JPS63301792A - 植物組織形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ＤＮＡ輸送電流を利用して単子葉類（単子
葉植物）および双子葉類（双子葉植物）植物細胞中にＤ
ＮＡを導入するための方法に関するものである。この方
法は、完全な単子葉類および双子葉類組織中へのプラス
ミドＤＮＡの直接移送を提供する。

［発明の背景コ 植物の遺伝的形質転換は２つの異なった方法によって長
年試みられてきた。しかしながら、申子葉類植物および
特に穀類のような商業的価値のある作物に使用する場合
、これらの両方が限界を有している。

これらの方法の内の最初のものは、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の土壌微生物の腫瘍
銹発（Ｔｉ）プラスミドの領域の能力、すなわち宿主細
胞に細菌が感染したとき宿主細胞ゲノムと融合する能力
に基づく。したがって、プラスミドの遺伝子操作は、宿
主中に外来ＤＮＡの導入をさせる。

しかしながら、単子葉植物は一般にこの微生物に感受性
がないので、この方法は、双子葉植物の形質転換に制限
される。この方法を使用するアスパラガス（Ａｓｐａｒ
ａｇｕｓ）の遺伝的形質転換は、［ＷＯ８６１０３７７
６］に開示され、およびグリムスレイら著、ネーチャー
　（Ｎａｔｕｒｅ）、３２５巻（１９８７年）１７７頁
にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
により穀類にＤＮＡを転移することが報告されているが
、実際の形質転換すなわち宿主細胞ゲノムによる外来Ｄ
ＮＡの取込みおよび同化または目的とする新特性の発現
が起こり得ることを示す報告はない。

第２の方法は、植物プロトプラストによる核酸の直接摂
取を包含する。このような摂取は化学的に、すなわち、
パスツォーキら著、メソッド・エンザイム（Ｍｅｔｈｏ
ｄ　Ｅｎｚｙｍ）　１１８巻（１９８６年）、６６８頁
に記載のようなポリエチレングリコール刺激摂取または
マイクロ秒時間の高圧電気パルスの使用によって達成し
得る。この後者の技術は電気せん孔または電気注入のい
ずれかとして記載されており、外来核酸がたやすく通過
し得るような植物細胞膜の一時裂溝によって働くと思わ
れる。例えばフロムら著、プロン−ディング・オブ・ナ
ンヨナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ（ＰＮＡＳ
）　８２巻、（１９８５年Ｌ５８２４頁、フロムら著、
ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１９巻、（１９８６
年）、７９１頁およびＷＯ３７１０６６１４参照。しか
しながら、この方法の成功は、プロトプラストから成熟
した稔性（ｆｅｒｔｉｌｅ）植物を再生するという、穀
類の場合には米にのみ示される特徴としての能力に依存
する。トウモロコシ・プロトプラストを稔性植物として
再生させる試みがなされてきた［例えばグラブスら著、
セオレティカル・アンド・アブレイド・ジエネティソク
ス（Ｔｈｅｏｒ　　Ａｐｐｌ　　Ｇｅｎｅｔ）、５４巻
、（１９７９年）、２０９頁］が、これらは今までのと
ころ不成功が証明されている。

電気輸送法を利用することにより裸のＲＮＡを双子葉植
物の細胞中に移す研究も行われている。

モリカワらは、ジー７　（Ｇｅｎｅ）　、４１巻、（１
９８６年）、１２１巻でタバコモザイクウィルス（ＴＭ
Ｖ）由来のＲＮＡが、双子葉植物ニコチアナ（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ）の全葉肉細胞によって採取し得ることを示
した。個々の細胞で行われたこの方法は、低い生存率の
細胞しか産生ぜず、宿主細胞が感染されるのではなく形
質転換されたということを明確には示していない。さら
に個々の単子葉細胞の電気輸送が将来成就されたとして
も、個々の細胞から全植物、特に稔性トウモロコシ植物
を再生させることの問題がまだ残っている。

［定義］ この発明を記載するうえで、専門用語は当業界の最新の
許容された意味にしたがって使用されるものとする。定
まった意味を許容する範囲が存在しないかまたは不明瞭
であることを避けるため以下の定義を制御すべきである
。

「電気形質転換（ｅｒｅｃｔｒｉｃ　　ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ）　Ｊは、ＤＮＡの宿主または受容細胞
への摂取およびそれに続く上記遺伝材料を宿主縄胞ゲノ
ムへの組込みを誘導する長期、継続直流の利用である。

「植物組織」は、細胞集団である。

「胚」は、根および苗条のような特定器官または器官系
が明らかに視認できないが、器官を生ずる細胞区分が存
在する発生段階である。

ＵカルスＪは、単一植物細胞または組織の組織培養から
得られる植物細胞の集落である。

ｒＣＭ　（３０）Ｊは、第Ａ表に示した組成の人工コー
ン培地である。

ｒＭＴＭＪは、パレディー、グレイソンおよびワルデン
によって、ブランク（Ｐｌａｎｔａ）、１７０巻（１９
８７年）、１４１頁に記載された組織のトウモロコシ組
織の培養に有用な人工液体培地である。

ｒＢＳＳＪは、第Ｂ表に示した組成のアブラナ属茎片（
ストリップ）用由来の人工液体培地である。

ｒＴＭＭＪは、第Ｂ表に示した組成のトマトの胚の培養
用の人工液体培地である。

「プロトプラスト」は、通常酵素消化によって細胞壁が
除去されているが、細胞膜によって閉じられている植物
細胞である。

「分裂細胞ｊまたは「分裂細胞組織Ｊは、さらに分裂し
て次に胚、初代または第２次組織を生ずることが充分に
可能である細胞から成る。

ここで使用する場合「ゲノム」は、染色体性および染色
体外性細胞の全ての遺伝物質に対応する。

ＤＮＡによって形質転換した細胞は、有糸分裂または減
数分裂を通して上記ＤＮＡを含有する細胞またはその子
孫であって、そのゲノム中に上記ＤＮＡ配列を保持する
ものである。

［膜透過ｊ剤は、それ自体哺乳類細胞に対するものとし
て知られている剤である。

［発明の記載］ この発明は、形質転換を行うに充分な時間電流を存在下
でＤＮＡおよび細胞膜透過剤を含む形質転換溶液と細胞
材料を接触させることから成る、植物細胞材料を形質転
換する方法に関するものである。

この発明の方法数多くの利点を有する。単一細胞でなく
全組織が使用され得るような数多くの層の細胞の侵入を
許す。細胞は傷つけられない。それらの細胞は、それら
の生存能力を保っており、成熟稔性植物の製造に使用し
得る。この方法は、以前にはうまく形質転換しなかった
植物の形質転換もさせる。この発明は、形質転換を行う
に充分な時間電流の存在下でＤＮＡおよび細胞膜透過剤
を含む形質転換溶液と接触させ、形質転換植物細胞を培
養条件下で培養する、形質転換した稔性植物を製造する
方法に関するものである。

