合体は
元の物から水で溶離し、凍結乾燥する。つぎに、配合体
はＤｏｗｅｘ　Ａｇ　１　ｘ　８カラム、塩化物型に適
用される。そのカラムを１０ミリモルＨＣｔで洗浄し、
それから１０ミリモルＨＣｔを含有する０、２モルＮａ
ＣＬ　　で洗浄し、残存する痕跡のＡＴＰを除去する。

それから配合体１０ミリモルＩ（ｃｔ　ｆ、含有する０
、２モルＮａＣｔ中の５０　Ｌ％エタノールで溶離する
。エタノールの使用により疎水的に結合される材料例え
ば配合体のフェニトインを離脱させる。

この材料の考えられる構造を以下（ＩＶ）に示す。

ハプテンはリボース環の２′位または３′位何れに結合
していてもよい。ハプテンが異る結合によってリポース
環に結合している配合体を導ひく他の合成経路もまた本
発明に用いるのに同様に適当である。

Ｈ２実施例２ホスホリラーゼキナーゼの調製調節酵素はホスホリラーゼキナーゼである。それは、実
質的に、組織をバルビタールの代りにトラノンで殺した
家兎からの、Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚｅ　　からの凍結の形
で得た点以外は、Ｃｏｈｅｎ、ｐ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｔ、　９９．２４３−２５０（１９８３）に記
載の如く精製した。また凍結組織はグリコリンスを妨げ
る助けるため、ドライアイス上の乳鉢と乳棒との中で磨
砕した。それは高い収率で酵素を与えた。５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂカラムから回収した後、精製酵素の比活性は
１１μモル／分／叩であった。

ホスホリラーゼキナーゼ活性の単位は本質的にｎ　Ｍ、
　ＫｉｎｇとＧ−Ｃａｒｌｓｏｎ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、　２０＋　４２８２（１９８１）　　により記載の如
く検定された。その検定は２つの個別の湿量混合物を必
要とする。第１においては、ホスホリラーゼキナーゼは
ＡＴＰとホスホリラーゼ基と湿量する。それからそのア
リコートをとり、第２の反応混合物中て希釈し、第１の
温置物中て形成した生成物（ホスホリラーゼａ）の童を
測定する。第１０温置混合物は次の成分を含有する。即
ち％　ＥＤＴＡ　６　ｘ　ＩＱ−ｓモルとＤＤＴ　１．
５ＸＩＯ−’モルとＣａＣｌ２２　×１０−’モルと酢
酸マグネシラムＩ　Ｘ　１０’−２モルとトリス緩衝剤
（３０℃でｐＨ８，２）４．２　Ｘ　１０−２モルとβ
−グリセロールリン酸６０ミリモルとＡＴＰ３Ｘ１０−
２モルとホスホリラーゼｙ２ｔａｇ　／　ｍｌとホスホ
リラーゼキナーゼを含有する溶液のアリコート。第２の
湿態混合物はグリコーケ°ン２　ｖ＋ｇ　／　ｒａｔと
ホスフェート（ｐＨ６，８）５０ミリモルとグルコース
１．６−二リン酸４　Ｘ　１０−’モルとＭｇＣｔ２ｘ
ｘｔｏ−２モルとＮＡＤＰ　３．４　Ｘ　１０モルとホ
スホグルコムターゼ０．８単位／ｍｌとグルコース６−
リン酸脱水素酵素６単位／　ｍｌとホスホリラーゼ且を
含有する第１の湿態混合物のアリコートを含有する。

材料：ホスホリラーゼｂとグリコーケ°ンと反応混合物
の他の成分とはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ−
＋　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ＊　Ｍｏ、　　から得た。５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　４ＢはｐｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ＋　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ＋　ＮＪ、から得た。

Ｄｏｗｅｘ　Ａｇ　１　ｘ　８　ｕ　ＢｉｏＲａｄ、　
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　＊　ＣＡ、から得た。

実施例　３ホモソニアス検定のための反応混合物組成物ホモソニアス検定を行うため、ホスホリラーゼキナーゼ
の単位測定用の前記の個別の反応混合物を１つの反応混
合物にする。ホスホリラーゼ上の空反応が主要の問題で
あることが判る。この反応はホスホリラーゼＡによって
行なれる反応の大きさの２〜３チである。ホスホリラー
ゼ見はホスホリラーゼキナーゼの基質であるから、高濃
度のこの酵素が反応混合物中に要求される。このことは
容認出来ない程高い空反応をもたらす。ｐｎを６．８か
ら７．７にあげ、反応混合物に６ミリモルのグルコース
を添加すると、その空反応ニ２０分の１に低くなる。グ
ルコースはアロステリックにホスホリラーゼｂのより活
性Ｒ型をより不活性のＴ型に変換する。空反応は、１ミ
リモルソチオトレイトール中のホスホリラーゼ上の溶液
をＤｏｗｅｘ　Ａｇｌ　Ｘ　８　＋酢酸塩型カラムを通
過させることにより更に１０　Ｘ減少する。これは酵素
調製物から痕跡のＡＭＰを除去する（ＡＭＰＧＩホスホ
リラーゼ亘のアロステリック賦活剤である）。その空反
応は、グリコ−ｒン溶液をＤｏｗｅｘ　Ａｇ　１ｘ８　
、水酸基型で処理することにより更にンに減少する。ホ
スホリラーゼ上に関する如く、痕跡のＡＭＰが除去され
る。

