JPS63219374A - 化学修飾カルボキシペプチダ−ゼ及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は両親媒性高分子残基を含有する基で化学修飾さ
れたカルボキシペプチダーゼ及びその用途に関する。

〔従来の技術〕

たんばく分解酵素による加水分解反応の逆反応を利用し
てペプチド合成を行うことは公知である。例えば、大部
分のセリンプロテアーゼでは、ペプチド又はペプチドエ
ステルの加水＋解の際に反応過程の１つでアシル酵素中
間体が形成され、これが次の段階で水分子の求核攻撃を
受けて脱アシル化され加水分解反応が完了する。

しかし、もしその反応系に水分子よりも強力な求核攻撃
をする物質が存在するなら、脱アシル化に伴い加水分解
反応に優先して、その物質との結合が起こるであろう。

そしてその求核攻撃をする物質がアミノ酸誘導体やペプ
チドの場合には、新たにペプチド結合が形成される。例
えばファストレツズ等〔Ｊ。

ファストレツズ（、Ｔ＃　１？ａａｔｒｅｚ　）及びＡ
、　Ｒ，フェルシェド（んＬ　？ｅｒａｈｔ　）、バイ
オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｓｓｍｉ自ｔｒｙ　）第１
２巻、第２０２５〜２０５４頁（１９７５）］は］Ｎ−
アセチルーＬ−フェニルアラニンエチルエステルムｃ−
Ｉ’ｈｅ−ＯＥｔ　）　、！：　種々のアミノ酸アミド
のキモトリプシン（Ｃ！Ｔ）による反応を詳細に検討し
ている。反応は下記反応式のように進む。

Ａｃ−Ｐｈｅ−０１！：ｔ−）−ＣＴ 上記反応式から明らかなように、まず酵素基質複合体が
形成され、続いてアシル酵素中間体が形成される。通常
の加水分解反応では、このアシル酵素中間体が水分子に
よって加水分解されるが、もし求核試薬（ｎ−Ｎｕ、　
）が存在するとアシル酵素中間体は加水分解反応に加え
てアミツリシス反応も受ける。

両反応の速度定数、及び水濃度（５５Ｍ）と競合する求
核試薬の濃度に依存してＮ−アシルジベプテドアミドが
生産することが期待される。

ファストレツズ等は彼らの実験条件下で９５％以上の収
率で実際にＡｃ−Ｐｈｅ−ＩＨＲを作っている。

他方、ヨハンセン等（特表昭５６−５００５１９号）は
セリンカルボキシペプチダーゼを用いたペプチドの合成
方法について提案している。

彼らは酵母菌体内から精製したカルボキシペプチダーゼ
ＹがｐＨａＯ〜１［Ｌ５までの間では主としてエステラ
ーゼ又はアシラーゼ活性のみを示してほとんどペプチダ
ーゼ活性を示さない点に着目して、これらアルカリ領域
におけるペプチド合成法を詳細に検討した。

最近、林等はカルボキシペプチダーゼＹがペプチド転換
反応ばかシでなく、Ｎ保獲アミノ酸と０保護アミノ酸を
直接縮合させる縮合反応を容易に触媒し、両端保籍ジペ
プチドを生成することを明らかにした（林、河原弁、層
化大会要旨、第６２６頁、１９８６年）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記した方法においては、酵素反応は水溶液中で行われ
るために、生成収率を上げるためには、基質濃度を上げ
たり、有機溶媒を添加したシ、又は生成物が水難溶性で
ある反応系を考える必要がある。

また、基質が水に難溶性の場合には上述の方法は用いる
ことができない。

本発明の目的は水系及び非水系溶媒中での酵素的ペプチ
ド合成方法に有用な化学修飾カルボキシペプチダーゼ及
びその用途を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は化学修飾カ
ルボキシペプチダーゼに関する発明であって、カルボキ
シペプチダーゼ分子中の少なくとも１個のアミン基が両
親媒性高分子残基を含有する基で修飾されていることを
特徴とする。

そして、本発明の第２の発明はペプチドの酵素的製造方
法に関する発明であって、必要に応じてアミノ基その他
を保護したアミノ酸若しくはペプチド、又はそれらのカ
ルボキシル基における反応性誘導体と、必要に応じてカ
ルボキシル基を保護したアミノ酸とを反応させ、必要に
応じて保護基を脱離して、ペプチド又はその誘導体を製
造する方法において、触媒として前記第１の発明の化学
修飾カルボキシペプチダーゼを用いることを特徴とする
。