この発明の形質転換工程をいわゆる電気せん孔または電
気注入技術［短パルス（一般に数マイクロ秒から約４０
０ｍ秒のオーダーの）の電流を使用する］から区別する
ために、この形質転換工程を電気形質転換と定義する。

それ故、この発明は、膜透過剤によって充分に増加され
た透過性を有する細胞膜にまたは細胞膜を通してＤＮＡ
の運搬または輸送を行う、さらに定常的で長期使用の起
電力（状態）を利用する。

この発明の電気形質転換に関して、全非プロトプラスト
植物材料を利用し得る。例えばこの発明は、雄穂または
雌穂分裂組織、腋芽、茎ストリップ、カルスまたは細胞
懸濁物のような植物組織、植物胚、細胞分裂組織の形質
転換を目的とする。

コーン胚組織を使用する場合、アベおよびスタインらに
よってアメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー（Ａｍ
　Ｊ　Ｂｏｔａｎｙ）　、４１巻（１９５４年）、２８
６−２８７頁で定義した、発展の第３段階、すなわち授
粉後２２から２８日間の段階に胚が到達していることが
望ましい。第３段階のコーン胚は典型的には長さ約３ｍ
ｍであり、層形結節組織は、それを目立たせる２つの狭
窄によって外見的に認識し得る。根鞘の範囲で、初期根
が認識し得るようになり、子葉鞘の範囲では第１および
第２の葉は寸法がかなり増加する。この段階は、最近発
生した第３葉の原基によって特徴づけられる。

使用する植物材料は、切除（ｅｘｃｉｓｅｄ）形である
のが好ましい。

この発明の方法は、水平ゲル電気泳動系、例えばアガロ
ースゲル電気泳動系で行われ、その中で形質転換される
植物材料とＤＮＡを電流がＤＮＡから植物材料に向かっ
て流れるようにウェル中に置くのが好ましい。

肝組織を使用する場合、胚が分裂組織を含む側が、形質
転換溶液を含むウェルに向き合った位置にあるのが好ま
しい。ＤＮＡ　（後の段階で選択を容易にするため例え
ば特定抗生物質に対する耐性をコード化をしたＤＮＡ配
列を含み得る）および膜透過剤を含む溶液を植物細胞材
料を含むものに隣接するウェルに置く。望ましい膜透過
剤は、張力が加えられた場合細胞膜に対しておよび通し
てＤＮＡと一緒に運搬されるように極性をもつものであ
る。極性膜透過剤の適当な例は、ＤＭＳＯ。

リゾレシチンおよびドデシル硫酸ナトリウム並びにトリ
トン−Ｘのような洗剤を包含し、好ましくはＤＭＳＯで
ある。使用する上記膜透過剤の濃度は、細胞膜に一時的
に透過性を付与し得るが、細胞内の器官の膜の完全な状
態を破壊することのないものである。上記濃度は広い範
囲で変化し得、特に含まれる植物材料に依存する。双子
葉類の細胞材料のようなより強靭な植物細胞材料は、例
えば１０％濃度のＤＭＳＯに耐える。一般に、形質転換
溶液の重量に対し約１％から約４％、好ましくは約２％
の膜透過側濃度でよい結果か得られる。

所望により、観察すべきベクターの経過を得るために追
跡用染料を形質転換溶液に含んでいてもよい。適当な追
跡用染料の例は、ブロモフェノールブルー、ブロモクレ
ゾールグリンまたはキシレンシアツールである。上記染
料および上記目的のための染料の用途は当業界で公知で
ある。ベクター含有ウェルから植物材料を含有するウェ
ルに向かった方向に流れるように、低い電圧の電流を加
える。

その後組織を殺菌水を用いて洗浄し、電気形質転換に関
連して存在しうる外傷から回復するために固形培地上で
培養する。固形培地上で経過する期間は処置した組織の
年齢および大きさに左右され、選別工程の前に幼若およ
び／またはより小さい組織は長い回復期間を必要とする
。通常２〜３日間組織を培地で保存した後、形質転換ベ
クターが、特異的抗生物質に対する耐性をコードするＤ
ＮＡ配列を含む場合、成功裏に形質転換された組織を、
この特異的抗生物質に対する組繊の露出によって選択す
る。選択培地で発芽前（胚の場合には根および茎を発生
する）または発育および葉緑素発生する組織は、形質転
換ＤＮＡの取り込みおよび同化により抗生物質に対する
耐性を獲得している。

加えられた電圧（張力）は、ＤＮＡの形質転換を援助す
るのに充分であり、実質的には細胞を傷つける張力を超
過しない。使用される張力は、広範囲で変化し得、使用
した植物材料の型および形態並びに張力が加えられる時
間のような種々のファクターに左右される。従って、実
施例１に記載したようにゲル電気泳動系で５分間、２０
０■の張力下で行うと、５０％のコーン胚が生存する。

（コーンは、おおよそ最も丈夫な単子葉植物であり、一
般に双子葉植物は、単子葉植物よりよく生存する。）発
芽を遅らせるかもしれないが、胚をひどく傷つけること
なく、ｌｌ０Ｖまでの電圧を使用し得る。一般に２００
Ｖ以上の電圧は避けるべきである。一方、８Ｖ＜らいの
低い張力でも、形質転換はまだ得られ得る。一般に、４
０Ｖから１４０Ｖまで、例えば５０Ｖから１４０Ｖ、好
ましくは約５０Ｖから１１０Ｖまで、最も好ましくは５
２Ｖから８０Ｖまでの電圧を加えた場合、充分な結果が
得られる。実施例で使用したゲル′電気泳動系では、電
極はそれぞれ１８ｃｍ離れている。従って、上記系で例
えば５０Ｖの張力の使用は、電界強度５０Ｖ／１８ｃｍ
または２−７８Ｖ／ｃｍの結果を得る。この事は、加え
る電界強度のマグニチュードのオーダーに１つの概念を
与える。言い換えると上記系で作られる電流強度は、形
質転換溶液（ゲル等）および加えた電圧に依存する。実
施例１で使用した電気泳動系については、電圧５２■で
電流は約２５ｍＡを生じる。

電流にたいする露出期間は、組織を含有するウェルと形
質転換溶液を含有するウェルの間の距離および組織標本
のサイズのような種々のファクターに依存する。従って
、最小期間は形質転換溶液中のＤＮＡを電界の影響下で
植物材料標本を含有するゲルの領域へ流し込むのに必要
な期間である。

例えば、２セツトのウェルの間の距離が電流開始時で１
ｍｍであれば、コーン胚を通って移動させるのに形質転
換溶液は電圧５２やで約１３から１５分かかり、初期雄
穂のような大きな組織を通って移動させるのにその溶液
は約２０分かかる。一般に、５から２５分間、特に１０
から２０分間、電気張力にさらした後よい収率の形質転
換が得られる。