１段検査用の反応混合物の組成物は次の成分を含有する
。即ち、ホスホリラーゼキナーゼ４〜６単位／　ｍｅと
、ホスホリラーゼｂ　２　Ｘ　１０−’モルと、ホスホ
グルコムターゼ０．５　単位／　”　？！：　、グルコ
ース６−リン酸脱水素酵素０．５単位／　ｍｌと、グリ
コ−ｒ７２．５１ｇ／ａｔと、リン酸カリウム加ミリモ
ルとＮＡＤＰ　　２．５　Ｘ　１０−４モルと、ＭｇＣ
ｌ２　ｌＯミリモルと、ＣａＣｔ２０．３ミリモルと、
ジチオトレイトール１ミリモルとトリシン−ＨＣｔ（ｐ
Ｈ７，７）　４０ミリモル。

感度：この反応混合物を用い１０　　モルの低いＡＴＰ
濃度が測定される。この濃度で得られる速度は約１０ｍ
Ｖ分である。配合体はそれより活性が小さく、感度限界
は約ｉｏ　−７モルである。

これらの反応の時間経過では、３０’Ｃで１５〜２０分
温置後に製置速度が最大であることが示された。

この時遊離ＡＴＰまたは配合体の捕捉が完結する。

ＡＴＰの濃度はホスホリラーゼキナーゼに対するＡＴＰ
のＫｒｎ　（０，３ミリモル）上り数桁低い故に、これ
だけの長さの時間を要する。

実施例　４・　Ａ　Ｔ　Ｐ−フェニトイン配合体の免疫反応性ホモ
ソニアス型式で適切に働く本発明の検定では、ホスホリ
ラーゼキナーゼが、それが抗体と結合している場合、配
合体を基質として利用できてはならない。表８中の結果
は、配合体の活性が反応混合物中の抗体量の増加によっ
て抑制されることを示している。この抗体はＫａｌｌｅ
ｓｔａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、　Ｃｈａｓｋａ、　ＭＮ、から得た単クロー
ンである。

反応混合物組成物はＡＴＰ−フェニトイン配合体が濃度
３．６　Ｘ　１０−’　　モルである、実施例３に記載
と同じものである。抗体と配合体とは酵素添加前、３〜
４分反応混合物中で一緒に湿量する。反応速度は酵素添
加後１５分と２０分との間で測定する。変性されていな
いＡＴＰに関しては抑制はみられない。それ故、免疫反
応性は特別に配合体中のフェニトインに帰せられる。

表　　８実施例　５フェニトインの存在量応答フエニト／濃度を変えた場合、その結果は存在量応答曲
線である（表９）。反応混合物は僅に更に最適化した、
実施例３に記載したものと殆んど同じものである。抗体
（反応混合物中６０μ！Ａｎｌ　）を指示された濃度の
フェニトインと５分間温情する。それから配合体を添加
し、更に５分間装置する。この後酵素を加え、反応速度
の測定を始める。

速度は酵素添加後１５分と２０分との間で測定する。

表　　　　　９１．６　　　　　　　　　　　　　　８４２．４　　　
　　　　　　　　　　　１０１３．１　　　　　　　　
　　　　　　１０７４．６　　　　　　　　　　　　　
　１１２４．７　　　　　　　　　　　　　　１３０６
．２　　　　　　　　　　　　　　１５３存在量応答曲
線は、フェニトインで強化された血清試料を用いて行わ
れる。フェニトインの濃度は臨床的に重要な範囲に亘る
ように選択する。それ（１０〜１２５μモル即ち０〜３
２μｆ／ｆｎｌである。試料は反応混合物中で１８倍に
希釈される。その検定法は２つの点でだけ前記と異なる
。第１に、配合体ｆｌ　ＴＬＣと］）ｏｗｅｘクロマト
グラフィーとの両方で精製する。これに対し、前の実験
における配合体はＴＬＣだけで精製した。より純粋の配
合体はそれより純粋でない配合体配合体より２倍活性で
ある。