また、本発明の第３の発明はアミノ酸誘導体又はペプチ
ド誘導体の酵素的製造方法に関する発明であって、必要
に応じてアミノ基その他を保護したアミノ酸若しくはペ
プチド、又はそれらのカルボキシル基における反応性誘
導体と、アルコール類又は第１級アミン類とを反応させ
、必要に応じて保護基を脱離して、相当するアミノ酸誘
導体又はペプチド誘導体を製造する方法において、触媒
として前記第１の発明の化学修飾カルボキシペプチダー
ゼを用いることを特徴とする。

本発明によれば、有機溶媒中で水弁存在下で反応させる
ことにより、加水分解反応の恐れなく、ペプチド（又は
アミド若しくはエステル）製造反応を効率良く実行させ
ることが可能である。

もちろん、この化学修飾酵素は、水溶液中でも可溶性で
あるため、水溶液中での水易溶性基質の反応も実施可能
である。すなわち、当咳化学修飾酵素を使用することで
ペプチド（又はアミド若しくはエステル）製造反応の溶
媒系を適当に設計することにより、あらゆる基質を用い
タヘプチド（又はアミド若しくはエステル）の酵素製造
を可能とするものである。

本発明者等は種々のプロテアーゼを化学修飾して有機溶
媒中での可溶性化を試みたところ種々のに源から得られ
たカルボキシペプチダーゼ分子中の少なくとも１個のア
ミノ基が両親媒性高分子残基を含有する基で置換された
化学修飾カルボキシペプチダーゼが、酵素活性を保持し
ながら有機溶媒中での溶解性を持つことを見出した。

本発明で用いるカルボキシペプチダーゼは特に限定はな
く、カルボ中ジペプチダーゼＰ１カルボキシペプチダー
ゼＹ等が用いられる。

また両親媒性高分子残基としてはポリエデレｙｆリーｙ
−ル、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン等が使用される。ポリエチ
レングリコールの湯量 合、通常分−７−，，２０００以上好ましくは５０００
以上であシ、該高分子残基の一方の末端はメチル、エチ
ル、プロピル、アセチル等でマスクされているのが好適
であり、通常はｏ−置換、特に０−メトΦシポリエチレ
ングリコールカ用いられる。　　　　− 更に１両親媒性高分子残基と酵素分子の結合方法として
は酸アジド法、ジアゾ法、アルキル化法等の公知の方法
によって活性誘導体を合成し、次いで該活性誘導体とカ
ルボキシペプチダーゼとを反応させて結合することがで
きる。カルボキシペプチダーゼ分子中における両親媒性
高分子残基の置換度は特に限定なく基質及び溶媒等の反
応条件によって任意に設定される。

しかして、核両親媒性高分子残基を含有する基で好適な
例としては、下記一般式Ｉ：ＮＹ／Ｎ”’　Ｌ、ＩＪ （式中Ｒ１及びＲ１の少なくとも一方は両親媒性高分子
残基、残りはハロゲンを示す）で表される基が挙げられ
る。

２つの本発明方法においては、各原料中の基で、当該反
応、すなわちアミド化（ペプチド化を含む）反応又はエ
ステル化反応に関与しない基を、必要に応じて保護する
。原料又は反応条件により、保護を必要としない場合も
ある。

そして、アミン基以外に保護する基の例としては、水酸
基、チオール基、カルボキシル基が挙げられる。

本発明の両方法は水系溶媒中においてはｐＨ５０〜ＺＯ
で、好ましくは４０〜へ５で行われる。また反応溶液中
の水分含量を減じて、その結果加水分解反応を抑える目
的で、必要に応じて反応中に８０％まで有機溶媒又は界
面活性剤を添加することができる。例えばメタノール、
エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミドが使用可能であり、特にジメチルホルムアミドが最
適である。

また、本発明の両方法における反応温度は通常２０〜５
０℃、好ましくは２５〜４０℃の範囲で行われる。

反応時間は数十分〜数時間で実施可能であるが通常は２
〜５時間である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ ポリエチレングリコール修飾カルボキシベプテダーゼＰ
の製造 ペニシリウム・ジャンチネラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）　ｌｉから得たカルボキ
シペプチダーゼＰ凍結乾燥標品〔宝酒造■製〕２■を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（１ａ　０ｍＭクエン酸ナトリ
ウムを含む、ｐ１１７．５）（Ｌ４−に２，４−に’、
ｒ、（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロロ−日
−トリアジン（該メトキシポリオキシエチレン基の分子
量は、それぞれ約５０００である）Ｑ、２ｆを加え、ａ
、５℃で１ａ日間反応させた後反応液を限外沢過して、
未反応の試薬を除き、水に対して充分透析してから、凍
結乾燥した。