一対のウェル、すなわち組織標本を含むものと形質転換
溶液を含むものの間の距離は、形質転換溶液の強度およ
び支持ゲルの濃度に、ゲルがさらに希釈されている場合
には距離が好ましく高いように依存する。

使用されるべきＤＮＡはベクター形態で、好ましくはプ
ラスミドの形であり、これは当業者公知の標準組換えＤ
ＮＡ技術を使用して植物組織を形質転換させることを目
的とするＤＮＡを含有するように遺伝学的に操作される
。

この発明で使用するのに適当なりＮＡは宿主または受容
体細胞以外の原料に由来する全てのＤＮＡを包含する。

従って、この発明の電気形質転換に使用し得る有用な上
記ＤＮＡの例は、暗号化ゼイン、コーンの貯蔵たんばく
またはキメラ構造に使用し得るトウモロコシの遺伝子由
来のもののような組織特異的プロモーターを含み得る。

上記プロモーターの例は、根を誘導し得るアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターであってよい。

この発明で使用するＤＮＡの好ましい分類は、外来ＤＮ
Ａとして分類し得る。ここに使用した外来ＤＮＡの語は
宿主または受容体種以外の原料を起源とする全てのＤＮ
Ａに対応する。外来ＤＮＡは、例えば非宿主植物のＤＮ
Ａ、合成りＮＡ配列、組換えＤＮＡによって生じた配列
、細菌、真菌、ウィルス、動物ＤＮＡ配列等を包含する
。

好適な外来ＤＮＡはＴｉおよびＲｉプラスミド由来のＴ
−ＤＮＡプロモーターのような非宿主植物プロモーター
、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＢＭＶ等のような植物ウィルスプ
ロモーターを包含する。有用な外来ＤＮＡは、例えばク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ１１（ｎ
ｐｔ−■■）、ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）、β−ガ
ラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、グリホセイト耐性遺伝
子（グリホスティト−５−エノールビルビルレキメート
−３−ホスフェートシンターゼに対する耐性を与える酵
素であるＥＰＳＰ）および結晶性たんばく昆虫毒素を暗
号化するバシルス・ツリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｆｅｎｓｉｓ）型遺伝子に対する遺
伝子由来の外来構造の配列を含む。

例えば、アダングら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３６巻、
（１９８５年）、２８９頁、ウォンら著、プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナインス・インターナシぢナル・スポ
ア・コンブレス（Ｐｒｏｃ　９ｔｈ　Ｉｎｔ　Ｓｐｏｒ
ｅＣｏｎｇ）　（ホッフおよびセトロー編、１９８５年
）参照。結晶性たんばく昆虫毒素を暗号化するバシルス
・ツリンジェンシスの例は、鱗翅目の幼虫、特にヤガ科
（Ｎｏｃｔｕｉｄｅａ）さらに具体的にヘリオチス・シ
ア（Ｈｅｒｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ）およびヘリオチス・
ビレッセンス（Ｈｅｒｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎ
ｓ）、並びにスボドブテラ０エクシギュア（ＳＰｏｄｏ
ｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のようなスボドプ
テラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）種に対するたんばく毒素
毒性を暗号化するバシルス・ツリンジェンシス（Ｂ、　
ｔ、　）亜種クルスタキ（ｋｕｒｕｓｔａｋｉ）遺伝子
、並びに鞘翅目害虫、具体的にハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏ
ｍｅｌｉｄｅａ）　、さらに特にディアブロチ力・ロン
ジコルニス（Ｄ、　ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ）、ディア
ブロチ力・ウンデシムブンクティタ（Ｄ　ｕｎｄｅｃｉ
ｍｐｕｎｃｔａｔｅ）およびディアブロチ力・ビルギフ
エラ（Ｄ。

ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）のようなディアブロチ力（Ｄｉａ
ｂｒｏｔｉｃａ）種、およびレブチノタルサ・デセムリ
ネータ（Ｌｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）のようなレブチ
ノタルサ（Ｌｅｐｔ　ｉｎ。

ｔａｒｓａ）を含む。前記へリオチス、スボドブテラお
よびジアブロチカ種はコーンのような作物に影響を与え
る害虫である。外来ＤＮＡは、例えばトウモロコシ貯蔵
たんばくのアミノ酸組成を変化させる目的で変化された
ゼインのように天然宿主植物遺伝子に基づく合成りＮＡ
シーケンスのような合成遺伝子を含む。この発明の外来
ＤＮＡは、望ましくは同族性プロモーター／構造配列の
組合せのようなキメラ構造から成る。上記同族構造の例
は、ＡＤＨプロモーターの制御下でのバシルス・ツリン
ジェンシス毒素遺伝子、およびＴ−ＤＮＡプロモーター
またはＣａＭＶプロモーターの制御下でのＣＡＴまたは
ｎｐｔ−ＩＩ構造配列のような選択し得る標識を含有す
る。上記組合せはマニアチスら著、モレキュラー（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ）　　［クローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ
）　、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　（１９８２年）およびデ
ィーエヌエー・クローニング（ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、第■および１１巻、（ディ・グローバー編、１９
８５年）で示したような標準組合せ技術によって構成さ
れ得る。この発明で使用されるような他のＤＮＡ配列ま
たは組換えは、この分野の通常の技術者には容易に明白
になる。

好ましい態様としては、うまく形質転換した組織の同定
が促進される選択標識遺伝子によって植物材料を形質転
換させる。例えば上記標識遺伝子の例は、カナマイシン
、ヒグロマイシン、ネオマイシンおよびクロラムフェニ
コールのような抗生物質に対する耐性を暗号化する遺伝
子、除草剤、耐性の遺伝子、および色素の遺伝子（例え
ばアントシアニン遺伝子）である。抗生物質を暗号化す
る遺伝子の存在は、例えば形質転換した植物細胞を生存
させ、選択抗生物質を含有する培地中で生育させ得る。

別の好ましい態様としては、昆虫に対する耐性、除草剤
に対する耐性、ウィルスに対する耐性、真菌に対する耐
性のような高い経済的または農業的価値を有する特性を
暗号化する遺伝子によって、または特に必須アミノ酸の
合成を導くもののような、生化学的経路を妨害する酵素
によって植物材料を形質転換させる。

特に好まし態様としては、選択可能な標識遺伝子および
好ましい他の望ましい特性を暗号化する１つまたはそれ
以上のＤＮＡ配列を含むＤＮＡによって植物材料を形質
転換させる。標識遺伝子の用途は首尾よく形質転換され
た材料を容易に非形質転換材料と区別し、それら自身は
容易に選択できない同時形質転換遺伝子または遺伝子類
をそのゲノム中に組み込まれた材料を後にスクリーニン
グするのを容易にし得ることを意味する。

この発明の方法に従って形質転換した植物材料は稔性（
ｆｅｒｔｉｌｅ）植物として生育および発芽し得る。

遺伝学的に形質転換された健全な稔性単子葉植物は新規
である。この発明は、宿主または受容体　′種以外の原
料に起源するＤＮＡをゲノム中に含む単子葉植物材料で
あって健全な稔性植物として再生しうるちのを提供する
。

