JPS63211230A

JPS63211230A - ヘモグロビン含有リポソ−ム

Info

Publication number: JPS63211230A
Application number: JP4282687A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Suzuki; 鈴木　一比好; Keisuke Sakaguchi; 坂口　圭介
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1987-02-27
Publication date: 1988-09-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は改良されたヘモグロビン含有リポソーム（以下
ヘモソームという）に関する。さらに詳しくは本発明は
高濃度のヘモグロビン水溶液を含有するヘモソームに関
する。

本発明のへモソームは酸素運搬能および安全性が高く、
酸化に対して安定な人工赤血球として利用される。

［従来の技術］ヘモグロビンを含有するリポソームとして従来いわゆる
薄膜法により製造されたものがミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）
らにより報告されている（米国特許第４．１３３．８７
４号）。この方法によればヘモグロビン含有リポソーム
は、リポソーム形成脂質をクロロホルム等の適当な打機
溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒を留去して脂質の
薄膜をつくり、この薄膜に溶血ヘモグロビン水溶液を加
え、激しく撹拌して多重層リポソームを形成し、次にこ
れを超音波処理することによって得られる。この方法に
よれば、ヘモグロビンが酸素に触れる時間が少ないので
ヘモグロビンの変性が比較的少ない利点がある。しかし
ながら保存中にリポソーム中のヘモグロビンのヘム鉄が
徐々に酸化されてメトヘモグロビンに変質して酸素の運
搬機能を失うおそれがある。血球内においてはヘモグロ
ビンはメト型に酸化されても酸素の作用によりもとへ還
元される機構をそなえているが、溶血して血球外へとり
出されるとこのような機構がないため、一旦メト型に変
質すると酸素運搬能を失ってしまう。

さらに、ヘモグロビンは分子ｆｆ１６８，０００の高分
子化合物であり、その水溶液は粘度が高い。ところが従
来の方法ではこのような高分子量、高粘度の水溶液を含
有するリポソームを調製することはできず、ヘモグロビ
ン濃度がせいぜい１５％程度のリポソームしか得られな
い。天然赤血球中のヘモグロビン濃度が３５％前後であ
ることを考慮すると上記濃度では酸素運搬能が低すぎる
。そのため該ヘモソーム自体の濃度を高めざるをえなく
なり、そうすると膜材の構成成分である脂質濃度が高く
なり、安全性の面から問題を生じる。さらにヘモソーム
濃度を高めるとその懸濁液の粘性が高くなり血流循環動
態にとって不利となる。従ってリポソーム内部に高濃度
のヘモグロビンを含Ｈするヘモソームが望まれる。

［発明が解決しようとする問題点］従って本発明の目的は、ヘモグロビンの酸化を防止した
ヘモソームを提供することにある。

さらに本発明の目的はリポソーム内部に取り込まれたヘ
モグロビン水溶液におけるヘモグロビン濃度が赤血球中
のそれと同等またはそれ以上であるヘモソームを提供す
ることにある。

［問題点を解決するための手段］上記の目的を達成するために本発明は下記の構成を何す
る。

１）　リポソーム内にヘモグロビン水溶液を取り込んで
なるヘモグロビン含有リポソームであって、リポソーム
膜が水素添加率５０％以上の水素添加リン脂質を主成分
とし、ヘモグロビン水溶液が３０〜６０％（ｗ／ｗ）の
ヘモグロビン濃度を有することを特徴とするヘモグロビ
ン含有リポソーム。

２）　水素添加リン脂質が水素添加天然リン脂質である
第１項に記載のヘモグロビン含有リポソーム。

３）　水素添加天然リン脂質が水素添加レシチンである
第２項記載のヘモグロビン含有リポソーム。

４）　水素添加率８０％以上の水素添加レシチンである
第３項記載のヘモグロビン含有リポソーム。

５）　水素添加率８０％以上の水素添加ホスファチジル
コリンである第４項記載のヘモグロビン含有リポソーム
。

６）　ヘモグロビン濃度が５０％（ｗ／ｗ）である第１
項記載のヘモグロビン含有リポソーム。

７）　リポソーム膜が負電荷を与える物質を含む第１項
乃至第５項のいずれかの項に記載のヘモグロビン含有リ
ポソーム。

８）　負電荷を与える物質がホスファチジン酸またはジ
セチルホスフェートである第６項記載のヘモグロビン含
有リポソーム。

本発明のへモソームは膜材が水素添加率５０％以上の、
水素添加リン脂質を主成分とする。

大豆レシチン、卵黄レシチン等天然のリン脂質は全て不
飽和脂肪酸を分子中に含んでいるが本発明においては上
記天然リン脂質の不飽和脂肪酸の５０％以−ヒを水素で
飽和した水素添加リン脂質が好適使用される。