この様にしてカルポキシペプテダーゼ分子中のアミン基
の３５チが上記トリアジン誘導体で修飾された化学修飾
カルボキシペプチダーゼＰを得た。

化学修飾カルボキシペプチダーゼＰのたんばく回収率は
７４１４であった。

ｐＨ＆ｏの水溶液中でＮ−アセチルチロシンエチルエス
テルを基質としてエステル分解活性を測定したとこや、
化学修飾カルボキシペプチダーゼＰの比活性は未修飾酵
素の７２１％であった。また化学修飾カルボキシペプチ
ダーゼＰはベンゼン％　　Ｌ’＋１−　ト！Ｊクロロエ
タン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ジメチル
ホルムアミド等の有機溶媒に１■／−以上溶解した。

実施例２ Ｎ−カルボベンゾキシテロシルフェニルアラニンメチル
エステルの製造 ５０ｍＭＮ−カルボベンゾ中シテロシンエチルエステル
ト１００ｍＭフェニルアラニンメチルエステルを含む水
飽和ベンゼン（５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＦ１６で飽和
させたベンゼン）１００μｔに実施例１で得た化学修飾
カルボ中ジペプチダーゼＰ　５０μｆ（たんばぐ量）を
加え、２５℃で保温し反応させた。２時間後、生成した
ペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分析した。そ
の結果、Ｎ−カルボベンゾキシチロシンエテルエステル
からの収率約５０チで目的のＮ−力ルボペンゾギシチロ
シルフェニルアラニンメチルエステルを得た。

実施例５ Ｎ−カルボベンゾキシチロシルフェニルアラニンアミド
の製造 １０ｍＭＮ−カルボベンゾキシチロシンエテルエステル
と２００ｍＭフェニルフェニルアラニ／アミドジメチル
ホルムアミドを含むｐＨ６の水溶液１００μｌに実施例
１で得た化学修飾カルポキンペグチダーゼＰ５０ｐｆ（
たんば＜量）を加え２５℃で加温して反応させた。２時
間後、生成したペプチドを高速液体クロマトグラフィー
テ分析した。その結果、Ｎ−カルボベンゾキシテロシン
エチルエステルからの収率的５０％で目的のＮ−力ルボ
ベ／ソキシチロシルフェニルアラニンアミドを得た。

実施例４ Ｎ−カルボベンゾキシチロシンエチルエステルの製造 ８０ｍＭＮ−カルボベンゾキシチロシンと４３Ｍエチル
アルコールを含む酢酸エチル１００μｌ　に実施例１で
得た化学修飾カルボキシペプチダーゼＰ５０μｆ（たん
ぽ＜ｆｋ）を加え、２５℃で加温して反応させた。１６
時間後、生成し−で分析した。その結果、Ｎ−カルボキ
クチロへ シンからの収率的ｓｏｂで目的のＮ−カルボベンゾキシ
チロシンエチルエステルヲ得た。

実施例５ ポリエチレングリコール修飾カルボキシベプテダーゼＹ
の製造 パン酵母菌から得たカルボキシペプチダーゼＹ凍結乾燥
標品〔オリエンタル酵母■製〕２ｔＩＩ９を含む５０ｒ
ｎＭホウ酸緩衝液（ｐａａｏ）、ａａ−に２．４−ビス
（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロロ−８−ト
リアジン（Ｌ２ｆを加え、（１５℃で１０日間反応させ
た後、反応液を限外ｒ過して未反応の試薬を除き水に対
して充分透析してから凍結乾燥した。この様にしてカル
ボキシペプチダーゼＹ分子中の７ミノ基の１６％が上記
トリアジン誘導体で修飾された化学修飾カルボキシペプ
チダーゼＹを得た。化学修飾カルボキシペプチダーゼＹ
のたんば〈回収率は５５ｅＩｋであった。ｐｌｌｌＬｏ
の水溶液中でＮ−アセチルチロシンエチルエステルを基
質としてエステル分解活性を測定したところ、化学修飾
カルボキシペプチダーゼＹの比活性は未修飾酵素の９９
係であった。また化学修飾カルボ中ジペプチダーゼＹは
ベンゼン、ＬＬｌ　−）　リクロロエタン、酢酸エチル
、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド等の
有機溶媒Ｋ　１　ｍｐ／−以上溶解した。