ここで使用する健全の語は、この発明の植物類をウィル
ス類等によって自然に感染された植物と区別することを
意味する。

さらにこの発明は、宿主または受容体柱以外の原料に起
源するＤＮＡおよびその一部をゲノムに含む健全な稔性
単子葉植物並びにその種子を提供する。

この発明による望ましい単子葉植物材料または植物類は
、イネ科、特に米、小麦、きび、大麦、サトウモロコシ
、ライ麦、カラスムギ、ライコムギおよびコーン、更に
特に小麦、きび、大麦、サトウモロコシ、ライ麦、カラ
スムギ、ライコムギおよびコーン、並びに最も特にコー
ンを含む穀類作物である。

しかしながらこの発明の方法は、ブラシカ・オレラセア
（Ｂ　ｒａｓｓｉｃａ　　ｏｌｅｒａｃｅａ）種、トマ
ト、ヒマワリ、人参、ウリ科、ばれいしよ、大豆、綿等
を含む双子葉植物の形質転換のための好便な代替方法で
もあることは評価されるべきである。

［実施例］ 以下に示す実施例は、この発明を表示するものであって
、その範囲を限定することを意味するものではない。

温度はセラ氏（°Ｃ）で示し、パーセント（％）は重量
による。電気形質転換は基本的には室温で行なわれるが
、電気泳動系の温度は電気的張力の影響下で増加し得る
。

第Ａ表 ＣＭ主要塩類 ＮＨ，ＮＯ３，１，６５ｇ／Ｉ ＫＮＯ，１，９０ｇ／ｌ ＣａＣ１，−２Ｈ，００，４４ｇ／ｌ Ｍｇ５Ｏ，・７　ＨｔＯ０，３７ｇ／　ＩＫＨｌＰＯ，
０，１７ｇ／Ｉ ＭＳ微量塩類 ＨｓＢＯｓ　　　　　　　　　６．２０ｍｇ／　ｌＭｎ
５Ｏ，・ＨＩＯ１６，８０ｔｓｇ／　ｌＺｎ５Ｏ，−７
Ｈ，０１０，６０１ｇ／ＩＫ　　Ｉ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８３ｍｇ／ＩＮａ
ｔＭｏＯ＋・２ＨｔＯＯ，２５ｍｇ／ｌＣｕＳ　Ｏ−・
５　Ｈ！Ｏ０，０２５ｍｇ／　ｌＣｏＣ１ｍ”　６Ｈ，
Ｏｏ、　０２５Ｂ／１ビタミン類 チアミンＨＣＩ　　　　　　　　　０．２５ｍｇ／ＩＬ
−アスパラギン　　　　　１３．２ｍｇ／ｌグリシン　
　　　　　　　　　７．７ｇｍｇ／ｌ炭素源 しょ糖　　　　　　　　　　２０ｇ／ｌ寒天（固形）　
　　　　　　　　　　８　ｇ／　１蒸留水で１リツトル
にした。

第８表 ＢＳＳ培地 ４倍ディフコ塩類混合物　　　５００ｍ１／１ニコチン
酸　　　　　　　　　０．　５ｍｇ／ｌピリドキシンＨ
Ｃジン　　　　　　０．５ｍｇ／ｌチアミンＭＣＩ　　
　　　　　　　１．０＋＊ｇ／ｌイノシトール　　　　
　　　　１００ｍｇ／ｌナフタレン酢酸　　　　　　　
０．２ｍｇ／ｌベンジルアデニンホスフェート１．　０
ｍｇ／ｌしょ糖　　　　　　　　　　　３０ｇ／ｌ寒天
（固形）　　　　　　　　　　１６ｇ／ｌ蒸留水で１リ
ツトルにした。

ＰＨ５，８に調製した。

ＴＭＭ培地 ４倍ディフコ塩類混合物　　　２５０ｍ１ニコチン酸（
０，５＋＋ｇ／ｌ）　　　　　１　ｍｌピリドキシン）
ＩＣＩ（０，５ｍｇ／ｌ）　　１　ｍｌチアミンＨＣｌ
（０，５ｍｇ／ｌ）　　　　２　ｍｌイノシトール（１
００ｍｇ／ｌ）　　　　　１　ｍｌＩ　Ａ　Ａ　（０，
ｌｌｌ１ｇ／ｌ）　　　　　　　５　ｍｌしょ糖　　　
　　　　　　　　２０ｇ 寒天（固形）　　　　　　　　　　８ｇ蒸留水で１リツ
トルにした。

ｐＨ６，０に調製した。

１：ディフコ塩類混合物は、ムラシゲ・アンド・スコッ
プ（「ＭＳ」）主要および微量塩類の商業的に有用な混
合物であり、４倍は貯蔵溶液の強度に関連する。

実施例１ ０．７％アガロースゲルの８つのウェルの各々に１つの
第３段階摘出コーン胚（７日間同調凍結）を置いた。さ
らに別の８つのウェルの各々を最初の８つのウェルから
１ｍｍ離れて平行して走らせてプラスミドＤＮＡ（Ｈ８
３ＥまたはＨ８３Ｒ）１５μｌ　　（１０μｇ）、ブロ
モフェノール染料２μｌおよび２％のＤＭＳＯを置き、
残量は蒸留水とした。分裂組織性組織を含有する胚の側
が形質転換溶液を含有するウェルに向かっているように
、ウェル上に胚を設置した。プラスミドＨ８３Ｅおよび
Ｈ８３Ｒはそれぞれカリフラワーモザイクウィルス（Ｃ
ａＭＶ）３５ｓプロモーター［ヌクレオチット　７０１
３から７４３６、ホーンら著、クール・トップ・ミクロ
ビオール・イムツール（Ｃｕｒｒ　Ｔｏｐ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ　　Ｉｓｍｕｎｏｌ）　、９６巻く１９８２年
）、１９３頁参照コをもつｐＵＣｇプラスミド、ヘグロ
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）暗号化
配列［ｐＬＧ８３由来のＢａｍ　　Ｈｌフラグメント、
グリッツおよびディビス著、ジー７　（Ｇｅｎｅ）　、
２５巻（１９８３年）、１７９頁参照］およびツバリン
シンターゼ（Ｎ。

Ｓ）ターミネータ−［ヌクレオチット　６８２から４３
７、ベーバンら著、ニュークレイツク・アシッド・レス
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５）、１１′
巻（１９８３年）、３６９頁参照コを含有する。ＨＰＴ
配列は、プラスミドＨ８３Ｅ中でプロモーターおよびタ
ーミネータ−配列に関連する有意配向をもつが、Ｈ３３
Ｒプラスミド中ではアンチセンスである。