第２に、検査に用いた抗体量は７０μｔであって、６０
μｔではない。表１０に示す結果は本質的に水性試料に
ついて得られた結果と同等である。

表　　　ｌＯ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）信号を生ずるプロセスを仲介でき、その仲
介活性を調節基の共有結合により調節できる標的蛋白質
と、（ｂ）前記標的蛋白質への調節基の共有結合に接触作用
を及ぼす調節酵素と、（ｃ）前記調節基を含有する前記調節酵素用の基質分子
と検体との配合体と、（ｄ）前記検体用の特異的結合相手と、（ｅ）前記標的蛋白質の条件に応答して検出可能信号を
発生する試薬手段と、からなる、検体検出のための特異的結合検定に用いる検
査組成物。
（２）特異的結合相手が抗体であり、検体が抗原または
ハプテンである前項（１）に記載の検査組成物。
（３）標的蛋白質が酵素である前項（１）に記載の検査
組成物。
（４）調節酵素がホスホリラーゼキナーゼであり、標的
蛋白質がグリコーゲンホスホリラーゼである前項（１）
に記載の検査組成物。
（５）調節酵素がサイクリックＡＭＰ依存性プロテイン
キナーゼであり、標的蛋白質がグリコーゲンシンテター
ゼである前項（１）に記載の検査組成物。
（６）調節酵素がアデニルトランスフェラーゼであり、
標的蛋白質がグルタミシンシテターゼである前項（１）
に記載の検査組成物。
（７）調節酵素が分枝鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼであ
り、標的酵素が分枝鎖ケト酸脱水素酵素である前項（１
）に記載の検査組成物。
（８）調節酵素がサイクリックＡＭＰ依存性プロテイン
キナーゼであり、標的蛋白質がホルモン感受性リパーゼ
である前項（１）に記載の検査組成物。
（９）調節酵素がヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ
リダクターゼキナーゼであり、標的蛋白質がヒドロキシ
メチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼである前項（１
）に記載の検査組成物。
（１０）調節酵素がサイクリックＡＭＰ依存性プロテイ
ンキナーゼであり、標的蛋白質がフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ及びトリプト
ファンヒドロキシラーゼとからなる群から選択される前
項（１）に記載の検査組成物。
（１１）調節酵素がアデニルトランスフェラーゼであり
、標的蛋白質がグルタミンシンテターゼである前項（１
）に記載の検査組成物。
（１２）（ａ）検出可能信号を発生するプロセスを仲介
することができる標的蛋白質と、標的蛋白質への調節基
の共有結合に接触作用を及ぼし、それによって標的蛋白
質が仲介するプロセスの速度を変化させることのできる
調節酵素とを提供し、（ｂ）前記調節基を含有する調節酵素用の基質分子とこ
れに共有結合した検体とを含んでなる配合体を提供し、（ｃ）前記配合体と結合でき、それによって前記配合体
が調節酵素用基質として働くのを制限する、検体の特異
的結合相手を提供し、（ｄ）調節酵素、標的蛋白質、標的蛋白質により仲介さ
れるプロセスの要素及び前記試料の存在の下に、前記配
合体を検体の特異的結合相手と接触させ、（ｅ）標的蛋白質により仲介されるプロセスの速度を測
定し、そして（ｆ）前記試料の存在下に行ったプロセスの速度と、既
知量の検体を含有する一連の標準組成物の存在下に行っ
た場合のプロセスの速度とを比較することからなる、試料中の検体の存在及び量を検出する方
法。
（１３）信号発生プロセスが、標的蛋白質に調節基が共
有結合すると抑制される前項（１２）に記載の方法。
（１４）信号発生プロセスが、標的蛋白質に調節基が共
有結合すると刺戟される前項（１２）に記載の方法。
（１５）測定段階においてニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートの還元型の生成をモニターする
前項（１２）に記載の方法。
（１６）標的蛋白質が酵素である前項（２）に記載の方
法。
（１７）調節酵素がホスホリラーゼキナーゼであり標的
蛋白質がグリコーゲンホスホリラーゼである前項（１２
）に記載の方法。
（１８）酵素がサイクリックＡＭＰ依存性プロテインキ
ナーゼであり、標的蛋白質がグリコーゲンシンテターゼ
である前項（１２）に記載の方法。
（１９）調節酵素がアデニルトランスフェラーゼであり
、標的蛋白質がグルタミンシンテターゼである前項（１
２）に記載の方法。
（２０）調節酵素が分枝鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼで
あり、標的酵素が分枝鎖ケト酸脱水素酵素である前項（
１２）に記載の方法。
（２１）調節酵素がサイクリックＡＭＰ依存性プロテイ
ンキナーゼであり、標的蛋白質がホルモン感受性リパー
ゼである前項（１２）に記載の方法。
（２２）調節酵素がヒドロキシメチルグルタリル−Ｃｏ
Ａレダクターゼキナーゼであり、標的蛋白質がヒドロキ
シメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼである前項（
１２）に記載の方法。
（２３）調節酵素がサイクリックＡＭＰ−依存性プロテ
インキナーゼであり、標的蛋白質がフェニルアラニンヒ
ドキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ及びトリプト
フランヒドロキシラーゼからなる群から選択される前項
（１２）に記載の方法。
（２４）調節酵素がアデニルトランスフェラーゼであり
、標的蛋白質がグルタミンシンテターゼである前項（１
２）に記載の方法。