合成ジステアロイルレシチンは分子中に不飽和脂肪酸を
含んでいないので酸化に対して安定であるが、ヘモグロ
ビンの捕捉率が水素添加天然レシチンにくらべて劣って
いる。これは水素添加天然リン脂質が異なった種類の脂
肪酸を分子中に含んだリン脂質の混合物であるのに対し
て、合成ジステアロイルレシチンは分子中に脂肪酸とし
てステアリン酸のみを含む単一化合物であることによる
と思われる。

本発明において用いる水素添加リン脂質の水素添加率は
５０％以上、好ましくは８０％以上であり、ヨウ素価で
表わして３０以下、好ましくは１０以下である。水素添
加率が５０％より少ないとヘモグロビンの酸化の防止が
不十分である。水素添加リン脂質の例としては、レシチ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
イノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジル
グリセロール、スフィンゴミエリン、カルシオリビン等
を常法に従って水素添加したものがあげられる。特に大
豆レシチン、卵黄レシチン、コーンレシチン、綿実油レ
シチン、ナタネレシチン等を水素添加した水素添加天然
レシチンが好適に使用される。

水素添加率は次の如くして測定される。すなわち、水素
添加リン脂質の脂肪酸部分をＪ　ｈｕｏ＋らの方法［Ｊ
、　Ａｍ、　Ｏｉｌ　Ｃｈｅａ＋、　Ｓｏｃ、　５３．
１３２　（１９８２）］によりメチルエステルとした後
ＧＬＣ分析し、構成脂肪酸からヨウ素価を算出する。同
様にして未水素添加リン脂質のヨウ素価を求め、」１記
水素添加リン脂質のヨウ素価との比率から水素添加率を
算出した。

本発明のへモソームの膜材には膜の強度を高めるために
、コレステロール、トコフェロール（ビタミンＥ）等の
ステロールを添加することができ、またリポソームの凝
集を防止するために、負の電荷を与える物質、例えばホ
スファチジン酸、ジセチルホスフェートを添加すること
ができる。さらに、膜材にアスコルビン酸エステルを加
えるとリポソーム膜の酸化が抑制される。

リポソーム内部に取り込まれるヘモグロビンは赤血球を
常法に従って溶血し分画分子量５万の膜を使用した限外
か過により３０％（ｗ／ｗ）以上に濃縮したものが使用
される。ヘモグロビンは水溶液の形態でリポソームに取
り込まれ、その濃度は３０〜６０％（ｗ／ｗ）であり、
その粘度はおよそ１０ｃＰ〜３．０００ｃＰ　　（４℃
）である。

本発明のヘモグロビン水溶液にビタミンＣを添加するこ
とはヘモグロビンの酸化を防止するのに有効であり、そ
の添加量はヘモグロビンに対しておよそ２〜１０倍モル
である。

本発明のへモソームは、上記水素添加天然リン脂質を主
成分とするリポソーム膜材を有機溶媒に溶解し、該溶液
から溶媒を留去し、残留物に３０〜６０ｗ／ｗ　　（％
）濃度のヘモグロビン水溶液を加え、振盪処理するかま
たは超音波処理することにより均一な懸濁液とし、該懸
濁液を不活性ガスで加圧し、不活性ガスを該懸濁液に十
分浸透させた後読懸濁液を細隙から高圧吐出処理するこ
とによって製造される。

上記製法において、均一な懸濁液を調製するまでの工程
は、水素添加天然リン脂質を主成分とする膜材を使用す
る以外は、前述した薄膜法として知られるリポソームの
製造方法と同じであり、そ。

れ自体公知の方法に従って実施される。有機溶媒として
は通常クロロホルム、エタノール等が用いられる。

かくして得られた懸濁液は細隙ノズル付き加圧容器内で
不活性ガス、例えば窒素ガスまたはアルゴンガス、で加
圧される。加圧はおよそ８０〜１３０ｋｇ　／　ｃ−が
適当である。不活性ガスが懸濁液に十分浸透したのち、
懸濁液をノズルから吐出処理する。