滅菌トリス酢酸−ＥＤＴＡ流通緩衝液（ｐＨ８゜０）４
５０ｍｌを用いる水平ゲル電気泳動系（ＢＲＬ　　Ｈ６
）に各ゲルを置いた。ゲルを、ＤＮＡから胚の方向へ流
れる電流５２Ｖに、ｌ０１１２゜５または１５分間のい
ずれかの期間さらした。流した後、胚を滅菌ＣＭ（３０
）を用いて洗浄し、固形ＣＭ（３０）培地で３日間培養
した。その後１００μｇ／ｍ１のハイグロマイシンを含
有するＣＭ（３０）培地に胚を移した。電気形質転換処
理後１１から１４日で胚を計測し、以下に示した結果を
得た。

１１日目で全ての胚は発芽した（根および茎を発生した
）。１１から１４日目で第０表の芽ばえは緑色であり、
ｐＬＧ８３遺伝子の取込みによってハイグロマイシンに
対する獲得耐性を示す。対照（ａ）は、この試験のよう
に電気形質転換された組織に対応するがその後はハイグ
ロマイシンの不在下で生育した。対照（ｂ）は、形質転
換溶液の不在下で電流にさらした組織に対応するが、そ
の後ではハイグロマイシン存在下で生育した。非形質転
換ハイグロマイシン選択対照はチョーク白になり生育を
止めた。

第０表 対照　　　Ｈ８３Ｅ　　　　　Ｈ８３Ｒ日　（ａ）　（
ｂ）　　１０　１２．５　１５分　１０　１２．５　１
．５分実施例２ プラスミドＤＮＡで処理後１４日目に、実施例１の各試
験群から得た緑の芽ばえ（実生）を集めて粉にし、ロジ
ェルら著、プラント・モル・パイオル（Ｐｌａｎｔ　　
Ｍｏｌ　　Ｂｉｏｌ）　、５巻（１９８５年）、６９頁
に記載したセチルトリメチルアンモニウムプロミド（Ｃ
ＴＡＢ）法を行うことで核酸を抽出した。

各群の回収芽ばえ組織を液体窒素またはドライアイス中
で挽いて微粒子にし、試験管に入れた。

混合物をゆっくりと６５°Ｃに暖めた後、３分間６５°
Ｃで加熱しながらｌｕｌ／ｍｇでＣＴＡＢ溶液［２％Ｃ
ＴＡＢ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭｔ−リス（ｐＨ８，０）
　、２０ｍＭ−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）、１．４Ｍ−
ＮａＣＩおよび１％ＰＶＰ　Ｃポリビニルピロリジン）
］を加えた。同量のセバグ（ｓｅｖａｇ）（ＣＨＣＩ３
：イソアミルアルコール２４：１で）を加えて混合した
。混合物をｌ１ｋＸで３０秒間遠心し、上層を新しい試
験管に移してから後、ＣＴＡＢ　（１０％ｗ　／　ｖ　
）および０１７Ｍ−ＮａＣ１を加えた。遠心を繰り返し
、上層を再び分離してＣＴＡＢおよびＮａＣｌを用いて
希釈した。１倍量のＣＴＡＢ沈澱物沈澱波緩衝液ＣＴＡ
Ｂ、５０ｍＭトリス（ｐｆ−Ｉ８．Ｏ）および１０ｍＭ
ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）並びにＩＭ−Ｎａｃｌ］を１
０分間６５°Ｃで加熱した。再水和完了後、２倍量のエ
タノールを用いて核酸を再沈澱させた後、１３〜１５分
間冷室で遠心して沈降させた。総ての標本の上にミニゲ
ルを添わせてＤＮＡの存在を示した。

ドツトプロット分析のため、抽出したＤＮＡを１００°
Ｃに加熱し、２０倍の５ＳＰＥ　［３，６Ｍ・ＮａＣＩ
、２００ｍＭ−ＮａＨ，ＰＯ，（ｐＨ７゜４）　、２０
ｍＭ−ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，４）］を加えてから溶液を
冷却した後、ニトロセルロース膜に移した。ニック転写
ＤＮＡ（ＢＲＬキット・口・。

ト５２１０番、およびＨ８３Ｅ）でノ・イブリッドした
。リッジパイら著、ジャーナル・イブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｊ　　Ｍｏｌ　　Ｂｉｏｌ）、１１３巻
（１９７７年）、２３７頁参照。二１・ロセルロースを
２倍の５ＳＰＥおよび０．　１％ＳＤＳで洗浄し、その
後５０℃で１時間加熱し、１倍の５ＳＰＥおよび０．　
１％ＳＤＳ中で１時間、室温でかくはんしてから、Ｘ線
フィルムにさらした。マニアチスラ著、モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）（１９８３年）参照。結果
は、ドツトプロット処理した標本の１０％に起こった強
いハイプリダイゼイションおよび形質転換を示した。

実施例３ バレディーおよびグレイソンら著、プラント・セル・テ
ィッシュ・アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａｎｔ
　　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃ１ｔ）　
、５巻、（１９８５年）、１１９頁に記載したように、
トウモロコシの毛を無菌的に切除し、電気形質転換する
までＭＴＭ培地上に保持した。実施例１にしたがって、
トウモロコシの毛および、ａ）８μ＋　　（１０μｇ）
のＨ８３Ｅプラスミド、２％のＤＭＳＯおよび２９μｍ
の蒸留水、またはｂ）１５μ＋（１０μｇ）のＨ８３Ｒ
プラスミド、２％のＤＭＳＯおよび２２μｌの蒸留水か
ら成る形質転換溶液を電気泳動系装置上の０．７％アガ
ロースゲルに置いて、電流５２Ｖで１３分間さらした。

その後トウモロコシの毛を除去し、５０μｇ／ｍｌのゲ
ンタマイシンを含む無菌ＣＭ（３０）培地に加えて、短
時間で穏やかに洗浄した。ゲンタマイシンは抗生物質と
して作用する。その後それらを５０μｍのＭＴＭ培地を
含有する無菌フラスコに置き、そのフラスコを窓台に置
いた。処理後２日目に、５μｍ／ｍｌのヒグロマイシン
を各フラスコに加えた。

ヒグロマイジン添加後６日目、３つの内１つのＨ８３Ｒ
処理トウモロコシの毛は死滅した（生長を中止し、白く
脱色した）。添加１０ｕｌ、１５の内２つのＨ８３Ｅ処
理トウモロコシの毛が死滅した。添加１３ｕｌ、さらに
２つの８８３Ｅ処理トウモロコシの毛が死滅した。残る
トウモロコシの毛は生長を続け、ヒグロマイジン添加後
２５日間緑色を保った。さらにＨ８３Ｅで処理した１つ
のトウモロコシの毛は花粉を生じた。