実施例６ Ｎ−カルボベンゾキシチロシルフェニルアラニンメチル
エステルの製造 ５０ｍＭＮ−カルボベンゾキシテロシンエチルエステル
、！：　１００ｍＭフェニルアラニンメチルエステルを
含む水飽和ベンゼン（５０！ＤＭホウ酸緩衝液ｐＨ１０
で飽和させたベンゼン）　１００ｐｌに上記実施例５で
得た化学修飾カルボキシペプチダーゼＹ１１５μｆ（た
んばく量）を加え、２５　　。

℃で保温して反応させた。２時間後、生成したペプチド
を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、
Ｎ−カルボベンゾキシチロシンエチルエステルからの収
率的５０％で目的のＮ　−力／Ｉ／　ｌ　ヘンゾキシチ
ロシルフェニル７ラニンメテルエステルを得た。

実施例７ Ｎ−カルボベンゾキシテロシルフェニルアラニンアミド
の製造 １０ｍＭＮ−カルボベンゾキシチロシンと２００ｍＭフ
ェニルフェニルアラニ／アミドジメテルホルムアミドを
含むｐＨ１０の水溶液１００μｌ　に実施例５で得た化
学修飾カルボ中ジペプチダーゼ！　　１５μｔ（たんば
く量）を加え、２５℃で保温して反応させた。２時間後
、生成したペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分
析した。その結果、Ｎ−カルボベンゾキシチロシンエチ
ルエステルからの収率約５０チで目的のミドを得た。

実施例８ Ｎ−カルボベンゾキシチロシンエチルエステルの製造 ８０ｍＭＮ−カルボベンゾキシチロシンと４５Ｍエチル
アルコールを含む酢酸エチル１００μｔ　に実施例５で
得た化学修飾カルボ中ジペプチダーゼ！１５μｆ（たん
ばく量）を加え２５℃で加温して反応させた。１６時間
後、生成したアミノ酸誘導体を高速液体クロマトグラフ
イーからの収率約５０チで目的のＮ−カルボペンゾキシ
チロクンエチルエステルヲ得り。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明したごとく、本発明によって水溶液中
及び有機溶媒の両方で使用可能な化学修飾カルボキシベ
プテダーゼを製造することができた。

得られた酵素はペプチド合成、アミノ酸又はペプチドの
誘導体の合成、たんばく質の構造解析等に有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カルボキシペプチダーゼ分子中の少なくとも１個の
   アミノ基が両親媒性高分子残基を含有する基で修飾され
   ていることを特徴とする化学修飾カルボキシペプチダー
   ゼ。 ２、該両親媒性高分子残基を含有する基が、下記一般式
   I ： ▲数式、化学式、表等があります▼…〔 I 〕 （式中Ｒ＿１及びＲ＿２の少なくとも一方は両親媒性高
   分子残基、残りはハロゲンを示す）で表される基である
   特許請求の範囲第１項記載の化学修飾カルボキシペプチ
   ダーゼ。 ３、該両親媒性高分子残基が、Ｏ−置換ポリエチレング
   リコール残基である特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載の化学修飾カルボキシペプチダーゼ。 ４、該Ｏ−置換ポリエチレングリコール残基が、Ｏ−メ
   トキシポリエチレングリコール残基である特許請求の範
   囲第３項記載の化学修飾カルボキシペプチダーゼ。 ５、必要に応じてアミノ基その他を保護したアミノ酸若
   しくはペプチド、又はそれらのカルボキシル基における
   反応性誘導体と、必要に応じてカルボキシル基を保護し
   たアミノ酸とを反応させ、必要に応じて保護基を脱離し
   て、ペプチド又はその誘導体を製造する方法において、
   触媒としてカルボキシペプチダーゼ分子中の少なくとも
   １個のアミノ基が両親媒性高分子残基を含有する基で修
   飾された化学修飾カルボキシペプチダーゼを用いること
   を特徴とするペプチドの酵素的製造方法。 ６、必要に応じてアミノ基その他を保護したアミノ酸若
   しくはペプチド、又はそれらのカルボキシル基における
   反応性誘導体と、アルコール類又は第１級アミン類とを
   反応させ、必要に応じて保護基を脱離して、相当するア
   ミノ酸誘導体又はペプチド誘導体を製造する方法におい
   て、触媒としてカルボキシペプチダーゼ分子中の少なく
   とも１個のアミノ基が両親媒性高分子残基を含有する基
   で修飾された化学修飾カルボキシペプチダーゼを用いる
   ことを特徴とするアミノ酸誘導体又はペプチド誘導体の
   酵素的製造方法。