懸濁液を高圧吐出処理する工程は、高圧吐出型乳化機、
好ましくはガス加圧式高圧吐出型乳化機（米国パール社
製、商品名二バール細胞破砕機）を用いて懸濁液を上記
の圧力を保持しつつ細隙から１〜数回吐出させることに
よって実施される。

この時不活性ガスの浸透した懸濁液は、ガスの急激な圧
力膨張によって激しく乳化され、リポソームが形成され
る。高圧で吐出され′るほどリポソームの粒径は小さく
なる。かくして得られるリポソーム液は常法に従って洗
浄され、超遠心処理等によって採取される。

次に実施例および試験例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

実施例 ■）赤血球膜除去ヘモグロビン（ＳＦＨ）の調製抗凝固
剤入りの採血バックを用いて、牛の静脈より牛全血１５
Ｉを採取する。採取全血は無菌的に密閉容器内、４℃に
て運搬保管する。以下工程はすべて無菌的に、４℃低温
下にて行なう。

連続遠心機により生理食塩水を用いて遠心洗浄を行ない
血小板、白血球、血漿を取り除いた粗洗浄赤血球５ｇを
得る。

孔径０．４５μの血漿分離器により、生理食塩水を用い
てさらに洗浄を行なう。洗浄赤血球５ｇに対してパイロ
ジエンフリーの蒸留水１０．Ｑを加え溶血させる。孔径
０．４５μの血漿分離器および孔径０．１μの血漿成分
分離器を用いて、赤血球膜の除去および濾過無菌化を行
なう。ヘモグロビン濃度８％（ｗ／ｗ）の赤血球膜除去
ヘモグロビン約１２ｇが得られる。

透析用ダイアライザーＴＡＦＩＯＷ（テルモ社製のセル
ロース系中空系ダイアライザー）を用いて限外濾過によ
り濃縮しヘモグロビン濃度５０％（ｗ／ｗ）の赤血球膜
除去ヘモグロビン約１．８ｇが得られる。

２）リポソーム形成脂質の調製水素添加率８０９６の精製ホスファチジルコリン２７．
７６　ｆ、コレステロール６．９６ｇ、水素添加率８０
％の精製ホスファチジン酸３．７５ｇをクロロホルムに
溶解する。該脂質溶液をナスフラスコに入れ、エバポレ
ーションを行ないクロロホルムを除去し、ナスフラスコ
の底に脂質膜を形成させる。さらに真空乾燥を１６時間
行ないクロロホルムを完全に除去する。

３）、ＳＦＨ・脂質の懸濁液作成前記ＳＦＨ調製工程で得られた５０％ＳＦＨのうち、３
００　ｍｌを該脂質膜に添加して、振盪または超音波に
より均一な懸濁液とし、これを原料溶液とする。

４）不活性ガスを用いた加圧吐出によるヘモグロビン溶
液を細隙ノズル付きの加圧容器、パール細胞破砕器（米
国ＰＡＲＲ社製）に入れ、チッ素ガスを導入し１３０　
ｋｇ／ｃｄに加圧する。３０分間放置し、チッ素ガスを
十分に原料溶液に浸透させる。

次にノズルのバルブを徐々に開放し、１３０　ｋｇ／ｃ
ｄの圧力を維持しながら原料溶液を吐出させる。

５）ヘモグロビン含有リポソームの精製加圧吐出後の液
を生理食塩水で１０倍に希釈し遠心（１７，００Ｏｒｐ
ｍ、　３０ｍ１ｎ）により、ヘモグロビン自白。

リポソームの沈殿として分離する。上澄のカプセル化に
関与しなかったヘモグロビン溶液をデカンテーションで
除き、その後生理食塩水でヘモグロビン含有リポソーム
沈殿を懸濁させ、再度遠心を行なう。以下同様の操作を
上澄にヘモグロビンが検出されなくなるまで繰り返す。

６）粗大粒子の除去精製後のヘモグロビン含有リポソームの懸濁液を０．４
μのニューフリポアメンブレン（材質：ポリカーボネイ
ト）にてン濾過して粗大粒子を取り除く。

７）ヘモグロビン濃度調製最終的に生理食塩水に懸濁し、ヘモグロビン濃度１０９
６に調製したものが１８０　ｍｌ得られた。

試験例　１ヘモグロビンの酸化実施例で作成された水素添加リン脂質へモソーム（ＮＩ
Ｊ、１）、未水素添加リン脂質へモソーム（ビタミンＥ
添加＃）［２）および未水素添加リン脂質へモソーム（
ビタミンＥ添加無’）　　（Ｎｏ、３）をそれぞれ生理
食塩水に懸濁し、３７℃で保持したときのメトヘモグロ
ビン比率（％）を経時的に測定した。結果を第１図に示
す。第１図から明らかに本発明の水素添加リン脂質へモ
ソーム（Ｎｏ、１）には酸化（メト化）抑制の効果がみ
られる。