実施例４ 実施例１の手段にしたがって、ブラシカ・オレラセア（
Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）　［ｃｖイタリ
カ（ｉｔａｌｉｃａ）、ＣｒＧＣ−９（クルジファー・
ジェネティックス・コーオペレイティブ−９）コのつぼ
みの若枝の２つの上層の裸層の間から得られた茎片（約
ｌＸ　３　Ｘ　４　ｍｍ）を１５ｕｌ　（１０μｇ）の
ｐｚｏ２５プラスミドＤＮＡ、２μｍのブロモフェニル
ブルー染料を含有する形質転換溶液のみを伴う電気泳動
系装置上の０．７％アガロースに置き、約１５分間電流
５２Ｖを照射した。

照射を行いながら、短時間茎片をＢＳＳ培地に移し、１
週間ヒグロマイシン２０μｇ／ｍｌを含有する選択培地
に移し、最終的に１週間５μｇ／ｍｌのヒグロマイシン
を含む培地に移した。ヒグロマイシンを含まないＢＳＳ
培地に移した際、２４個の茎片がカルスを生じた。２力
月後、それらは若枝を発生し、湿潤チャンバー中の土壌
に移して根を発生した。

２つのヒグロマイシン選択ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ
）由来の葉を小片に切断し、２５μｇ／ｍｌのヒグロマ
イシンを含有するＢＳＳ培地で２次選択させた。これら
の小片は緑色を保持し、根を形成した。

半分の力価の塩類を伴うＢＳＳおよびヒグロマイシンを
伴わないＢＳＳに移した場合も、それらは根を出した。

上記２つの１次形質転換葉でヒグロマイシン遺伝子の存
在を分析した。各葉（約０゜２ｇ）を液体窒素中で冷凍
して、破砕機で粉末に挽いた。この粉末に、１５ｍ１水
冷しょ糖緩衝液（１５％しょ糖、５０ｍＭトリス（ｐＨ
８，０）および５０ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する）および
０゜２５Ｍ−ＮａＣ１を破砕機中で組織に加え、破砕を
継続した。スラリーを５ｍｌのライ−トンのアースガラ
ス製ホモジナイザー中に注いで、５〜１０パスの聞手で
粉砕した。スラリーを１．　５ｍｌエペンドルフ試験管
に移して３分間、６５００ｒｐｍで遠心した。粗製核ベ
レットを０．５ｍｌ水冷しょ糖緩衝液（ＮａＣＩ以外は
上記のように）に再懸濁した。１μｍジエチルプ口カル
ボネートを加えて、懸濁物を室温で渦動運動させた。次
に、２０％５Ｄ３５μｌを加えて、渦動運動させ、その
後１０分間７０℃で加熱した。５Ｍ酢酸カルシウム５０
μｍを加えた後、溶液を渦動運動させた。

その後試験管を氷上で３００分間冷却した。

カルシウムＳＤＳ画分を沈澱させて４℃で１５分間遠心
した。上清を清潔な１．５ｍｌ用試験管に移してから、
色が消えるまで再度フェノール：クロロホルムを用いて
抽出し界面が奇麗になった。

エタノール沈澱を行い、溶液を５分間室温で遠心してＤ
ＮＡを回収した。

導入したヒグロマイシン遺伝子の存在に関する分析を形
質転換物に行った。総ＤＮＡを定量し、制限酵素ＴＡＱ
Ｉを用いて切断した。７０Ｖで約３時間水平ゲル電気泳
動（０，７％アガローズ）を用いＤＮＡフラグメントを
単離し、バイオラッド・ゼタ・プローブ・プロット膜イ
ンストラクションマニュアルで指定されたＤＮＡ毛管移
動のためのアルカリ性プロット法を用いてバイオラッド
・ゼタ・プローブ膜に移した。前ノ１イブリダイゼーシ
ョン後、ハイブリダイゼーションした物を洗浄し、上述
の方法に従って作業して、プロットした膜をすぐにオー
トラジオグラフィーに付した。

単離したｌＫｂのヒグロマイシン遺伝子のフラグメント
をアメルシャム・マルチプライム・デイーエヌエイ・ラ
ベリング−システムズ・マニュアル（＾ｍｅｒｓｈａｍ
　Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ
　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍａｎｕａｌ）第１〜２８頁に示さ
れた低融点アガロース法によってｓｔｐのＣＴＰを用い
て標識した。

診断用１．４およびＱ、７ｋｂフラグメントが形質転換
ＤＮＡ中に存在し、対照ＤＮＡからは不存在であった。

プラスミドｐＺＱ２５は、ＨＰＴ暗号化配列が１９７か
ら１２５１のヌクレオチドから成ること以外は〈実施例
１の）８８３Ｅと同様であり、２０６の位置でグアニン
の代わりにアデニンを置き換えて修飾されている。

実施例５ 実施例１の方法に従って、第３段階の過剰胚および１５
ｕｌ　　（１０ｕｇ）のｐｚ０３３プラスミドＤＮＡ、
２％のＤＭＳＯおよび２２μｍの蒸留水を電気泳動系装
置中の０．７％アガロースゲル中に移して１３分間、電
流５２Ｖにさらした。

その後、胚を無！１ＣＭ（３０）液体培地を用いて洗浄
し、ＣＭ（３０）固体培地に置いた。プラスミドＤＮＡ
の選択を行う試みはしなかった。得られる実生を通常の
方法で成熟コーン植物にさせ交互に授粉させてＦ１植物
を得た。Ｆ１植物の穂軸由来の種を発芽させた後、ＣＡ
Ｔアッセイを行うために１週間生育して、形質転換物を
含む穂軸を確認するため計測した。さらに陽性の可能性
のある穂軸由来の種を栽培し、得られる植物の根を採集
して、ＣＡＴアッセイで試験した。最初の８つの形質転
換可能穂軸の内２つは形質転換を示した。

導入ＣＡＴ遺伝子配列の存在についてＣＡＴ陽性Ｆ１形
質転換物の葉を分析した。ＤＮＡを抽出、切断、単離、
プロッティングおよびプロービングする手段は実施例４
で与えられた方法から成る。

ｐｚ０３３　　（３５Ｓ−ＣＡＴ−ＮＯ３）プラスミド
またはプラスミドによって形質転換したゲノムＤＮＡを
制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲＩを
用いて切断し、ＣＡＴ遺伝子を用いてプローブする時は
いつでも診断用１　２Ｋｂフラグメントを放出した。こ
の子孫においては、１．　２Ｋｂフラグメントは常にｌ
、４Ｋｂフラグメントを伴う。このＦｌ族を製造するの
に使用した雄花の穂から、および全ての陽性個体から抽
出したＤＮＡは１．　２Ｋｂおよびｌ、４Ｋｂフラグメ
ントを包含する。反対に、全ての対照（３７８０由来の
ＤＮＡ核、３７８０由来の全ＤＮＡおよびＦ１ハイブリ
ッド３７８０）はこれらのフラグメントを欠いていた。