試験例　２濃厚ヘモグロビン水溶液をリポソーム化することによる
ヘモソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度に対する脂質濃
度低減化の効果を調べた。

実施例で作成した５０％ＳＦＨへモソーム（Ｎａｌ）、
対照としての３０％ＳＦＨへモソーム（Ｎｏ、４）およ
び１５％ＳＦＨヘモソーム（、Ｎｏ、　５　）における
ヘモソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度：　Ｈ（ｍｇ／
ｍｌ）と脂質濃度：　Ｌ　（ｍｇ／ｍｌ）の比Ｈ／Ｌを
表１に示す。

表　　　１試　　　　　料　　　　　　　　）（／ＬＮ［Ｌｌ　　
５０％ＳＦＨのへモソーム　　１６２９賜、４３０％Ｓ
ＦＨヘモソーム　　３．４８陽、５１５％ＳＦＨへモソ
ーム　　６．７６表１からＳＦＨの濃度が上昇するにつ
れＨｂ濃度に対する脂質濃度低減化の効果が明らかであ
る。

試験例　３濃厚ヘモグロビン水溶液をリポソーム化することによる
ヘモソーム懸濁液の粘度低減効果を調べた。

ヘモソーム懸濁液（生理食塩水）中のヘモグロビン濃度
を一定（１０％）にしたときの５０％ＳＦＨへモソーム
懸濁液（Ｎｏ、１）、３０％ＳＦＨへモソーム懸濁液（
Ｎｏ、４）および１５％ＳＦＨへモソーム懸濁液（隘５
）のそれぞれの粘度を測定した。結果を第２図に示す。

第２図から、ヘモソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度を
一定にしてその粘度を比較すると、濃厚なＳＦＨを含有
する程へモソーム懸濁液の粘度は低減化することが明ら
かである。

［発明の効果］本発明のへモソームにおいては膜材が５０％以上水素添
加された水素添加天然リン脂質が使用され、酸化に対し
て抵抗性を有するので、ヘモグロビンのメト化が抑制さ
れる。

ざらに本発明のへモソームにおいてはヘモグロビンが濃
厚な水溶液としてリポソーム内部に取り込まれているの
で、膜材であるリン脂質の使用量をヘモグロビン量に対
して相対的に低減化することができ、それだけ安全性を
高めることができる。

さらに、ヘモソームの懸濁液の濃度を低めることができ
るので、その粘度が低減化され、血流循環動態にとって
有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図はへモソーム中のメトヘモグロビン比率（％）の
経時変化を示すグラフである。第２図はへモソーム懸濁液の粘度を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１）リポソーム内にヘモグロビン水溶液を取り込んでな
るヘモグロビン含有リポソームであって、リポソーム膜
が水素添加率５０％以上の水素添加リン脂質を主成分と
し、ヘモグロビン水溶液が３０〜６０％（ｗ／ｗ）のヘ
モグロビン濃度を有することを特徴とするヘモグロビン
含有リポソーム。２）水素添加リン脂質が水素添加天然リン脂質である特
許請求の範囲第１項に記載のヘモグロビン含有リポソー
ム。３）水素添加天然リン脂質が水素添加レシチンである特
許請求の範囲第２項記載のヘモグロビン含有リポソーム
。４）水素添加率８０％以上の水素添加レシチンである特
許請求の範囲第３項記載のヘモグロビン含有リポソーム
。５）水素添加率８０％以上の水素添加ホスファチジルコ
リンである特許請求の範囲第４項記載のヘモグロビン含
有リポソーム。６）ヘモグロビン濃度が５０％（ｗ／ｗ）である特許請
求の範囲第１項記載のヘモグロビン含有リポソーム。７）リポソーム膜が負電荷を与える物質を含む特許請求
の範囲第１項乃至第５項のいずれかの項に記載のヘモグ
ロビン含有リポソーム。８）負電荷を与える物質がホスファチジン酸またはジセ
チルホスフェートである特許請求の範囲第６項記載のヘ
モグロビン含有リポソーム。