プラスミドｐＺＯ３３は、ｐＵｃ１９（商業的にはファ
ルマシアおよびＵＳバイオケミカルから入手）の５ａｃ
１部位にＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ヌクレオチド７
０６９から７５６９）、Ｐｓｔ部位にＴｕ９由来の７７
３ｂｐのクロラムフェニコール・アセチル・トランスフ
ェラーセ遺伝子（そのＴａｇｌ終端がＰｓｔＩに変化し
ている）、およびＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌ１１部位の
間にＮＯＳターミネータ−（ヌクレオチド６８２から４
３７）を含有する（アルドンおよびバブネック著、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２巻く１９７９年）　、
８６４頁参照）。

ＣＡＴアッセイを以下に示した。

ＣＡＴアッセイ １、実生または他の組織抽出物 Ａ、実生または他の組織を０．２５Ｍトリス−ＭＣＩ　
　（ｐＨ７，８）（またはそれらの多重物）１５０μｍ
中で粉砕した。　　　　　　゛Ｂ、標本を水上で超音波
処理（２番セツティングで３パルス）した。

Ｃ１標本を３分間１２Ｋｇで遠心し、上清を清潔な試験
管に移した。

Ｄ、標本を水浴中で１２分間、６５°Ｃに加熱してその
後、室温に冷却した。

Ｅ、標本を３０秒間遠心して、上清を収集してからＣＡ
Ｔアッセイに使用した。

２、各反応に１個の試験管を準備した。工・ノシエリヒ
ヤ・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来のＣＡＴを対照として設
定した（１３Ｘ１００ｃｍ試験管）。

陰性　　　位置的　　　　陽性 対照　　　形質転換　　　ＣＡＴ対照 上清　　　　　　１００μｌ　　　　ｔｏｏμ！１０自
軒リス（ｐＨ７，８）　　　　−９９μＩＣＡＴ（０，
５単位／ｕｌ）　　−１ｕｌ＋４（りａ５ム７ｘ二］−
ル　　　　３μ＋　　　　　　　　　３μｍ　　　　　
　　　　　　　　３μ＋Ｈ，０５７ｕｌ　　　　５７ｕ
ｌ　　　　　　５７ｕｌ＊４ｓＭ酢酸ＣｏＡ　　　２０
ｕ１　　　　２０μｍ　　　　　　　２０ｕ＋全量　　
　　　１１１０μｍ１８０μｍ１８０μｍ＊：５分間、
３７℃でインキ１ベートして反応混合物を室温にした。

３、標本を３７℃で１〜２時間インキュベートした。

４、冷酢酸エチル飽和水溶液２ｍｌを用いて反応を停止
させた。１ｍｌのＨ，Ｏを加えて、界面をより認識でき
るようにした。

５、パラフィルムで試験管を覆い、約１分間、１番で渦
動運動させた。

６．３〜５分間、５番でＩＥＣ中で回転させた。

７、上層を小試験管に移した。

８、乾燥するまで覆いをしてＮ、下で乾燥した（約４５
分間、乾燥しすぎをさけて）。

９、標本が乾燥する間に、溶媒１００ｍ１またはクロロ
ホルム：メタノール９５：５を用いてＴＬＣタンクを準
備した。全ての側のタンクに芯を設置した。

ｔｏ、２０Ｘ２０ｃｍシリカ６０ゲルＴＬＣ板を準備し
た。下から１．５ｃｍに鉛筆で線を引いた。

標本位置を交互線で記した。分解は上昇クロマトグラフ
ィーによる。

１１、標本を乾燥させた後、３０μｌの酢酸エチル（非
飽和水溶液）でそれらを再懸濁した。

１２、非常に小さい場所に１０μｍマイクロピペットを
用いて標本をスポットした。スポットしている間プレー
ト上にヘヤードライヤーの風を送った。

１３、タンクの中にプレートを置き、溶媒の前線をプレ
ートの頂点から約３ｍｍに到達させた（４０〜５０分間
）。

１４、プレートを１５または２０分間、覆いをして風乾
させ、小片のフィルム（予備フラッシュ）と共にカセッ
ト中室温で一夜放置した。

１５、フィルムを次の日現像した。

実施例６ 実施例１の方法によって、水平電気泳動系中の０．７％
アガロースゲルのウェルの中に、トマトの胚を、１０μ
ｇのｐＺＯ６７ブラスミドＤＮＡ。

２％ＤＭＳＯおよびブロムフェニルブルー追跡用染料か
らなる形質転換溶液を含有するウェルのそばに置いた。

電流５２Ｖを約１５分間胚に流した。

電気形質転換後、２〜３日目に回収するために胚をＴＭ
Ｍ培地に移した。その後、１０日ロー２５μｇ／ｍｌヒ
グロマイシンを含有する選択的トマト培地の上に置いた
。非処理対照実生はこの選択で生残しなかった。その後
形質転換物を０．５ｍｇ１ＡＡを含有する培地に移し、
土壌に移植する前に発根けした。

この１次形質転換物の葉で導入ＤＮＡ、特にヒグロマイ
シン遺伝子の存在を分析した。実施例４で詳述したよう
に全ＤＮＡを植物組織から分離し、制限酵素ＴＡＱＩを
用いて切断し、分離し、プロットしてハイブリダイスし
た。診断用ヒグロマイシンフラグメント（１，４，０，
７および０．４ｋｂ）が形質転換したＤＮＡに存在し、
対照ＤＮＡには不存在であった。

プラスミドｐＺＯ６０をｐＵｃ８プラスミドから３５３
プロモーター、ＨＰ　Ｔ暗号化シーケンスとｐＺＯ２５
のｎｏｓターミネータ−（実施例４参照）、その直後に
（直列で）続く３５Ｓプロモーターの２次複製、ｐＺｏ
３３のＣＡＴ暗号化シーケンス（実施例５参照）および
ｎｏｓターミネータ−の２次複製によって、構成させた
。

プラスミドｐＺＯ６７は、ｐＵＣ８プラスミドとＨ８３
Ｅの３５３プロモーター（実施例１参照）、ＲＡＪ−２
６０由来のＰｓｔｌフラグメントのＢ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）暗号化域（ジ工ファーソン等、ＰＮＡＳ８
３　（１９８６）８４４７）およびｎｏｓターミネータ
−１直後のく直列）３５Ｓプロモーター、ＨＰＴシーケ
ンスおよびｐｚｏ２５のｎｏｓターミネータ−によって
構成する（実施例４参照）。

実施例７ 実施例１の方法に従って、第３段階のコーン胚を水平電
気泳動系の０．７％アガロースゲル上でバシルス・ツリ
ンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ）亜種クルスタキ（ｋｕｒｕｓｕｔａｋｉ）　
（Ｂ　ｔ　ｋ）　／ＨＰＴブラスミ）’　（ｐＺＯ８５
−ＢＴＫ／ＨＰＴ）ＤＮＡ、２％ＤＭＳＯおよびブロモ
フェニルブルー追跡用染料を含む形質転換溶液を含有す
るウェルのそばのウェルの上に置いた。連続して電流５
２ｖを約１５分間胚にかけた後それらをＣＭ　（３０）
培地に移して、獲得したヒグロマイノン耐性について選
択した。ヒグロマイシン耐性を示すそれらの胚をより大
きな実生に成長させてから、ヘリオシス・ビレッセンス
（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖ　ｉ　ｒｅｓｃｅｎｓ）および
スボドブテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）種のようなヘリ
オシス種に対する耐性の標準バイオアッセイ法を用いて
試験した。形質転換した実生は、非処理標準と比較して
ヘリオシスおよびスボドブテラ種に対する減少した感受
性を示した。

プラスミドｐＺＯ８５は以下のようにして構成されれい
る。ｐＲＡＪ２７５由来のＢ−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）コード配列を含むＳａ　Ｉ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラ
グメントを修飾して、３−末端のＥｃｏＲ１部位をｐｓ
ｔ１部位に変化させた。このＧＵＳ遺伝子の特性は、Ｎ
Ｃ０１部位が暗号化シーケンスのイニシエータコドン（
ＡＴＧ）を展開（ｓ　ｔ　ｒａｄｄ　ｌ　ｅ）する。ｐ
ＺＯ８５は３５ＳプロモーターおよびｐＺＯ３３で見ら
れるようなｎｏｓシーケンス（実施例５参照）並びに上
述の５ａｔ−Ｐｓｔフラグメント（ＣＡＴ遺伝子の代わ
りに）から成る。

ｐＺＯ８５−ＢＴＫ−ＨＰＴは、ｐＺＯ８５のＮｃｏ−
Ｐｓｔｌフラグメントを修飾Ｂｔｋンーケンス［バー＋
−ンら著、プラント・フィシオル（ｐｌａｎｔ　　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ）８５巻、（１９８７年）、１１０３頁］を
含むｐΔＭＶＢＴＳのＮｃｏ−Ｐｓｔフラグメントと置
換することによって製造した。このシーケンスは直後に
３５３プロモーターおよびと共にｐＺＯ３３のｎｏｓタ
ーミネータ−（実施例５参照）をｐＺＯ２５ＨＰＴ７−
ケンスと共に直列に有した（実施例４参照〉。

実施例８ 実施例１の方法によって、１０μｇのＢｔｔ／ＨＰＴプ
ラスミドＤＮＡ　（ｐＺ○８５−Ｂｔｌ−ＨＰＴ）、２
％ＤＭＳＯおよびブロムフェニルブルー追跡用染料から
なる形質転換溶液を含有するウェルのそばに水平電気泳
動系中の０．７％アガロースゲルのウェルの中に３つの
コーン胚を置いた。連続して電流５２Ｖを約１５分間胚
に流した後ＣＭ　（３０）培地に移してヒグロマイシン
獲得耐性について選択した。耐性を示すこれらの胚はよ
り大きな実生に成長し、コーンの根の虫（ダイアブロチ
力・エスピーピー（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　　５ｐｐ）
　）に対する耐性の標準バイオアッセイ法を用いて試験
した。バシルス・ツリンジェンシッ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種テネブリオニス（ｔ
ｅｈｅｂｒｉ。

ｎ１ｓ）　（Ｂｔｔ）は、コーンの根の虫および他の鞘
翅類の昆虫に対する昆虫毒素活性を生じる。

ＡＴＧスタートコドンで修飾して、Ｎｃｏ１部位を含ま
せ、暗号化域３′末端でＰｓｔ１部位を生じさせたＢｔ
ｔ暗号化シーケンスの修飾Ｎｃ。

−ＰｓｔフラブメントをｐＺＯ８５のＮｃｏ−Ｐｓｔｌ
フラブメントと交換することによりｐＺＯ８５−Ｂｔ　
ｔ−ＨＰＴを製造した（実施例７参照）［セカーら著、
プロジ−ディング・オプ・ナショナル・アカデミ−・イ
ブ・サイエンス（ＰＮＡＳ）、８４巻（１９８７年）、
７０３６頁記載］。このシーケンスは直後に３５８プロ
モーターおよびｎｏｓターミネータ−ｐＺＯ３３，（実
施例５参照）をＰＺＯ２５のＨＰＴシーケンスと共に直
列に有した（実施例４参照）。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物材料中へのＤＮＡの輸送および形質転換を起
   こすのに充分な時間電流の存在下でＤＮＡおよび膜透過
   剤を含む形質転換用溶液と細胞材料を接触させることか
   ら成る、植物細胞材料を形質転換するための方法。
2. （２）ＤＮＡがベクターＤＮＡである請求項第１項記載
   の方法。
3. （３）ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項第２項記
   載の方法。
4. （４）電流がＤＮＡから植物細胞に向けて流れるように
   、形質転換される植物細胞およびＤＮＡ物質をウェル内
   に置いた、水平ゲル電気泳動系を使用する請求項第１〜
   ３項の何れか１項記載の方法。
5. （５）膜透過剤がジメチルスルホキシド、リゾレシチン
   、ドデシル硫酸ナトリウムおよび他の洗剤から選ばれた
   極性膜透過剤である、請求項第４項記載の方法。
6. （６）植物材料が植物組織、植物胚、分裂組織性組織、
   腋芽、茎片またはカルスである、請求項第１〜５項の何
   れか１項記載の方法。
7. （７）植物材料がコーン植物材料である、請求項第６項
   記載の方法。
8. （８）請求項第１〜７項記載の方法に従って、植物細胞
   材料を形質転換することおよび培養条件下で形質転換植
   物細胞を培養することから成る、形質転換した稔性植物
   を製造する方法。
9. （９）請求項第１〜８項の何れか１項記載の方法によっ
   て得られた形質転換した稔性植物および種子およびそれ
   らの子孫。
10. （１０）植物ゲノム中に宿主または受容種以外の原料に
    起源するＤＮＡを含み、健全な稔性植物として再生し得
    る単子葉植物細胞材料。
11. （１１）植物がコーンである、請求項第１０項記載の植
    物細胞材料。
12. （１２）植物ゲノム中に宿主または受容種以外の原料に
    起源するＤＮＡを含む、健全な稔性単子葉植物。
13. （１３）植物ゲノム中に、宿主または受容体細胞以外の
    原料から起源するＤＮＡを含む、健全な稔性単子葉植物
    。
14. （１４）植物がコーンである、請求項第１２または１３
    項記載の植物。
15. （１５）害虫または除草剤に対して感受性が減少した請
    求項第１４項記載のコーン植物。
16. （１６）害虫に対して感受性が減少した請求項第１５項
    記載のコーン植物。
17. （１７）昆虫に対して感受性が減少した請求項第１６項
    記載のコーン植物。
18. （１８）鱗翅類の害虫に対して感受性が減少した請求項
    第１７項記載のコーン植物。
19. （１９）鞘翅類の害虫に対して感受性が減少した請求項
    第１８項記載のコーン植物。
20. （２０）請求項第１２〜１９項記載の植物の種子。